CN111893208A - 一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的pcr引物及定量检测方法 - Google Patents

一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的pcr引物及定量检测方法 Download PDF

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Abstract

一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物及定量检测方法，根据胶孢炭疽菌生理小种的cutinase基因共有序列设计，包括两条引物Cfcut1和Cfcut2，扩增产物115bp；利用本发明，无需经过病原菌的分离、培养，可以对真菌基因组DNA或田间样本DNA进行PCR检测，扩增效率高，特异性好，引物的扩增效率为99.47％，快速检测、鉴定引起草莓炭疽病的胶孢炭疽菌复合种；通过实时荧光定量PCR，可对样本中的胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量检测，及时、准确预测炭疽病的发生时期、流行强度，提早防治甚至避免炭疽病的发生，可以降低因农药使用所带来的负面影响，为炭疽病的综合防治提供依据。

Description

一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物及定量检测方法
技术领域
本发明属于植物病菌检测领域，具体涉及一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物及定量检测方法。
背景技术
草莓属于蔷薇科，草莓属，多年生草本植物，为我国传统的优秀果品之一，草莓作为目前上海地区园艺作物中的特色优势产业，经济效益十分显著，市郊面积常年维持在4万亩左右。然而，草莓病害一直制约草莓产业的发展，草莓炭疽病作为草莓生产上的主要病害之一，近年来的发生危害有上升趋势。
“草莓炭疽病”指所有炭疽菌属真菌引起的草莓病害，己报道的草莓炭疽病病原菌主要有胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)两种，在我国，草莓炭疽病报道最多的是胶孢炭疽菌复合种。在我国草莓生产中，草莓炭疽病危害严重的年份直接导致减产50～80％，甚至绝产。因此，草莓炭疽病在上海乃至世界各地的草莓主产区一直是制约草莓产业持续稳定发展的主要瓶颈。
采用无病种苗可以避免草莓炭疽病的发生。育苗基地多选在无草莓炭疽病发生的地方，但随着草莓种植规模的扩大，病害的传播范围越来越广，这种方法实施的难度越来越大。因此，种苗检疫在草莓种植过程中是必不可少的，但是，由于草莓炭疽菌具有潜伏侵染的特征，带菌的种苗并不表现症状，这就给检测带来了难度。
传统的炭疽菌鉴定方法需要经过病原菌的分离、培养，进一步依据其培养特征和微观形态结构来进行判断，耗时耗力；并且，依据标记基因ITS、β-tubulin、ACT、CAL、CHS、GAPDH等的PCR特异性检测具有信息错误率高、无法实现种内关系区分等特点，而基于此的多基因联合建树系统进化分析虽然被公认为炭疽菌鉴定的标准操作，但由于其复杂性和消耗时间长，无法应用于田间的快速检测。
目前该病的最主要防治手段仍是喷施化学农药，随着施药量的增加，出现了如果实品质下降、环境污染、病菌抗性产生等一系列问题。因此，开展草莓炭疽病预测预报研究对于科学防治草莓炭疽病具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物及定量检测方法，能够快速检测、鉴定引起我国草莓炭疽病的主要炭疽菌种类胶孢炭疽菌复合种(Colletotrichum gloeosporioides species complex)，无需经过病原菌的分离、培养等步骤，节省时间和成本，并且可通过实时荧光定量PCR的方法对样本中的胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量检测，快速准确，进一步为作物材料的抗性评价和筛选育种工作提供良好的途径。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物，根据胶孢炭疽菌生理小种C.fructicola、C.siamense和C.aenigma对应的35个菌株的cutinase基因共有序列设计，所述共有序列如SEQ ID NO.1所示，包括两条引物Cfcut1和Cfcut2，扩增产物115bp，引物核苷酸序列如下：
Cfcut1：5’-AGAACCAGATCAAGGGCGTCGTG-3’；
Cfcut2：5’-GCGTCCGCAATGTCGCAGTA-3’。
一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR试剂盒，包括：上述引物Cfcut1和Cfcut2，终浓度各为200～300nM。
本发明提供一种草莓胶孢炭疽菌的PCR快速检测方法，以草莓样品基因组DNA为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行PCR扩增，退火温度为60℃，反应结束后通过琼脂糖凝胶检测扩增产物，根据产物片段大小判断草莓胶孢炭疽菌的有无，若存在115bp的扩增产物条带，则样品中含有该病原菌。
优选地，所述样品DNA为真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA。
一种对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，包括以下步骤：
1)以10倍等浓度梯度稀释后的胶孢炭疽菌标准品质粒pGEM-T-cut系列为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，获得对应标准品的循环数Cq值，利用获得的循环数Cq值和相应的质粒模板拷贝数作图，获得标准曲线方程；
2)以草莓样品基因组DNA为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，95℃2分钟；95℃15秒，60℃10秒，40个循环；反应结束后，获得样品的循环数Cq值，代入标准曲线方程，计算样品中出胶孢炭疽菌的起始拷贝数。
进一步，所述标准曲线方程为Y＝-3.3348(log10 X)+34.726，Y为循环数Cq值，X为起始拷贝数，相关系数R2值0.9992。
进一步，所述实时荧光定量PCR扩增中，引物Cfcut1和Cfcut2的扩增效率为99.47％。
又，所述实时荧光定量PCR扩增程序采用两步法，退火温度为60℃，扩增体系中引物浓度各为100nM。
本发明提供引物Cfcut1和Cfcut2在炭疽菌检测中的应用。
本发明根据田间草莓上常见的炭疽菌种类，选取胶孢炭疽菌的三个常见生理小种C.fructicola、C.siamense和C.aenigma，通过对分离获得的多个炭疽菌菌株样本进行基因扩增、测序、序列比对，找出其在cutinase基因的3’端存在一段共有核酸序列，针对该共有序列，设计了特异性引物对Cfcut1和Cfcut2，以待测物的基因组DNA为模板，用由Cfcut1和Cfcut2组成的引物对进行PCR扩增，如扩增产物中具有115bp的核苷酸条带，则该待测物中含有草莓胶孢炭疽菌，可以快速实现对草莓炭疽菌和田间草莓样本的鉴定工作，节省时间和成本，可以广泛用于我国田间草莓炭疽菌的鉴定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
传统的炭疽菌鉴定方法需要经过病原菌的分离、培养，进一步依据其培养特征和微观形态结构来进行判断，耗时耗力，利用本发明，无需经过病原菌的分离、培养、联合建树系统进化分析，可以直接对真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA进行PCR，扩增效率高，特异性好，引物Cfcut1和Cfcut2的扩增效率为99.47％，快速实现对炭疽菌和田间样本的鉴定工作，节省时间和成本。
利用本发明，通过实时荧光定量PCR，可对样本中的胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量检测，进一步为作物材料的抗性评价和筛选育种工作提供良好的途径，及时、准确预测由胶孢炭疽菌引起的草莓炭疽病的发生时期、流行强度，提早防治甚至避免炭疽病的发生，可以降低因农药使用所带来的负面影响，为炭疽病的综合防治提供依据。
附图说明
图1为本发明实施例3中草莓炭疽菌常见优势种和其他几种病原真菌基因组DNA样品的电泳检测结果，泳道1：C.aenigma，C.gloeosporioides species complex；泳道2：C.fructicola，C.gloeosporioides species complex；泳道3：C.siamense，C.gloeosporioides species complex；泳道4：C.gloeosporioide，C.gloeosporioidesspecies complex；泳道5：C.nymphaeae，C.acutatum species complex；泳道6：Botrytiscinerea；泳道7：Sphaerotheca macularis；泳道8：Pestalotiopsis clavispora；泳道9：草莓基因组DNA；泳道10：ddH2O；泳道11：DL2000 marker。
图2为本发明实施例3中全国各地分离获得的48个胶孢炭疽菌菌株的基因组DNA的电泳检测结果，其中包括24个C.fructicola菌株、22个C.siamense菌株和2个C.aenigma菌株，胶图最右侧泳道为DL2000marker。
图3为本发明实施例4中无明显症状和有典型症状的田间草莓炭疽病样本电泳检测结果，其中，泳道1：DL2000 marker；泳道2：无明显炭疽病症状草莓炭疽病样本；泳道3：有典型症状的草莓炭疽病样本。
图4为本发明实施例5中人工接种了胶孢炭疽菌C.fructicola的草莓果实和叶片基因组DNA中所含病原菌的起始拷贝数分析。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明实施例中炭疽菌菌丝基因组DNA提取采用Omega Bio-Tek公司的E.Z.N.ATMfungal DNA mini kit试剂盒(货号D3390)，操作流程参照说明书。
实施例1一种草莓胶孢炭疽菌的PCR快速检测方法
1、引物设计
为了尽量大范围地检测出我国田间草莓上的胶孢炭疽菌复合种，将搜集自全国不同地区的35个胶孢炭疽菌菌株的cutinase基因序列分别进行扩增、测序，序列比对后，选取其在基因3’端具有的一段共同的核酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
选择的保守序列位于cutinase基因3’端，为我国草莓胶孢炭疽菌的生理小种所特有，该基因编码的角质酶参与协助炭疽菌的入侵过程，推测可能与胶孢炭疽菌在我国的高致病性相关，通过该片段可实现对我国不同地区的特化生理小种的扩增鉴定工作。
根据胶孢炭疽菌复合种的cutinase基因共有序列，设计特异性引物对Cfcut1和Cfcut2，扩增目的核酸条带的大小为115bp，引物对具体序列如下：
Cfcut1：5’-AAGAACCAGATCAAGGGCGTCGTG-3’；
Cfcut2：5’-GCGTCCGCAATGTCGCAGTAGA-3’。
靶序列为我国草莓常见胶孢炭疽菌3个生理小种C.fructicola，C.siamense和C.aenigma的35个分离菌株的cutinase基因序列保守区域，目前已验证该引物对能够检测出从全国不同地区分离到的胶孢炭疽菌样本。
2、提取生物样本基因组DNA
生物样本的提取采用简化后的CTAB法，具体操作如下：
(1)称取约50mg待测样本，液氮迅速研磨后加入800μL CTAB，振荡混匀，60℃金属浴60分钟，每隔20分钟混匀1次；
(2)加入800μL CIA溶液(氯仿：异戊醇＝24：1)，200转/分钟摇床晃动20分钟；
(3)13000rpm离心5分钟，吸取上清800μL，加入等体积氯仿后振荡混匀；
(4)13000rpm离心5分钟，吸取上清，加入等体积CIA振荡混匀；
(5)13000rpm离心5分钟，吸取上清(400～500μL)，加入二倍体积的无水乙醇混匀，放入-20℃冰箱30分钟；
(6)13000rpm离心5分钟，弃上清，600μL 75％乙醇洗涤1次；
(7)13000rpm离心5分钟，弃上清，65℃烘箱烘5～10分钟保存于-20℃，或加入100μL～150μL无菌水溶解，测DNA浓度，稀释成100ng/μL用于后续PCR扩增。
3、常规PCR反应：
以真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA为模板，反应体系如下：
DNA模板≤50ng，dNTPs(2.5mM each)0.4μL，引物Cfcut1(10μM)0.2μL，引物Cfcut2(10μM)0.2μL，10×PCR buffer1μL，rTaq聚合酶0.1μL，补双蒸水至总体积为10μL。
反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃终末延伸7分钟，产物4℃保存。
4、电泳检测：
取10μL PCR产物经2％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中电泳30min,电压设为110V，结束后UV灯下观察成像情况。
胶孢炭疽菌DNA样品中均能够观察到一条115bp的核酸条带，其它病原真菌和草莓基因组DNA中则没有核酸条带；在被胶孢炭疽菌感染的草莓样品中也可观察到该115bp大小的核酸条带。
实施例2一种对草莓炭疽病病原菌胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法
1、制定标准曲线
以10倍等浓度梯度稀释后的标准品质粒pGEM-T-cut系列为模板，浓度分别为3.28×101copies/μL、3.28×102copies/μL、3.28×103copies/μL、3.28×104copies/μL、3.28×105copies/μL，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，获得对应标准品的循环数Cq值，利用获得的循环数Cq值和相应的质粒模板拷贝数作图，获得标准曲线方程Y＝-3.3348(log10 X)+34.726，Y为循环数Cq值，X为起始拷贝数，相关系数R2值0.9992，引物扩增效率为99.47％。
其中，实时荧光定量PCR反应体系为：稀释后的标准品质粒1μL，2×TB GreenTMPremix Ex TaqTM II 10μL，引物Cfcut1(10μM)0.2μL，引物Cfcut2(10μM)0.2μL，补双蒸水至总体积为20μL。
其中，2×TB GreenTM Premix Ex TaqTM II是Takara公司产品，货号RR820。
反应程序为：95℃2分钟；95℃15秒，60℃10秒，40个循环。
2、待测样品起始拷贝数计算：
模板可为真菌基因组DNA或田间样本基因组DNA，以待测样品基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应结束后以获得的Cq循环数为Y值，代入标准曲线方程Y＝-3.3348(log10 X)+34.726，计算得出该病原菌的起始拷贝数X。
实施例3
以4种胶孢炭疽菌生理小种C.aenigma、C.fructicola、C.siamense和C.gloeosporioide，草莓尖孢炭疽菌C.nymphaeae、其它三种田间常见的病原真菌Botrytiscinerea、Sphaerotheca macularis和Pestalotiopsis clavispora、健康草莓基因组DNA分别为样品，进行检测。
1、真菌基因组DNA提取：
(1)取新鲜菌丝100mg至离心管中，迅速加入FG1缓冲液600μL，剧烈震荡使菌丝充分散开，65℃孵育10分钟，期间颠倒混匀两次；
(2)加入140μL FG2缓冲液震荡混匀后≥10000g离心10分钟，小心吸取上清约600μL转移至新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇后混匀；
(3)10000g离心2分钟后弃上清，加入65℃预热好的300μL无菌去离子水溶解沉淀，加入4μL RNase酶混匀；
(4)加入150μL FG3缓冲液混匀后，加入300μL无水乙醇吹打混匀，将液体转移至DNA吸附柱中，10000g离心1分钟，弃滤液和收集柱；
(5)将吸附柱放入新的2mL收集柱中，加入700μL DNA漂洗液，10000g离心1分钟，弃滤液，重复此步骤1次；
(6)以最大速度空转离心2分钟，将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入65℃预热好的无菌去离子水100μL，室温静置2-3分钟。10000g离心1分钟收集DNA，保存于-20℃备用。
2、常规PCR反应：
以真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA为模板，反应体系如下：
DNA模板0.3～0.5μL(50μg)，dNTPs(2.5mM each)0.4μL，引物Cfcut1(10μM)0.2μL，引物Cfcut2(10μM)0.2μL，10×PCR buffer 1μL，rTaq聚合酶0.1μL，补双蒸水至总体积为10μL。
反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃终末延伸7分钟，产物4℃保存。
3、电泳检测：
取10μL PCR产物经2％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中电泳30分钟,电压设为110伏，结束后UV灯下观察成像情况，参见图1。
4、结果分析：
由图1可见，只有4种胶孢炭疽菌生理小种的基因组DNA中均能够观察到一条115bp的核酸条带，草莓尖孢炭疽菌、三种其它病原真菌、草莓基因组DNA和负对照双蒸水中则没有核酸条带。
对全国各地分离获得的48个胶孢炭疽菌菌株基因组进行PCR检测，其中包括24个C.fructicola菌株、22个C.siamense菌株和2个C.aenigma菌株，电泳结果见图2。
由图2可见，全国各地分离获得的48个胶孢炭疽菌菌株的基因组DNA中均能够观察到一条115bp的核酸条带。
实施例4检测无明显症状和有典型症状的田间草莓炭疽病样本
1、草莓样本基因组DNA提取：
(1)称取约50mg样本，液氮迅速研磨后加入800μL CTAB，振荡混匀，60℃金属浴60分钟，每隔20分钟混匀1次；
(2)加入800μL CIA溶液(氯仿：异戊醇＝24：1)，200转/分钟摇床晃动20分钟；
(3)13000rpm离心5分钟，吸取上清800μL，加入等体积氯仿后振荡混匀；
(4)13000rpm离心5分钟，吸取上清500μL，加入等体积CIA振荡混匀；
(5)13000rpm离心5分钟，吸取上清400μL，加入二倍体积的无水乙醇混匀，放入-20℃冰箱30分钟；
(6)13000rpm离心5分钟，弃上清，600μL 75％乙醇洗涤1次；
(7)13000rpm离心5分钟，弃上清，65℃烘箱烘5～10分钟保存于-20℃，或加入100μL的无菌水溶解，测DNA浓度，稀释成100ng/μL用于后续PCR扩增。
2、常规PCR反应：
以混合样本基因组DNA为模板，反应体系如下：
DNA模板0.5μL(50μg)，dNTPs(2.5mM each)0.4μL，引物Cfcut1(10μM)0.2μL，引物Cfcut2(10μM)0.2μL，10*PCR buffer 1μL，rTaq聚合酶0.1μL，双蒸水7.6μL，反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃终末延伸7分钟，产物4℃保存。
3、电泳检测：
取10μL PCR产物经2％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中电泳30分钟,电压设为110伏，结束后UV灯下观察成像情况，参见图2。
4、结果分析：
由图3可见，无论是否有肉眼可见的典型炭疽病症状，在被胶孢炭疽菌感染的草莓样品中均可观察到115bp大小的核酸条带。
实施例5对人工接种了胶孢炭疽菌C.fructicola的草莓果实和叶片进行检测及绝对定量分析
1、草莓样本基因组DNA提取：
(1)分别称取约50mg人工接种了胶孢炭疽菌C.fructicola的草莓果实和叶片的样本，液氮迅速研磨后加入800μL CTAB，振荡混匀，60℃金属浴60分钟，每隔20分钟混匀1次；
(2)加入800μL CIA溶液(氯仿：异戊醇＝24：1)，200转/分钟摇床晃动20分钟；
(3)13000rpm离心5分钟，吸取上清800μL，加入等体积氯仿后振荡混匀；
(4)13000rpm离心5分钟，吸取上清500μL，加入等体积CIA振荡混匀；
(5)13000rpm离心5分钟，吸取上清400μL，加入二倍体积的无水乙醇混匀，放入-20℃冰箱30分钟；
(6)13000rpm离心5分钟，弃上清，600μL 75％乙醇洗涤1次；
(7)13000rpm离心5分钟，弃上清，65℃烘箱烘5～10分钟保存于-20℃，或加入100μL的无菌水溶解，测DNA浓度，稀释成100ng/μL用于后续PCR扩增。
2、实时荧光定量PCR反应：
分别以人工接种了胶孢炭疽菌C.fructicola的草莓果实和叶片的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为：DNA模板1μL，2×TB GreenTM Premix Ex TaqTM II10μL，引物Cfcut1(10μM)0.2μL，引物Cfcut2(10μM)0.2μL，双蒸水8.6μL。
反应程序为：95℃2分钟；95℃15秒，60℃10秒，40个循环。
3、起始拷贝数计算：
反应结束后，获得样品的循环数Cq值，Y＝Average Cq(叶片)＝25.57，Y＝AverageCq(果实)＝23.59；
代入标准曲线方程Y＝-3.3348(log10 X)+34.726，计算得出胶孢炭疽菌C.fructicola的起始拷贝数X：X(果实)＝2184.39拷贝，X(叶片)＝556.66拷贝。
4、结果分析：
由图4可见，人工接种了胶孢炭疽菌C.fructicola的草莓果实和叶片的基因组DNA样品中均检测到胶孢炭疽菌的存在，并且对应的生物量分别约为2184.39拷贝和556.66拷贝。
可见，利用本发明，可对真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA直接进行PCR反应，获得定性结果，并可进一步通过实时荧光定量PCR反应，获得对应的胶孢炭疽菌的绝对定量结果。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物及定量检测方法
<130> 2011159
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 184
<212> DNA
<213> Colletotrichum gloeosporioides species complex
<400> 1
agcaccacgt caagaaccag atcaagggcg tcgtgctctt cgggtacacc aagaacctgc 60
agaacctggg ccgcatcccc aacttcgaga cgtccaagac cgaggtctac tgcgacattg 120
cggacgcggt ctgctacggc accctgttca tcctgccggc gcactttttg taccagactg 180
atgc 184

Claims (9)

1.一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物，其特征在于，根据胶孢炭疽菌生理小种C.fructicola、C.siamense和C.aenigma对应的多个菌株的cutinase基因共有序列设计引物，包括两条引物Cfcut1和Cfcut2，扩增产物115bp，所述共有序列如SEQ ID NO.1所示，引物核苷酸序列如下：
Cfcut1：5’-AGAACCAGATCAAGGGCGTCGTG-3’；
Cfcut2：5’-GCGTCCGCAATGTCGCAGTA-3’。
2.一种快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR试剂盒，其包括权利要求1所述的两条引物Cfcut1和Cfcut2，终浓度各为200～300nM。
3.一种草莓胶孢炭疽菌的PCR快速检测方法，以样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物Cfcut1和Cfcut2进行PCR扩增，退火温度为60℃，反应结束后通过琼脂糖凝胶检测扩增产物，根据产物片段大小判断胶孢炭疽菌的有无，若存在115bp的扩增产物条带，则样品中含有胶孢炭疽菌。
4.根据权利要求3所述草莓胶孢炭疽菌的PCR快速检测方法，其特征在于，所述样品DNA为真菌基因组DNA或草莓样本基因组DNA。
5.一种对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的快速检测方法，包括以下步骤：
1)以10倍等浓度梯度稀释的胶孢炭疽菌标准品质粒系列为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，获得对应标准品的循环数Cq值，利用获得的循环数Cq值和相应的质粒模板拷贝数作图，获得标准曲线方程；
2)以草莓样品基因组DNA为模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2进行实时荧光定量PCR扩增，95℃2分钟；95℃15秒，60℃10秒，40个循环；反应结束后，获得样品的循环数Cq值，代入标准曲线方程，计算出样品中的胶孢炭疽菌的起始拷贝数。
6.根据权利要求5所述对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，其特征在于，所述标准曲线方程为Y＝-3.3348(log10X)+34.726，Y为循环数Cq值，X为起始拷贝数，相关系数R2值0.9992。
7.根据权利要求5所述对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增中，引物Cfcut1和Cfcut2的扩增效率为99.47％。
8.根据权利要求5所述对草莓胶孢炭疽菌生物量进行绝对定量的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增程序采用两步法，退火温度为60℃，扩增体系中引物浓度各为100nM。
9.如权利要求1所述快速检测草莓胶孢炭疽菌的PCR引物在草莓炭疽菌检测中的应用。
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