CN110878371A - 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物lamp快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP快速检测方法，本发明针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因保守序列的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温61℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性；LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30‑50%；反应结束后，可直接通过肉眼观察反应管颜色变化，或通过凝胶电泳判断检测结果；该技术对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的检测特异性强，具有快速、高效、仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说本发明涉及一种利用环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术检测杏褪绿卷叶植原体的技术领域。
背景技术
杏褪绿卷叶病(apricot chlorotic leaf roll, ACLR)是危害杏树的一种高致死性植原体病害。中国，欧洲和北美均将其列入进境植物检疫性有害生物名录。该病害于1973年首次在法国杏树上发现，之后陆续在欧洲其他核果类树种如扁桃、欧洲李、樱桃、桃和油桃等多种果树上发现，成为影响欧洲核果类果树商业化栽培的主要病害。尽管不同国家所报道的杏褪绿卷叶病症状相似，但各国已报道的杏褪绿卷叶病的病原包括分类地位不同的多种植原体。如土耳其、比利时、捷克等国发生的ACLR病原被鉴定属于苹果丛簇组（16SrX）成员。黎巴嫩、德国发生的ACLR病原被鉴定属于翠菊黄化组（16SrⅠ）成员。2007年李文慧等首次在新疆的杏园中发现了杏褪绿卷叶病疑似病株，症状主要表现叶片沿主脉向上翻卷成筒状，早衰落果，果小味差，轻者产量降低，重者树体整株死亡，并通过电镜观察确定引起新疆杏褪绿卷叶病的病原为植原体。2010年韩冰等对新疆杏褪绿卷叶病病株中植原体16SrDNA基因进行序列测定和分析，发现杏褪绿卷叶植原体新疆分离物属于榆树黄化组（16SrⅤ）成员。杏褪绿卷叶病分布范围广，传播速度快，致病力强，树体一旦感病，终身携带，传统的病害防治技术和栽培技术难以治愈。要从根本上解决杏褪绿卷叶病的防治问题是采取有效的预防措施，加强种苗（接穗、砧木）的检疫检验，采用健康苗木（砧木、接穗），建立无病苗木繁育体系，从源头上杜绝病原才是控制杏褪绿卷叶病发生蔓延的根本途径，而建立和应用先进的病原检测技术是核心所在。
植原体自发现后，其检测技术的发展一直没有大的突破。传统的电镜观察、血清学等检测方法因为灵敏度低、周期长和操作繁琐等不足，已不能满足现代生产的需要。随着分子生物学技术引入植原体病害研究领域，植原体鉴定和检测技术才得到了较快的发展，如普通PCR、巢氏PCR、实时荧光PCR等，但这些方法不仅需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等昂贵的仪器设备，且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员有较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。
环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等在2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，具有特异性强、操作简单、不需要复杂的仪器，肉眼可直接观察检测结果，其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点非常适合于基层及现场使用。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增，目前该技术已广泛应用于植物病原菌的检测，其中也包括一些植原体的LAMP检测技术，如以16S-23S间隔区作为靶标建立了翠菊黄化、草莓绿瓣、三叶草变叶、和圣保罗岛椰子枯萎病植原体的LAMP检测方法；以IGS和23S作为靶标序列建立了番木瓜黄化和银胶菊丛枝植原体的LAPMP检测方法；以16SrRNA基因作为靶标建立了槟榔叶黄化植原体和枣疯病植原体的LAMP检测体系。但目前，尚未见利用环介导等温扩增方法检测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的报道。
发明内容
目前针对现有技术中未见专门利用环介导等温扩增技术检测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的技术现状，本发明旨在提供一种杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的环介导等温扩增检测方法，能够进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。
本发明通过以下技术方案实现的：本发明根据杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因的保守序列，设计了特异性LAMP引物，确定反应条件和试剂浓度并进行优化，建立了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP快速检测体系，此方法检测特异性强，1 h即可获得检测结果，具有快速、高效、结果可视化等特点。
本发明提供了一种杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP快速检测方法，包括以下步骤。
（1）提供一套用于检测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP反应特异性引物序列，具体的寡聚核苷酸序列为：
ACLR-F3:5'-AGAACGTGGTATTACAATTAACG-3'；
ACLR-B3:5'-AGGAACTCCTACTTGTTTAGC-3'；
ACLR-FIP:5'-TGCCCAGGACAATCTATGTGACTTCGCACATAGAATATCAAACG -3'；
ACLR-BIP:5'-AAGAACATGATCACAGGAGCTGCTTTGAGGCATTACTCCATCT-3'。
（2）提供杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增。
（3）最后通过肉眼观察反应管颜色变化或电泳检测待测样品中是否含有杏褪绿卷叶植原体。
具体的，本发明提供了一种杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP快速检测方法，包括以下步骤：
（1）设计用于检测杏褪绿卷叶植原体的LAMP引物：首先在Genebank中搜集全部植原体的tuf基因核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，包括1对外引物ACLR-F3、ACLR-B3和1对内引物ACLR-FIP、ACLR-BIP，引物由上海生工生物工程公司按照HPLC纯度级别合成。
引物序列如下所示：
ACLR-F3：5'-AGAACGTGGTATTACAATTAACG-3'；
ACLR-B3：5'-AGGAACTCCTACTTGTTTAGC-3'；
ACLR-FIP:5'-TGCCCAGGACAATCTATGTGACTTCGCACATAGAATATCAAACG-3'；
ACLR-BIP:5'-AAGAACATGATCACAGGAGCTGCTTTGAGGCATTACTCCATCT-3'。
（2）植物总DNA的提取：采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取杏树枝条韧皮部或叶脉总DNA，置于-40℃冰箱贮存备用。
（3）配制LAMP反应体系：反应体系为25µL，各组分的用量为，8 U/µL Bst2.0WarmStart® DNA聚合酶0.5 µL；1xThermoPol反应缓冲液2.5 µL；10 mmol/L dNTPs 2.5 µL， 10 mmol/L Betaine 2.0 µL；100 mmol/L MgSO4 1.5 µL，20 µmol/L内引物ACLR-FIP/ACLR-BIP各1.5 µL，10 µmol/L外引物ACLR-F3/ ACLR-B3各0.5 µL，1.25 mmol/L钙黄绿素1.0 µL；12.5 mmol/L MnCl2 1.0 µL，模板DNA 1.0 µL，补足灭菌超纯水至25 µL。
（4）通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增：将混合物置于61 ℃恒温反应 60min，80 ℃灭活 5 min。
（5）LAMP扩增产物的分析：
分析方法1：琼脂糖凝胶电泳，扩增产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色15min后，在凝胶成像系统上成像。分析方法2：肉眼观察反应管中颜色的变化。
（6）结果的判定：在分析方法1中，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性。在分析方法2中，若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有杏褪绿卷叶植原体新疆分离物，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：本发明针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因中6个不同区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（BstDNA polymerase）在等温60℃左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增，4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。另外本发明使用Calcein+MnCl2替代了SYBR Green，在配置环介导等温扩增反应液时就加入反应液中，仅在发生环介导等温扩增反应时才呈现翠绿色，避免了常规环介导等温扩增方法需在反应结束后加入SYBR Green染液显色造成的假阳性问题，具有更好的特异性和灵敏性。环介导等温扩增反应不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费，使反应速度可提高30-50%，只在水浴锅中1 h即可完成检测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1) 特异性强：所用的特异性引物针对杏褪绿卷叶植原体tuf基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR和荧光定量PCR技术。
(2)灵敏度高：对杏褪绿卷叶植原体检测的灵敏比普通PCR方法高100倍以上。
(3)检测快捷：从 DNA的提取，到检测完毕用时约2 h，而常规PCR 需要5 h 以上，节省检测时间。
(4) 经济实用：不需要昂贵的的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只要水浴锅或金属浴就能完成检测反应。
(5) 操作简便、结果明显：整个检测过程不涉及复杂仪器或设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；结果可直接通过肉眼观察鉴定，阳性结果为翠绿色，阴性结果为棕黄色。
(6) 对人和环境安全：避免了常规PCR检测过程使用溴化乙锭等有毒化学药品，对人和环境都较为安全。
总之，本发明采用的环介导等温扩增技术，具有反应时间短、特异性强、灵敏度高等特点，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：杏褪绿卷叶植原体环介导等温扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中泳道M为100bp DNA Ladder，泳道1为阴性对照，泳道2-5为杏褪绿卷叶植原体。
图2：杏褪绿卷叶植原体环介导等温扩增产物的可视化检测结果。图中1为阴性对照，2-5为杏褪绿卷叶植原体。
图3：杏褪绿卷叶植原体LAMP反应特异性试验的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中泳道M为100bp DNA Ladder，泳道1为健康杏树组织，泳道2～3代表杏褪绿卷叶植原体，泳道4～7代表枣疯病植原体、葡萄金黄化植原体、泡桐丛枝植原体、柳树丛枝植原体。
图4：杏褪绿卷叶植原体LAMP反应特异性试验的可视化检测结果。图中1为健康杏树组织，2～3代表杏褪绿卷叶植原体，4～7代表枣疯病植原体、葡萄金黄化植原体、泡桐丛枝植原体、柳树丛枝植原体。
图5：常规PCR灵敏度试验结果。图中泳道M为100 bp DNA Ladder，泳道1～5分别对应采用10倍梯度稀释的DNA模板即DNA浓度为50 ng/µL～5.0 pg/µL时的扩增情况，泳道6为灭菌超纯水对照。
图6：LAMP灵敏度试验可视化检测结果。图中1-5分别对应采用10倍梯度稀释的DNA模板即DNA浓度为50 ng/µL～5.0 pg/µL时的扩增情况，6为灭菌超纯水对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
试验药品：植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)、三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）、TaqDNA聚合酶购自北京天根生化科技有限公司；Bst2.0 WarmStart® DNA聚合酶、1×ThermoPol 反应缓冲液为北京纽英伦NEB生物技术有限公司产品；甜菜碱（Betain）、钙黄绿素（Calcein）购自上海生工生物工程公司。
试验材料：以常规PCR检测到的含有杏褪绿卷叶植原体的杏树叶脉或枝条韧皮部总DNA为材料，健康杏树叶片总DNA和灭菌超纯水为阴性对照。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1引物的制备
1.引物的设计和合成：首先在Genebank中搜集全部植原体的tuf基因核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因保守序列的6个区域设计了多组引物，然后根据引物所在区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素，选取出1套特异性引物，包括1对外引物ACLR-F3、ACLR-B3和1对内引物ACLR-FIP、ACLR-BIP，引物由上海生工生物工程公司按照HPLC纯度级别合成。
引物序列如下所示：
ACLR-F3：5'-AGAACGTGGTATTACAATTAACG-3'；
ACLR-B3：5'-AGGAACTCCTACTTGTTTAGC-3'；
ACLR-FIP:5'-TGCCCAGGACAATCTATGTGACTTCGCACATAGAATATCAAACG-3'；
ACLR-BIP:5'-AAGAACATGATCACAGGAGCTGCTTTGAGGCATTACTCCATCT-3'。
2.引物的准备：引物合成后，用灭菌超纯水分别稀释为100 µmol/L，将引物置于-20℃冰箱避光保存备用。
实施例2 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP检测方法的建立
1.植物总DNA的提取
采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取杏树叶脉或枝条韧皮
部总DNA，置于-40℃冰箱贮存备用。
2.LAMP检测体系的优化及建立
根据已报到LAMP基本原理，本发明初步设计并建立了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP反应体系和程序。进而对LAMP反应温度、扩增时间及对构建反应体系的主要影响因素进行优化：外引物与内引物浓度比（1:1、1:4、1:6、1:8 、1:10 、1:12 、1:14）；Mg2+（0~14.0mmol/L，以0.5 mmol/L依次递增）；dNTPs（0.2~1.6 mmol/L，以0.2 mmol/L依次递增）；Bst2.0 WarmStart® DNA聚合酶（1.6~12.8 U/µL，以1.6 U依次递增）；甜菜碱（0~1.6 mmol/L，以0.5 mmol/L依次递增）；钙黄绿素与MnCl2浓度比：钙黄绿素（1.25 mmol/L），MnCl2（从0.4~2.5 mmol/L，以0.2 mmol/L依次递增）。扩增温度55～68 ℃依次递增，反应60 min；在最优扩增温度条件下，分别扩增20，30，40，50，60和70 min，确定最佳扩增时间。
每次检测时，设置阴性对照和阳性对照，在阴性对照和阳性对照均成立时，整个实验有效，可判定结果。
环介导等温扩增反应结果的判定：通过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性（见图1）。或通过肉眼观察反应管中颜色的变化（见图2），若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有杏褪绿卷叶植原体新疆分离物，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
通过各反应条件的优化，最终确定杏褪绿卷叶植原体环介导等温扩增最佳反应体系为25 µL：8 U/µL Bst2.0 WarmStart® DNA聚合酶0.5 µL；1xThermoPol反应缓冲液2.5 µL；10 mmol/L dNTPs 2.5 µL， 10 mmol/L Betaine 2.0 µL；100 mmol/L MgSO4 1.5 µL，20µmol/L内引物ACLR-FIP/ ACLR-BIP各1.5 µL，10 µmol/L外引物ACLR-F3/ ACLR-B3各0.5 µL，1.25 mmol/L钙黄绿素1.0 µL；12.5 mmol/L MnCl2 1.0 µL，模板DNA 1.0 µL，补足灭菌超纯水至25 µL。
最佳反应条件为：61 ℃恒温反应 60 min，80 ℃灭活 5 min。
实施例3特异性检验
按上述实施例2所建立的杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP反应体系，同时以杏褪绿卷叶植原体（榆树黄化组），枣疯病植原体（榆树黄化组），葡萄金黄化植原体（榆树黄化组），泡桐丛枝植原体（翠菊黄化组），柳树从枝植原体（翠菊黄化组）阳性样品以及实验室保存的健康杏树基因组DNA作为模板，进行特异性验证。
判断结果如图3、图4所示，只有杏褪绿卷叶植原体新疆分离物DNA表现为阳性反应，肉眼观察可见翠绿色，琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯形条带。而同属植原体榆树黄化组的枣疯病植原体、葡萄金黄化植原体和属于翠菊黄化组的泡桐丛枝植原体、柳树丛枝植原体以及健康杏树均为阴性。由此可见，本发明建立的环介导等温扩增检测方法对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物有较强的特异性，能较好的区分不同组间及组内的植原体，特异性较好。特异性验证通过后，即表明该检测方法可应用于杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的检测。
实施例4灵敏度检测
采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取感染了杏褪绿卷叶
植原体的杏树韧皮部总DNA，以此作为模板，用灭菌双蒸水进行10倍梯度稀释（50 ng/µL～5 pg/µL），按照上述实例2中的最佳反应体系和最佳反应条件进行环介导等温扩增，同时进行常规PCR检测进行灵敏度比较。
常规PCR检测：以10倍梯度稀释的DNA为模板，R16mF2:5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’，R16mR2: 5’-CTTAACCCCAATCATCGA-3’为扩增引物进行常规PCR扩增。常规PCR扩增体系为25μL：DNA模板1.0 µL，10 µmol/ L的引物各1.0 µL，10 mmol/L 的dNTP 1.0 µL，10×PCRBuffer(2.5 mmol/L MgCl2) 2.5 µL，2.5 U/µL的TaqDNA聚合酶0.3 µL，灭菌超纯水 18.2µL。扩增程序：94 ℃ 预变性6 min；94 ℃变性 45 s，52 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。
结果显示，常规PCR扩增得到预期扩增片段大小约为1500 bp，其最小检出限为5ng/µL（见图5）。环介导等温扩增技术可检测到的最小DNA浓度为50 pg/µL（见图6）。由此可以看出，本发明建立的环介导等温扩增检测方法的敏感性比常规PCR高100倍。
实施例5田间样品检测
采集30份不同杏树多年生枝条，提取枝条韧皮部基因组DNA后，同时利用建立的LAMP检测方法及常规PCR检测方法进行检测，比较LAMP和常规PCR检测方法的阳性检出率和符合率，以验证LAMP方法的可行性和准确性。
结果显示LAMP方法检出14份为阳性，常规PCR检出2份为阳性阳性检出率分别为46.6%和6.6%。有2份样品经常规PCR和LAMP检测均为阳性反应，但有10份样品LAMP检测为阳性，而常规PCR未能检出。以上结果表明常规PCR检测方法灵敏度极低，建立的LAMP方法比常规PCR方法更敏感，可以稳定地实现对田间样品中杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的检测。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP快速检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 824
<212> DNA
<213> apricot chlorotic leaf roll phytoplasma
<400> 1
cctgaagaaa gagaacgtgg tattacaatt aacgcttcgc acatagaata tcaagcggat 60
aaaagacatt atgctcacat agattgtcct gggcatgcag attatattaa gaacatgatc 120
acaggagctg cgcaaatgga tgcaggtatt ttagtagttt ctgctgtaga tggagtaatg 180
cctcaaacaa aagagcatat tttacttgct aaacaagtag gagttcctaa attagtagtt 240
tttttaaaca aatgtgattt agtagaagat aaagatattt ttgaattaat agaattagaa 300
attagagatg ttttaagttc taatggtttt gatggtgata acatacctat tattcaaggt 360
tctgcttcac gtgttgaagg tataaaagaa ttacttgaca ctttggacac atatgttgag 420
gacccaatac gtgatttaga caaatctttc ttaatgccta tcgaaggcgt tattaacgta 480
aaaggaagag gaactgttgc tacaggacgt gttgaaagag gacaaataaa actttctgaa 540
gaagttgaaa ttgtaggtat taaagaaact aaaaaatcta cagtaactgg tttgcaaatg 600
tttcataaaa atttagataa agaaggcgct tttgccggcg ataatattgg tattttgtta 660
cgtggtgtca attacaaaga tattcaacgt ggtcaagtta tatcaaaacc aggttctgta 720
aaaccttatt ctaaatttgt agctaaaatt tatattctta cagctaaaga aggcggaaga 780
agtactttct tcggagataa ttatcgtcct caattctatt tccg 824
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> apricot chlorotic leaf roll phytoplasma
<400> 2
agaacgtggt attacaatta acg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> apricot chlorotic leaf roll phytoplasma
<400> 3
aggaactcct acttgtttag c 21
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> apricot chlorotic leaf roll phytoplasma
<400> 4
tgcccaggac aatctatgtg acttcgcaca tagaatatca aacg 44
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> apricot chlorotic leaf roll phytoplasma
<400> 5
aagaacatga tcacaggagc tgctttgagg cattactcca tct 43
Claims (1)
1.杏褪绿卷叶植原体新疆分离物LAMP检测方法，其特征在于，具体检测步骤如下：
（1）设计并提供1套用于检测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的LAMP引物：在Genebank中搜集全部植原体的tuf基因核苷酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与其他植原体的基因差异位点和高度保守区域，利用LAMP引物在线设计软件Primer Explorer V4针对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，即长度分别为23bp、21bp、44bp和43bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为ACLR-F3、ACLR-B3、ACLR-FIP和ACLR-BIP，上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下：
ACLR-F3：5'-AGAACGTGGTATTACAATTAACG-3'；
ACLR-B3：5'-AGGAACTCCTACTTGTTTAGC-3'；
ACLR-FIP:5'-TGCCCAGGACAATCTATGTGACTTCGCACATAGAATATCAAACG -3'；
ACLR-BIP:5'-AAGAACATGATCACAGGAGCTGCTTTGAGGCATTACTCCATCT-3'；
（2）模板的提取：采用植物基因组提取试剂盒：Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN，提取提取杏树枝条韧皮部或叶脉总DNA作为模板；
（3）配制LAMP反应体系：反应体系为25µL，所述的LAMP反应体系为：8 U/µL Bst2.0WarmStart® DNA聚合酶0.5 µL；1xThermoPol反应缓冲液2.5 µL；10 mmol/L dNTPs 2.5 µL， 10 mmol/L Betaine 2.0 µL；100 mmol/L MgSO4 1.5 µL，20 µmol/L内引物ACLR-FIP/ACLR-BIP各1.5 µL，10 µmol/L外引物ACLR-F3/ ACLR-B3各0.5 µL，1.25 mmol/L钙黄绿素1.0 µL；12.5 mmol/L MnCl2 1.0 µL，模板DNA 1.0 µL，补足灭菌超纯水至25 µL；
（4）通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，所述的LAMP反应程序：将混合物置于61℃恒温反应 60 min，80 ℃灭活 5 min；
（5）LAMP反应结果分析：分析方法1：琼脂糖凝胶电泳，反应结果通过2%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色15 min后，在凝胶成像系统上成像，若出现梯形条带判定为阳性，反之，为阴性；分析方法2：肉眼观察反应管中颜色的变化，若扩增产物变为翠绿色则判定为阳性反应，即样品中感染有杏褪绿卷叶植原体新疆分离物，若扩增产物仍为棕黄色则判定为阴性。
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2019
- 2019-12-30 CN CN201911388582.4A patent/CN110878371A/zh active Pending
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