CN110564875B - 一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110564875B CN110564875B CN201910732504.5A CN201910732504A CN110564875B CN 110564875 B CN110564875 B CN 110564875B CN 201910732504 A CN201910732504 A CN 201910732504A CN 110564875 B CN110564875 B CN 110564875B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- mulberry
- bacterial wilt
- pcr amplification
- primer pair
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 title claims abstract description 61
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 241000218231 Moraceae Species 0.000 title claims description 6
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 claims abstract description 55
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 claims description 19
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 5
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 3
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001493237 Enterobacter mori Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001412304 Ixeris Species 0.000 description 1
- 241000532927 Lagerstroemia Species 0.000 description 1
- 241000097097 Laurella Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 235000015095 lager Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因试剂盒检测技术领域，特别涉及一种可快速检测桑树青枯类病害的PCR引物组、试剂、试剂盒及应用，本发明针对广西桑树青枯类病害由拉尔氏菌和肠杆菌两种病原菌单独或复合侵染的特点，选用和设计这两种病原菌的PCR特异性引物，制备特异的检测试剂盒，该试剂盒能同时、快速有效地检测出桑树青枯类病害的两种病原菌，可为该类病害的诊断、监测、种质选育及防治提供了有效手段。
Description
【技术领域】
本发明涉及基因试剂盒检测技术领域，特别涉及一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用。
【背景技术】
蚕桑业是广西优势农业产业之一。桑是桑蚕生产的基础，桑叶的正常产量和质量是确保蚕桑业持续、稳定发展的重要保障之一。桑树青枯类病害是广西桑园常见的毁灭性细菌性病害，具有发病急、蔓延快和死亡率高等特点，有“桑瘟”之称，是国内桑树病害的主要检疫对象之一。发明人通过连续3年对广西桑树青枯类病害的发生情况进行全面的调查研究，发现广西的桑树青枯类病害由拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和肠杆菌属(Eenterbacter spp.)两类细菌引起，这为病害的防控技术研究提供了基础。由于这两种病原菌均能侵染桑树根部导管和茎部维管束，影响水分运输，叶片出现萎凋，地上部的症状均表现为青枯，剖开根和茎部皮层可见木质部褐变，这两种病原菌在生产上的危害症状非常相似，肉眼难以区分，因此业内统称为桑树青枯类病害。
由于桑树青枯类病害为土传病害，采用农药防治该病存在很大难度，其中加强桑树苗木检疫是对该类病害进行综合治理的有效策略之一，已有研究表明，该类病害的病原菌可随土壤、水和带菌的植物繁殖材料在国内或国际间传播，其中植物繁殖材料是病原菌远距离传播的主要方式。从国家农业产业结构调整和广西优势农业产业发展的情况来看，广西桑园的面积还会不断扩大，还需要调运很多桑树苗木，广西已有部分地区发生了该类病害，要控制其进一步的扩散蔓延，就必须严格实行检疫措施，把带病菌的苗木堵在保护区之外，才能确保蚕业生产的安全，因此在病害诊断和检疫上均急需建立一套快速检测的体系。虽然目前有各种多重PCR体系用于检测病原菌，但是，还没有明确可同步检测桑青枯类病害病原菌的研究，这是因为在多重PCR反应中反应引物和反应体系是很难摸索的。
【发明内容】
鉴于上述内容，在探明广西桑青枯类病害病原菌种类的研究基础上，建立基于PCR的快速检测技术，获得高灵敏度、特异性强和结果稳定的快速检测体系可为桑树健康种苗的生产和引进、抗病育种提供有效的监控手段。对最终指导桑园青枯类病害的综合治理，减少损失，保证蚕茧产量和质量，促进蚕桑业的可持续发展具有深远的意义。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测或辅助检测桑树青枯类病的引物组，所述引物组包含引物对1和引物对2；所述引物组包含引物对1和引物对2；所述引物对1的上游引物为SEQ ID No.1；下游引物为SEQ ID No.2；所述引物对2的上游引物为SEQ ID No.3；下游引物为SEQ ID No.4。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测桑树青枯类病害的PCR试剂。
本发明提供的检测或辅助检测桑树青枯类病害的PCR试剂包括上述引物组。
本发明的PCR试剂所述引物对1和引物对2在PCR试剂中的终浓度等量，均为10μmol/l。
本发明还提供了一种检测或辅助检测桑树青枯类病害的试剂盒。
为解决上述问题，本发明的试剂盒包括上述的引物组和/或上述PCR试剂。
上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测桑树青枯类病害侵染病原是拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和/或肠杆菌属(Eenterbacter spp.)中的应用。
本发明还提供一种检测或辅助检测桑树青枯类病害的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用权利要求1所述引物组对待测桑树样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)检测所述PCR扩增产物的大小；
若所述PCR扩增产物大小为678bp的片段，则桑树青枯类病害的病原为肠杆菌属(Eenterbacter spp.)；
若所述PCR扩增产物大小为287bp的片段，则桑树青枯类病害的病原为拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
进一步的，上述方法PCR扩增的模板为待测样品病原菌的基因组DNA。
进一步的，所述PCR扩增反应的体系为：PCR Mastermix试剂12.5ul；10μmol/l的引物对1正向引物1ul；10μmol/l的引物对1反向引物1ul；10μmol/l的引物对2正向引物1ul；模板DNA1ul；10μmol/l的引物对2反向引物1ul；ddH2O7.5ul。
进一步的，所述PCR扩增反应程序为：96℃预变性2min；94℃变性20s，68℃退火20s，72℃延伸30sec，总共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃终止反应。
上述方法在检测或辅助检测桑树青枯类病害病原菌是拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)和/或肠杆菌属(Eenterbacter spp.)中的应用。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明针对广西桑树青枯类病害的由拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和肠杆菌属(Eenterbacter spp.)两种病原菌侵染引起的特性，选用和设计特异性引物，制成PCR反应试剂，进一步制备成DNA试剂盒，该试剂盒能同步、快速检测出桑树的青枯类病害是由拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)还是肠杆菌属(Eenterbacter spp.)引起，或者为两种病原菌复合侵染。使用本申请的试剂盒最大优势是桑树在带菌未出现青枯症状的早期就可快速检出，能有效起到病害早发现、早预防、早防治的作用；且可同步检出桑树青枯类病害的两类病原菌，为桑树健康种苗的生产和引进、抗病育种提供有效的监控手段。
2、多重PCR技术虽然有应用在某些疾病病原菌的检测，但是由于不同引物其退火温度不同、反应体系不同等技术问题，使得利用多重PCR进行检测时无法摸索出适宜的反应条件，而不得不放弃使用多重PCR这个技术进行检测的技术难点；因此，目前还未发现关于桑青枯病一步检测两个病原菌的反应引物及体系，而本申请通过大量持续研究，经过申请人近7年的努力，找到了适合桑青枯类病害病原菌一步检测的引物及反应系统，能快速实现对桑青枯类病害病原菌的一步检测，该引物错配率低，配合PCR反应系统反应得到的条带清晰、稳定，能快速的进行青枯类病害的一步检测。
【附图说明】
图1是本申请实施例试剂盒体系对两种病原菌的检测验证图；
其中M为D2000DNA Marker，条带从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；编号1、4、6号为肠杆菌菌株；2号为空白组(ddH2O)；5号为肠杆菌和拉尔氏菌的混合菌株；3号为拉尔氏菌菌株。
图2是本申请实施例用试剂盒检测广西不同采样地受桑树青枯类病害侵染的样品DNA检测图。
其中M为D2000DNA Marker，条带从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；
编号1-13分别为：1、上林西燕镇北林村(GX-E008)；2、上林西燕镇(GX-E029)；3、象州中平镇仁义村(GX-E024)；4、贵港八唐镇(GX-E038)；5、融安仁义镇(GX-E003)；6、忻城北更乡(GX-E026)；7、ddH2O(ck)8、象州中平镇罗汉村(GX-E021)9、宜州板围镇(GX-E006)；10、农科院(无病害)(nky-1)；11、宾阳义和村(GX-E062)；12、横县旧兰村(GX-E063)13、融安仁义镇(GX-E004)。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例：
一种检测桑树青枯类病害的方法，该方法包括如下步骤：
(1)引物的设计：
根据桑树青枯类病害病原菌的侵染情况，研发出能检测拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)和肠杆菌属(Eenterbacter spp.)的引物，
引物对1正向引物：5′-acgccagttaccgatctggagcagt-3′(SEQ ID No.1)
引物对1反向引物：5′-ttagccgtcagaataaca-3′(SEQ ID No.2)
引物对2正向引物：5′-cccactgctccgtcccgtaggagt-3′(SEQ ID No.3)
引物对2反向引物：5′-gggggtagcttctgacctgcc-3′(SEQ ID No.4)
(2)建立试剂盒PCR试剂的反应体系，体系如下：
PCR反应程序：
(3)检验试剂盒对病原菌的检测能力：
步骤一：分别提取含有菌株为肠杆菌DNA和/或拉尔氏菌病原菌DNA的样品；
步骤二：将步骤一的样品与本申请的引物组混合，在(2)的PCR反应体系和PCR反应程序中进行反应、凝胶电泳检测；
步骤三：根据反应条带分析各样品的病原菌，有如下几种情况：
1、如果PCR扩增产物大小为678bp的片段，则说明样品为肠杆菌属(Eenterbacterspp.)侵染；
2、如果PCR扩增产物大小为287bp的片段，则说明样品为拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)侵染。
3、如果PCR扩增产物有两条带，为678bp和287bp片段，则说明样品为肠杆菌属(Eenterbacter spp.)和拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)两种病原菌复合侵染。
4、如果PCR扩增产物没有扩增产物，说明样品中不含病原菌。
因此，申请人预先制备样品1-6号，其中，1号、4号、6号为肠杆菌(Eenterbacterspp.)，3号菌株为拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；2号为空白组(ddH2O)；5号为肠杆菌(Eenterbacter spp.)和拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的混合。(制样与PCR验证的为不同人，且PCR实验的操作人不清楚样本病原菌情况)。
步骤一的病原菌DNA的提取方法为：煮沸法，即，从30℃培养了24h的平皿上用接种环挑取一个新鲜的完整菌苔放于0.5mL灭菌水中，充分震荡混匀。在100℃沸水条件下煮5min，快速转入冰水混合物中冰浴10min，在1200r/min条件下离心8min，取上清液作为模板DNA溶液。
按照步骤(2)的PCR试剂盒和PCR反应程序进行PCR反应，结果如图1所示，在1-6号条带中，1、4、6号条带大小为700bp左右；3号条带大小为300bp左右；2号无条带；5号条带有700bp和300bp，说明本申请的试剂盒可同步检测出肠杆菌(Eenterbacter spp.)和拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
(4)对桑树青枯类病害的检测效果：
S1：取样提取桑树样品DNA：
在广西各地(南宁、桂林、河池等不同县份)不同地点进行取样，取样方法为：用刀片或锐利器械刮取桑树木质部疑似病灶位置成绒毛状，将其放置与EP管中，加入800ul SDS提取液，盖紧震荡；转移EP管至100℃沸水煮沸15min后迅速转移至冰水混合物中冷却15min，震荡离心、12000rpm、10min，取上清液即得到桑树样品的DNA，将该上清液置于-20℃的冰箱中保存。
上述取样方法优势在于：前处理全过程只需1小时，即可直接用于PCR扩增。对于桑树样品的病害诊断具有大幅节约时间、提高检测速率的优点。
S2：采用步骤S1的方法提取多个桑树DNA样品(12个)，其中有11个为广西各地市提取到的疑似桑青枯类病害桑树样本，1个为农科院内新鲜采集的健康桑树样本；再设置一个ddH2O阴性对照组；采集好样本DNA后，用本申请的试剂盒即反应体系分别对各样品的DNA进行PCR检测，结果如图2所示，最终检出：4个为肠杆菌阳性；3个为拉尔氏菌阳性；4个为拉尔氏菌和桑肠杆菌双阳性；农科院的无病害桑树和ddH2O组为阴性，未扩增出PCR产物，具体情况见表1：
表1试剂盒对14个桑树样品直接进行检测的结果
如表1所示，使用本申请的试剂盒可准确的对桑树青枯类病害的两种病原菌同时进行检测、区分，高效、快速、准确；而且，检测结果不受桑树地域、品种的限制。
综上所述，使用的试剂盒和PCR试剂能同时、有效且快速的检测出，桑树的青枯类病害感染是由病原菌拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)还是肠杆菌属(Eenterbacterspp.)引起的，利用该试剂盒可同步同时检出桑树青枯类病害的两类病原菌，为桑树健康种苗的生产和引进、抗病育种提供有效的监控手段。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120> 一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用
<140> 2019107325045
<141> 2019-08-09
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgccagtta ccgatctgga gcagt 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttagccgtca gaataaca 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccactgctc cgtcccgtag gagt 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggggtagct tctgacctgc c 21
Claims (2)
1.一种检测或辅助检测桑树青枯类病害的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)用引物组对待测桑树样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)检测所述PCR扩增产物的大小；
若所述PCR扩增产物大小为678bp的片段，则桑树青枯类病害的感染病原是肠杆菌属(Enterobacterspp.)；
若所述PCR扩增产物大小为287bp的片段，则桑树青枯类病害的感染病原是拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)；
若PCR扩增产物有两条带，为678bp和287bp片段，则说明样品为肠杆菌属(Enterobacter spp.)和拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)两种病原菌复合侵染；
若PCR扩增产物没有扩增产物，说明样品中不含病原菌；
所述引物组包含引物对1和引物对2；所述引物对1的上游引物为SEQ ID No.1；下游引物为SEQ ID No.2；所述引物对2的上游引物为SEQ ID No.3；下游引物为SEQ ID No.4；
所述PCR扩增反应的体系为：PCRMastermix试剂12.5ul；10μmol/l的引物对1正向引物1ul；10μmol/l的引物对1反向引物1ul；10μmol/l的引物对2正向引物1ul；10μmol/l的引物对2反向引物1ul；模板DNA1ul；ddH2O7.5ul；
所述PCR扩增反应程序为：96℃预变性2min；94℃变性20s，68℃退火20s，72℃延伸30sec，总共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃终止反应。
2.根据权利要求1所述的方法在检测或辅助检测桑树青枯类病害病原菌是拉尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)和/或肠杆菌属(Enterobacterspp.)中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910732504.5A CN110564875B (zh) | 2019-08-09 | 2019-08-09 | 一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910732504.5A CN110564875B (zh) | 2019-08-09 | 2019-08-09 | 一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110564875A CN110564875A (zh) | 2019-12-13 |
| CN110564875B true CN110564875B (zh) | 2023-08-18 |
Family
ID=68775014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910732504.5A Active CN110564875B (zh) | 2019-08-09 | 2019-08-09 | 一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110564875B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101724692A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-06-09 | 浙江大学 | 用于诊断桑细菌性枯萎病的引物及诊断方法 |
| WO2012147928A1 (ja) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | 国立大学法人広島大学 | 青枯病予防剤および青枯病の予防方法 |
| CN105296479A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-02-03 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用 |
| ES2592352A1 (es) * | 2015-05-26 | 2016-11-29 | Universitat De Valencia (Estudi General) | Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos |
| JP2017035048A (ja) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 核酸、プライマーセットおよびこれを用いたカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルムの検出方法 |
| CN108441569A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-08-24 | 华南农业大学 | 桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在检测阴沟肠杆菌方面的应用 |
-
2019
- 2019-08-09 CN CN201910732504.5A patent/CN110564875B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101724692A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-06-09 | 浙江大学 | 用于诊断桑细菌性枯萎病的引物及诊断方法 |
| WO2012147928A1 (ja) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | 国立大学法人広島大学 | 青枯病予防剤および青枯病の予防方法 |
| ES2592352A1 (es) * | 2015-05-26 | 2016-11-29 | Universitat De Valencia (Estudi General) | Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos |
| JP2017035048A (ja) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 核酸、プライマーセットおよびこれを用いたカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルムの検出方法 |
| CN105296479A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-02-03 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用 |
| CN108441569A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-08-24 | 华南农业大学 | 桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在检测阴沟肠杆菌方面的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Umesha等.Multiplex PCR for simultaneous identification of Ralstonia solanacearum and Xanthomonas perforans.3 Biotech.2015,第5卷(第3期),245-252. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110564875A (zh) | 2019-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107937599B (zh) | 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb2、引物及应用 | |
| Carvalho et al. | Development of a qPCR for Leifsonia xyli subsp. xyli and quantification of the effects of heat treatment of sugarcane cuttings on Lxx | |
| CN106702029B (zh) | 一种同步检测5种西瓜病毒的多重rt-pcr方法及其应用 | |
| CN111534621A (zh) | 用于橡胶树胶孢炭疽菌实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法 | |
| CN107557446A (zh) | 用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN106868164B (zh) | 一种用于检测樟疫霉菌的引物及巢式pcr检测方法 | |
| CN106399511A (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物 | |
| CN112646914B (zh) | 一种快速检测桃枝枯病菌的lamp引物组及其快速检测的方法和试剂盒 | |
| CN112899404B (zh) | 鳜蛙虹彩病毒的Nested-RAA检测引物对及其应用和检测方法 | |
| CN108315471B (zh) | 鉴定根肿病菌4号生理小种的特异基因、特异性引物、含有所述引物的试剂盒及其应用 | |
| CN104651493A (zh) | 快速鉴定辣椒疫霉PcORP1基因核苷酸点突变及其对氟噻唑吡乙酮抗药性的方法 | |
| CN103866038B (zh) | 用于检测烟草对tmv抗性的n基因特异性引物对、检测方法及试剂盒 | |
| Zhao et al. | Field detection of canker-causing bacteria on kiwifruit trees: Pseudomonas syringae pv. actinidiae is the major causal agent | |
| CN110564875B (zh) | 一种可快速检测桑树青枯类病害的引物组、试剂、试剂盒及应用 | |
| CN102796825B (zh) | 特异性检测旱稻孢囊线虫的pcr方法 | |
| Li et al. | PCR detection of ratoon stunting disease pathogen and natural resistance analysis in sugarcane core germplasms | |
| CN112522254B (zh) | 一种检测番茄青枯病抗性位点Bwr12的分子标记及应用 | |
| CN107937593A (zh) | 芸苔根肿病菌的特异性pcr引物及检测方法 | |
| AU2021103185A4 (en) | Primer group, reagent, kit and application for rapidly detecting bacterial wilt disease of mulberry trees | |
| CN112280890A (zh) | 一种基于rpa-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法 | |
| CN108034771A (zh) | 西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重pcr方法 | |
| CN111118038B (zh) | 一种冬生疫霉的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用 | |
| CN103981264B (zh) | 一种利用实时荧光定量pcr进行谷子锈病早期诊断的技术 | |
| CN111057777B (zh) | 鉴定野油菜黄单胞菌9号生理小种的分子标记、引物对及其应用 | |
| CN113430289B (zh) | 一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230727 Address after: 530007, 174 East University Road, the Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning Applicant after: GUANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Address before: 530007, 174 East University Road, the Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning Applicant before: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |