CN110857452A - 一种检测SdhB-H278R点突变的含量的方法及其专用成套试剂 - Google Patents

一种检测SdhB-H278R点突变的含量的方法及其专用成套试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测SdhB‑H278R点突变的含量的方法及其专用成套试剂。方法包括如下步骤：分别以待测样本基因组DNA和SdhB‑H278R点突变标准溶液为模板，分别采用特异引物对(由序列1和序列2所示的引物组成)和内参引物对(由序列3和序列4所示的引物组成)进行实时荧光定量PCR，依次得到CT1和CT2，进而得到ΔCT；ΔCT＝CT1‑CT2；根据标准溶液中SdhB‑H278R点突变的含量和相应的标准溶液ΔCT绘制标准曲线，将待测样本ΔCT代入标准曲线，得到待测样本基因组DNA中SdhB‑H278R点突变的含量。该方法检测SdhB‑H278R点突变的含量准确率高且特异性好，具有重要的应用价值。

Description

一种检测SdhB-H278R点突变的含量的方法及其专用成套试剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测SdhB-H278R点突变的含量的方法及其专用成套试剂。
背景技术
多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)是一种重要的植物病原菌，是棒孢属内发现最早、寄主范围最广的种，可以侵染葫芦科、茄科和豆科等大部分蔬菜，园艺花卉，橡胶等经济作物以及大豆等粮食作物约300个种。在国内，北京、山东、辽宁、河北、广东和黑龙江等多个省份，以及在日本和韩国均发生大范围的黄瓜棒孢叶斑病，一般田间发病率为10％-25％，严重时可达60％-70％，甚至100％。因此由多主棒孢菌引起的黄瓜棒孢叶斑病在黄瓜上已成为一种重要的叶部病害。
啶酰菌胺是德国巴斯夫公司开发的一种SDHIs类杀菌剂，其可用于防治黄瓜灰霉病(由灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起)和黄瓜棒孢叶斑病。由于啶酰菌胺长期大量的使用，导致灰霉病菌和多主棒孢菌均对啶酰菌胺产生了抗药性。琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基上的点突变是导致大多数病原菌产生SDHIs类杀菌剂抗性的主要原因。其中在多主棒孢菌上发现对啶酰菌胺抗性的点突变主要有SdhB-H278R/Y、SdhC-S73P、SdhD-S89P和SdhD-G109V等几种点突变。根据抗性指数(Resistancefactor，RF)，多主棒孢菌对啶酰菌胺表现出超高抗、高抗、中抗和低抗四类抗性。已有研究表明，琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基上不同的点突变分别对应不同的抗性水平，对于超高抗菌株，主要发生SdhB-H278Y(CAC-TAC)突变；对于高抗菌株，主要发生SdhB-H278R(CAC-CGC)突变；对于中抗菌株，抗性突变包括SdhC-S73P(TCG-CCG)突变、SdhD-G109V(GGC-GTC)突变和SdhD-S89P(TCC-CCC)突变。
本发明的发明人对北京大兴区田间收集的黄瓜棒孢叶斑病样品进行啶酰菌胺抗性检测时，发现了含有SdhB-H278R点突变的抗性菌株，这说明田间多主棒孢菌种群中已出现含有该点突变的抗性菌株。目前，尚未建立SdhB-H278R点突变的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的是检测SdhB-H278R点突变的含量。
本发明首先保护成套试剂。所述成套试剂可包括特异引物对；所述特异引物对可由引物B-H278R-2F和引物B-H278R-2R14组成；所述特异引物对在多主棒孢菌SdhB基因中的靶序列可含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲可为如下Y1)或Y2)：
Y1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
Y2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
所述引物B-H278R-2F可为如下X1)或X2)：
X1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
X2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物B-H278R-2R14为如下X3)或X4)：
X3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
X4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
所述成套试剂还可包括内参引物对；所述内参引物对可由引物B-H278R-TY-F和引物B-H278R-TY-R组成；所述内参引物对在多主棒孢菌SdhB基因中的靶序列可含有特异DNA片段乙；所述特异DNA片段乙可为多主棒孢菌SdhB基因的保守区段，不发生任何形式的突变。
所述引物B-H278R-TY-F可为如下Z1)或Z2)：
Z1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
Z2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物B-H278R-TY-R可为如下Z3)或Z4)：
Z3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
Z4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
上述任一所述成套试剂还可包括进行实时荧光定量PCR的一些常规试剂和/或SdhB-H278R点突变标准溶液。
本发明还保护上述任一所述成套试剂的制备方法，可为将上述任一所述成套试剂中的所述引物B-H278R-2F和/或所述引物B-H278R-2R14和/或所述引物B-H278R-TY-F和/或引物B-H278R-TY-R分别单独包装。
本发明还保护上述任一所述的成套试剂的应用，可为如下(S1)-(S6)中至少一种：
(S1)检测SdhB-H278R点突变；
(S2)制备用于检测SdhB-H278R点突变的产品；
(S3)评价多主棒孢菌的啶酰菌胺抗性；
(S4)制备用于评价多主棒孢菌的啶酰菌胺抗性的产品；
(S5)检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量；
(S6)制备用于检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量的产品。
本发明还保护一种产品，其可包括上述任一所述的成套试剂。
本发明还保护所述产品的应用，可为如下(S1)或(S3)或(S5)中至少一种：
(S1)检测SdhB-H278R点突变；
(S3)评价多主棒孢菌的啶酰菌胺抗性；
(S5)检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量。
本发明还保护一种检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：
所述步骤(a)包括如下步骤：
(a-1)以待测样本基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行实时荧光定量PCR，得到待测样本CT1；
(a-2)以待测样本基因组DNA为模板，采用上述任一所述内参引物对进行实时荧光定量PCR，得到待测样本CT2；
(a-3)得到待测样本ΔCT；待测样本ΔCT＝待测样本CT1-待测样本CT2；
所述步骤(b)包括如下步骤：
(b-1)以SdhB-H278R点突变标准溶液为模板，采用上述任一所述特异引物对进行实时荧光定量PCR，得到标准溶液CT1；
(b-2)以SdhB-H278R点突变标准溶液为模板，采用上述任一所述内参引物对进行实时荧光定量PCR，得到标准溶液CT2；
(b-3)得到标准溶液ΔCT；标准溶液ΔCT＝标准溶液CT1-标准溶液CT2；
所述步骤(c)：根据所述SdhB-H278R点突变标准溶液中SdhB-H278R点突变的含量和相应的标准溶液ΔCT绘制标准曲线，将所述步骤(a-3)得到的待测样本ΔCT代入所述标准曲线，得到待测样本基因组DNA中SdhB-H278R点突变的含量。
上述任一所述SdhB-H278R点突变标准溶液可为若干个SdhB-H278R点突变的含量不同的溶液。所述SdhB-H278R点突变标准溶液的制备方法可如下：将仅发生SdhB-H278R点突变的多主棒孢菌菌株的基因组DNA和未发生突变的多主棒孢菌菌株的基因组DNA按照不同摩尔质量比混合，得到混合DNA。在本发明的一个实施例中，所述混合DNA中，发生SdhB-H278R点突变的多主棒孢菌菌株的基因组DNA的摩尔质量占混合DNA的摩尔质量的6.25％、12.5％、25.0％、50.0％、75.0％或100.0％。
所述仅发生SdhB-H278R点突变的多主棒孢菌菌株具体可为实施例提及的多主棒孢菌HG-R菌株。多主棒孢菌HG-R菌株的SdhB基因发生SdhB-H278R点突变。
所述未发生突变的多主棒孢菌菌株具体可为实施例提及的多主棒孢菌HG-H1菌株、多主棒孢菌HG-H2菌株、多主棒孢菌HG-H3菌株或多主棒孢菌HG-H4菌株。多主棒孢菌HG-H1菌株、多主棒孢菌HG-H2菌株、多主棒孢菌HG-H3菌株和多主棒孢菌HG-H4菌株的SdhB基因均为野生型。
本发明还保护一种检测待测样本基因组DNA是否存在SdhB-H278R点突变的方法，可为G1)或G2)：
G1)以待测样本基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果PCR扩增产物中含有244bp的DNA片段，则待测样本基因组DNA中存在或疑似存在SdhB-H278R点突变；如果PCR扩增产物中不含有244bp的DNA片段，则待测样本基因组DNA中不存在或疑似不存在SdhB-H278R点突变；
G2)以待测样本基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果PCR扩增产物中含有序列表中序列5所示的DNA片段，则待测样本基因组DNA中存在或疑似存在SdhB-H278R点突变；如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列5所示的DNA片段，则待测样本基因组DNA中不存在或疑似不存在SdhB-H278R点突变。
上述任一所述待测样本可为r1)菌株；r2)多主棒孢菌菌株；r3)灰葡萄孢菌；r4)瓜枝孢菌；r5)立枯丝核菌；r6)茄链格孢菌；r7)茄葡柄霉菌；r8)尖孢镰孢菌；r9)核盘菌；r10)古巴假霜霉菌；r11)植物组织；r12)植物叶片；r13)黄瓜叶片。
上文中，如果存在SdhB-H278R点突变，则待测样本具有啶酰菌胺抗性。SdhB-H278R点突变的含量越高，则SdhB-H278R点突变的抗性种群在田间的比例越高(即出现的频率越高)。因此，可以根据SdhB-H278R点突变的含量的高低，指导农药的使用。例如，如果SdhB-H278R点突变的含量较高，则需要使用非啶酰菌胺的杀菌剂。
采用本发明提供的检测SdhB-H278R点突变的含量的方法，可以准确检测SdhB-H278R点突变在田间出现的频率以及动态变化，对病害的有效防治和农药的合理使用有指导意义，同时也为药剂筛选压力下，不同类型抗性群体的动态变化的研究提供了基础。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为特异引物对甲在多主棒孢菌SdhB基因上的位置示意图。
图2为特异性实验。
图3为SdhB-H278R点突变的标准曲线。
图4为熔解曲线分析。
图5为熔解曲线分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
2×Taq PCR MasterMix为北京博迈德基因技术有限公司的产品。2×SuperRealPreMix Plus、50×ROX Reference Dye和植物组织DNA提取试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司的产品。
实施例1、检测9个多主棒孢菌菌株对啶酰菌胺的敏感性
一、9个多主棒孢菌菌株的获得和SdhB基因的突变类型鉴定
1、9个多主棒孢菌菌株的获得
多主棒孢菌HG-H1菌株(以下简称HG-H1)、多主棒孢菌HG-H2菌株(以下简称HG-H2)、多主棒孢菌HG-H3菌株(以下简称HG-H3)和多主棒孢菌HG-H4菌株(以下简称HG-H4)均为本发明的发明人(孙炳学，15600157883)从北京大兴区田间采集具有黄瓜棒孢叶斑病的典型病斑的植物叶片，然后采用组织分离培养法分离得到。
多主棒孢菌HG-R菌株(以下简称HG-R)、多主棒孢菌HG-Y菌株(以下简称HG-Y)、多主棒孢菌HG-V菌株(以下简称HG-V)、多主棒孢菌HG-S菌株(以下简称HG-S)和多主棒孢菌HG-P菌株(以下简称HG-P)均为本发明的发明人(孙炳学，15600157883)从山东省寿光县田间采集具有黄瓜棒孢叶斑病的典型病斑的植物叶片，然后采用组织分离培养法分离得到。
采用组织分离培养法从具有黄瓜棒孢叶斑病的典型病斑的植物叶片中分离多主棒孢菌菌株的具体步骤如下：
(1)取具有黄瓜棒孢叶斑病的典型病斑的植物叶片，切取病健交界处的病斑组织，置入75％(v/v)酒精水溶液中60s，灭菌水漂洗3次，然后接种于PDA固体平板(PDA固体培养基自然冷却制备而成)上，26℃培养3d。
(2)完成步骤(1)后，用接种针挑取病斑组织边缘长出的白色菌丝，置于PDA固体平板上进行纯化。
(3)将完成步骤(2)的菌接种于PDA固体平板，26℃培养7d；收集孢子并用无菌水配成浓度为1×104个/mL的孢子悬浮液。
(4)将20μL孢子悬浮液均匀涂布于水琼脂平板上，然后在显微镜下寻找单个孢子。挑取单个孢子置于PDA固体平板上，26℃培养，得到单孢菌株。将分离到的单孢菌株转移至PDA固体斜面，4℃保存。
2、9个多主棒孢菌菌株SdhB基因的突变类型鉴定
分别提取9个多主棒孢菌菌株的基因组DNA并以其为模板，以CC-sdhB-F：5’-CACTCTTCTTCGCCATCC-3’和CC-sdhB-R：5’-CATCACACTCACGGTCAC-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序。根据测序结果，判断步骤1分离的9个多主棒孢菌菌株SdhB基因的突变类型。
结果表明，HG-H1、HG-H2、HG-H3和HG-H4的SdhB基因均为野生型，没有发生突变；HG-R的SdhB基因发生SdhB-H278R点突变；HG-Y的SdhB基因发生SdhB-H278Y点突变；HG-V的SdhB基因发生SdhB-I280V点突变；HG-S的SdhB基因发生SdhB-P199S点突变；HG-P的SdhB基因发生SdhC-S73P点突变。
二、检测9个多主棒孢菌菌株对啶酰菌胺的敏感性
供试菌株为HG-H1、HG-H2、HG-H3、HG-H4、HG-R、HG-Y、HG-V、HG-S或HG-P。
1、取啶酰菌胺，加入丙酮配制成浓度为30000ppm的啶酰菌胺母液。
2、完成步骤1后，取啶酰菌胺母液，加入丙酮，分别配制成浓度为1ppm的啶酰菌胺溶液1、浓度为10ppm的啶酰菌胺溶液2、浓度为100ppm的啶酰菌胺溶液3、浓度为1000ppm的啶酰菌胺溶液4、浓度为5000ppm的啶酰菌胺溶液5和浓度为10000ppm的啶酰菌胺溶液6。
3、完成步骤2后，取90mLPDA固体培养基(约55℃，处于溶化状态)，加入90μL啶酰菌胺溶液(啶酰菌胺溶液1、啶酰菌胺溶液2、啶酰菌胺溶液3、啶酰菌胺溶液4、啶酰菌胺溶液5或啶酰菌胺溶液6)，混匀，然后倒入培养皿(直径为5cm)中，自然冷却，得到PDA抗性平板。
按照上述步骤，将90μL啶酰菌胺溶液替换为90μL丙酮，其它步骤均不变，得到PDA无抗平板(作为空白对照)。
4、实验重复三次取平均值，得到菌落的平均直径。每次实验重复的步骤如下：完成步骤3后，将活化的供试菌株接种至PDA固体平板，26℃黑暗培养5d，得到供试菌株的菌落；用打孔器沿供试菌株的菌落的边缘打取直径为0.5cm的菌饼，然后菌丝面向下接种至PDA抗性平板或PDA无抗平板中，然后置于培养箱，26℃黑暗培养，5d后采用十字交叉法测量菌落直径。
5、完成步骤4后，根据菌落的平均直径计算出不同啶酰菌胺浓度下供试菌株的菌丝生长抑制率；然后将抑制率转化成机率值(Y)，啶酰菌胺浓度转换成以10为底的对数值(X)，制作回归直线，得到供试菌株对啶酰菌胺的毒力回归曲线方程(Y＝a+bX)、相关系数r和有效抑制中浓度EC50值。如果EC50值为1以上，则相应的供试菌株为啶酰菌胺抗性菌株；如果EC50值小于1，则相应的供试菌株为啶酰菌胺敏感菌株。
供试菌株的菌丝生长抑制率＝(供试菌株在PDA无抗平板上形成菌落的直径-供试菌株在PDA抗性平板上形成菌落的直径)/供试菌株在PDA抗性平板上形成菌落的直径。
供试菌株的EC50值的结果表1中第2列。结果表明，HG-H1、HG-H2、HG-H3和HG-H4均为啶酰菌胺敏感菌株，HG-R、HG-Y、HG-V、HG-S和HG-P均为啶酰菌胺抗性菌株。
表1
多主棒孢菌菌株 EC<sub>50</sub>(μg/mL) 抗性倍数
HG-H1 0.057 --
HG-H2 0.337 --
HG-H3 0.221 --
HG-H4 0.226 --
HG-R 11.710 >15
HG-Y 22.371 >15
HG-V 3.956 >15
HG-S 1.111 5.28
HG-P 19.526 >15
6、完成步骤5后，根据供试菌株的EC50值，计算各个啶酰菌胺抗性菌株的抗性倍数。
结果表明，HG-S的抗性倍数为5.28，HG-R、HG-Y、HG-V和HG-P的抗性倍数均大于15。
实施例2、检测SdhB-H278R点突变的成套试剂的制备
本发明的发明人经过大量实验，根据多主棒孢菌SdhB基因(genebank号为：MG729609.1)的核苷酸序列和其第278位氨基酸的密码子的核苷酸序列(SdhB-H278R点突变是指多主棒孢菌SdhB蛋白(GeneID为：1350884019)第278位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，即SdhB基因编码区的第833位由A突变为G)，设计并合成表2所示的特异引物对甲(特异引物对甲的引物位置如图1所示)、特异引物对乙和特异引物对丙。
根据多主棒孢菌SdhB基因保守区段(即不发生突变的区段)的核苷酸序列，设计并合成表2所示的内参引物对。
引物对名称、引物名称、核苷酸序列、序列表中的位置、产物长度依次见表2中第1-5列。
检测SdhB-H278R点突变的成套试剂由特异引物对(特异引物对甲、特异引物对乙或特异引物对丙)和内参引物对组成。
表2.引物信息
注：引物名称中含有“F”的为上游引物，含有“R”的为下游引物，“-”表示不存在。
实施例3、特异性实验
待测菌株为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、瓜枝孢菌(Cladosporiumcucnerinu)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、茄链格孢菌(Alternariasolani)、茄葡柄霉菌(Stemphyliumsolani)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis)、HG-H1、HG-R、HG-Y、HG-V、HG-S或HG-P。
1、以待测菌株的基因组DNA为模板(约50ng)，采用实施例2制备的特异引物对(特异引物对甲、特异引物对乙或特异引物对丙)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
按照上述步骤，将待测菌株的基因组DNA替换为健康黄瓜叶片的基因组DNA，其它步骤均不变，作为对照。
按照上述步骤，将待测菌株的基因组DNA替换为水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
反应体系为20μL，由10μL2×Taq PCR MasterMix、0.4μL上游引物(浓度为10μM)、0.4μL下游引物(浓度为10μM)、1.6μL模板和7.6μLddH2O组成。
反应程序：94℃5min；94℃45s，65℃45s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
2、完成步骤1后，将各个PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后凝胶成像系统分析。
采用特异引物对甲进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果见图2(S为HG-H1，
SdhB-H278R为HG-R，SdhB-H278Y为HG-Y，SdhB-I280V为HG-V，SdhB-P199S为HG-S，
SdhC-S73P为HG-P)。结果表明，只有以HG-R的基因组DNA为模板可以扩增获得244bp的DNA片段。经测序，该244bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。由此可见，采用特异引物对甲检测SdhB-H278R点突变具有较高的特异性。
采用特异引物对乙进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果表明，采用特异性引物对乙进行PCR扩增时，特异性较差，进行体系优化后仍然有非特异性扩增。
采用特异引物对丙进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果表明，采用特异性引物对丙进行PCR扩增时，特异性较差，进行体系优化后仍然有非特异性扩增。
实施例4、定量检测SdhB-H278R点突变
一、SdhB-H278R点突变的标准曲线的制作
1、将HG-R基因组DNA和HG-H1基因组DNA按照不同摩尔质量比混合，得到混合DNA。混合DNA中，HG-R基因组DNA的摩尔质量占混合DNA的摩尔质量的6.25％、12.5％、25.0％、50.0％、75.0％或100.0％。
2、配制反应体系
反应体系1为20μL，由10μL2×SuperRealPreMix Plus、0.4μL 50×ROXReferenceDye、1μLB-H278R-2F(浓度为10μM)、1μLB-H278R-2R14(浓度为10μM)、40pg步骤1制备的混合DNA(作为模板)和ddH2O组成。
反应体系2为20μL，由10μL2×SuperRealPreMix Plus、0.4μL 50×ROXReferenceDye、1μLB-H278R-TY-F(浓度为10μM)、1μLB-H278R-TY-R(浓度为10μM)、40pg步骤1制备的混合DNA(作为模板)和ddH2O组成。
3、AS-Realtime PCR检测
(1)取步骤2配制的反应体系1，置于7500real-time PCR system仪器中进行AS-Realtime PCR检测，得到CT1。
反应条件：95℃15min；95℃10s，60℃32s，40个循环；95℃15s；60℃1min；60℃开始，每个循环增加0.35℃，100个循环，60℃15s。
(2)按照步骤(1)的方法，将反应体系1替换为反应体系2，其它步骤均不变，得到CT2。
(3)完成步骤(1)和(2)后，得到ΔCT，ΔCT＝CT1－CT2。
4、SdhB-H278R点突变的标准曲线的制作
以ΔCT值为纵坐标，SdhB-H278R所占比例的对数为横坐标，制作SdhB-H278R点突变的标准曲线。
SdhB-H278R点突变的标准曲线见图3。
二、熔解曲线分析
1、取步骤一中2配制的反应体系1，置于7500real-time PCR system仪器中进行AS-Realtime PCR检测。
PCR扩增产物在熔解温度为91.62℃处出现单一的特异性峰(图4)。
2、取步骤一中2配制的反应体系2，置于7500real-time PCR system仪器中进行AS-Realtime PCR检测。
PCR扩增产物在熔解温度为87.81℃处出现单一的特异性峰(图5)。
熔解曲线分析结果表明，不存在非特异性扩增产物的问题。
三、AS-Realtime PCR定量检测体系的验证
1、DNA验证
(1)将HG-R基因组DNA和HG-H1基因组DNA按照不同摩尔质量比混合，得到混合DNA。混合DNA中，HG-R基因组DNA的摩尔质量占混合DNA的摩尔质量的80％、40％、20％、10％或5％。
(2)配制反应体系
反应体系1为20μL，由10μL2×SuperRealPreMix Plus、0.4μL 50×ROX ReferenceDye、1μLB-H278R-2F(浓度为10μM)、1μLB-H278R-2R14(浓度为10μM)、40pg步骤(1)制备的混合DNA(作为模板)和ddH2O组成。
反应体系2为20μL，由10μL2×SuperRealPreMix Plus、0.4μL 50×ROX ReferenceDye、1μLB-H278R-TY-F(浓度为10μM)、1μLB-H278R-TY-R(浓度为10μM)、40pg步骤(1)制备的混合DNA(作为模板)和ddH2O组成。
(3)AS-Realtime PCR检测
(a)取步骤(2)配制的反应体系1，置于7500real-time PCR system仪器中进行AS-Realtime PCR检测，得到CT1。
反应条件：95℃15min；95℃10s，60℃32s，40个循环；95℃15s；60℃1min；60℃开始，每个循环增加0.35℃，100个循环，60℃15s。
(b)按照步骤(a)的方法，将反应体系1替换为反应体系2，其它步骤均不变，得到CT2。
(c)完成步骤(a)和(b)后，得到ΔCT，ΔCT＝CT1－CT2。
(4)根据步骤(3)得到的ΔCT和步骤一得到的SdhB-H278R点突变的标准曲线，得到各个模板中SdhB-H278R所占比例的对数；进一步得到混合DNA中HG-R基因组DNA的摩尔质量占混合DNA的摩尔质量的比例。
检测结果见表3中第2行。
(5)计算预期值和检测值之间的线性相关性。
2、孢子悬浮液验证
(1)将HG-R或HG-H1接种至PDA固体平板，28℃黑暗培养11d。
(2)完成步骤(1)后，取所述PDA固体平板，用0.1％Tween20刷下孢子，并用三层纱布过滤，经稀释，得到孢子浓度为1×105个/mL(采用血球计数板调节)的孢子悬浮液。
(3)完成步骤(2)后，将HG-R的孢子悬浮液和HG-H1的孢子悬浮液按照不同孢子数量混合，得到混合孢子悬浮液。混合孢子悬浮液中，HG-R的孢子数量分别占混合孢子数的80％、40％、20％、10％或5％。
(4)完成步骤(3)后，取混合孢子悬浮液，12000r/min离心10min，收集沉淀；然后用植物组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
(5)配制反应体系
反应体系1为20μL，由10μL2×SuperRealPreMix Plus、0.4μL 50×ROX ReferenceDye、1μLB-H278R-2F(浓度为10μM)、1μLB-H278R-2R14(浓度为10μM)、40pg步骤(4)提取的基因组DNA(作为模板)和ddH2O组成。
反应体系2为20μL，由10μL2×SuperRealPreMix Plus、0.4μL 50×ROX ReferenceDye、1μLB-H278R-TY-F(浓度为10μM)、1μLB-H278R-TY-R(浓度为10μM)、40pg步骤(4)提取的基因组DNA(作为模板)和ddH2O组成。
(6)AS-Realtime PCR检测
(a)取步骤(5)配制的反应体系1，置于7500real-time PCR system仪器中进行AS-Realtime PCR检测，得到CT1。
反应条件：95℃15min；95℃10s，60℃32s，40个循环；95℃15s；60℃1min；60℃开始，每个循环增加0.35℃，100个循环，60℃15s。
(b)按照步骤(a)的方法，将反应体系1替换为反应体系2，其它步骤均不变，得到CT2。
(c)完成步骤(a)和(b)后，得到ΔCT，ΔCT＝CT1－CT2。
(7)根据步骤(6)得到的ΔCT和步骤一得到的SdhB-H278R点突变的标准曲线，得到各个模板中SdhB-H278R所占比例的对数；进一步得到混合孢子悬浮液中HG-R的孢子数量占混合孢子数的比例。
检测结果见表3中第3行。
(5)计算预期值和检测值之间的线性相关性。
表3
预期值(％) 80％ 40％ 20％ 10％ 5％
DNA检测值(％) 85.95±1.45 44.64±0.69 22.24±0.85 11.86±0.60 6.40±0.24
孢子检测值(％) 116.45±4.83 48.39±6.15 26.38±4.59 11.86±0.98 6.83±1.43
结果表明，预期值为80％、40％、20％、10％和5％时，相应的DNA检测值依次为85.95％、44.64％、22.24％、11.86％和6.40％，孢子检测值依次为116.45％、48.39％、26.38％、11.86％和6.83％。预期值和检测值具有较高的相关性(DNA验证的R2＝0.9998，孢子悬浮液验证的R2＝0.9922)。由此可见，实施例2制备的成套试剂可以检测SdhB-H278R点突变的含量，具有较高的准确性。
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一种检测SdhB-H278R点突变的含量的方法及其专用成套试剂
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gtgaataccg ccagtccaa 19
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cagttgagaa tcgcgc 16
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gacctttagg cgaagttgc 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ctgcttgtag aagagcgtca t 21
<210> 5
<211> 244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gtgaataccg ccagtccaag gaggagcgca agaagctcga cggcctgtac gagtgcattc 60
tgtgcgcctg ctgctcaacg tcctgcccgt cgtactggtg gaaccaggag gagtacctcg 120
gccctgccgt gctgctccag tcgtaccgct ggatcgccga ttcgcgtgac gagaagacgg 180
cacaacgcca ggatgccctc aacaactcga tgagcatgta ccgctgccgc gcgattctca 240
actg 244

Claims (10)

1.成套试剂，包括特异引物对，所述特异引物对由引物B-H278R-2F和引物B-H278R-2R14组成；所述特异引物对在多主棒孢菌SdhB基因中的靶序列含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲为如下Y1)或Y2)：
Y1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
Y2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
2.如权利要求1所述成套试剂，其特征在于：
所述引物B-H278R-2F为如下X1)或X2)：
X1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
X2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物B-H278R-2R14为如下X3)或X4)：
X3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
X4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
3.如权利要求1或2所述成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括内参引物对；所述内参引物对由引物B-H278R-TY-F和引物B-H278R-TY-R组成；所述内参引物对在多主棒孢菌SdhB基因中的靶序列含有特异DNA片段乙；所述特异DNA片段乙为多主棒孢菌SdhB基因的保守区段，不发生任何形式的突变。
4.如权利要求3所述成套试剂，其特征在于：
所述引物B-H278R-TY-F为如下Z1)或Z2)：
Z1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
Z2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物B-H278R-TY-R为如下Z3)或Z4)：
Z3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
Z4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
5.权利要求1至4任一所述成套试剂的制备方法，为将权利要求1至4任一所述成套试剂中的所述引物B-H278R-2F和/或所述引物B-H278R-2R14和/或所述引物B-H278R-TY-F和/或引物B-H278R-TY-R分别单独包装。
6.权利要求1至4任一所述的成套试剂的应用，为如下(S1)-(S6)中至少一种：
(S1)检测SdhB-H278R点突变；
(S2)制备用于检测SdhB-H278R点突变的产品；
(S3)评价多主棒孢菌的啶酰菌胺抗性；
(S4)制备用于评价多主棒孢菌的啶酰菌胺抗性的产品；
(S5)检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量；
(S6)制备用于检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量的产品。
7.一种产品，其包括权利要求1至4任一所述的成套试剂。
8.权利要求7所述产品的应用，为如下(S1)或(S3)或(S5)中至少一种：
(S1)检测SdhB-H278R点突变；
(S3)评价多主棒孢菌的啶酰菌胺抗性；
(S5)检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量。
9.一种检测待测样本中SdhB-H278R点突变的含量的方法，包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：
所述步骤(a)包括如下步骤：
(a-1)以待测样本基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述特异引物对进行实时荧光定量PCR，得到待测样本CT1；
(a-2)以待测样本基因组DNA为模板，采用权利要求3或4中所述内参引物对进行实时荧光定量PCR，得到待测样本CT2；
(a-3)得到待测样本ΔCT；待测样本ΔCT＝待测样本CT1-待测样本CT2；
所述步骤(b)包括如下步骤：
(b-1)以SdhB-H278R点突变标准溶液为模板，采用权利要求1或2中所述特异引物对进行实时荧光定量PCR，得到标准溶液CT1；
(b-2)以SdhB-H278R点突变标准溶液为模板，采用权利要求3或4中所述内参引物对进行实时荧光定量PCR，得到标准溶液CT2；
(b-3)得到标准溶液ΔCT；标准溶液ΔCT＝标准溶液CT1-标准溶液CT2；
所述步骤(c)：根据所述SdhB-H278R点突变标准溶液中SdhB-H278R点突变的含量和相应的标准溶液ΔCT绘制标准曲线，将所述步骤(a-3)得到的待测样本ΔCT代入所述标准曲线，得到待测样本基因组DNA中SdhB-H278R点突变的含量。
10.一种检测待测样本基因组DNA是否存在SdhB-H278R点突变的方法，为G1)或G2)：
G1)以待测样本基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果PCR扩增产物中含有244bp的DNA片段，则待测样本基因组DNA中存在或疑似存在SdhB-H278R点突变；如果PCR扩增产物中不含有244bp的DNA片段，则待测样本基因组DNA中不存在或疑似不存在SdhB-H278R点突变；
G2)以待测样本基因组DNA为模板，采用权利要求1或2中所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果PCR扩增产物中含有序列表中序列5所示的DNA片段，则待测样本基因组DNA中存在或疑似存在SdhB-H278R点突变；如果PCR扩增产物中不含有序列表中序列5所示的DNA片段，则待测样本基因组DNA中不存在或疑似不存在SdhB-H278R点突变。
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