CN105603119A - 用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的snp标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的SNP标记方法，该方法包括如下步骤：(1)提取被检测样品黄瓜基因组DNA；(2)以该DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列为上、下游引物，进行PCR扩增，获得319bp核苷酸序列，(3)对该核苷酸序列进行测序，如SEQIDNo.3所示，为抗病；如SEQIDNo.4所示或同时具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所述的序列，为感病。本发明方法简单高效，结果可靠；所提供的分子标记可用于黄瓜棒孢叶斑病抗性的分子辅助选择育种，可以为通过基因工程改良黄瓜品种的抗病性、完善黄瓜分子育种技术平台奠定基础。

Description

用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的SNP标记方法
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术及分子生物学领域，提供了黄瓜棒孢叶斑病抗性的SNP标记及其鉴定方法。可用于黄瓜棒孢叶斑病抗性的早期分子辅助选择，以提高育种效率。
背景技术
黄瓜(CucumisSativusL.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)一年蔓生草本植物，是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，是中国栽培面积最大、种植范围最广的主要蔬菜作物之一。黄瓜棒孢叶斑病[Cucumbertargetleafspot]，又称“褐斑病”、“靶斑病”、“黄点子病”，是一种世界性分布的真菌病害，近年来在我国严重暴发，是公认的危害黄瓜生产的一种仅次于霜霉病的病害，已成为制约黄瓜生产的关键病害。黄瓜棒孢叶斑病在温室、露地都有发生，且有不断加重的趋势，一旦发生常造成严重损失甚至毁园。北方地区以春、秋及越冬保护地栽培发生普遍，南方则以春、秋露地发生较多。一般病田发病率为10％～25％，严重时可达60％～70％，甚至100％，给种植户造成巨大经济损失。尤其在蔬菜高度产业化的今天，基于传统的抗病育种模式严重制约着黄瓜品种的更新换代、生产产业化的步伐，利用现代生物技术手段进行黄瓜抗病分子标记辅助育种势在必行。
随着分子生物学技术和遗传标记的应用和发展，为蔬菜育种学开辟了崭新的研究和应用领域，它使蔬菜育种学家能直接从分子水平了解物种间的差异,也使育种过程更直观，目的性更强。分子标记辅助选择(Molecularmarker-assistedselection，MAS)技术目前已成为育种研究的热点和重要手段，将分子遗传技术应用于蔬菜抗病遗传育种的研究上，为材料的选择提供了全新的手段。可在早代对表现优良的基因型进行直接选择，苗期即可在DNA水平上对目标性状进行选择，抗病性鉴定可在室内完成，鉴定周期缩短到2天，而且稳定可靠，不受季节、环境条件等因素的影响，可提高选择速度，增强选择的准确性和可靠性，加快育种进程，因此具有广阔的应用前景。
随着蔬菜集约化生产和栽培技术的提高，黄瓜抗病育种已提到重要位置。黄瓜棒孢叶斑病是黄瓜生产上的重要病害。查阅国内外文献，迄今为止，有关黄瓜棒孢叶斑病的SNP分子标记辅助育种研究尚未见相关报道。因而将黄瓜抗棒孢叶斑病基因与不抗棒孢叶斑病的其它品种的优良品质基因相结合，培育优良抗病的黄瓜新品种和创造黄瓜新种质是生产实践中亟需解决的实际问题。筛选与黄瓜抗棒孢叶斑病基因紧密连锁的SNP标记，建立黄瓜抗棒孢叶斑病分子标记辅助育种体系，将会推动传统的“经验育种”向高效的“精确育种”转变，提升育种效率和技术水平，加速抗病育种的进程，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供了用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性的引物。
本发明的第二个目的是提供用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的SNP标记方法。
本发明的技术方案概述如下：
用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性的引物，由SEQIDNo.1所示的正向引物，和SEQIDNo.2所示的反向引物组成。
用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的SNP标记方法，包括如下步骤：
(1)提取被检测样品黄瓜基因组DNA；
(2)以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，获得319bp核苷酸序列，所述序列中包含四个与黄瓜棒孢叶斑病抗病性相关基因紧密连锁的SNP位点或四个与黄瓜棒孢叶斑病感病性相关基因紧密连锁的SNP位点；
(3)将步骤(2)获得的核苷酸序列进行测序，如果测序结果如SEQIDNo.3所示，为抗棒孢叶斑病资源；如测序结果如SEQIDNo.4所示或同时具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所述的核苷酸序列，为感棒孢叶斑病资源。
本发明的优点：
本发明的方法简单高效，结果可靠；所提供的分子标记可用于黄瓜棒孢叶斑病抗性的分子辅助选择育种，可以为通过基因工程改良黄瓜品种的抗病性奠定基础，并为完善黄瓜分子育种技术平台奠定坚实基础。
附图说明
图1是利用鉴定黄瓜棒孢叶斑病抗性的方法获得的与黄瓜抗棒孢叶斑病基因紧密连锁的SNP标记和基因片段及感棒孢叶斑病基因紧密连锁的SNP标记和基因片段的比对图：
R为SEQIDNo.3所示，319bp；S为SEQIDNo.4所示，319bp。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性的引物，由SEQIDNo.1所示的正向引物，和SEQIDNo.2所示的反向引物组成。
正向引物F:5'-accctgaccttccttatc-3'(SEQIDNo.1)
反向引物R:5'-ggttgacagttgattaagc-3'(SEQIDNo.2)
上述引物用来检测黄瓜基因组序列Csa6M138620.1的第9718701、9718752、9718799和9718919个碱基处存在四个与黄瓜棒孢叶斑病抗性相关的SNP位点，该特异引物可对黄瓜棒孢叶斑病抗性进行良好分型，即检测9718701、9718752、9718799和9718919处的碱基形式表达黄瓜棒孢叶斑病抗病性和感病性的差异。该四个SNP标记位于黄瓜第六号染色体。
实施例2
用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的SNP标记方法，包括如下步骤：
(1)提取被检测样品黄瓜基因组DNA；
(2)以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA20ng、序列表中SEQIDNo1所述的核苷酸序列25ng、序列表中SEQIDNo2所述的核苷酸序列25ng、dNTP0.20mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，52℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；
(3)将步骤(2)获得的核苷酸序列进行测序，获得319bp核苷酸序列，所述序列中包含四个与黄瓜棒孢叶斑病抗病性相关基因紧密连锁的SNP位点或四个与黄瓜棒孢叶斑病感病性相关基因紧密连锁的SNP位点；
如果是SEQIDNo.3所示，9718701处碱基为G、9718752处碱基为A、9718799处碱基为C和9718919处碱基为A的黄瓜为抗棒孢叶斑病资源；
如果同时具有SEQIDNo.3所述的核苷酸序列和SEQIDNo.4所述的核苷酸序列的材料，即9718701处碱基为A或A和G同时存在、9718752处碱基为C或C和A同时同在、9718799处碱基为T或T和C同时存在，并且9718919处碱基为G或G和A同时存在的黄瓜为感棒孢叶斑病资源。见图1。抗棒孢叶斑病资源，或者是抗棒孢叶斑病基因的携带者，可以用作进一步抗病品种选育的材料和育种种质。
对黄瓜抗棒孢叶斑病种质资源或对黄瓜进行抗棒孢叶斑病分子标记辅助育种。同时，这四个SNP标记也为黄瓜抗棒孢叶斑病基因的克隆奠定了基础。
实施例3
鉴定黄瓜种质资源棒孢叶斑病抗性
选取保存于天津科润黄瓜研究所育种一室的黄瓜种质资源XL6-1-2、09L4、Q6、LX-11-1、P62-1-1、D507-1-1、Q5、JY118等，分别采用实施例2的方法进行操作：经检测，XL6-1-2、09L4、Q6、LX-11-1、Q5扩增产物均出现SEQIDNo.3所述的核苷酸序列，为抗棒孢叶斑病资源；P62-1-1、D507-1-1扩增产物出现SEQIDNo.4所述的核苷酸序列，为感棒孢叶斑病资源；JY118扩增产物出现SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所述的核苷酸序列，为不纯合感棒孢叶斑病资源。

Claims (2)

1.用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性的引物，其特征由SEQIDNo.1所示的正向引物，和SEQIDNo.2所示的反向引物组成。
2.用于检测黄瓜棒孢叶斑病抗性位点的SNP标记方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取被检测样品黄瓜基因组DNA；
(2)以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，获得319bp核苷酸序列，所述序列中包含四个与黄瓜棒孢叶斑病抗病性相关基因紧密连锁的SNP位点或四个与黄瓜棒孢叶斑病感病性相关基因紧密连锁的SNP位点；
(3)将步骤(2)获得的核苷酸序列进行测序，如果测序结果如SEQIDNo.3所示，为抗棒孢叶斑病资源；如测序结果如SEQIDNo.4所示或同时具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所述的核苷酸序列，为感棒孢叶斑病资源。
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