CN106591454A - 一种茶白星病病叶的分子检测方法 - Google Patents
一种茶白星病病叶的分子检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106591454A CN106591454A CN201611186436.XA CN201611186436A CN106591454A CN 106591454 A CN106591454 A CN 106591454A CN 201611186436 A CN201611186436 A CN 201611186436A CN 106591454 A CN106591454 A CN 106591454A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tea
- tea white
- white star
- dna
- lamp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 21
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 title abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000032989 Ipomoea lacunosa Species 0.000 claims description 29
- 241001564064 Elsinoe theae Species 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 229930184149 elsinochrome Natural products 0.000 claims description 10
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 2
- 241000125117 Elsinoe Species 0.000 abstract 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 241001523339 Discula theae-sinensis Species 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 208000031968 Cadaver Diseases 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N Carbendazim Natural products C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000461774 Gloeosporium Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 235000004522 Pentaglottis sempervirens Nutrition 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006013 carbendazim Substances 0.000 description 1
- JNPZQRQPIHJYNM-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=C[CH]C2=NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 JNPZQRQPIHJYNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000027993 eye symptom Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。本发明的分子鉴定是融合了光谱技术的精确定量、DNA杂交的特异性以及其敏感性，在对病菌进行检验过程中，与形态观察及病菌分离回接鉴定比较，可以实现在茶白星病的早期未显症时期的快速鉴定，2天时间即可准确完成批量的样品鉴定，有利于病害的及时准确防治，从而实现茶园有效的提质增效。
Description
技术领域
本发明属于农作物病害检测及防治技术领域，具体涉及一种茶白星病病叶的分子检测方法。
背景技术
茶白星病(Tea white scab)是全球高海拔茶园最严重的真菌病害之一，病症与茶圆赤星病及虫害为害初期症状易混淆，因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶白星病的发生，从而导致该病难以得到及时高效的防控，生产上通常采用多菌灵等化学农药对该病进行防控，因发病期常为多雨季节，不但防效不佳，杀菌剂的过量使用，导致茶叶农残超标事件屡屡发生，其首要关键环节在于茶白星病监控的技术创新性与实用性不够，2000年，Notomi等建立了一种非常实用而又有效的核酸扩增技术—环介导等温扩增。LAMP是对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。
传统的症状观察，茶白星病发病初期，只是小小红点凸起，与茶叶上发生茶圆赤星病及害虫叮咬症状极为相似，而等到出现典型鸟眼状症状时，已经是发病晚期，产量及品质都受到严重影响。如采用PCR分子检测技术灵敏度较好，但是操作繁琐、检测时间长、检测仪器及试剂昂贵，难以在基层推广。而目前LAMP检测技术主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原鉴定上应用较少。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种快速、准确检测茶白星病菌的分子方法，该方法利用LAMP技术扩增靶基因，设计引物，优化反应条件，建立一个从核酸抽提到LAMP检测痂囊腔菌的快速检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：
（1）根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：
SEQNO.1：
F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；
SEQNO.2：
B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；
外引物对：
SEQNO.3：
FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；
SEQNO.4：
BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)；
（2）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；
（3）采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；
（4）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；
（5）在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。
作为优选，所述LAMP扩增反应体系如下：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10 pmol，Bst DNA 聚合酶1ul，加去离子水配成23ul。
作为优选，所述反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20mM，MgSO4:16mM，（NH4）2SO4：20 mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。
作为优选，阳性对照DNA：用限制性内切酶 Hind Ⅲ消化λ噬菌体 DNA 后，取其片段（6557 bp）重组入质粒所得；阴性对照：反应体系未添加DNA。
作为优选，LAMP扩增条件为外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。
作为优选，所述荧光染料为1％SYBR green I。
作为优选，反应体系中加入荧光染料后，于自然光及紫外灯下观察，可观察到绿色荧光，则茶叶发生了茶白星病。
作为优选，反应体系中加入荧光染料后，用琼脂糖凝胶电泳检测，出现LAMP特征性的梯形带，则茶叶发生了茶白星病。
作为优选，所述电泳条件为：LAMP产物在1.0％琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm。
从以上技术方案可知，本发明的分子鉴定是融合了光谱技术的精确定量、DNA杂交的特异性以及其敏感性，在对病菌进行检验过程中，与形态观察及病菌分离回接鉴定比较，可以实现在茶白星病的早期未显症时期的快速鉴定， 2天时间即可准确完成批量的样品鉴定，有利于病害的及时准确防治，从而实现茶园有效的提质增效；且LAMP技术可在恒定温度(一般60℃～65℃)下进行目的片段的大量扩增 ，操作简单、成本低 ，同时具有很高的特异性和灵敏度，且检测结果能实现可视化，更适合于条件落后的部门开展工作。
附图说明
图1为特异性实验的显色法检测结果。其中：
1、4：阳性对照；2：痂囊腔菌；5：茶炭疽病菌；3、6：阴性对照；
1、2、4号管反应液颜色为绿色，3、5、6号管反应液颜色为橙色。
图2为灵敏度实验的显色法检测结果。其中：
1：10-2；2：10-3；3：10-4；4：10-5，1-4号管反应液颜色为绿色。
图3为LAMP对照的电泳法检测结果。其中：
M：Marker 2000。
具体实施方式
下面结合附图将详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：
1.茶白星病菌检测的特殊引物设计：根据茶白星病菌DNA序列的特性，合成对茶白星病菌具特异扩增作用的一套引物：
SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；
SEQNO.2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；
SEQNO.3：
FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；SEQNO.4：
BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)。
2.茶白星病菌检测体系的建立：
（1）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；
（2）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；
（3）LAMP反应体系配置：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30 pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10 pmol，Bst DNA 聚合酶1 ul，加去离子水（DW）配成23ul。其中反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20mM，MgSO4:16 mM，（NH4）2SO4：20 mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。阳性对照DNA：用限制性内切酶 Hind Ⅲ消化λ噬菌体DNA 后，取其片段（6557bp）重组入质粒所得。阴性对照：反应体系未添加DNA。
反应体系和反应条件：外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。
（4）LAMP产物荧光目视检测时，向预混溶液中添加Loopamp®“朗报®”荧光目视检测试剂。该方法可特异的检出E.leucospil。电泳在1.0％琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。本发明所用引物对茶白星病菌具有很高的特异性，能够用于区别茶白星病与其余病害的检测。
实施例1
1.茶白星病菌检测的特殊引物设计：根据茶白星病菌DNA序列的特性，合成了对茶白星病菌具特异扩增作用的一套引物：
SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；
SEQNO.2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；
SEQNO.3：
FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；SEQNO.4：
BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)。
2.茶白星病菌检测体系的建立：
（1）采集茶叶样品，以痂囊腔菌分离纯化培养14天；采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；
（2）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；其中LAMP反应体系配置：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30 pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10pmol，BstDNA 聚合酶1ul，加去离子水（DW）配成23ul。其中反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20mM，MgSO4:16 mM，（NH4）2SO4：20 mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。阳性对照DNA：用限制性内切酶 Hind Ⅲ消化λ噬菌体 DNA 后，取其片段（6557 bp）重组入质粒所得。阴性对照：反应体系未添加DNA。
反应体系和反应条件：外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。
（3）LAMP产物荧光目视检测时，向预混溶液中添加Loopamp®“朗报®”荧光目视检测试剂。
从图1可知，利用已建立的LAMP检测方法，以痂囊腔菌与茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinensis Miyake）为模板进行特异性试验。结果表明，只有痂囊腔菌能扩增出阳性条带，茶炭疽病菌扩增出的DNA为阴性对照，初步确定本方法设计的引物对痂囊腔菌具有专一性。
从图2可知，利用已建立的LAMP检测方法，以稀释成10-2、10-3、10-4、10-5的痂囊腔菌DNA为模板，以LAMP作为对照，结果表明， LAMP能扩增出10-5痂囊腔菌DNA模板，而LAMP的扩增浓度限于10-4痂囊腔菌DNA，从而明确LAMP法在灵敏度上高于LAMP10倍。
实施例2
1.茶白星病菌检测的特殊引物设计：根据茶白星病菌DNA序列的特性，合成了对茶白星病菌具特异扩增作用的一套引物：
SEQNO.1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；
SEQNO.2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；
SEQNO.3：
FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；SEQNO.4：
BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)。
2.茶白星病菌检测体系的建立：
（1）采集茶叶样品，以痂囊腔菌分离纯化培养14天；采用TIANGEN公司真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；
（2）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；其中LAMP反应体系配置：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30 pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10pmol，BstDNA聚合酶1 ul，加去离子水（DW）配成23ul。其中反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20mM，MgSO4:16 mM，（NH4）2SO4：20 mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。阳性对照DNA：用限制性内切酶 Hind Ⅲ消化λ噬菌体 DNA 后，取其片段（6557 bp）重组入质粒所得。阴性对照：反应体系未添加DNA。
反应体系和反应条件：外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。
（3）电泳在1.0％琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。
从图3可知，利用已建立的LAMP检测方法，以痂囊腔菌与茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinensis Miyake）为模板进行特异性试验。结果表明，只有痂囊腔菌能扩增出阳性条带，茶炭疽病菌扩增出的DNA为阴性对照，初步确定本方法设计的引物对痂囊腔菌具有专一性。利用已建立的LAMP检测方法，以稀释成10-2、10-3、10-4、10-5的痂囊腔菌DNA为模板，以LAMP作为对照，结果表明，LAMP能扩增出10-5痂囊腔菌DNA模板，而LAMP的扩增浓度限于10-4痂囊腔菌DNA，从而明确LAMP法在灵敏度上高于LAMP10倍。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (9)
1.一种茶白星病病叶的分子检测方法，其包括以下步骤：
（1）根据茶白星病菌DNA序列的特性，设计以内引物对：
SEQNO.1：
F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’)；
SEQNO.2：
B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’)；
外引物对：
SEQNO.3：
FIP（5’-GCCAGAACCAAGAGATCCGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCAGTC-3’)；
SEQNO.4：
BIP（5’-TGAAGAACGCAGCGAAATGCG-GCGCAATGTGCGTTCAA-3’)；
（2）采集茶叶，以痂囊腔菌分离纯化培养；
（3）采用真菌基因组DNA试剂盒提取上述培养液中的茶白星病菌基因组DNA；
（4）以上述基因组DNA为模板进行特异性LAMP扩增反应；
（5）在上述反应体系中加入荧光染料，可判断采集的茶叶是否发生了茶白星病。
2.根据权利要求1所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增反应体系如下：反应缓冲液12.5ul，其中FIP：30pmol，BIP：30pmol，F3：10pmol，B3：10pmol，BstDNA聚合酶1ul，加去离子水配成23ul。
3.根据权利要求2所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：所述反应缓冲液组成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20mM，MgSO4:16 mM，（NH4）2SO4：20mM，Tween20：0.2％，Betaine：1.6M，dNTPs：2.8mM每种。
4.根据权利要求3所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：阳性对照DNA：用限制性内切酶 Hind Ⅲ消化λ噬菌体 DNA 后，取其片段（6557 bp）重组入质粒所得；阴性对照：反应体系未添加DNA。
5.根据权利要求4所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：LAMP扩增条件为外引物：内引物=3:1，63℃lh反应后立即于80℃10min使酶灭活。
6.根据权利要求5所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：所述荧光染料为1％SYBR green I。
7.根据权利要求6所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：反应体系中加入荧光染料后，于自然光及紫外灯下观察，可观察到绿色荧光，则茶叶发生了茶白星病。
8.根据权利要求6所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：反应体系中加入荧光染料后，用琼脂糖凝胶电泳检测，出现LAMP特征性的梯形带，则茶叶发生了茶白星病。
9.根据权利要求8所述茶白星病病叶的分子检测方法，其特征在于：所述电泳条件为：LAMP产物在1.0％琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611186436.XA CN106591454A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 一种茶白星病病叶的分子检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611186436.XA CN106591454A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 一种茶白星病病叶的分子检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106591454A true CN106591454A (zh) | 2017-04-26 |
Family
ID=58600490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611186436.XA Pending CN106591454A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 一种茶白星病病叶的分子检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106591454A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108849164A (zh) * | 2018-05-22 | 2018-11-23 | 广西昭平县古书茶业有限公司 | 一种茶圆赤星病的防治方法 |
| CN110710450A (zh) * | 2019-08-28 | 2020-01-21 | 湖南省茶叶研究所 | 通过茶白星病菌感染提高茶叶中黄酮含量的方法 |
| CN110713936A (zh) * | 2019-08-28 | 2020-01-21 | 湖南省茶叶研究所 | 茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104073560B (zh) * | 2014-06-30 | 2016-04-06 | 贵阳中医学院 | 一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法 |
| CN104328205B (zh) * | 2014-11-21 | 2016-11-23 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立 |
-
2016
- 2016-12-20 CN CN201611186436.XA patent/CN106591454A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104073560B (zh) * | 2014-06-30 | 2016-04-06 | 贵阳中医学院 | 一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法 |
| CN104328205B (zh) * | 2014-11-21 | 2016-11-23 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 谷子白发病菌lamp快速检测方法的建立 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| XINHOU等: "Detection of Elsinoe fawcettii in planta through real-time PCR", 《JOURNAL OF FOOD, AGRICULTURE & ENVIRONMENT》 * |
| YOICHI TSUMURAYA等: "A NEW FUNGAL a-D-GLUCAN, ELSPNAN, ELABORATED BY Elsinoe leucospiia", 《CARBOHYCTATE RESEARCH》 * |
| 周凌云: "基于环介导等温扩增技术快速检测茶白星病菌的方法研究", 《茶叶通讯》 * |
| 谢峥嵘: "白茶星病的病原特性及防治技术", 《贵州茶叶》 * |
| 陈利锋等: "《农业植物病理学》", 28 February 2007, 中国农业出版社 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108849164A (zh) * | 2018-05-22 | 2018-11-23 | 广西昭平县古书茶业有限公司 | 一种茶圆赤星病的防治方法 |
| CN110710450A (zh) * | 2019-08-28 | 2020-01-21 | 湖南省茶叶研究所 | 通过茶白星病菌感染提高茶叶中黄酮含量的方法 |
| CN110713936A (zh) * | 2019-08-28 | 2020-01-21 | 湖南省茶叶研究所 | 茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法 |
| CN110713936B (zh) * | 2019-08-28 | 2022-03-04 | 湖南省茶叶研究所 | 茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| CN106987653B (zh) | 一种马铃薯晚疫病菌lamp检测引物及其可视化检测方法 | |
| CN108060257B (zh) | 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法 | |
| Li et al. | Specific and sensitive detection of Phytophthora nicotianae by nested PCR and loop‐mediated isothermal amplification assays | |
| CN106591454A (zh) | 一种茶白星病病叶的分子检测方法 | |
| CN104774955A (zh) | 一种葡萄座腔菌的检测方法 | |
| CN116516058A (zh) | 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒 | |
| CN116064906A (zh) | 一种用于同步检测多种大豆检疫性病原菌的引物组及其检测方法 | |
| CN110878371A (zh) | 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物lamp快速检测方法 | |
| CN105296479B (zh) | 一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用 | |
| Jun-hai et al. | Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of bacterial blight pathogen (Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae) in anthurium | |
| Ren et al. | Development and application of a LAMP method for rapid detection of apple blotch caused by Marssonina coronaria | |
| KR102000459B1 (ko) | 벼멸구 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 벼멸구 검출 방법 | |
| Hilmi et al. | Molecular PCR assays for detection of Ganoderma pathogenic to oil palm in Malaysia | |
| KR101437498B1 (ko) | 벼키다리병균(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ) 신속 검출용 특이 프라이머 및 이를 이용한 균 검출방법 | |
| CN111534626A (zh) | 一种用于钟器腐霉的lamp检测引物组合物、检测试剂盒及其可视化检测方法 | |
| KR102213231B1 (ko) | 고추 감염 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| Lee et al. | Development of a rapid detection method for Peronospora destructor using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) | |
| Thangavelu et al. | Rapid and sensitive detection of Pseudocercospora eumusae pathogen causing eumusae leaf spot disease of banana by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method | |
| CN107641655B (zh) | 一种快速检测褐飞虱对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗药性的方法 | |
| KR101149437B1 (ko) | 벼흰잎마름병균의 유전자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 레이스 판별 방법 | |
| CN110951923A (zh) | 一种同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重pcr方法及其引物和试剂盒 | |
| AU2021101342A4 (en) | Enhanced loop-mediated isothermal amplification method for detecting latent xap infection in pomegranate | |
| CN111676311B (zh) | 一种用于检测刺腐霉菌的lamp引物组合物、试剂盒及其检测方法 | |
| US20220162666A1 (en) | Soil Pathogen Testing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170426 |