CN108085410B - 苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苗期草莓炭疽病的环介导等温扩增检测方法以及所用的环介导等温扩增引物；采用该方法能用于进行现场快速检测草莓种苗是否带菌。本发明还公开了一种检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP检测方法及所用的LAMP引物；采用该方法能特异性检测出对QoI类杀菌剂高抗的草莓胶孢炭疽菌。本发明具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对草莓炭疽病的苗期检测、抗药性流行预警具有重要的现实意义。

Description

苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及检测苗期草莓植株带菌及草莓胶孢炭疽菌抗QoI类杀菌剂的环介导等温扩增(LAMP)引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定、防治及抗药性早期预警的技术领域。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa)，蔷薇科，草莓属，是宿根性多年生常绿草本植物，在园艺学上属于浆果类水果。在世界各种浆果中，草莓的栽培面积和产量仅次于葡萄，居第二位。由于草莓收益高，见效快，而且含有丰富的蛋白质和维生素，受到生产者和消费者的喜爱。近年来，中国草莓种植面积迅速增长，2015年，中国成为最大的草莓生产国，总种植面积13万hm²，年产量达350万t(农业部2017年数据)。随着草莓消费量的快速上升，促进了草莓栽培产业的迅速发展，种植面积逐渐增加。然而由于产区相对固定，连作危害暴露，病害种类逐年增多，危害程度持续加重，导致经济效益下降。

草莓炭疽病已经成为了草莓的主要病害，并且在许多国家均有发生。我国草莓炭疽病主要分布在温暖的南方地区，浙江和上海发生较重。炭疽病可以发生在草莓生产上的整个生产周期中，特别是苗期和移栽阶段。胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)可导致草莓植株各个部位发生病变，而以短缩茎、匍匐茎、叶柄最易受害，湿度高时病部可见粉红色分生孢子堆，在发生严重情况下导致植物坍塌和死亡。草莓炭疽病菌具有典型潜伏侵染的特点，草莓可通过匍匐繁殖，一旦种苗带菌，到了适宜的条件，植株发病造成大量损失。草莓炭疽病主要发生在育苗期，该病发生适温28-32℃，属于高温型病害。筛选无菌种苗是防控草莓炭疽病是最经济有效的途径。在大部分地区，除种植一些无菌和高抗品种外，种植者都要依靠一些化学防治手段进行病害防控，但随着炭疽菌抗药性的不断增强，杀菌剂防治炭疽菌的效果都不太理想。

甲氧基丙烯酸酯(QoI)类杀菌剂是一类来源于具有杀菌活性的天然抗生素strobilurinA的杀菌剂，包括嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯等，具有广谱高效的抗菌活性。由于其具有独特的作用靶标，与其它现有杀菌剂不存在交互抗性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用于真菌线粒体呼吸链上的复合体III，通过与cytb基因编码的cytb的Qo位点结合来抑制呼吸链上的电子传递，进而影响呼吸作用阻碍病原真菌的合成，干扰细胞正常分裂和生长，进而造成菌体死亡。在甲氧基丙烯酸酯杀菌剂开发和使用早期，对其抗药性风险的研究认为这类药剂为中等抗药性风险。实际上在这类杀菌剂应用两年后就产生了抗药性，且防治效果下降。现已归为高抗药性风险。有报道称甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂醚菌酯对葡萄炭疽病的防效不理想，也有检测到对嘧菌酯高抗的瓜类炭疽菌的报道。植物病原菌对QoIs类杀菌剂产生抗药性的机理主要是病原菌cytb基因DNA序列上的G143A、F129L和G137R氨基酸残基发生单点突变或旁路氧化途径被启动。草莓炭疽病田间抗药性的产生的主要原因是点突变G143A，含有点突变G143A的菌株表现为高抗，而且该点突变引起的抗性水平稳定。

在植物病害的研究中，病原真菌的早期诊断和抗药性预警是植物病害防治中的关键步骤，对防治措施的制定具有极为重要的意义。植物病原真菌及其抗药性的检测主要依赖于传统的生物学分离纯化及形态学鉴定，抗药性检测则是在含药培养基上接种纯化病原菌，观察药剂对病原菌的生长抑制作用，来判断是否为抗性菌株，必要时运用分子检测等手段。传统检测抗药性检测，须首先通过组织或者单胞分离纯化病原菌，之后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗药性菌株。该方法结果准确可靠，但具有检测周期长的特点，不能达到及时监测的目的。基于聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)等一系列分子检测手段，也是体外扩增特定基因来检测抗药性突变体的最常用方法，检测需要精确的热循环仪器及繁琐的电泳过程，检测成本较高，且不能脱离实验室的环境进行检测。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是于2000年由Notomi等首次发明、报道的一种新型、方便快捷、灵敏度极高且廉价的核酸扩增方法，该方法引物设计原理是针对标靶序列300bp内的6个高度保守区域(F3c，F2c，Flc，B1，B2，B3区)特异性的设计4条引物。LAMP反应过程会析出大量焦磷酸根离子，其与反应液中的Mg²⁺结合，形成乳白色焦磷酸镁沉淀，焦磷酸镁的产生量与扩增产物量成正比关系，即可判断靶序列是否存在。因此，可以通过观察反应液中是否形成白色混浊来判断靶序列是否存在。同时，可在反应液中添加适当的核酸染料和金属离子指示剂，通过指示反应液颜色变化，来判断反应结果。常使用的指示剂有钙黄绿素(Calcein)、HNB(羟基萘酚蓝)和SYBR Green I。反应终止时，在LAMP反应管中加入SYBR GreenI或钙黄绿素(Calcein)后，如果含有扩增产物，反应体系颜色变绿，反之则保持橙色不变；若加入HNB，阳性反应结果会由紫色变成天蓝色。其中HNB(羟基萘酚蓝)和SYBR Green I检测敏感度极高，是钙黄绿素的10倍。从扩增原理可知，扩增过程中会产生大量大小不一的片段(即茎环DNA)，当用的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测时，会出现一系列呈梯状的电泳条带。因此，也可以利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，来判断是否进行扩增。

LAMP快速检测技术特异性高，4条引物针对6个不同的区域，任何一个区域不能匹配反应就无法进行，因此特别适合用于抗药性单点突变病原菌的检测，而且由于其简便、快速、准确、廉价、以及不需要特定实验仪器就能快速完成检测，所以更适用于在田间现场检测或基层部门应用，为生产中病原菌群体对药剂抗性风险发展的动态监测、抗药性植物病害的流行预测及植物病害的综合防控提供用药指导。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增引物及其检测方法；本发明还同时提供了一种用于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增引物，所述的环介导等温扩增引物组(LAMP引物组合物)由以下4条引物(上下游外引物，上下游内引物)组成：

TU-F3:CTCGACAGCAATGGAGTGT

TU-B3:TACTTGTTGCCGGAAGCC

TU-FIP:GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG

TU-BIP:ACCTTATAGCCCCCAGAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA。

本发明同时提供了一种用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，包含上述引物组合物：

LAMP检测体系(25μL)含有8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM TU-FIP 2.0μL、20μM TU-BIP 2.0μL、10μM TU-F3 0.5μL、10μM TU-B3 0.5μL、25mMMgCl₂5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)0～1μL、DNA模板，双蒸水补足至25μL。

本发明还提供如下一种用于抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP检测引物组合物，由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：

G143A-F3:GTATGTTTGTATGTTTTACCTTACG

G143A-B3:ACCTATAGTAGGAAAGAAATGCT

G143A-FIP:CTCCAATTCATGGGATAGCACTTATGGCAAATGTCATTATGATCA

G143A-BIP:TCGTTGAGTCAACAAACAATACAGTGCTGATAACCTAATGGTCCTA。

说明：由含草莓胶孢炭疽菌cytb基因143位点突变区域引入错配碱基的引物组构成。

本发明还同时提供了一种用于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP检测方法，包含上述引物组合物：

LAMP检测体系(25μL)含有：8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM G143A-FIP 2.0μL、20μM G143A-BIP 2.0μL、10μM G143A-F3 0.5μL、10μM G143A-B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)0～1μL、DNA模板，双蒸水补足至25μL。

利用上述提供的两个LAMP检测(25μL)方法进行扩增的检测，其扩增反应程序均为63℃，50～60min；80℃灭活10min。

作为本发明的环介导等温扩增方法的改进：利用检测反应体系进行扩增反应，扩增结果的分析和判定方法为选择以下任一：

方法一、在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，观察到蓝紫色判断为阴性。

方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，若无扩增条带则判断为阴性。

即，方法一，LAMP检测体系(25μL)中3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)的用量为1μL；方法二，LAMP检测体系(25μL)中3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)的用量为0μL。

本发明的发明方案具体如下：

1、引物的设计和筛选：

引物的筛选是检测的关键因素，首先通过测定胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和其他炭疽菌(Colletotrichum spp.)，对炭疽菌属不同种间β-tubulin基因序列进行比对分析，设定相应的引物设计规则，利用在线引物设计软件PrimerExplore V5设计LAMP引物，最终获得一套草莓胶孢炭疽菌特异性引物，包括F3、B3、FIP和BIP等4条引物，其序列为：

TU-F3:CTCGACAGCAATGGAGTGT

TU-B3:TACTTGTTGCCGGAAGCC

TU-FIP:GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG

TU-BIP:ACCTTATAGCCCCCAGAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA

对于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物组，从胶孢炭疽菌数据库中下载的cytb基因序列进行比对分析，设定相应的引物设计规则，在包含143位突变位点的200～300bp序列中，利用在线软件Primer Explore V4设计突变体LAMP引物。本发明根据突变位点，错配正向外引物FIP的3’端的3～5个碱基，以筛选出能与G143A突变型胶孢炭疽菌反应的引物为目的，使用未突变的敏感型胶孢炭疽菌DNA为模板，作为阴性对照；以G143A突变型胶孢炭疽菌DNA为模板，作为阳性对照，将模板加入由不同引物所配制反应液进行反应，反应温度设为63℃，50min，反应后观察反应液颜色变化。显色结果观察到含有抗QoI类杀菌剂胶孢炭疽菌DNA模板的反应液变成天蓝色，加入敏感型胶孢炭疽菌样品的反映管呈蓝紫色，则该引物符合实验要求，可继续下一步检测。取扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳检测作为验证，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到QoI类杀菌剂胶孢炭疽菌，无扩增条带则判断为阴性，即显示检测菌株为敏感型胶孢炭疽菌或所含胶孢炭疽菌未达检测限；若不能区分QoI类杀菌剂的突变型和敏感型胶孢炭疽菌，则该引物不符合实验要求，废弃。最终设计筛选出特异性检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物组，LAMP引物序列如下：

G143A-F3:GTATGTTTGTATGTTTTACCTTACG

G143A-B3:ACCTATAGTAGGAAAGAAATGCT

G143A-FIP:CTCCAATTCATGGGATAGCACTTATGGCAAATGTCATTATGATCA

G143A-BIP:TCGTTGAGTCAACAAACAATACAGTGCTGATAACCTAATGGTCCTA

2、提取待测样品基因组

(1)用于检测病原菌纯培养物时，采用真菌基因组DNA提取试剂盒(生工生物，上海)进行基因组DNA的提取。

(2)用于检测草莓植株中存在胶孢炭疽菌时，采用横向测流试(lateral-flowdevice,LFD购于Forsite Diagnostics Ltd.公司)，直接提取草莓植株组织DNA。在Extraction buffer(购于Forsite Diagnostics Ltd.公司)中裂解植物材料，随后将含有粗提取物的缓冲液加到LFD的释放垫，使其沿着装置毛细管层析到硝酸纤维素膜上(LFD膜)。可以将膜的一部分直接添加到LAMP扩增反应，来扩增LFD膜上的DNA。

具体如下：将草莓植物组织样品(100mg)加入含有五个钢球(直径5mm)和1mLExtraction buffer的塑料瓶中，剧烈振荡90s以破坏样品材料；得含有粗提取物的缓冲液(即，裂解液)。这种方法导致植物组织的充分破裂以释放DNA。从瓶中吸取缓冲液(70μL)转移到LFD膜上。在室温下干燥LFD装置，之后将LFD膜的一部分(≈5×1mm)直接添加到LAMP反应混合物中作为模板(简单的样品前处理后，裂解液中混合物DNA浓度为100-200ng/μL)。

3、LAMP反应体系

LAMP检测体系分别包含上述LAMP引物组合。

LAMP检测体系(25μL)为：8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μMFIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mMdNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)0～1μL、DNA模板，双蒸水补足至25μL。LAMP扩增反应程序为：63℃，50～60min；80℃，灭活10min。

在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，观察到蓝紫色判断为阴性。取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，若无扩增条带则判断为阴性。

4、LAMP检测的特异性

验证苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增(LAMP)检测引物为目的。利用上述描述的检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，对分别不同刺盘孢属(Colletotrichum spp.)菌株和草莓灰霉病菌DNA为模板，dd H₂O为阴性对照，测试本发明中草莓炭疽病LAMP检测体系的特异性，所用真菌包括胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、墨色刺盘孢菌(C.atramentarium)、辣椒炭疽菌(C.capsici)、平头炭疽菌(C.truncatum)、灰葡萄孢(B.cinerea)。检测结果见图1，在本发明中该LAMP检测可以特异性检测出草莓胶孢炭疽菌，而其他刺盘孢如黑色刺盘孢、平头炭疽菌和辣椒炭疽病菌均呈阴性反应，草莓灰霉病菌样品也无阳性反应，表明该LAMP检测具有较好的特异性。

验证检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物组为目的。利用利用上述描述的抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，检测G143A基因型草莓胶孢炭疽菌和敏感菌株，ddH2O为阴性对照。检测结果见图2，只有G143A基因型草莓胶孢炭疽菌样品产生阳性反应，敏感菌株样品和阴性对照没有阳性反应产生。

备注说明：G143A基因型为抗QoI类杀菌剂菌株，G143则为敏感菌株。

本发明通过对胶孢炭疽菌β-tubulin基因特异性序列进行LAMP引物设计，筛选出特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立可供该菌快速分子检测的技术，可用肉眼观察检测结果。利用LFD对植物组织进行前处理以提取核酸，联合LAMP检测可在1h内完成苗期草莓胶孢炭疽菌的现场检测。本发明通过对胶孢炭疽菌cytb基因中包含143位突变的200～300bp序列进行LAMP引物错配设计，筛选出特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立可供该菌抗药性快速分子检测的技术。反应过程简便(63℃恒温)、检测周期短(仅需50-60min)、特异性强、灵敏度高可用肉眼观察检测结果。

本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：

(1)、实用性好。植物病原真菌及其抗药性的检测主要依赖于传统的生物学分离纯化及形态学鉴定，从分离到鉴定长达1周，耗时长。传统的杀菌剂敏感性检测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为敏感型菌株，该方法检测周期长，基于PCR的分子检测，过程繁琐，耗时长，检测成本高昂，不能满足经济高效检测的需求。而LAMP反应只需在恒温(60-65℃)下进行，反应结束后可通过肉眼在常光下直接判断结果，能快速检测出病原菌抗药性，从而增加了其在田间检测的应用价值。

(2)、恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源如恒温水浴锅LAMP反应就可以完成，不需要昂贵的仪器设备，因而便于基层农业生产单位推广应用。LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

(3)、准确性高。传统的病原菌抗药性检测技术是在含药培养基上培养鉴定，鉴定方法耗时长、易受人为及环境等诸多因素的干扰。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都显著提高。

本发明中，根据草莓胶孢炭疽菌β-tubulin基因特异性片段序列设计引物，基于环介导恒温扩增技术，优化反应条件，采用横向测流试纸(lateral-flow device,LFD)在2min内完成植物样品的前处理进行核酸提取，建立了苗期草莓炭疽病潜伏侵染LAMP现场检测方法；本发明中根据胶孢炭疽菌cytb基因上143位密码子突变位点，引入错配碱基，筛选出一套用以检测高抗QoI类杀菌剂G143A基因型的草莓胶孢炭疽菌的环介导等温扩增(LAMP)引物组合物，建立了胶孢炭疽菌抗QoI类杀菌剂LAMP检测方法。LAMP检测技术具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对草莓炭疽病的苗期检测、抗药性流行预警具有重要的现实意义。

采用本发明的方法可先判定该植株是否患有草莓炭疽病；然后再判定是否可用用QoI类杀菌剂来杀灭该病菌。

综上所述，本发明公开了一种用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增引物及其应用，以胶孢炭疽菌β-tubulin基因特异性片段为靶标，设计并筛选出LAMP检测草莓胶孢炭疽菌的特异性引物，建立了LAMP检测方法，能快速现场检测草莓种苗是否带菌，有助于早期草莓炭疽病的预防和治疗研究；本发明同时公开了一种用于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物，基于胶孢炭疽菌cytb基因143位突变位点引入错配碱基，能特异性检测出对QoI类杀菌剂高抗的草莓胶孢炭疽菌，监测抗性发展情况，合理指导用药。本发明公开的一种苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测方法可在1h内完成现场检测。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为LAMP检测不同种刺盘孢属炭疽菌和灰霉病菌的结果；

a：LAMP显色变化图；b：琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000maker。

图2为G143A-LAMP检测不同敏感性胶孢炭疽菌的结果；

a：LAMP显色变化图；b：琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000maker；1：敏感菌株；2：G143A胶孢炭疽菌；3：ddH₂O；

图3为LAMP检测田间草莓炭疽病植株样品的结果；

a,b：田间患病植株形态；c：典型炭疽菌造成草莓植株维管束变色形态特征；d：分离到的草莓炭疽病菌在PDA培养基上的菌落形态特征；e：LAMP检测草莓植株短缩茎、茎秆、叶柄和叶片带菌情况，1-2：根部组织，3-4：茎秆组织，5-6：叶柄组织，7-8：叶片组织；

图4为通过LAMP和MIC检测来自不同地理区域的草莓炭疽病菌菌株G143A突变体的结果；

a：LAMP反应中的HNB颜色变化；1-5管：具有G143A突变的草莓炭疽病菌，6-10管对QoIs敏感性草莓炭疽病菌；b：MIC方法检测场样品，S表示QoIs敏感菌株，R表示QoI抗性菌株；

图5为苗期草莓炭疽病LAMP检测和PCR检测限比较结果；

a：灵敏度检测HNB反应显色图；b:LAMP灵敏度检测凝胶电泳检测图；c：PCR灵敏度检测凝胶电泳检测图；反应管1-8分别为十倍稀释的DNA，1-8管DNA浓度为：10,10×10^-1,10×10^-2,10×10^-3,10×10^-4,10×10^-5,10×10^-6ng/μl,10×10^-7ng/μl；

图6为G143A胶孢炭疽菌LAMP灵敏度和PCR比较结果；

a：灵敏度检测HNB反应显色图；b：LAMP灵敏度检测凝胶电泳检测图；c：PCR灵敏度检测凝胶电泳检测图；管1-8DNA浓度为:10,10×10^-1,10×10^-2,10×10^-3,10×10^-4,10×10^-5,10×10^-6,10×10^-7ng/μL。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方法做进一步详细描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中使用的主要试剂及仪器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，MgCl2(Sigma)，dNTPs，甜菜碱、ddH2O、DL2000DNA Maker(TaKaRa生物工程公司基因组)、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)，上海精宏实验仪器厂DK-8D型电加热恒温水浴锅。

实施例1、苗期草莓炭疽病LAMP检测对田间草莓植株样品的测试

对采集到20株集疑似患有炭疽病的草莓植株样品，分别在其有病状或没有明显病斑的短缩茎、茎秆、叶柄和叶等部位分别取样100mg，利用上述DNA提取方法，采用横向测流试(lateral-flow device,LFD)直接提取草莓植株组织DNA。在Extraction buffer中裂解植物材料，随后将含有粗提取物的缓冲液加到LFD的释放垫，使其沿着装置毛细管层析到硝酸纤维素膜上(LFD膜)。可以将膜的一部分直接添加到LAMP扩增反应，来扩增LFD膜上的DNA。将草莓植物组织样品(100mg)加入含有五个钢球(直径5mm)和1mL Extraction buffer的塑料瓶中，剧烈振荡90s以破坏样品材料。这种方法导致植物组织的充分破裂以释放DNA。从瓶中吸取裂解液(70μL)转移到LFD膜上。在室温下干燥LFD装置，之后将LFD膜的一部分(≈5×1mm)直接添加到LAMP反应混合物中作为模板(简单的样品前处理后，裂解液中混合物DNA浓度为100-200ng/μL)。

将LFD膜加入所建立的苗期草莓炭疽病潜伏侵染LAMP检测体系中。

短缩茎、茎秆、叶柄和叶分别进行如下检测：

LAMP检测体系(25μL)为：8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μMTU-FIP 2.0μL、20μM TU-BIP 2.0μL、10μM TU-F3 0.5μL、10μM TU-B3 0.5μL、25mMMgCl₂5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板(LFD膜)，双蒸水补足至25μL。

TU-F3:CTCGACAGCAATGGAGTGT

TU-B3:TACTTGTTGCCGGAAGCC

TU-FIP:GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG

TU-BIP:ACCTTATAGCCCCCAGAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA。

LAMP扩增反应程序为：63℃，50min；80℃，灭活10min。

以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，观察到蓝紫色判断为阴性。

或者，取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，若无扩增条带则判断为阴性。

同时，LAMP检测结果和组织分离结果相对比。组织分离方法如下：取植物组织，用75％乙醇浸泡30s，继而在2％的NaClO溶液中浸泡1min，最后用无菌水漂洗3次，用无菌滤纸将水分吸干后切成0.5cm²小块，置于PDA表面，在25℃恒温培养箱中黑暗培养3d，待菌丝长出后，挑取菌落边缘琼脂块到新的平板上进行纯化培养，继代纯化3次后置于PDA斜面中4℃保存备用。

利用上述植株样品前处理的方法，提取田间样品DNA进行LAMP检测；结果表明，在所采集到的20株疑似感染炭疽病草莓植株中，LAMP检测呈阳性的植株数为18株，并且在其短缩茎、茎秆和叶柄处均检测到阳性反应(图3)，叶片上都没有检测到阳性反应。其中大部分草莓植株的短缩茎靠近根部部分有维管束变色的现象，其他部位没有典型症状。组织分离结果表明，从18株LAMP检测呈阳性植株的短缩茎、茎秆和叶柄也都成功分离到炭疽菌菌株，菌株纯培养7d后，培养基表面有粉红色分生孢子堆和黑色产孢结构出现，是典型的胶孢炭疽菌的形态特点(图3)，此外，从植株叶片部都没有分离到胶孢炭疽病原菌。

说明：只要该植株的短缩茎、茎秆、叶柄和叶中的至少一个的检测结果呈阳性，即，判定该植株为阳性。

实施例2、G143A草莓炭疽病菌LAMP检测的准确度

以不同地区采集分离到的10株草莓炭疽病菌菌株DNA为模板(采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取)，进行炭疽病抗药性LAMP检测准确度分析。采用区分剂量法，测定所分离到草莓炭疽病菌菌株对两种药剂的抗性情况，每个菌株活化培养3d后，在培养皿同一生长圆周上打取生长一致的菌饼(5mm)，转移到含有0、5、20和100μg/mL的甲基硫菌灵的PDA培养基上，在25℃黑暗条件下培养3d后，观测菌丝生长情况。所测菌株不同表型可定义为(S)：最低抑菌浓度MIC<5μg/mL；(LR)：5μg/mL<MIC<20μg/mL；(MR)：20μg/mL<MIC<100μg/mL；(HR)：MIC>100μg/mL。

10株菌株的检测结果为：5株高抗，5株敏感。使用引物Hcytb-F(CCTTTTGGTGTTTTACTTATTTG)和Hcytb-F(TAATCGCCTACAGACTGG GTCAC)对10个草莓胶孢炭疽菌菌株cytb基因包含143位片段进行扩增。反应体系为25μL：12.5μL2×PCR Master，0.4μM引物Hcytb-F和Hcytb-F，1μL DNA模板，dd H₂O补足25μL，PCR程序是95℃5min；95℃30s，55℃30s和72℃40s，35个循环，接着72℃延伸10min。PCR产物送上海生工生物测序，测序结果经过Blast比对后，用Seqbuilder软件进行分析。测序结果表明，5株高抗菌株，其cytb基因143密码子均由GGT→GCT，导致第143位由甘氨酸突变为丙氨酸，而敏感菌株143位均未发生突变。

即，5株MIC>100μg/mL(高抗HR)；5株MIC<5μg/mL(敏感S)。

如图4所示，10株来自不同地区对QoI类杀菌剂不同敏感表型的草莓炭疽病菌菌株的DNA进行了LAMP检测，

LAMP检测体系(25μL)为：8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μMG143A-FIP 2.0μL、20μM G143A-BIP 2.0μL、10μM G143A-F3 0.5μL、10μM G143A-B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝(HNB)1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至25μL。

G143A-F3:GTATGTTTGTATGTTTTACCTTACG

G143A-B3:ACCTATAGTAGGAAAGAAATGCT

G143A-FIP:CTCCAATTCATGGGATAGCACTTATGGCAAATGTCATTATGATCA

G143A-BIP:TCGTTGAGTCAACAAACAATACAGTGCTGATAACCTAATGGTCCTA。

LAMP扩增反应程序为：63℃，50min；80℃，灭活10min。

以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，观察到蓝紫色判断为阴性。

或者，取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，若无扩增条带则判断为阴性。

其中5株对QoI类杀菌剂抗性的草莓炭疽病菌菌株均为G143A基因型。基于HNB的可视化结果(即，观察LAMP反应后是否变色)，表明LAMP检测到所有抗性菌株都是阳性反应的，敏感的菌株株显示阴性结果，与区分剂量法和PCR测序结果一致。

备注说明：此实施例中，也可以用实施例1所得的模板进行操作，即，在实施例1检测是否有菌后之后，直接利用同样的模板进行实施例2的检测，判断检测到的菌是否有抗性。

实施例3、LAMP检测的灵敏度

对于苗期草莓炭疽病LAMP检测灵敏度测试，10倍梯度稀释胶孢炭疽菌DNA模板，使DNA浓度为10ng/μL～10×10^-7ng/μL，分别以其为模板，进行LAMP和PCR扩增。

PCR扩增采用引物TU-F3和TU-B3，反应体系为25μL：12.5μL 2×PCR Master，0.4μM引物Hcytb-F和Hcytb-F，1μL DNA模板，dd H2O补足25μL，PCR程序是95℃5min；95℃30s，55℃30s和72℃30s，35个循环，接着72℃延伸10min。

PCR，可参照已公开发表于《European Journal of Plant Pathology》的Detection and characterization of benzimidazole resistance of Botrytiscinerea in greenhouse vegetables中描述的方法进行。

LAMP的扩增体系和程序，同实施例1。

对比LAMP和PCR的灵敏度，结果表明，DNA模板的浓度大于或等于10×10^-2ng/μl时，反应结束后反应管中HNB颜色发生明显变化(由紫色变成天蓝色)，凝胶电泳显示均有典型的LAMP梯形条带产生；而当DNA浓度小于10×10^-2ng/μl时，反应管无颜色变化，也无条带产生，说明本实验中草莓炭疽病LAMP检测其最低检测限为10×10^-2ng/μl；PCR扩增结果显示，DNA模板的浓度大于或等于10×10^-1ng/μl时，有扩增条带，DNA浓度小于10×10^-1ng/μl时，无扩增条带，说明PCR的最低检测限为10×10^-1ng/μl。由此，结果表明LAMP检测比常规PCR高10倍(图5)。

对于草莓炭疽病抗药性G143A基因型LAMP检测，10倍梯度稀释的提取的G143A胶孢炭疽菌DNA，使DNA浓度为10，10×10^-1，10×10^-2，10×10^-3，10×10^-4，10×10^-5，10×10^-6，10×10^-7ng/μL。分别以其为模板，进行LAMP和PCR扩增，对比LAMP和PCR的灵敏度。

PCR扩增采用引物G143A-F3和G143A-B3，反应体系为25μL：12.5μL 2×PCRMaster，0.4μM引物Hcytb-F和Hcytb-F，1μL DNA模板，dd H2O补足25μL，PCR程序是95℃5min；95℃30s，55℃30s和72℃30s，35个循环，接着72℃延伸10min。对比LAMP和PCR的灵敏度，结果表明，DNA模板的浓度大于或等于10×10^-3ng/μl时，反应结束后反应管中HNB颜色发生明显变化(由紫色变成天蓝色)，凝胶电泳显示均有典型的LAMP梯形条带产生；而当DNA浓度小于10×10^-3ng/μl时，反应管无颜色变化，也无条带产生，说明本实验中草莓炭疽病LAMP检测其最低检测限为10×10^-3ng/μl；PCR扩增结果显示，DNA模板的浓度大于或等于10×10^-1ng/μl时，有扩增条带，DNA浓度小于10×10^-2ng/μl时，无扩增条带，说明PCR的最低检测限为10×10^-2ng/μl。由此，结果表明本试验中，G143A突变型LAMP检测其最低检测限为10×10^-3ng/μL，PCR的最低检测限为10×10^-2ng/μL。LAMP检测比常规PCR高10倍(图6)。

备注说明：LAMP的扩增体系和程序，同实施例2。

PCR，参照已公开发表于《European Journal of Plant Pathology》的Detectionand characterization of benzimidazole resistance of Botrytis cinerea ingreenhouse vegetables中描述的方法进行。

对比例1-1、

将用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增引物改成为如下所述：

TU-F3-1:CTCGACAGCAATGGAGTTC

TU-B3-1:AGCTTGTTGCCGGAAGCC

TU-FIP:GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG

TU-BIP:ACCTTATAGCCCCCAGAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA。

对比例1-2、

将用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增引物改成为如下所述：

TU-F3:CTCGACAGCAATGGAGTGT

TU-B3:TACTTGTTGCCGGAAGCC

TU-FIP-1:GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTAC

TU-BIP-1:TTCTTATAGCCCCCAGAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA。

按照对比例1-1、对比例1-2所述引物，按照本发明的上述方法对胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、墨色刺盘孢菌(C.atramentarium)、辣椒炭疽菌(C.capsici)、平头炭疽菌(C.truncatum)、灰葡萄孢(B.cinerea)进行检测，所得结果为：反应后观察反应管均无颜色变化，没有阳性结果产生。结果表明该引物组构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出草莓胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，即使将模板的浓度增加至1000ng/μL仍然无法产生阳性反应，无法有效区分。

对比例2-1、

将用于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物改成为如下所述：

G143A-F3-1:GTATGTTTGTATGTTTTACCTTAAC

G143A-B3-1:GTCTATAGTAGGAAAGAAATGCT

G143A-FIP:CTCCAATTCATGGGATAGCACTTATGGCAAATGTCATTATGATCA

G143A-BIP:TCGTTGAGTCAACAAACAATACAGTGCTGATAACCTAATGGTCCTA。

对比例2-2、

将用于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物改成为如下所述：

G143A-F3:GTATGTTTGTATGTTTTACCTTACG

G143A-B3:ACCTATAGTAGGAAAGAAATGCT

G143A-FIP:CTCCAATTCATGGGATAGCACTTATGGCAAATGTCATTATGAGCT

G143A-BIP:ACTTTGAGTCAACAAACAATACAGTGCTGATAACCTAATGGTCCTA。

按照对比例2-1、对比例2-2所述引物利用上述描述的抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，检测G143A基因型草莓胶孢炭疽菌和敏感菌株，ddH₂O为阴性对照。反应后观察反应管均无颜色变化，没有阳性结果产生。结果表明该引物组构成的环介导等温扩增体系不能有效检测出G143A基因型草莓胶孢炭疽菌，即使将模板的浓度增加至1000ng/μL仍然无法产生阳性反应，无法有效区分。

最后，还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgacagca atggagtgt 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacttgttgc cggaagcc 18

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagctcaga ggtgccgttg ctggccacat tggtggttg 39

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accttatagc ccccagagtg cagggtagga gcgaaggtca 40

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtatgtttgt atgttttacc ttacg 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acctatagta ggaaagaaat gct 23

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccaattca tgggatagca cttatggcaa atgtcattat gatca 45

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgttgagtc aacaaacaat acagtgctga taacctaatg gtccta 46

Claims (2)

1.用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增检测方法，其特征在于：该方法能进行现场快速检测草莓种苗是否带菌；

用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增引物由以下4条引物组成：

TU-F3:CTCGACAGCAATGGAGTGT

TU-B3:TACTTGTTGCCGGAAGCC

TU-FIP:GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG

TU-BIP:ACCTTATAGCCCCCAGAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA；

LAMP检测体系为：8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM TU-FIP2.0μL、20μM TU-BIP 2.0μL、10μM TU-F3 0.5μL、10μM TU-B3 0.5μL、25mM MgCl₂ 5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝0～1μL、DNA模板，双蒸水补足至25μL；

LAMP扩增反应程序为：63℃，50～60min；80℃，灭活10min；

以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，观察到蓝紫色判断为阴性；

或者，取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，若无扩增条带则判断为阴性。

2.用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP检测方法，其特征在于：基于如权利要求1所述用于检测苗期草莓炭疽病潜伏侵染的环介导等温扩增检测方法所得的结果，该方法能特异性检测出对QoI类杀菌剂高抗的草莓胶孢炭疽菌；

用于检测抗QoI类杀菌剂G143A基因型草莓胶孢炭疽菌的LAMP引物由以下4条引物组成：

G143A-F3:GTATGTTTGTATGTTTTACCTTACG

G143A-B3:ACCTATAGTAGGAAAGAAATGCT

G143A-FIP:CTCCAATTCATGGGATAGCACTTATGGCAAATGTCATTATGATCA

G143A-BIP:TCGTTGAGTCAACAAACAATACAGTGCTGATAACCTAATGGTCCTA；

LAMP检测体系为：8U Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM G143A-FIP2.0μL、20μM G143A-BIP 2.0μL、10μM G143A-F3 0.5μL、10μM G143A-B3 0.5μL、25mM MgCl₂5.0μL、10mM dNTPs 2.5μL、5M甜菜碱3.0μL、3.75mM羟基萘酚蓝0～1μL、DNA模板，双蒸水补足至25μL；

LAMP扩增反应程序为：63℃，50～60min；80℃，灭活10min；

以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，观察到蓝紫色判断为阴性；

或者，取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，若无扩增条带则判断为阴性。

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