CN105296479B - 一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用 - Google Patents

一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑树青枯病鉴定的特异性引物，由上游引物RS‑16S‑F和下游引物RS‑16S‑R组成，所述上游引物RS‑16S‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物RS‑16S‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。本发明还公开了一种利用上述引物早期快速鉴定桑树青枯病的方法以及该引物在制备具有鉴定桑树青枯病功能的药物中的应用。本发明中的桑树青枯病鉴定的特异性引物，灵敏、高效、特异性好，本发明通过设计桑树青枯菌16SrRNA的特异引物，结合荧光定量PCR的方法，在发病早期快速鉴定桑树青枯病，为防治桑树青枯病的发生提供可靠的依据。

Description

一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用
技术领域
本发明属于青枯病技术领域，具体涉及一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用。
背景技术
桑树青枯病是一种毁灭性土传病害，其发病速度快，蔓延迅速，发病范围广，严重时发病面积达90％以上，使得桑叶产量急剧下降直至绝收，给蚕农造成了严重的经济损失。桑树青枯病一旦爆发，防治非常困难。但在早期检测出病害的发生，可以通过病株拔除、农药灌根、土壤消毒等方法有效预防青枯病的大面积爆发。
目前，对青枯病鉴定的方法主要有表型鉴定和培养基病原菌分离鉴定。表型鉴定即通过观测桑叶和桑根的发病表型特征来判定青枯病的发生。由于植株病症表型在发病中后期才能观测到，而青枯病中后期防治比较困难，因此这种方法对青枯病的防治意义不大。培养基病原菌分离鉴定即利用TTC培养基分离病根木质部中的病原菌，通过观察病原菌形态鉴定青枯病的发生。这种方法能在较早期检测青枯病的发生，但培养中易出现肠杆菌等杂菌污染，影响鉴定的准确度。因此发明一种早期快速的桑树青枯病鉴定方法，为桑树青枯病早期诊断和防治提供理论基础，对保障蚕桑产业稳产持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种桑树青枯病鉴定的特异性引物，该引物特异性强，快速、灵敏。
本发明的第二个目的在于提供一种早期快速鉴定桑树青枯病的方法，该方法在发病早期能快速鉴定桑树青枯病，为防治桑树青枯病的发生提供可靠的依据。
本发明的最后一个目的在于提供上述桑树青枯病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑树青枯病功能的药物中的应用。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种桑树青枯病鉴定的特异性引物，由上游引物RS-16S-F和下游引物RS-16S-R组成，所述上游引物RS-16S-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物RS-16S-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。
根据NCBI数据库中桑树青枯菌的16SrRNA(GenBank ID：JX112350)序列特征，利用Primer Premier 5.0和Oligo6.0设计和筛选了上述桑树青枯菌荧光PCR特异性引物(RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT如SEQ ID NO：1中所示/RS-16S-R:TCGAGCACCTAATGCATCTCTGCTTC，如SEQ ID NO：2中所示)。该引物对理论扩增片段大小为197bp，该引物可由华大基因等公司合成。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种早期快速鉴定桑树青枯病的方法，包括以下步骤：
(1)取疑似青枯病桑树的根部，提取该桑树根部的DNA；
(2)以该桑树根部的DNA为模板，利用上述桑树青枯病鉴定的特异性引物RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR；
(3)记录该桑树根部的DNA的qPCR反应体系的Ct值，当Ct值≤36时，表明有桑树青枯菌的存在，该桑树为发病植株；当Ct值＞36时，表明没有桑树青枯病的存在，该桑树为健康植株。
步骤(1)中优选采用DNAiso reagent kit试剂盒提取桑树根部的DNA。
步骤(2)中荧光定量qPCR优选采用Roche LightCycler 480实时荧光PCR仪和SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒进行。
步骤(2)中荧光定量qPCR的反应体系优选包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10.0μL、浓度为10μM的上游引物RS-16S-F 0.8μL、浓度为10μM的下游引物RS-16S-R 0.8μL、模板2.0μL、双蒸水6.4μL。
步骤(2)中荧光定量qPCR的扩增程序优选为：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环。
步骤(3)中Ct值的确定方式优选为：选取桑树青枯病菌，配制一组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液，以该组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液为模板，利用权利要求1中的桑树青枯病鉴定的特异性引物RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR，记录该组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液的Ct值，建立Ct值与桑树青枯病菌溶液各浓度log值之间的线性关系，将最低浓度的桑树青枯病菌溶液的Ct值作为评判该桑树是否具有桑树青枯病的临界值。
其中最低浓度的桑树青枯菌溶液的浓度为0.95×102～1.05×102CFU/mL。
本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述桑树青枯病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑树青枯病功能的药物(如试剂盒等)中的应用。
本发明具有如下优点：本发明中的桑树青枯病鉴定的特异性引物，灵敏、高效、特异性好，本发明通过设计桑树青枯菌16SrRNA的特异引物，结合荧光定量PCR的方法，在发病早期快速鉴定桑树青枯病，为防治桑树青枯病的发生提供可靠的依据。
附图说明
图1是实施例1中青枯菌荧光PCR引物特异性检测。泳道1、2模板为桑青枯菌DNA；泳道3、4模板为桑肠杆菌DNA；泳道5、6模板为桑假单胞菌DNA；泳道7、8模板为桑欧文氏菌DNA；泳道9、10模板为桑黄单胞菌DNA；M为2000bp DNA Ladder；
图2是实施例1中待测菌株与已知青枯菌16SrRNA序列比对；
图3是实施例2中细菌含量Log值和qPCR Ct值的标准曲线；
图4是实施例3中青枯菌侵染前和侵染后桑根样本的Ct值。
具体实施方式
实施例1
桑树青枯菌特异引物的设计与验证
1.1根据NCBI数据库中桑树青枯菌的16SrRNA(GenBank ID:JX112350)序列特征，利用Primer Premier 5.0和Oligo6.0设计和筛选了一对桑树青枯菌荧光PCR特异性引物(RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT/RS-16S-R:TCGAGCACCTAATGCATCTCTGCTTC)。该引物对理论扩增片段大小为197bp，该引物由华大基因公司合成。引物稀释前先在4℃条件下，以1×104rpm离心2min，然后加入去离子水配成10μM的贮存液保存于-20℃待用。
1.2桑树肠杆菌、假单胞菌、欧文氏菌和黄单胞菌为对照，所有实验菌株均接种于LB液体培养基中，在恒温气浴摇床中以200rpm的转速，在30℃条件下过夜培养，待OD600为1时即可取样。采用DNAiso reagent kit(Takara,Otsu,Japan)提取各菌株的DNA，保存于-20℃条件下待用。
1.3以各菌株DNA为模板，利用青枯菌荧光PCR特异性引物RS-16S-F和RS-16S-R进行常规PCR扩增，PCR反应体系如下：25μL的反应体系中包含12.5μL Taq PCR Mix(2×)，8.5μL双蒸水，2μL模板，1μL上游引物RS-16S-F，1μL下游引物RS-16S-R。扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR完成后，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4同时将电泳条带切胶回收，连接到T-easy载体上，并转化至E.coli中，获得阳性菌落并送至公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对，确定其菌属类型。
1.5结果
1.5.1以桑树肠杆菌、假单胞菌、欧文氏菌和黄单胞菌为对照，利用青枯菌特异性引物RS-16S-F和RS-16S-R进行常规PCR，电泳分析结果表明：仅青枯菌能扩增出条带，而对照菌株肠杆菌、假单胞菌、欧文氏菌和黄单胞菌均未扩增出条带，详情见图1。
1.5.2将电泳条带回收转化并测序后，将测序结果在NCBI上已知的青枯菌16SrRNA序列(KT748524)进行比对，比对结果表明，该序列为青枯菌的16SrRNA特征序列，详情见图2。
综上所述，该青枯菌引物的特异性好，可用于后续青枯菌的荧光定量分析实验。
实施例2
早期快速鉴定桑树青枯病的方法
2.1 Ct值的确定
2.1.1将1×108CFU/mL的青枯菌悬液按梯度进行稀释，使其终浓度分别为1×108、5×107、1×107、5×106、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL。
2.1.2取2μL各梯度稀释的菌悬液为模板，利用引物对RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用Roche LightCycler 480实时荧光PCR仪和SYBR Premix ExTaqTM(Takar,Otsu,Japan)试剂盒进行。20μL qPCR反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0uL，上游引物RS-16S-F(10μM)0.8μL，下游引物RS-16S-R(10μM)0.8μL，模板2.0μL，双蒸水6.4μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环，PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复3次。
2.1.3记录qPCR反应体系的Ct值，并分析其与青枯菌悬液浓度的相关性。
结果表明，利用qPCR技术对各梯度稀释的青枯菌悬液进行检测，记录Ct值，并分析菌液浓度的Log值和对应的循环阈值(Ct)的相关性。如图3所示，菌液浓度在102～108CFU/mL范围内，菌液浓度的Log值与Ct值之间呈良好的线性关系，线性方程为y＝-3.127x+42.626(x代表菌液浓度的Log值，y代表对应的循环阈值(Ct))，R2＝0.9969。实验中的空白对照的Ct值为43.241，菌液浓度为102CFU/mL的Ct值为36.053。因此，我们Ct值36作为是否为桑树青枯病的临界值(本申请发明人早期试验发现，当桑树感染青枯病后，桑树青枯病菌的浓度通常不低于约100CFU/mL，因此，将青枯病菌溶液的浓度最低约为100CFU/mL作为临界值的判定标准)。即当桑树样本qPCR检测的Ct值小于36时，表明有桑树青枯菌的存在，为桑树青枯病发病植株；当桑树样本qPCR检测的Ct值大于36时，表明桑树没有青枯菌，为桑树健康植株。
2.1.4早期快速鉴定桑树青枯病的方法，包括以下步骤：
(1)取疑似青枯病桑树的根部，提取该桑树根部的DNA；
(2)以该桑树根部的DNA为模板，利用实施例1中的桑树青枯病鉴定的特异性引物RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR；
(3)记录该桑树根部的DNA的qPCR反应体系的Ct值，当Ct值≤36时，表明有桑树青枯菌的存在，该桑树为发病植株；当Ct值＞36时，表明没有桑树青枯病的存在，该桑树为健康植株。
步骤(2)中荧光定量qPCR采用Roche LightCycler 480实时荧光PCR仪和SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒进行。
步骤(2)中荧光定量qPCR的反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0μL、浓度为10μM的上游引物RS-16S-F 0.8μL、浓度为10μM的下游引物RS-16S-R 0.8μL、模板2.0μL、双蒸水6.4μL。
步骤(2)中荧光定量qPCR的扩增程序为：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环。
实施例3
3.1取青枯菌侵染前和侵染后桑根样本，将病根用自来水冲洗干净，用70％酒精表面消毒1min，用无菌水冲洗1次，液氮速冻后，存于-80℃备用。
3.2以0.5g桑根样本为材料，采用DNAiso reagent kit(Takara,Otsu,Japan)提取桑根样本的DNA，琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于-20℃条件下待用。
3.3取1μL桑根样本DNA为模板，利用实施例1中的引物对RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用Roche LightCycler 480实时荧光PCR仪和SYBR Premix ExTaqTM(Takar,Otsu,Japan)试剂盒进行。20μL qPCR反应体系包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0uL，上游引物RS-16S-F(10μM)0.8μL，下游引物RS-16S-R(10μM)0.8μL，模板2.0μL，双蒸水6.4μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环，PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复3次。
3.4记录各样本qPCR反应体系的Ct值。
3.5实验结果如图4所示，利用qPCR技术对青枯菌侵染前和侵染后的桑根样本进行检测，记录Ct值。结果表明：
1)侵染前的桑根样本Ct值为43.5，大于上述Ct值的临界值，为健康植株。
2)侵染后1d、3d、5d和7d的桑根样本中，Ct值分别为25.3、22.2、17.4、15.6，均小于上述Ct值的临界值，为发病植株。同时大田实验观测结果也表明侵染后的植株在后期均表现出青枯病的病症，与依据Ct值判定的结果一致。
实施例4
4.1取6株疑似青枯病桑树植株的桑根样本，将桑根用自来水冲洗干净，用70％酒精表面消毒1min，用无菌水冲洗1次，液氮速冻后，存于-80℃备用。
4.2以0.5g桑根样本为材料，采用DNAiso reagent kit(Takara,Otsu,Japan)提取桑根样本的DNA，琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于-20℃条件下待用。
4.3取1μL桑根样本DNA为模板，利用实施例1中的引物对RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR实验。qPCR采用Roche LightCycler 480实时荧光PCR仪和SYBR Premix ExTaqTM(Takar,Otsu,Japan)试剂盒进行。20μL qPCR反应体系包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10.0uL，上游引物RS-16S-F(10μM)0.8μL，下游引物RS-16S-R(10μM)0.8μL，模板2.0μL，双蒸水6.4μL。扩增程序如下：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环，PCR结束后立即进行溶解曲线分析，验证扩增的特异性。每个qPCR反应重复3次。
4.4记录各样本qPCR反应体系的Ct值。
4.5实验结果表明：
1)6个桑根样本中，有2个样本的Ct值分别为42.9和43.3，大于上述Ct值的临界值36，鉴定为健康植株。持续观察植株后期的发病情况，发现这2棵桑树植株没有出现青枯病症状，与依据Ct值判定的结果一致。
2)6个桑根样本中的另外4个样本的Ct值分别为18.1、17.4、17.2、16.6，均小于上述Ct值的临界值，鉴定为发病植株。持续观察该植株后期的发病情况，发现这4棵桑树植株后期均表现出青枯病症状，与依据Ct值判定的结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种桑树青枯病鉴定的特异性引物，其特征是：由上游引物RS-16S-F和下游引物RS-16S-R组成，所述上游引物RS-16S-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物RS-16S-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。
2.一种早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)取疑似青枯病桑树的根部，提取该桑树根部的DNA；
(2)以该桑树根部的DNA为模板，利用权利要求1中的桑树青枯病鉴定的特异性引物RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR；
(3)记录该桑树根部的DNA的qPCR反应体系的Ct值，当Ct值≤36时，表明有桑树青枯菌的存在，该桑树为发病植株；当Ct值＞36时，表明没有桑树青枯病的存在，该桑树为健康植株。
3.根据权利要求2所述的早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是：步骤(1)中采用DNAiso reagent kit试剂盒提取桑树根部的DNA。
4.根据权利要求2所述的早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是：步骤(2)中荧光定量qPCR采用Roche LightCycler 480实时荧光PCR仪和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行。
5.根据权利要求2所述的早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是：步骤(2)中荧光定量qPCR的反应体系包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10.0μL、浓度为10μM的上游引物RS-16S-F 0.8μL、浓度为10μM的下游引物RS-16S-R 0.8μL、模板2.0μL、双蒸水6.4μL。
6.根据权利要求2所述的早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是：步骤(2)中荧光定量qPCR的扩增程序为：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，45个循环。
7.根据权利要求2所述的早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是：步骤(3)中Ct值的确定方式为：选取桑树青枯病菌，配制一组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液，以该组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液为模板，利用权利要求1中的桑树青枯病鉴定的特异性引物RS-16S-F/RS-16S-R进行荧光定量qPCR，记录该组具有浓度梯度的桑树青枯病菌溶液的Ct值，建立Ct值与桑树青枯病菌溶液各浓度log值之间的线性关系，将最低浓度的桑树青枯病菌溶液的Ct值作为评判该桑树是否具有桑树青枯病的临界值。
8.根据权利要求7所述的早期快速鉴定桑树青枯病的方法，其特征是：最低浓度的桑树青枯菌溶液的浓度为0.95×102～1.05×102CFU/mL。
9.权利要求1所述的桑树青枯病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑树青枯病功能的药物中的应用。
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