ES2592352A1 - Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos - Google Patents

Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos. Se divulga la caracterización estructural, secuencia genómica y actividad de tres bacteriófagos líticos específicos de R. solanacearum. Se trata de podovirus, que, entre 4ºC y 30ºC, presentan una elevada estabilidad en medio acuoso en ausencia de huésped. Por su alta estabilidad, actividad lítica, elevada especificidad por R. solanacearum y la ausencia de actividad frente a la microbiota asociada a las plantas a proteger, se propone su uso para el control biológico de R. solanacearum en cursos fluviales y aguas de riego, así como un procedimiento para prevenir y/o controlar la marchitez producida por dicha bacteria en el que al menos uno de dichos bacteriófagos, o combinaciones de ellos, se aportan a las plantas y/o suelo en el agua de riego.

Description

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En el caso concreto del agente fitopatógeno R. solanacearum, cuyos hábitats son las plantas huésped y el suelo, un agente biológico que sea suministrado por medio del agua debe tener características biológicas que le permitan sobrevivir en ese medio, que no es el habitual ni de la bacteria ni de sus bacteriófagos específicos. Si dicha supervivencia resulta ser prolongada y los bacteriófagos mantienen su actividad lítica sobre el huésped tras largos períodos en el agua, además se favorece su aplicabilidad en el campo, ya que pueden vehicularse directamente a través de ese medio natural y simple como es el agua, sin necesidad de encapsularlos o de añadir otros soportes físicos y/o biológicos para proteger su viabilidad hasta el encuentro con la célula diana. Esa alta supervivencia facilitaría también la preparación de su presentación comercial, que podría ser en medio acuoso sin requerir condiciones de refrigeración (o incluso temperaturas inferiores) para su mantenimiento.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los bacteriófagos son parásitos intracelulares obligados y, como tales, necesitan de la célula huésped para su perpetuación. Puesto que se vehiculan hacia esta célula por diferentes vías, según los tipos de bacteriófagos y tipos de células huésped, es esperable un tiempo de supervivencia en el medio ambiente que les permita contactar con la célula huésped. Es conocido que este tiempo puede ser variable entre distintos bacteriófagos, siendo necesario su estudio en cada caso particular. Así, por ejemplo, se observan variaciones apreciables en la supervivencia de bacteriófagos del mismo serotipo/genotipo (Brion et al., 2002) o, incluso, entre bacteriófagos de bacterias acuáticas patógenas de peces, cuyo hábitat natural es el agua (Pereira et al., 2011). En este último caso se ha llegado a considerar como buena una supervivencia de los bacteriófagos de tres meses en agua, aceptándose que los bacteriófagos que presentan mayor supervivencia en agua son buenos candidatos para el control de enfermedades bacterianas de peces en sistemas de cultivo acuáticos (Pereira et al., 2011).
Debe hacerse notar que R. solanacearum es una bacteria fitopatógena cuyo medio natural es el xilema de las plantas y con frecuencia el suelo, pero no el agua. Al no tratarse de una bacteria autóctona de ambientes acuáticos, no es esperable una alta supervivencia en agua de bacteriófagos específicos de la misma. De hecho, en ninguna de las publicaciones y patentes anteriormente comentadas se describe la viabilidad y actividad lítica de bacteriófagos líticos específicos de la especie anteriormente denominada R. solanacearum en agua medioambiental en ausencia de células huésped.
Y, sin embargo, sería interesante disponer de bacteriófagos líticos específicos frente a R. solanacearum, particularmente que mostraran un amplio espectro de cepas de dicha
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Por tanto, los tres bacteriófagos por separado, así como las combinaciones de los mismos, cumplen las características deseables para agentes de control biológico como son la alta especificidad por la célula huésped, no suponiendo un riesgo para la microbiota del agua, suelo o plantas, por ser específicos frente a R. solanacearum. Tampoco suponen una amenaza para la salud del ser humano, animales o plantas, al tratarse de virus bacteriófagos que sólo infectan bacterias. Son activos, además, en un rango de pH compatible con las características de distintos cursos fluviales de la geografía española, y en un rango de temperaturas compatible con las características de los mismos. Ello apoya el uso de los bacteriófagos de la presente invención, de forma individual o como combinaciones de los mismos, y el de las composiciones que comprenden dichos bacteriófagos, para el control de R. solanacearum, ya sea en agua de cursos naturales de agua como los ríos, arroyos o riachuelos, reservorios naturales de agua como lagos, lagunas, charcas, manantiales y acumulaciones subterráneas, reservorios artificiales de agua como embalses, depósitos cubiertos, tanques, estanques (con cubierta superficial o sin ella), pozos, agua de riego en general y reservorios de la misma como los reservorios naturales o artificiales antes citados.
En ese sentido, los datos de campo recopilados por los presentes inventores sobre las aguas naturales contaminadas con R. solanacearum en las distintas comunidades autónomas españolas revelan que en los meses estivales (que es cuando se detecta la bacteria en agua y se prohíbe su uso para riego) las temperaturas diurnas más altas de estas aguas oscilan entre 13ºC y 17ºC, disminuyendo por la noche. Así, por ejemplo, en Salamanca y Guadalajara las temperaturas de las aguas muestreadas varían entre 14ºC y 4ºC. Además, en los distintos países del centro y norte de Europa con aguas medioambientales contaminadas con R. solanacearum las temperaturas son más bajas en los meses de verano. Por tanto, el rango de actividad observado para los bacteriófagos de la presente invención es compatible con su utilización en cursos naturales de agua, en particular de España. También lo es su rango de pH de actuación. Sin embargo, no es sencillo añadir bacteriófagos a un curso fluvial de agua en cantidad suficiente para conseguir el control efectivo de microorganismos en los mismos, en especial en el lugar concreto donde esa agua pueda desear utilizarse para regar, pues los bacteriófagos quedarán muy diluidos y serán transportados con el curso de agua a lo largo del mismo por lo que, aunque su tiempo de supervivencia sea muy alto, no se favorece que los bacteriófagos contacten con la célula huésped en el tramo de curso de agua que pueda ser de interés, salvo que los bacteriófagos se añadan a cursos de agua cortos y/o de reducido caudal, como riachuelos, regatos y canalizaciones artificiales, especialmente las que conduzcan a un reservorio donde el agua vaya a tener un tiempo
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temperaturas de ensayo durante más de 5 meses, y que su supervivencia con actividad lítica alcance períodos de tres años.
Por tanto, los bacteriófagos de la presente invención presentan como característica particularmente novedosa su supervivencia durante más de 5 meses en agua natural en ausencia de la célula huésped. Esto supone una característica adecuada y muy ventajosa para un agente de control biológico, que debe tener características que le permitan sobrevivir en el medio en el que se pretende aplicar que, en este caso, es el agua.
Gracias a ello, es compatible con la aplicación del método y el uso de la presente invención que la composición que contiene los bacteriófagos se mantenga durante su almacenamiento y/o utilización, preferiblemente, a una temperatura comprendida en el rango de 4ºC y 24ºC, ambas incluidas, que puede considerarse un intervalo medioambiental habitual, aunque, dado que los bacteriófagos de la invención son activos hasta 31ºC, dicho intervalo puede extenderse al intervalo de 4ºC a 30ºC, ambos incluidos, a pesar de que este último valor no sea habitual en reservorios de agua medioambiental. Como ya se discutió anteriormente, también se consideran adecuadas condiciones donde la temperatura media del agua del reservorio esté comprendida entre 4ºC y 24ºC, ambos valores incluidos, dadas las fluctuaciones de temperatura ambiental diarias y estacionales. Esto facilita que las composiciones de la presente invención puedan mantenerse fácilmente durante largo tiempo previamente a su aplicación, en forma de suspensiones en las que los bacteriófagos se encuentran en un vehículo acuoso que puede ser agua (medioambiental, natural, destilada, previamente esterilizada,
o sometida a otro tratamiento habitual para los vehículos acuosos) o una solución acuosa (tal como solución salina estéril, tampón fosfato salino, etc) y lista para utilizar y aplicar directamente cuando sea necesario. Por tanto, las composiciones de la presente invención, que pueden comprender cualquier vehículo o excipiente agronómicamente aceptable, pueden estar en forma líquida, por ejemplo en forma de suspensión acuosa, que se puede preparar en agua o en una solución acuosa y/o sus diluciones. Y en esta misma forma pueden usarse para el control de R. solanacearum y aplicarse con el método de prevención o tratamiento de la marchitez provocada por dicha bacteria, pudiendo estar por tanto listas para su aplicación directa desde su forma de comercialización y almacenamiento.
La elevada supervivencia, con mantenimiento de la actividad lítica sobre el huésped, de los bacteriófagos de la presente invención, favorece su aplicabilidad en el campo, ya que pueden vehicularse directamente a través del agua, un medio natural y simple, sin necesidad de encapsularlos o de añadir otros soportes físicos, químicos y/o biológicos
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CÓDIGO CEPA
PAÍS DE ORIGEN HUÉSPED AÑO
Cepas internacionales
NCPPBa 1115
Reino Unido (Ex Egipto) Patata 1961
NCPPB 1584
Chipre Patata 1963
NCPPB 2505
Suecia Patata 1972
NCPPB 2797
Suecia Solanum dulcamara 1974
BR 264
Reino Unido Solanum dulcamara 1993
Bordeaux 11-47
Francia Berenjena 1994
Nantes 9-46
Francia Tomate 1994
550
Bélgica (Ex Turquía) Patata 1995
IPO-1609
Holanda Patata 1995
Port 448
Portugal Patata 1995
W 12
Bélgica Patata 1996
WE 4-96
Reino Unido Agua de río 1996
Tom 1
Reino Unido Tomate 1997
Cepas españolas
IVIAb-1602.1
Canarias Patata 1996
IVIA-2049.53
Canarias Suelo 1999
IVIA-2068.58a
Canarias Patata 1999
IVIA-2068.61a
Canarias Patata 1999
IVIA-2093.3.1
Canarias Patata 1999
IVIA-2093.5T.1a
Canarias Patata 1999
IVIA-2128.1b
Castilla-León Patata 1999
IVIA-2128.3a
Castilla-León Patata 1999
IVIA-2167.1a
Castilla-León Agua de río 1999
IVIA-2167.2b
Castilla-León Agua de río 1999
IVIA-2528.A1-2
Castilla-León Agua de río 2001
IVIA-2528.A3.1
Castilla-León Agua de río 2001
IVIA-2528.54.A2
Castilla-León Agua de río 2001
IVIA-2751.11
Extremadura Agua de río 2003
IVIA-2762.1
Extremadura Tomate 2003
IVIA-2762.4
Extremadura Tomate 2003
IVIA-3090.1
Andalucía Tomate 2005
IVIA-3090.5
Andalucía Tomate 2005
IVIA-3205.A.22
Castilla-La Mancha Agua de río 2006
IVIA-3243
Andalucía Tomate 2006
IVIA-3359.9
Castilla-La Mancha Agua de río 2007
IVIA-3359.10
Castilla-La Mancha Agua de río 2007
aNCPPB: National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Reino Unido. bIVIA: Colección de Bacterias del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, España.
Las cepas de la NCPPB están disponibles en esta colección internacional. El resto de cepas está disponible en la colección de bacterias fitopatógenas del IVIA.
También se ensayó la especificidad frente a otras especies de bacterias fitopatógenas y diversos aislados bacterianos de agua de río, para evaluar el posible impacto de los bacteriófagos aislados sobre la microbiota del agua natural.
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VP4 y, sobre todo, Rhizobium RHEph01, todos ellos del tipo de los bacteriófagos similares a T7 (T7-like) (Tabla 4). Estas regiones (correspondientes al 5-23% del genoma completo de los bacteriófagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2) pertenecen a regiones altamente conservadas.
Tabla 4. Comparación de las secuencias de los genomas de los bacteriófagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 con genomas de varios bacteriófagos T7-like.
Secuencia comparada (SEQ ID NO:)
Genoma del virus con la secuencia patrón de comparación (nº Acceso GenBank) Cobertura* Identidad**
1
Φ Ralstonia RSB1 (AB597179.1) 2% 84%
1
Φ T7 (NC_001604.1) 5% 67%
1
Φ Rhizobium RHEph01 (JX483873.1) 19% 68%
1
Φ Vibrio VP4 (NC_007149.1) 5% 70%
2
Φ Ralstonia RSB1 (AB597179.1) 15% 66%
2
Φ T7 (NC_001604.1) 5% 67%
2
Φ Rhizobium RHEph01 (JX483873.1) 23% 68%
2
Φ Vibrio VP4 (NC_007149.1) 4% 70%
3
Φ Ralstonia RSB1 (AB597179.1) 15% 66%
3
Φ T7 (NC_001604.1) 5% 67%
3
Φ Rhizobium RHEph01 (JX483873.1) 22% 68%
3
Φ Vibrio VP4 (NC_007149.1) 2% 70%
* Homología entre las secuencias de los genomas comparados, en porcentaje. ** Nucleótidos coincidentes dentro de las zonas de homología de los genomas comparados, en porcentaje.
10 Estos resultados revelan que, excepto en estas zonas conservadas dentro de los bacteriófagos T7-like, los genomas de los bacteriófagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 contienen una secuencia nucleotídica altamente divergente de la de los demás bacteriófagos depositados en el GenBank. Por lo tanto, estas elevadas diferencias en secuencia nucleotídica avalan que los bacteriófagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y
15 vRsoP-WR2 corresponden a una nueva especie dentro del género de los virus T7-like.
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con este patógeno, como en la prevención y/o control de la enfermedad que causa en campo. Esta capacidad de biocontrol es especialmente importante si se tiene en cuenta que no hay actualmente métodos de control eficaces en suelo, ni disponibles en agua. Y, en el presente caso, como se ha discutido previamente y se demuestra en los experimentos anteriores, los agentes de biocontrol proporcionados por la presente invención presentan la inesperada característica de su elevada supervivencia en agua en condiciones de temperatura medioambiental habituales en España, lo que es una ventaja tanto para su aplicación a las plantas mediante el agua de riego y para el control y prevención de la presencia de R. solanacearum en la misma, como para el fácil y prolongado mantenimiento de las formas de comercialización de los bacteriófagos de la invención previamente a su utilización. Dicho mantenimiento puede tener lugar en medio acuoso durante largo tiempo sin pérdidas severas de la actividad lítica y ni siquiera requeriría, antes de su aplicación directa al agua, de la dilución previa de los bacteriófagos o de su mezcla con algún tipo de soporte físico o químico que actuara como vehículo para facilitar su interacción con la bacteria diana o que garantizara su estabilidad hasta conseguirlo, de forma que la aplicación al agua de riego o a corrientes o reservorios de agua en los que se quiera controlar posibles contaminaciones con R. solanacearum podría ser, por ejemplo, por simple vertido sobre dicha agua.
Depósito de microorganismos
Los bacteriófagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2, con capacidad para lisar células de R. solanacearum han sido depositados en la colección alemana de cultivos microbianos Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche-Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, siguiendo las normas del Tratado de Budapest para el depósito de microorganismos para fines de patentes, en las siguientes fechas y se les ha asignado el siguiente número de acceso (Tabla 5).
Tabla 5. Datos del depósito de los bacteriófagos en la colección alemana DSMZ.
Material
Fecha de Depósito Número de acceso
vRsoP-WF2
15 de abril de 2015 DSM 32039
vRsoP-WM2
15 de abril de 2015 DSM 32040
vRsoP-WR2
15 de abril de 2015 DSM 32041
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Claims (1)

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