ES2592352B2 - Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la prevención y/o el control biológico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a través del uso de bacteriófagos útiles para ello y composiciones de los mismos.#Se divulga la caracterización estructural, secuencia genómica y actividad de tres bacteriófagos líticos específicos de R. solanacearum. Se trata de podovirus, que, entre 4ºC y 30ºC, presentan una elevada estabilidad en medio acuoso en ausencia de huésped. Por su alta estabilidad, actividad lítica, elevada especificidad por R. solanacearum y la ausencia de actividad frente a la microbiota asociada a las plantas a proteger, se propone su uso para el control biológico de R. solanacearum en cursos fluviales y aguas de riego, así como un procedimiento para prevenir y/o controlar la marchitez producida por dicha bacteria en el que al menos uno de dichos bacteriófagos, o combinaciones de ellos, se aportan a las plantas y/o suelo en el agua de riego.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la prevention y/o el control biologico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum, a traves del uso de bacteriofagos utiles para ello y composiciones de los mismos

Campo tecnico

La invention se refiere al control biologico de organismos patogenos para cultivos vegetales. Mas concretamente, la invention se refiere a un procedimiento para la prevencion y/o el control biologico de la marchitez causada por la bacteria Ralstonia solanacearum, a bacteriofagos utiles para ello y al uso de dichos bacteriofagos y de composiciones que los contengan para el control biologico de dicha bacteria.

Antecedentes de la invention

R. solanacearum produce marchitez bacteriana en todo el mundo, en mas de 200 especies vegetales pertenecientes a mas de 50 familias botanicas, y muchas de estas especies susceptibles a este patogeno son de interes agronomico. Tambien hay muchos otros cultivos que son colonizados por la bacteria, pero que no desarrollan slntomas, a los que se considera cultivos tolerantes. Esta bacteria ataca especialmente a cultivos basicos como la patata en mas de ochenta palses, con perdidas que superan los 950 millones de dolares. Por este motivo, esta considerada como un potencial agente de bioterrorismo y, en la Union Europea (UE), como un organismo de cuarentena (Anonimo 2000: Directiva del Consejo 2000/29/EC), por lo que esta sometida a estrictas medidas de prevention y control reguladas por dos Directivas europeas (Anonimo 1998, 2006: Directiva del Consejo 98/57/EC y Directiva de la Comision 2006/63/EC).

R. solanacearum presenta una gran diversidad intraespeclfica, por lo que durante mucho tiempo se ha considerado un complejo de especies formado por cuatro grupos filogeneticos o filotipos. En 2014, tras una revision taxonomica, se ha propuesto una reclasificacion de este complejo (Safni et al., 2014). Los filotipos I y III de R. solanacearum se han clasificado en la nueva especie R. pseudosolanacearum y el filotipo IV en la nueva subespecie R. syzygii subsp. indonesiensis. El filotipo II mantiene el nombre de la especie R. solanacearum.

En el texto del presente documento se utiliza el termino "especie anteriormente denominada R. solanacearum”, para hacer referencia a R. solanacearum en trabajos, datos, patentes, publicaciones, bibliografla, etc, previos a la revision taxonomica de Safni

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y colaboradores (2014), independientemente de si la denomination se corresponde o no con la clasificacion actual. Asimismo, se utilizara el termino “R. solanacearum”, para hacer referencia a la especie R. solanacearum tal y como se ha descrito tras la citada revision taxonomica, es decir, la especie constituida unicamente por cepas de filotipo II.

En Espana, como en la mayor parte de palses de la UE, ha habido focos de la enfermedad causados por R. solanacearum en varias zonas, generalmente en patata y en algunos casos en tomate. En todos los focos se han aplicado las medidas de erradicacion establecidas en la legislation correspondiente. Sin embargo, esta bacteria puede sobrevivir en el medio ambiente, en agua, suelo u otros reservorios (Alvarez et al., 2007, 2008, 2010). Asl, focos posteriores se han asociado al riego con aguas superficiales contaminadas con esta bacteria (Caruso et al., 2005), ya que estas constituyen una de las principales vlas de introduction y diseminacion del patogeno en nuevas areas, a las que llega a traves del agua de riego. De hecho, se ha descrito la presencia de R. solanacearum en diversos cursos de agua tanto de Espana como de practicamente todos los palses de la UE. Por ello, las Directivas de la UE prohlben el riego con agua contaminada con esta bacteria.

Esto representa un problema de caracter practico al agricultor, ya que los principales cultivos afectados son de regadlo (tomate y patata) y el agua de riego es un bien escaso en Espana y otros palses de la cuenca mediterranea, donde la bacteria tambien esta presente. Asimismo, en las parcelas en las que se han detectado focos de la enfermedad, no se pueden cultivar plantas huesped en un perlodo de al menos 4 anos desde la detection del foco.

La gran capacidad de supervivencia de R. solanacearum en el medio ambiente (agua, suelo u otros reservorios) hace que su control se vea dificultado. En el pasado y hasta el momento presente, se recurre al control a traves de las practicas culturales y el control qulmico. Asl, en las zonas del mundo donde esta presente este patogeno en el suelo, normalmente en palses en vlas de desarrollo, es problematico el cultivo de plantas huesped y los metodos de control mas utilizados son los culturales con resultados variables. Tambien se han obtenido cultivares resistentes, sin embargo, la resistencia puede ser inestable (Hartman y Elphinstone, 1994).

Con respecto al control por tratamientos qulmicos o flsicos, en general no son eficaces. La aplicacion de compuestos de cobre, antibioticos y fumigantes del suelo se ha utilizado sin mucho exito (Lopez y Biosca, 2005), y ademas es costosa y con gran impacto para el medio ambiente. Otros tratamientos qulmicos como la cloracion o tratamientos flsicos

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como la radiacion ultravioleta de agua contaminada con patogenos bacterianos, ven muy afectada su eficacia por la presencia de partlculas en el agua, incluso las de tamano muy pequeno (Marco-Noales et al., 2008). Ademas, se ha demostrado que ambos tratamientos desinfectantes pueden inducir en diversas bacterias la entrada en el estado viable pero no cultivable (VBNC) (Oliver et al., 2005; Santander et al., 2012) o causar danos celulares reversibles (McFeters y LeChevallier, 2000). Estas celulas bacterianas en estado VBNC o con danos reversibles pueden recuperar la cultivabilidad y patogenicidad mediante contacto con plantas huesped susceptibles (Santander et al., 2012). Estas circunstancias demuestran la necesidad de metodos alternativos que, preferiblemente, destruyan las celulas bacterianas.

Una alternativa serla el control biologico mediante el uso de bacteriofagos especlficos de R. solanacearum. Esta estrategia de biocontrol ha dado buenos resultados en el tratamiento de otras enfermedades producidas por bacterias fitopatogenas (Jones et al., 2007).

En esa llnea, la patente de Japon JP4532959-B2 (numero de publication JP2005278513) describe tres tipos de bacteriofagos con actividad bacteriolltica sobre cepas japonesas de la especie anteriormente denominada R. solanacearum y desde 2014 pertenecientes a la nueva especie R. pseudosolanacearum. El tipo 1, con genoma de ADN bicatenario (dsDNA) de unos 250 kpb, y los tipos 2 y 3, con un genoma de ADN monocatenario (ssDNA) de tamano 4,5 y 6 kpb respectivamente. Los bacteriofagos se caracterizan y distinguen por el tamano de su genoma y su actividad frente a seis cepas de la bacteria (C319, M4S, Ps29, Ps65, Ps72 y Ps74), todas las cuales son sensibles a los bacteriofagos de tipo 1, mientras que los de tipo 2 solo lisan a una (la cepa C319) y los de tipo 3 lisan a cuatro de las seis cepas (M4S, Ps29, Ps65 y Ps74) y en algun ensayo a una quinta (la C319). Los ensayos con endonucleasas de restriction se han realizado solo con bacteriofagos del tipo 1 y muestran que su genoma (dsDNA) presenta dianas frente a PstI y Kpnl, pues en los perfiles de restriccion obtenidos se observan varias bandas distintas. Por ultimo, se describe el uso de dos de los tres tipos de bacteriofagos (tipos 1 y 2) para el control de la enfermedad causada por la especie anteriormente denominada R. solanacearum (actualmente R. pseudosolanacearum), mediante su adicion al suelo de cultivo donde crece la planta a proteger.

La patente japonesa JP4862154-B2 surge por una limitation de la anterior ya que, como ellos mismos indican, "no es suficiente para controlar el efecto”. En esta segunda patente incluyen un nuevo tipo de bacteriofago con actividad Utica frente a todas las cepas de la especie anteriormente denominada R. solanacearum que ensayan (solo un numero de 15

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cepas) y realizan su caracterizacion, pero no demuestran su capacidad para el biocontrol, ya que no realizan ensayos de biocontrol en planta con este nuevo tipo de bacteriofago. En definitiva, la segunda patente solo aporta un nuevo tipo de bacteriofago lrtico con un rango de huespedes aparentemente mas amplio que los tipos anteriores.

Yamada y colaboradores (2007) describen el aislamiento de cuatro tipos de bacteriofagos que infectan espedficamente a cepas de la especie anteriormente denominada R. solanacearum y desde 2014 pertenecientes a la nueva especie R. pseudosolanacearum, a partir de muestras de suelo tomadas en distintas areas de Japon. Estos autores realizan una caracterizacion estructural que incluye una caracterizacion morfologica por microscopia electronica de los viriones y una caracterizacion molecular por analisis de restriccion de los cuatro tipos de bacteriofagos, y algunos ensayos de actividad lrtica con cultivos de la bacteria en placa. Dos de los tipos de bacteriofagos descritos son del tipo de los miovirus, el genero al que pertenedan todos los bacteriofagos que infectaban a la especie anteriormente denominada R. solanacearum (actualmente R. pseudosolanacearum) descritos antes de la publicacion del articulo de Yamada y colaboradores, y los otros dos tipos son bacteriofagos filamentosos del tipo de los inovirus. Entre otras aplicaciones, se sugiere la utilidad de bacteriofagos con actividad lrtica como agentes de biocontrol para la erradicacion de la especie anteriormente denominada R. solanacearum (actualmente R. pseudosolanacearum) en suelos contaminados y la prevencion de la marchitez provocada por dicha bacteria en cultivos vegetales, mostrando preferencia por los bacteriofagos capaces de infectar un amplio rango de cepas patogenas, aunque solo ensayan 15 cepas de este huesped. Los unicos ensayos realizados con plantas incluidos en dicho articulo se refieren al efecto observado al inyectar a la planta una cepa previamente infectada con uno de los bacteriofagos lisogenicos aislados, concluyendo que ese fago filamentoso no resulta satisfactorio para el control de la enfermedad. Este mismo metodo de ensayo ha sido utilizado en otros trabajos del mismo grupo tambien con bacteriofagos filamentosos de la familia Inoviridae [vease Addy et al., 2012 y la solicitud de patente internacional WO2012/147928], donde se demuestra que dicho metodo de inoculacion, para el caso del bacteriofago lisogenico del tipo 0RSM, da lugar a la aparicion de cepas avirulentas de R. solanacearum que ayudan a controlar la enfermedad provocada por las formas virulentas de dicha bacteria. Sin embargo, ademas de que los ensayos de inoculacion se han realizado solamente en 5 plantas por cepa y sin repeticion [ver material y metodos de Addy et al., 2012], la aplicacion practica de este metodo de ensayo en vivero o en campo es altamente cuestionable debido a la laboriosidad que requiere la inyeccion individual de cada una de las plantas.

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En otro artlcuio del mismo grupo investigador (Fujiwara et al., 2011) se aportan resultados de ensayos que demuestran la utilidad como agentes de biocontrol sobre la especie anteriormente denominada R. solanacearum (actualmente R. pseudosolanacearum) de dos de los tipos de bacteriofagos de la familia Myoviridae descritos por Yamada y colaboradores (2007, 2010), 0RSA1 y 0RSL1, as! como el efecto de otro tipo de bacteriofago adicional, 0RSB1, de aislamiento posterior (Kawasaki et al., 2009). Este ultimo pertenece a la familia Podoviridae y, como 0RSA1, es capaz de provocar lisis en un mayor numero de cepas, hasta 13 de 15 cepas de la especie anteriormente denominada R. solanacearum (de las cuales, al menos 13 estan actualmente clasificadas como R. pseudosolanacearum) (Yamada et al., 2007; Kawasaki et al., 2009). Se demuestra que el tratamiento de la bacteria con 0RSA1, 0RSB1 y 0RSL1, bien de forma individualizada o con las posibles combinaciones entre ellos, da lugar, excepto el tratamiento solo con 0RSL1, a una disminucion rapida de la densidad celular de la bacteria huesped, disminucion que es solo inicial porque va seguida de la aparicion de resistencias visibles por D.O. (densidad optica) en menos de 2 dlas. Para evitar estas resistencias, Fujiwara y colaboradores (2011) seleccionan el uso del miovirus 0RSL1 de forma individualizada con respecto al resto de combinaciones con 0RSA1 y 0RSB1, aunque es destacable que este bacteriofago es el de menor potencial lltico de los tres.

Los ensayos realizados sobre plantas descritos en el artlculo de Fujiwara y colaboradores (2011), todos ellos efectuados con 0RSL1, conllevaron dos tratamientos con una suspension de este bacteriofago a altas concentraciones llevados a cabo con un espaciado de un mes, primero de las semillas y despues de las plantas obtenidas; a los dos dlas se inoculan individualmente estas plantas con la suspension bacteriana por contacto directo con las puntas cortadas de las ralces (durante 30 segundos) y luego se trasplantan. Este metodo de inoculacion, al igual que el anterior utilizado por estos autores en otras publicaciones y patentes, es muy complicado si no imposible de llevar a la practica en viveros o en campos cultivados. Ademas, en dicha publication no indican la reproducibilidad de sus resultados.

Fujiwara y colaboradores (2011) describen tambien en su artlculo ensayos sobre la estabilidad de 0RSL1 en dos plantas previamente tratadas con dicho bacteriofago y el suelo en contacto con ellas, detectando bacteriofagos en las ralces y en el suelo rizosferico 4 meses despues de la inoculation, aunque no se comprueba que los bacteriofagos recuperados sean del mismo tipo que los inoculados. Tambien comprobaron el efecto de la temperatura en la estabilidad de 0RSA1, 0RSB1 y 0RSL1,

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en presencia y ausencia de suelo (en tampon SM, con Tris-HCl, NaCI, MgSO4 y gelatina). La estabilidad se controlo solo durante 15 dias. A igualdad de temperaturas, se observaron mayores diferencias entre la estabilidad de los tres bacteriofagos en presencia de suelo. Tanto en ausencia como en presencia de suelo, las diferencias fueron mayores al aumentar la temperatura aunque, en el caso de ausencia de suelo, las diferencias comienzan a marcarse a partir de 28°C. Tras 15 dias de incubacion en

ausencia de suelo y a 50°C, el 10% de los bacteriofagos 0RSL1 sobrevrna, no

detectandose bacteriofagos 0RSB1 tras 9 dias de incubacion, ni tras 3 dias de incubacion en el caso de 0RSA1.

Asi, los trabajos del grupo japones del que forman parte Yamada, Addy y Fujiwara, demuestran que en algunos casos y con algunos bacteriofagos que infectan a la especie anteriormente denominada R. solanacearum (actualmente R. pseudosolanacearum), estos se pueden usar como agentes de prevencion de la enfermedad causada por dicha bacteria. Salvo en un caso, el del podovirus 0RSB1, descartado por estos autores para el biocontrol (Fujiwara et al., 2011), los bacteriofagos descritos y utilizados en dichos ensayos pertenecen a las familias Myoviridae o Inoviridae. En sus ensayos los

bacteriofagos se aplican directamente al suelo, en plantulas o bien en raices o tallos de plantas. No se dan pruebas sobre la posible efectividad de otros medios de

administracion de bacteriofagos, como puede ser a traves del agua de riego. Esto no es sorprendente, pues en Japon R. pseudosolanacearum no ha sido detectada en aguas de cursos naturales, a diferencia de lo que ocurre en numerosos paises europeos y en algunas zonas de EE.UU., donde este tipo de agua es uno de los reservorios y vias de diseminacion de R. solanacearum.

La posibilidad de controlar R. solanacearum en agua mediante el uso de bacteriofagos si se ha considerado en estudios realizados en algunas zonas de Europa oriental y occidental. Asi, el resumen de la solicitud de patente de Georgia GEU20041089 sugiere la neutralizacion de dicha bacteria en plantas, en suelo y en agua, utilizando una mezcla de bacteriofagos polivalentes en igual proporcion.

El grupo de los presentes inventores, por su parte, ha sugerido previamente el uso de bacteriofagos espedficos de la especie anteriormente denominada R. solanacearum en el agua de riego para el control de la marchitez bacteriana provocada por dicho patogeno (Alvarez et al., 2006a; Alvarez et al., 2006b). Tambien han comprobado la influencia de las condiciones de los cursos de agua en la supervivencia de la bacteria, encontrando que la presencia de microbiota nativa y las temperaturas de 24°C favoredan su desaparicion con respecto a la temperatura de 14°C y al agua esteril utilizada como

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control (Alvarez et al., 2006a). Ninguna de estas divulgaciones incluye information sobre el filotipo de las cepas ensayadas, por lo que no puede afirmarse que estos fagos pudieran actuar sobre la actual R. solanacearum, constituida por cepas del filotipo II.

El grupo de los presentes inventores ha informado tambien del aislamiento de bacteriofagos llticos especlficos de la especie anteriormente denominada R. solanacearum a partir de rlos espanoles (Alvarez et al., 2006a, Alvarez et al., 2006b), aunque sin concretar el metodo de aislamiento ni el lugar especlfico de aislamiento de cada uno. Los autores han divulgado datos iniciales sobre la caracterizacion de uno de ellos, afirmando que el mismo parece mostrar actividad lltica entre 14°C y 31°C, pero no a temperaturas inferiores (9°C) ni superiores (32-39°C), incluso en agua natural de riego en rangos de pH de 6,5 a 8,2. El bacteriofago inicialmente caracterizado parece ser especlfico de la especie anteriormente denominada R. solanacearum, pues muestra actividad lltica sobre 30 cepas de diferentes orlgenes, de las que no se ha divulgado el filotipo. El bacteriofago no mostro actividad lltica frente a otros aislados bacterianos de agua de rlo. Dicho bacteriofago da lugar tambien a la disminucion de la marchitez bacteriana en plantas de tomate regadas con agua que contiene mezclas del bacteriofago y de la especie anteriormente denominada R. solanacearum.

Los datos obtenidos por Alvarez y sus colaboradores apoyan la posibilidad de utilizar bacteriofagos para la prevention y/o el control de la marchitez bacteriana, en particular mediante su adicion al agua de riego. Sin embargo, los datos divulgados por dicho grupo hasta este momento no permiten identificar los cursos fluviales concretos a partir de los cuales pueden aislarse los bacteriofagos llticos obtenidos por ellos. Tampoco se dan datos especlficos sobre las caracterlsticas estructurales concretas de ninguno de dichos bacteriofagos que facilite su identification. Y solo para uno de estos bacteriofagos se han divulgado datos sobre el rango de temperaturas y de pH en los que es activo, afirmandose tambien su capacidad para lisar 30 cepas distintas de la especie anteriormente denominada R. solanacearum, sin especificar las cepas concretas en las que se ha comprobado la actividad.

Por tanto, sigue sin disponerse de bacteriofagos llticos concretos en los que se haya comprobado que, de forma individual, sean capaces de disminuir la marchitez bacteriana al ser anadidos al agua de riego. Para el unico bacteriofago con el que se han realizado este tipo de ensayos, reflejados en las comunicaciones a congreso del grupo de los presentes inventores (Alvarez et al., 2006a; Alvarez et al., 2006b), no se han divulgado otros datos que permitan su identificacion que no sea su actividad lltica a distintos pHs y temperaturas y la afirmacion de que disminuye la marchitez bacteriana en plantas de

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tomate, no habiendose divulgado el genero o la familia a la que pertenece ni datos concretos sobre los cursos fluviales en los cuales esta presente (y a partir de los cuales se podrla aislar) ni el metodo especlfico que permite su aislamiento, ni el filotipo de las cepas huesped a las que afecta.

Asl, ni para los bacteriofagos aislados por Alvarez y colaboradores ni para los bacteriofagos cuyo uso se sugiere en la solicitud de patente de Georgia GEU20041089,

en forma de mezclas polivalentes, se dispone de datos sobre su supervivencia en

condiciones naturales, en particular, sobre su supervivencia en las condiciones de las aguas en las que se aplicarlan. Y, precisamente, un factor central en la determination de la idoneidad de un bacteriofago como agente de control biologico es su supervivencia en condiciones naturales. Cuando se aplican bacteriofagos de bacterias fitopatogenas a suelo o plantas para suprimir dichos patogenos, el tiempo que pueden mantenerse activos hasta encontrar su celula diana es el factor limitante del proceso, lo que hace que puedan requerirse repetidas aplicaciones de dichos bacteriofagos para obtener un control eficaz. Y, en el caso de la especie anteriormente denominada R. solanacearum, su

control en los cursos de agua, en especial en el agua de riego, asl como en los

reservorios de la misma (tanques, depositos, embalses...) es importante, especialmente en Europa, porque:

i) los principales cultivos afectados por R. solanacearum son de regadlo (en especial, patata y tomate),

ii) actualmente hay una situation de escasez de agua en Espana y otros palses de la cuenca mediterranea en los que el patogeno esta presente,

iii) existen prohibiciones oficiales en toda la UE para utilizar agua contaminada para el riego de plantas huesped (Anonimo, 1998, 2006: Directiva del Consejo 98/57/EC y Directiva de la Comision 2006/63/EC),

iv) no hay metodos de control disponibles en agua,

v) un objetivo prioritario de la polltica de la UE es la conservation del medio ambiente (Montesinos et al., 2008; Programa Horizon 2020).

Por todo ello, serla muy deseable controlar las poblaciones de la bacteria en agua de rlo y/o de riego mediante un tratamiento biologico eficaz y respetuoso con el entorno natural. Y, tal y como se comento previamente, serla preferible que el metodo utilizado diera lugar a la muerte de las bacterias.

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En el caso concreto del agente fitopatogeno R. solanacearum, cuyos habitats son las plantas huesped y el suelo, un agente biologico que sea suministrado por medio del agua debe tener caracterlsticas biologicas que le permitan sobrevivir en ese medio, que no es el habitual ni de la bacteria ni de sus bacteriofagos especlficos. Si dicha supervivencia resulta ser prolongada y los bacteriofagos mantienen su actividad Utica sobre el huesped tras largos perlodos en el agua, ademas se favorece su aplicabilidad en el campo, ya que pueden vehicularse directamente a traves de ese medio natural y simple como es el agua, sin necesidad de encapsularlos o de anadir otros soportes flsicos y/o biologicos para proteger su viabilidad hasta el encuentro con la celula diana. Esa alta supervivencia facilitarla tambien la preparation de su presentation comercial, que podrla ser en medio acuoso sin requerir condiciones de refrigeration (o incluso temperaturas inferiores) para su mantenimiento.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los bacteriofagos son parasitos intracelulares obligados y, como tales, necesitan de la celula huesped para su perpetuation. Puesto que se vehiculan hacia esta celula por diferentes vlas, segun los tipos de bacteriofagos y tipos de celulas huesped, es esperable un tiempo de supervivencia en el medio ambiente que les permita contactar con la celula huesped. Es conocido que este tiempo puede ser variable entre distintos bacteriofagos, siendo necesario su estudio en cada caso particular. Asl, por ejemplo, se observan variaciones apreciables en la supervivencia de bacteriofagos del mismo serotipo/genotipo (Brion et al., 2002) o, incluso, entre bacteriofagos de bacterias acuaticas patogenas de peces, cuyo habitat natural es el agua (Pereira et al., 2011). En este ultimo caso se ha llegado a considerar como buena una supervivencia de los bacteriofagos de tres meses en agua, aceptandose que los bacteriofagos que presentan mayor supervivencia en agua son buenos candidatos para el control de enfermedades bacterianas de peces en sistemas de cultivo acuaticos (Pereira et al., 2011).

Debe hacerse notar que R. solanacearum es una bacteria fitopatogena cuyo medio natural es el xilema de las plantas y con frecuencia el suelo, pero no el agua. Al no tratarse de una bacteria autoctona de ambientes acuaticos, no es esperable una alta supervivencia en agua de bacteriofagos especlficos de la misma. De hecho, en ninguna de las publicaciones y patentes anteriormente comentadas se describe la viabilidad y actividad Utica de bacteriofagos llticos especlficos de la especie anteriormente denominada R. solanacearum en agua medioambiental en ausencia de celulas huesped.

Y, sin embargo, serla interesante disponer de bacteriofagos llticos especlficos frente a R. solanacearum, particularmente que mostraran un amplio espectro de cepas de dicha

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especie sobre las cuales fueran activos y que, ademas, tuvieran una alta supervivencia en agua, preferiblemente de al menos un mes o, mas preferiblemente, de varios meses. Con ello se podrla realizar un tratamiento biologico del agua de riego contaminada con R. solanacearum, mediante el uso de bacteriofagos especlficos de dicho patogeno, que pudiera tener un efecto preventivo o de disminucion de la marchitez bacteriana en zonas contaminadas donde pueda haber plantas susceptibles. El tratamiento con dichos bacteriofagos presentarla las ventajas habituales frente a los tratamientos qulmicos, as! como las asociadas a otros tratamientos de biocontrol, en especial con bacteriofagos:

- alta especificidad por la celula huesped,

- replication natural solo en la celula huesped,

- inocuidad para otros seres vivos, incluida la microbiota beneficiosa para las plantas a proteger,

- la aplicacion del tratamiento biologico a traves de agua de riego es mas sencilla y economica que en el caso del control qulmico, y no requiere medidas de proteccion para el personal durante su aplicacion, al ser inocuo para el ser humano,

- menor impacto medioambiental, en especial en comparacion con los compuestos cupricos y los antibioticos utilizados en agricultura, para los cuales muchos patogenos han desarrollado resistencia, reduciendose la eficacia de dichos tratamientos qulmicos que ademas aumentan la contamination qulmica del suelo, las plantas y sus frutos,

- menores restricciones legales para su uso, pudiendo aplicarse donde estuviera prohibido el control qulmico,

- al ser inertes durante su estado extracelular, los bacteriofagos pueden combinarse con otras estrategias de control y/o biocontrol para incrementar el control de la enfermedad,

- production facil y economica, ya que aumentan su numero en presencia de la bacteria diana,

- facil ajuste de la dosis de bacteriofagos a aplicar en funcion de la concentration de patogeno a tratar.

La presente invention aporta una solution al problema de la ausencia de bacteriofagos que muestren un amplio espectro de cepas de dicha bacteria sobre las cuales fueran

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activos y que, ademas, tengan una alta supervivencia en agua, preferiblemente de al menos un mes o, mas preferiblemente, de al menos varios meses.

Sumario de la invencion

La presente invencion se basa en el aislamiento, a partir de agua de rlo de varias regiones de Espana, de varios bacteriofagos capaces de lisar la bacteria R. solanacearum, y en los resultados de su caracterizacion estructural, funcional y molecular, asl como genomica, que han permitido evidenciar:

- que todos ellos pertenecen a la misma especie vlrica, tratandose de una nueva especie perteneciente a la familia Podoviridae,

- su especificidad por dicha bacteria,

- su actividad sobre un amplio espectro de cepas de R. solanacearum,

- su actividad a diferentes temperaturas, pHs, condiciones de salinidad y aireacion y en presencia de luz,

- su elevada supervivencia en agua, superior a tres anos, en aguas naturales de distinta composition qulmica y pH, a distintas temperaturas, en ausencia del huesped, manteniendo su capacidad lltica tras perlodos tan prolongados,

- la capacidad para disminuir la marchitez provocada por R. solanacearum en plantas regadas con agua que contenla al menos uno de dichos bacteriofagos.

Los ensayos realizados han permitido comprobar que estas caracterlsticas son tambien compartidas por el bacteriofago del que ya se habla descrito una caracterizacion funcional parcial (actividad lltica en medio llquido a distintas temperaturas y pHs, rango inicial de huespedes y capacidad de controlar la marchitez en plantas) en anteriores trabajos del grupo de los presentes inventores (Alvarez et al., 2006a, Alvarez et al., 2006b), sin haberse descrito su origen especlfico, metodo de aislamiento, capacidad de supervivencia, ni haberse realizado una caracterizacion molecular y genomica, que permitiera su clasificacion taxonomica, desconociendose hasta ahora la familia a la que pertenecla.

Su alta especificidad, el amplio rango de cepas sobre las que presentan actividad y, muy en especial, su elevada supervivencia en agua, hace de todos estos bacteriofagos agentes muy adecuados para el biocontrol de R. solanacearum en agua de cursos

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naturales y/o aguas de riego y reservorios de las mismas, y para la prevention y/o el tratamiento de la marchitez producida por dicha bacteria en plantas. Esto es asl porque el mantenimiento de la actividad Utica tras largos perlodos favorece su aplicabilidad en cultivos de campo o en invernaderos o viveros u otros, a los que puede vehicularse directamente a traves del agua, medio natural y simple, sin necesidad de encapsularlos o de anadir otros soportes flsicos, qulmicos y/o biologicos para proteger su viabilidad hasta el encuentro con la celula diana. Con ello, se reducen tambien los costes de aplicacion, al disminuir el numero de aplicaciones requeridas en el tiempo, se aumenta la eficiencia a largo plazo del producto en los sistemas agricolas en los que se pretende aplicar, y se puede prevenir y combatir mas eficazmente la aparicion de brotes de la enfermedad causada por R. solanacearum. Asl, los agentes de control de R. solanacearum basados en estos bacteriofagos presentan un mayor "valor anadido" del producto de cara a los agricultores y viveristas, principales consumidores potenciales de dicho producto.

Ademas, tal y como se comento previamente, esta capacidad de supervivencia tan alta en agua de los bacteriofagos objeto de la invention, manteniendo la capacidad Utica tras perlodos prolongados en dicho medio en ausencia de huesped, no era esperable para bacteriofagos especlficos de una bacteria cuyo medio natural no es el agua como es el caso de R. solanacearum, no observandose esta capacidad en otros bacteriofagos llticos especlficos de dicha bacteria y aislados tambien de cursos fluviales naturales de Espana por los presentes inventores.

Por todo ello, en un primer aspecto, la invention se refiere a un bacteriofago con capacidad de lisar celulas de Ralstonia solanacearum seleccionado del grupo de:

a) vRsoP-WF2 (DSM 32039), vRsoP-WM2 (DSM 32040), vRsoP-WR2 (DSM 32041), o

b) un podovirus cuyo genoma presenta la secuencia de SEQ ID NO:1 (correspondiente a vRsoP-WF2), SEQ ID NO:2 (correspondiente a vRsoP-WM2) o SEQ ID NO:3 (correspondiente a vRsoP-WR2).

En lo sucesivo, la expresion "bacteriofago de la invention" se utilizara para hacer referencia a uno cualquiera de estos bacteriofagos.

En otro aspecto, la invention se refiere a una composition que comprende al menos uno de los bacteriofagos de la invencion, o combinaciones de los mismos. Dicha composicion sera considerada una composicion de la presente invencion.

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En un aspecto mas, la invention se refiere al uso de al menos uno de los bacteriofagos de la invencion, o de combinaciones de los mismos, para el control de R. solanacearum en agua de cursos naturales, corrientes de agua canalizadas, reservorios naturales de agua, agua de riego y reservorios de aguas de riego, mediante la adicion de uno o mas de dichos bacteriofagos al agua de riego o reservorios de la misma.

En otro aspecto, relacionado con el anterior, la invencion se refiere al uso de al menos uno de los bacteriofagos de la invencion, o de combinaciones de los mismos, o composiciones de la invencion para el control de R. solanacearum en suelo, mediante la adicion de uno o mas de dichos bacteriofagos o de una composicion de la invencion a dicho suelo a traves del agua de riego con la que se inunda el suelo, previamente tratada con el o los bacteriofagos mencionados o con la mencionada composicion.

En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a un procedimiento para prevenir o controlar la marchitez bacteriana provocada por R. solanacearum en plantas, que comprende las etapas de:

a) anadir al agua que vaya a utilizarse para regar las plantas una composition que comprende bacteriofagos pertenecientes a al menos uno de los bacteriofagos objeto de la invencion, o combinaciones de los mismos;

b) regar las plantas con dicha agua tratada.

Como se indico previamente, el termino "R. solanacearum", sin alusion al significado previo de esta denominacion, se utiliza en la invencion para hacer referencia a la especie R. solanacearum tal y como se ha descrito tras la ultima revision taxonomica, es decir, la especie constituida unicamente por cepas de filotipo II. En cambio, cuando se utiliza el termino "especie anteriormente denominada R. solanacearum”, se hace referencia a las bacterias que se consideraban comprendidas dentro del termino R. solanacearum en trabajos, datos, patentes, publicaciones, bibliografla, etc, previos a la revision taxonomica de Safni y colaboradores (2014), independientemente de si la denomination se corresponde o no con la clasificacion actual.

Por consiguiente, la presente invencion, es decir, el "procedimiento para la prevention y/o el control biologico de la marchitez causada por Ralstonia solanacearum a traves del uso de bacteriofagos utiles para ello y las composiciones de los mismos”, hace referencia a R. solanacearum tal y como se ha descrito tras la revision taxonomica de Safni y colaboradores (2014). Las tres invenciones de otros autores mencionadas en el presente documento hacen referencia a la "especie

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anteriormente denominada R. solanacearum’’ que, en los casos en los que hay information disponible (documento de patente, publicaciones, etc), puede comprobarse que se trata de cepas mayoritariamente reclasificadas en la nueva especie R. pseudosolanacearum.

Breve description de las figuras

La Fig. 1 muestra fotograflas de placas de medio de cultivo de los ensayos de actividad Utica de bacteriofagos aislados de agua de rlo frente a R. solanacearum. Las zonas mas oscuras corresponden a zonas de lisis y/o areas aisladas o calvas, que son zonas de reproduction de los bacteriofagos en el cesped bacteriano, que permiten observar el medio de cultivo por lisis de las bacterias, cuyo crecimiento masivo se aprecia en las zonas mas blanquecinas y mas opacas.

La Fig. 2 muestra una fotografla de una placa de medio de cultivo con un cesped de la cepa I VIA 1602.1 de R. solanacearum en la que se realizaron ensayos de lisis. En cada cuadrante se indica el bacteriofago contenido en la suspension anadida sobre el cesped bacteriano; se indica tambien la localization del cuadrante del control sin bacteriofagos (cuadrante superior izquierdo, marcado con el nombre de la cepa bacteriana).

La Fig. 3 muestra una fotografla de los bacteriofagos de la presente invention obtenida por microscopla electronica de transmision tras tincion negativa. Se observa que presentan una cabeza poligonal (entre 40 y 60 nm de diametro dependiendo del bacteriofago) sin envoltura, y una cola corta.

La Fig. 4 es una fotografla obtenida tras someter a electroforesis las muestras en las que se habla llevado a cabo la digestion del ADN de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP- WM2 o vRsoP-WR2 (segun se indica en la parte superior de la fotografla) con distintas enzimas de restriction, indicadas sobre cada carril. Los carriles de los extremos derecho e izquierdo corresponden al patron de pesos moleculares (M): ADN del fago A digerido con Hindi!!.

La Fig. 5 muestra la zona en la que la secuencia correspondiente al bacteriofago vRsoP- WM2 presenta una insertion de 468 nucleotidos respecto a las secuencias correspondientes a los bacteriofagos vRsoP-WF2 y vRsoP-WR2, as! como las zonas de secuencia proximas a esta. La presencia de un guion en una secuencia indica una posicion en la que un nucleotido esta ausente en dicha secuencia con respecto a una o las otras dos secuencias, ausencia que permite continuar el alineamiento en la misma zona. En la llnea inferior situada bajo las llneas correspondientes a las secuencias, la

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presencia de un asterisco indica coincidencia entre los nucleotidos situados en esa posicion en las tres secuencias.

La Fig. 6 muestra la organization genomica de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP- WM2 y vRsoP-WR2 en comparacion con la del bacteriofago T7. En distintos tonos de gris o con tramas de llneas paralelas en direcciones diferentes se indica la localization de los marcos abiertos de lectura funcionales (ORFs), que han sido identificados mediante la herramienta BLAST, segun se especifica en las leyendas situadas en la parte inferior de la figura. Se observa que los tres bacteriofagos poseen una organizacion genomica y expresion de los ORFs similar a la del bacteriofago T7 en parte del genoma.

La Fig. 7 muestra las curvas de supervivencia de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP- WM2 y vRsoP-WR2 incubados a 14°C en ausencia de celulas huesped en agua del rlo Tormes (panel A, superior) y del rlo Turia (panel B, inferior). La supervivencia se expresa como el logaritmo en base 10 de las unidades formadoras de calvas detectadas por mililitro (UFC/ml) en las muestras tomadas en los tiempos indicados en abscisas.

La Fig. 8 muestra un grafico de la actividad Utica del bacteriofago vRsoP-WF2, anadido a una concentration inicial de 103 unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml) en agua de rlo esteril, a la que se han anadido 106 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de R. solanacearum. Se observa la disminucion con el tiempo de las UFC/ml correspondientes a la bacteria (expresadas en forma de su logaritmo en base 10, puntos indicados con un clrculo relleno), mientras aumentan las UFC/ml correspondientes al bacteriofago (expresadas tambien en forma de su logaritmo en base 10, puntos indicados con un cuadrado relleno).

La Fig. 9 muestra un esquema ilustrado del procedimiento experimental de la aplicacion de los bacteriofagos objeto de la invention al agua de riego desarrollado por los presentes inventores para comprobar su capacidad de control de la marchitez bacteriana. En la parte inferior, se muestran fotograflas del estado de las plantas al comienzo del ensayo (tiempo cero, fila superior de fotograflas) y tras 1 mes (tiempo 1 mes, fila inferior de fotograflas), para cada una de las combinaciones de R. solanacearum y el bacteriofago vRsoP-WF2 indicadas sobre las mismas.

La Fig. 10 muestra un grafico de barras en el que se representa la reduction de la marchitez bacteriana, expresada como tanto por ciento, en dos ensayos diferentes realizados en plantas de tomate. Experimento (Exp.) 1, concentracion de bacteriofago: 109 unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml) y Exp. 2, concentracion de bacteriofago: 106 UFC/ml. En ambos experimentos, la concentracion de bacteria fue de

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105 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml). Las barras con trama vertical corresponden a las plantas tratadas con bacterias, sin adicion de bacteriofagos; las barras sin trama corresponden a las plantas tratadas con bacterias y bacteriofagos a las concentraciones indicadas; las barras con trama horizontal, corresponden a las plantas tratadas con bacterias y diluciones 1/10 de las concentraciones de bacteriofagos antes indicadas.

La Fig. 11 muestra un grafico de barras en el que se representa la reduction de la marchitez bacteriana producida por R. solanacearum, expresada como tanto por ciento, en ensayos en los que plantas de tomate se regaron con agua que contenla las combinaciones de bacteria (Rsol) y bacteriofago que se indican bajo las barras. Los cuatro casos situados mas a la derecha corresponden a aguas de riego con combinaciones binarias (de izquierda a derecha, vRsoP-WF2 con vRsoP-WM2, vRsoP- WF2 con vRsoP-WR2, o vRsoP-WM2 con vRsoP-WR2) o terciarias (vRsoP-WF2, vRsoP- WM2 y vRsoP-WR2) de bacteriofagos junto con la bacteria.

Description detallada de la invention

Tal y como se ha mencionado anteriormente, la invencion se refiere a nuevos bacteriofagos especlficos de R. solanacearum (los bacteriofagos de la invencion), al uso de al menos uno de los bacteriofagos de la invencion, o de combinaciones de los mismos, para el control de R. solanacearum en agua de cursos naturales, reservorios naturales de agua, agua de riego y reservorios de agua de riego, mediante la adicion de uno o mas de estos bacteriofagos a dicha agua o sus reservorios; tambien se refiere al uso de estos bacteriofagos para el control de R. solanacearum en suelo, mediante la adicion de uno o mas de estos bacteriofagos a dicho suelo a traves del agua de riego tratada; y a un procedimiento para prevenir o controlar la marchitez bacteriana provocada por R. solanacearum en plantas, en el que, al agua que vaya a utilizarse para regar las plantas, se anade una composition que comprende al menos uno de los bacteriofagos a los que se ha denominado vRsoP-WF2 (DSM 32039), vRsoP-WM2 (DSM 32040) o vRsoP-WR2 (DSM 32041), o combinaciones de los mismos, y se riegan las plantas con dicha agua tratada.

En la presente solicitud, se utiliza la palabra "fago" como abreviatura de la palabra "bacteriofago", con el mismo significado. Por ello, de ahora en adelante ambos terminos se utilizaran indistintamente. Por "bacteriofago" se entiende un virus capaz de infectar bacterias, ya sea produciendo su lisis (ciclo lltico) o insertandose en su genoma y replicandose con el, sin producir lisis (ciclo lisogenico).

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Los bacteriofagos de la invention se han aislado de agua de rlo de varias regiones de Espana, en concreto Badajoz, Salamanca y las Alpujarras (Granada).

La caracterizacion morfologica por microscopla electronica de los viriones y molecular por analisis de restriction del ADN de los mismos ha demostrado que pertenecen a la familia Podoviridae (concretamente, al genero de los virus similares a T7 o "T7-like'), una familia de la cual, hasta ahora, solo se habla descrito un bacteriofago con actividad lltica frente a la especie anteriormente denominada R. solanacearum, el bacteriofago 0RSB1, descrito por Fujiwara y colaboradores (Fujiwara et al., 2011) y que presenta un genoma de mayor tamano que los bacteriofagos de la presente invencion, cuyo genoma no supera los 41.000 pares de bases (pb) en ninguno de los tres casos (ver Tabla 2), mientras que el genoma del 0RSB1 tiene un tamano de 43.077 pb. Ademas, las tres invenciones de otros autores mencionadas en la presente solicitud, relacionadas con el uso de bacteriofagos para el control de R. solanacearum hacen referencia a la especie anteriormente denominada R. solanacearum que, en los casos en que hay information disponible (documento de patente, publicaciones cientlficas, etc.), puede comprobarse que tratan de cepas mayoritariamente reclasificadas en la nueva especie R. pseudosolanacearum.

Por tanto, los bacteriofagos de la presente invencion no pertenecen a una de las familias mas comunes entre los bacteriofagos llticos de la especie anteriormente denominada R. solanacearum, Myoviridae, sino a otra familia distinta. Ademas, parecen formar parte de una misma especie, distinta de otras especies de virus similares a T7 descritas hasta el momento. El hallazgo de virus que pertenecen a una nueva especie entre los bacteriofagos que atacan a R. solanacearum es un hecho inesperado.

El genoma de ninguno de los tres bacteriofagos de la presente invencion parece presentar dianas de reconocimiento para la enzima de restriccion PstI, que no da lugar a digestion de los mismos, lo que supone una diferencia con los bacteriofagos llticos de la patente de Japon JP4532959-B2, que si son digeridos por dicha enzima.

Asl, en la presente invencion se proporcionan por primera vez datos para identificar los tres bacteriofagos de la presente invencion y distinguirlos entre ellos y con respecto a cualquier otro bacteriofago conocido, como son la familia a la que pertenecen, el genero, la asignacion de todos ellos a una misma especie, la secuencia de su genoma y el perfil de restriccion caracterlstico, obtenido con varias enzimas tras la digestion de su genoma (ver Ejemplos 1 y 2, y las Fig. 3, 4, 5 y 6). Se describe, ademas, el metodo de aislamiento utilizado y la procedencia concreta de cada uno de ellos. Adicionalmente, para su clara definition, se aporta el dato del numero de deposito otorgado por el Leibniz-Institut

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DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, en su calidad de autoridad de deposito internacional segun el Tratado de Budapest, para cada uno de los bacteriofagos.

Ademas de la caracterizacion estructural (caracterizacion morfologica de las partlculas vlricas y caracterizacion genomica), en la presente solicitud se describe tambien la caracterizacion funcional (fisiologica y lltica) de los bacteriofagos aislados. Tal y como se comento previamente, una de las caracterlsticas importantes para que un agente de biocontrol pueda ser efectivo es mostrar un amplio rango de cepas sobre las cuales pueda actuar. Tal y como se muestra mas adelante en Ejemplos de la presente solicitud, se confirmaron los datos previamente descritos por Alvarez y colaboradores (Alvarez et al., 2006a, Alvarez et al., 2006b) para un bacteriofago del que se sabla que se habla aislado en un curso fluvial de Espana que no quedaba especlficamente identificado y respecto al cual no se aportaban suficientes datos estructurales para adscribirlo a una familia y, menos aun, a un genero y especie concretos. En particular, se confirmo su capacidad lltica para 30 cepas que se consideraban entonces pertenecientes todas ellas a la misma especie, la especie anteriormente denominada R. solanacearum, de las que se desconocla su filotipo, asl como los rangos de pH y temperatura en los que muestra actividad: entre 14°C y 31°C, y a rangos de pH de 6,5 a 8,2. Dichos datos corresponden al bacteriofago denominado en la presente solicitud vRsoP-WF2. Se ha comprobado que los otros dos bacteriofagos de la presente invention, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2, presentan capacidad lltica para las mismas cepas de R. solanacearum, y que son activos en los mismos rangos de pH y temperatura, ampliandose dicha caracterizacion para los tres bacteriofagos de la presente invencion. Los mismos resultados se obtuvieron con las mezclas de dos de los bacteriofagos (vRsoP-WF2 con vRsoP-WM2, vRsoP-WF2 con vRsoP-WR2, o vRsoP-WM2 con vRsoP-WR2) o con la combinacion de los tres (vRsoP- WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2). Asl, las mezclas que comprenden una de dichas combinaciones de bacteriofagos son una posible realizacion de las composiciones de la presente invencion, asl como las composiciones que comprenden al menos uno de los bacteriofagos de la presente invencion.

Tambien se comprobo su especificidad por R. solanacearum, no observandose actividad lltica con aislados bacterianos de agua de rlo con los que se realizaron ensayos, ni con cepas de otras especies de bacterias fitopatogenas. De nuevo, estos datos son validos tanto para los tres bacteriofagos de la presente invencion como para las combinaciones de los mismos.

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Por tanto, los tres bacteriofagos por separado, asl como las combinaciones de los mismos, cumplen las caracterlsticas deseables para agentes de control biologico como son la alta especificidad por la celula huesped, no suponiendo un riesgo para la microbiota del agua, suelo o plantas, por ser especlficos frente a R. solanacearum. Tampoco suponen una amenaza para la salud del ser humano, animales o plantas, al tratarse de virus bacteriofagos que solo infectan bacterias. Son activos, ademas, en un rango de pH compatible con las caracterlsticas de distintos cursos fluviales de la geografla espanola, y en un rango de temperaturas compatible con las caracterlsticas de los mismos. Ello apoya el uso de los bacteriofagos de la presente invencion, de forma individual o como combinaciones de los mismos, y el de las composiciones que comprenden dichos bacteriofagos, para el control de R. solanacearum, ya sea en agua de cursos naturales de agua como los rlos, arroyos o riachuelos, reservorios naturales de agua como lagos, lagunas, charcas, manantiales y acumulaciones subterraneas, reservorios artificiales de agua como embalses, depositos cubiertos, tanques, estanques (con cubierta superficial o sin ella), pozos, agua de riego en general y reservorios de la misma como los reservorios naturales o artificiales antes citados.

En ese sentido, los datos de campo recopilados por los presentes inventores sobre las aguas naturales contaminadas con R. solanacearum en las distintas comunidades autonomas espanolas revelan que en los meses estivales (que es cuando se detecta la bacteria en agua y se prohlbe su uso para riego) las temperaturas diurnas mas altas de estas aguas oscilan entre 13°C y 17°C, disminuyendo por la noche. Asl, por ejemplo, en Salamanca y Guadalajara las temperaturas de las aguas muestreadas varlan entre 14°C y 4°C. Ademas, en los distintos palses del centro y norte de Europa con aguas medioambientales contaminadas con R. solanacearum las temperaturas son mas bajas en los meses de verano. Por tanto, el rango de actividad observado para los bacteriofagos de la presente invencion es compatible con su utilizacion en cursos naturales de agua, en particular de Espana. Tambien lo es su rango de pH de actuacion. Sin embargo, no es sencillo anadir bacteriofagos a un curso fluvial de agua en cantidad suficiente para conseguir el control efectivo de microorganismos en los mismos, en especial en el lugar concreto donde esa agua pueda desear utilizarse para regar, pues los bacteriofagos quedaran muy diluidos y seran transportados con el curso de agua a lo largo del mismo por lo que, aunque su tiempo de supervivencia sea muy alto, no se favorece que los bacteriofagos contacten con la celula huesped en el tramo de curso de agua que pueda ser de interes, salvo que los bacteriofagos se anadan a cursos de agua cortos y/o de reducido caudal, como riachuelos, regatos y canalizaciones artificiales, especialmente las que conduzcan a un reservorio donde el agua vaya a tener un tiempo

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de permanencia mayor. Por ello, se prefiere que el uso se lleve a cabo en un reservorio natural o artificial de agua, tal como lagos, lagunas, charcas, manantiales, embalses, depositos cubiertos, tanques, estanques (con cubierta superficial o sin ella) o pozos. En ellos, ademas, si se sospecha que puede haber una contamination con R. solanacearum, es mas sencillo realizar una estimation de la misma y determinar la cantidad o concentration de bacteriofagos a anadir en funcion de la misma. En cualquier caso, se prefiere que se trate de un reservorio en el que el agua se mantiene a una temperatura comprendida en el rango de temperaturas de 4°C a 30°C, ambos valores incluidos, intervalo en el cual los bacteriofagos de la presente invention sobreviven perlodos prolongados, manteniendo su actividad lltica, tanto en forma aislada como formando parte de composiciones que contienen al menos uno de ellos. Dicho intervalo comprende tambien las temperaturas ambientales de supervivencia y/o multiplication del patogeno R. solanacearum, el intervalo medioambiental de 4°C a 24°C, de forma que la actividad lltica de los bacteriofagos de la presente invencion es efectiva a las temperaturas en las que dicha bacteria supone una amenaza real para el desarrollo de la enfermedad en los cultivos. Como los valores proximos a 30°C no son habituales en los reservorios de agua medioambiental, y teniendo en cuenta las fluctuaciones de temperatura ambientales diarias y estacionales, se tiene preferencia tambien por condiciones donde la temperatura media del agua del reservorio este comprendida entre 4°C y 24°C, ambos valores incluidos.

Debe senalarse que los ensayos descritos en el Ejemplo 4 de la presente solicitud confirman la aplicabilidad de los bacteriofagos de la presente invencion a traves del agua de riego y su utilidad para reducir los danos de marchitez producidos por R. solanacearum en plantas. Es por ello que la presente invencion proporciona tambien un procedimiento para prevenir o controlar la marchitez provocada por R. solanacearum en una planta, que comprende las etapas de anadir al agua que vaya a utilizarse para regar la planta una composition que comprenda al menos uno de los bacteriofagos de la presente invencion, o combinaciones de los mismos, y regar la planta con dicha agua tratada.

La propuesta de realizar un tratamiento previo del agua de riego antes de su uso para regar es una option no considerada en los trabajos previos de autores japoneses que se discutieron anteriormente y es una opcion de gran interes, puesto que los principales cultivos afectados por R. solanacearum son cultivos de regadlo. Asl, aunque es compatible con la invencion que el cultivo de la planta se lleve a cabo en cualquiera de las condiciones en que sea posible dicho cultivo, una posible realization de la invencion

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donde puede tener gran interes es aquella en la que la planta se esta cultivando en un campo, en un vivero, en un invernadero o cualquier otro tipo de sustrato, o en cultivo hidroponico, donde puede ser sencillo planificar y aplicar el procedimiento de la invention dentro del sistema de regadio y, ademas, hacerlo de forma que beneficie simultaneamente a muchas plantas. Por otra parte, pero de forma perfectamente compatible con la realization anterior, dentro de la posible aplicacion a cualquier cultivo de una especie susceptible y/o tolerante a R. solanacearum, una realizacion de gran interes de la invencion es aquella en la que la planta es de una especie perteneciente a la familia de las solanaceas (familia Solanaceae) y en particular, aquella en la que la planta se selecciona entre tomate (Solanum lycopersicum), patata (Solanum tuberosum) (los dos cultivos mas frecuentemente afectados), pimiento (Capsicum annuum) o berenjena (Solanum melongena). La aplicacion del metodo de la invencion es perfectamente compatible con que la planta se encuentre en un cultivo o plantacion dedicado a plantas de una unica especie, o en zonas de cultivo donde hay plantas de distintas especies, generalmente en secciones espedficas para cada una, como sucede con los huertos tradicionales, siendo habitualmente el sistema de riego comun a todas ellas, asi como el reservorio del que parte el agua de riego. Las caracteristicas de los bacteriofagos de la presente invencion posibilitan que no sea necesaria su aplicacion individualizada (planta por planta), como si sucede con las aplicaciones propuestas por los autores japoneses y con otros agentes de biocontrol.

El riego puede realizarse por cualquiera de los sistemas conocidos, tales como los sistemas tradicionales de inundation parcial o total, por goteo, por riego subterraneo mediante tuberias perforadas, por exudation a traves de tuberias porosas, o por aspersion.

Como se comento anteriormente, es conveniente que, previamente al riego, el agua a la que se le haya anadido la composition con uno o mas bacteriofagos de la presente invencion se mantenga a una temperatura comprendida en el intervalo de 4°C a 24°C, que puede considerarse un intervalo medioambiental habitual, aunque, dado que los bacteriofagos de la invencion son activos hasta 31°C, dicho intervalo puede extenderse al intervalo de 4°C a 30°C, ambos incluidos, a pesar de que este ultimo valor no sea habitual en reservorios de agua medioambiental. Como ya se discutio anteriormente, tambien se consideran adecuadas condiciones donde la temperatura media del agua del reservorio este comprendida entre 4°C y 24°C, ambos valores incluidos, dadas las fluctuaciones de temperatura ambientales diarias y estacionales.

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Tambien es conveniente que el pH del agua este en el intervalo de 6,5 a 9,0 (ambos valores incluidos), para favorecer la actividad lrtica de los bacteriofagos de la presente invention.

Por las mismas razones antes discutidas, es preferible que, previamente al riego de la planta con el agua, el agua de riego se mantenga en un reservorio, natural o artificial, desde el momento en que se anade la composition con uno o mas bacteriofagos de la presente invencion; este planteamiento es compatible con que la adicion de los bacteriofagos no se produzca necesariamente cuando el agua esta en dicho reservorio, sino que puede hacerse en un curso de agua que desemboque o vierta al mismo, especialmente cuando el mismo es una canalizacion o un curso natural de pequeno caudal que parte de un curso natural caudaloso o un gran reservorio, natural o artificial, tal como un lago o un embalse.

En cuanto al reservorio en si, puede ser un deposito sin cobertura superficial o un deposito cubierto, incluidos los de tipo tanque o estanque; tambien puede ser algun encharcamiento natural, como los producidos en los afloramientos de ciertos manantiales, o pozos artificiales, naturales o seminaturales como los formados en ciertas oquedades naturales, con acceso facilitado posteriormente por el hombre.

Por otro lado, es importante tener en cuenta, como se comento anteriormente, que uno de los puntos fundamentales que determinan la efectividad de los bacteriofagos como agentes de biocontrol es su supervivencia en las condiciones del entorno en el que se pretendan aplicar. En general, la supervivencia de los bacteriofagos fuera del huesped, como se discutio previamente, es extremadamente variable y depende de la naturaleza particular de cada bacteriofago, estando altamente influenciada por el medio ambiente circundante, por condiciones tales como el pH del medio, la temperatura o la luz solar (Iriarte et al., 2007). Debido a que la luz solar es un factor que con frecuencia afecta negativamente a la supervivencia de los bacteriofagos en condiciones naturales, para plantearse su utilization en aguas superficiales es importante que sobrevivan adecuadamente en presencia de dicho factor. En este sentido, los bacteriofagos objeto de la invencion se aislaron de distintos cursos fluviales espanoles expuestos a distintos niveles de insolacion, a diferencia de los bacteriofagos japoneses, aislados de suelo y de material vegetal. Por otra parte, como los bacteriofagos de la invencion se aislaron de muestras de agua en las que estaban presentes celulas del huesped, se desconoda su inesperada supervivencia en agua en ausencia de celulas huesped.

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Por todas esas razones, la supervivencia de los bacteriofagos aislados por los presentes inventores se considera un factor importante, casi una caracterlstica crucial que supone una importante ventaja para su uso como agente de biocontrol en agua. Tal y como se describe mas adelante en el Ejemplo 3, dicha supervivencia se ensayo en ausencia de la celula huesped, en agua natural de dos rlos espanoles (Tormes en Salamanca y Turia en Valencia) de distinta composition qulmica y pH, y a distintas temperaturas. Estos dos tipos de agua presentaron diferencias destacables en los principales parametros flsico- qulmicos consultados de su composicion: en concreto con el agua del rlo Turia los valores fueron comparativamente unas 100 veces mayores para el Mn, 10 veces mayores para el Fe, entre 5 y 10 veces mayores para los cloruros y el triple de nitratos; con el agua del rlo Tormes los valores fueron aproximadamente 4 veces mas altos de fosfatos; los valores medios de pH estuvieron en torno a 8,13 en el agua del rlo Turia y 7,36 en el agua del rlo Tormes. Los rangos de temperatura de las aguas oscilaron entre 3,5 a 20,9°C para el rlo Tormes y de 11,5 a 22,0°C para el rlo Turia, es decir, ambos rangos medioambientales de temperatura de las aguas se encuentran dentro de los valores de temperatura utilizados para los ensayos de supervivencia de los bacteriofagos, que fueron de: 4°C, 14°C y 24°C, y a los valores de pH de 7,2 para el agua del rlo Tormes y 8,1 para el agua del rlo Turia. De estos rlos, el Tormes esta contaminado con R. solanacearum y esta prohibido el uso de este agua para riego, mientras que en el Turia no se ha observado contamination hasta el momento. Para los ensayos de la presente invention, dicha agua natural se filtro por 0,22 pm y se esterilizo, de manera que los ensayos de supervivencia se realizaron en ausencia del huesped. Tal y como se demuestra en el Ejemplo 3, los tres bacteriofagos de la presente invencion se mantuvieron activos y en niveles altos de actividad lltica durante mas de 5 meses, perlodo superior a los tres meses considerados como buen perlodo de supervivencia para bacteriofagos de bacterias acuaticas que afectan a peces y que estan, por tanto, en su medio natural (Pereira et al., 2011). Esta alta supervivencia se observo a las tres temperaturas ensayadas (4°C, 14°C y 24°C), con las que se pretendla cubrir el rango medioambiental de interes para la aplicacion a agua de cursos y reservorios naturales de agua, reservorios artificiales y aguas de riego. Posteriormente y como se menciona en el Ejemplo 3, se continuo el ensayo, encontrando que, tras 3 anos en agua natural, se mantienen activos. Este largo perlodo de supervivencia con mantenimiento de la actividad lltica es inesperado y sorprendente, particularmente para un bacteriofago lltico de R. solanacearum pues, al no tratarse de una bacteria autoctona de ambientes acuaticos, sino que su medio natural es el xilema de las plantas y con frecuencia el suelo, no era esperable que bacteriofagos especlficos de esta bacteria presentaran una alta

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supervivencia en agua, fuera del huesped. De hecho, en los estudios de Fujiwara y colaboradores (Fujiwara et al., 2011), por ejemplo, la estabilidad se controlo solo durante 15 dlas, lo que permitio observar claras diferencias entre la estabilidad de los tres bacteriofagos ensayados, mas pronunciadas en tampon que en presencia de suelo, observandose ademas acusadas diferencias en la capacidad de supervivencia de los dos bacteriofagos de la familia Myoviridae, 0RSL1 y 0RSA1.

Tal y como se discutio previamente, la supervivencia fuera del huesped varla mucho entre los diferentes bacteriofagos, incluso entre los que pertenecen a un mismo serotipo/genotipo (Brion et al., 2002) o, incluso, entre los que comparten un mismo habitat natural como el agua (Pereira et al., 2011), habitat en el que una supervivencia de bacteriofagos acuaticos de al menos tres meses se ha considerado previamente como una caracterlstica adecuada para la selection de buenos candidatos para el control de enfermedades bacterianas de peces transmitidas por el agua. Asl, la supervivencia de los bacteriofagos aislados por los presentes inventores no era en absoluto predecible, especialmente teniendo en cuenta que ni siquiera se conocla la familia a la que perteneclan y que no era de esperar una elevada supervivencia en agua de los mismos, puesto que el habitat habitual de su huesped son las plantas y el suelo, no el agua.

En ese sentido, merecen comentarse los resultados de supervivencia en ausencia del huesped de los bacteriofagos objeto de la invention obtenidos a 24°C, pues anteriores resultados de los presentes autores en estudios de supervivencia de R. solanacearum en los que se ensayo la actividad Utica de otros bacteriofagos de la bacteria en presencia de este huesped indicaban que la temperatura de 24°C favorece la velocidad de desaparicion del patogeno con respecto a la temperatura de 14°C (Alvarez et al., 2007). No obstante, a la temperatura de 14°C, los bacteriofagos objeto de la invencion mantienen una actividad lltica sobre el huesped en agua natural incluso tras tres anos en ausencia de este, y se ha observado que, en condiciones similares a las naturales, en estudios realizados por los presentes autores con otros bacteriofagos de este patogeno, la lisis tambien causa una reduccion significativa de las poblaciones del mismo (Alvarez et al., 2007). Ademas, 14°C es una temperatura mas cercana a las registradas en la mayor parte de los habitats acuaticos a partir de los cuales se ha detectado el patogeno en Espana y otros palses europeos.

Por otra parte, cabe destacar que es habitual conservar los agentes de biocontrol, previamente a su aplicacion, a bajas temperaturas, preferiblemente a 4°C, aunque tambien se pueden almacenar a 14°C, asl como a 24°C. Por ello, es destacable que los bacteriofagos de la presente invencion se mantengan activos y en niveles altos a las tres

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temperaturas de ensayo durante mas de 5 meses, y que su supervivencia con actividad lltica alcance perlodos de tres anos.

Por tanto, los bacteriofagos de la presente invention presentan como caracterlstica particularmente novedosa su supervivencia durante mas de 5 meses en agua natural en ausencia de la celula huesped. Esto supone una caracterlstica adecuada y muy ventajosa para un agente de control biologico, que debe tener caracterlsticas que le permitan sobrevivir en el medio en el que se pretende aplicar que, en este caso, es el agua.

Gracias a ello, es compatible con la aplicacion del metodo y el uso de la presente invencion que la composition que contiene los bacteriofagos se mantenga durante su almacenamiento y/o utilization, preferiblemente, a una temperatura comprendida en el rango de 4°C y 24°C, ambas incluidas, que puede considerarse un intervalo medioambiental habitual, aunque, dado que los bacteriofagos de la invencion son activos hasta 31°C, dicho intervalo puede extenderse al intervalo de 4°C a 30°C, ambos incluidos, a pesar de que este ultimo valor no sea habitual en reservorios de agua medioambiental. Como ya se discutio anteriormente, tambien se consideran adecuadas condiciones donde la temperatura media del agua del reservorio este comprendida entre 4°C y 24°C, ambos valores incluidos, dadas las fluctuaciones de temperatura ambiental diarias y estacionales. Esto facilita que las composiciones de la presente invencion puedan mantenerse facilmente durante largo tiempo previamente a su aplicacion, en forma de suspensiones en las que los bacteriofagos se encuentran en un vehlculo acuoso que puede ser agua (medioambiental, natural, destilada, previamente esterilizada, o sometida a otro tratamiento habitual para los vehlculos acuosos) o una solution acuosa (tal como solucion salina esteril, tampon fosfato salino, etc) y lista para utilizar y aplicar directamente cuando sea necesario. Por tanto, las composiciones de la presente invencion, que pueden comprender cualquier vehlculo o excipiente agronomicamente aceptable, pueden estar en forma llquida, por ejemplo en forma de suspension acuosa, que se puede preparar en agua o en una solucion acuosa y/o sus diluciones. Y en esta misma forma pueden usarse para el control de R. solanacearum y aplicarse con el metodo de prevention o tratamiento de la marchitez provocada por dicha bacteria, pudiendo estar por tanto listas para su aplicacion directa desde su forma de comercializacion y almacenamiento.

La elevada supervivencia, con mantenimiento de la actividad lltica sobre el huesped, de los bacteriofagos de la presente invencion, favorece su aplicabilidad en el campo, ya que pueden vehicularse directamente a traves del agua, un medio natural y simple, sin necesidad de encapsularlos o de anadir otros soportes flsicos, qulmicos y/o biologicos

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para proteger su viabilidad hasta el encuentro con la celula diana. Esto facilita el proceso de production, abarata los costes y hace innecesario el uso de formulaciones complejas para su aplicacion, asl como la adicion de agentes qulmicos al medio ambiente. Con ello, la alta supervivencia de los bacteriofagos en agua en ausencia de la celula diana reduce los costes de aplicacion de los mismos, al disminuir el numero de aplicaciones requeridas en el tiempo, y aumenta la eficiencia a largo plazo del producto en los sistemas agricolas donde se pretenden aplicar, pudiendo asl prevenir mas eficazmente la aparicion de brotes de la enfermedad causada por R. solanacearum. Todo ello redunda en un mayor "valor anadido" del producto de cara a los agricultores y viveristas, principales consumidores potenciales del producto a comercializar, los bacteriofagos de la presente invention y/o las composiciones que los comprenden.

Ademas, esta elevada supervivencia en agua natural durante su estado extracelular facilita su combination con otras estrategias de control (qulmico y/o flsico, e incluso biologico) frente al mismo patogeno de plantas u otros, lo que puede constituir una etapa opcional adicional del metodo de la presente invencion. El metodo de la presente invencion tambien es compatible con la aplicacion de compuestos de cobre, antibioticos y/o fumigantes del suelo, cuya aplicacion al suelo de crecimiento de la planta puede considerarse tambien una etapa opcional adicional del metodo de la presente invencion.

La presente invencion es tambien compatible con la aplicacion adicional no solo de un agente de control qulmico o flsico, sino de uno o mas agentes adicionales de control biologico, distintos de cualquiera de los bacteriofagos de la presente invencion (otros microorganismos, como bacterias, hongos y otros bacteriofagos, etc.). Una posibilidad es que se trate de alguno de los bacteriofagos llticos o lisogenicos previamente conocidos, que presentan actividad frente a dicha bacteria. Para su aplicacion, el agente adicional puede estar comprendido adicionalmente en una composition de la presente invencion, o puede aplicarse de forma separada.

Aunque la forma preferida de las composiciones de la presente invencion sea la forma llquida, en medio acuoso, especialmente cuando esta prevista su aplicacion a agua para el control de R. solanacearum y/o la prevention o la reduction de la marchitez bacteriana provocada por esta bacteria en plantas que vayan a ser regadas con dicha agua, son compatibles con la invencion otras formas de la composicion, especialmente aquellas conocidas por los expertos en la materia para la conservation de bacteriofagos, tales como en forma de liofilizados (lo que facilita su mantenimiento a temperatura ambiente) o en forma de suspension acuosa refrigerada y/o congelada, que preferiblemente se

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mantendra entre 4°C y -20°C, y hasta temperaturas mas bajas, como las del intervalo de -20°C hasta -80°C.

Como ya se comento, las composiciones de la presente invention pueden contener uno de los tres bacteriofagos cuyo aislamiento y caracterizacion morfologica y genomica se describe en la presente solicitud (vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 o vRsoP-WR2), o combinaciones de los mismos (vRsoP-WF2 y vRsoP-WM2, vRsoP-WF2 y vRsoP-WR2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2, o vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2). Los ensayos realizados y descritos en el Ejemplo 4 sugieren que las combinaciones, tanto de dos como de los tres bacteriofagos de la presente invencion, son mas efectivas que el uso de los bacteriofagos por separado, por lo que pueden ser una buena opcion para su utilization frente a R. solanacearum en aguas a tratar y, particularmente, en aguas que vayan a ser utilizadas para riego, con el objetivo de prevenir o reducir la marchitez provocada por esta bacteria. En las composiciones con combinaciones de varios bacteriofagos, cada uno de ellos puede estar a la misma concentracion, como en el Ejemplo 4 de la presente solicitud, pero tambien es compatible con la invencion que las concentraciones sean diferentes.

Ademas, una ventaja a considerar con el uso de la combination de dos o mas de los bacteriofagos objeto de la presente invencion es que con las mezclas se previene la aparicion de cepas de R. solanacearum que pudieran ser resistentes a la action lltica de alguno de ellos.

Respecto a la concentracion total de bacteriofagos en las composiciones de la presente invencion, no hay limitaciones, salvo las impuestas por razones qulmicas, que den lugar a que se sature la suspension y que los bacteriofagos precipiten o se depositen. Sin embargo, en la practica, esto es altamente improbable. Una posible option es que la concentration total de bacteriofagos objeto de la invencion oscile entre 105 y 109 unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml), que son concentraciones que han sido probadas en los Ejemplos de la presente solicitud y que puede ser tambien un rango de concentraciones orientativo en el que elegir la concentracion final de bacteriofagos que se desea que este presente en el agua de riego. No obstante, las concentraciones pueden ser mayores o menores que las comprendidas en ese rango, pudiendo mantenerse y/o utilizarse a concentraciones de 103 UFC/ml, como en el apartado 4.1 del Ejemplo 4, o incluso menores, pues los presentes inventores disponen de datos de obtencion de lisis en medio llquido con bacteriofagos de la presente invencion a concentraciones del orden de 102 UFC/ml. Asl, los rangos de 102 a 109 UFC/ml o de 103 a 109 UFC/ml son tambien posibles rangos de concentracion de las composiciones de la

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presente invention o para las condiciones de actuation de los bacteriofagos de la presente invencion, as! como otros con llmites superiores o inferiores, puesto que los bacteriofagos se multiplican dentro la bacteria.

En cuanto a los distintos bacteriofagos de la presente invencion, segun las condiciones previstas de aplicacion y/o mantenimiento, los datos de supervivencia pueden dar lugar a una preferencia por vRsoP-WM2, mientras que los macroensayos con plantas descritos en el Ejemplo 4, realizados concretamente con plantas de tomate, pueden dar lugar a una preferencia por vRsoP-WR2, pues en dichos ensayos se observo una mayor reduction de la marchitez bacteriana al aplicar este bacteriofago de forma individual, con respecto a los otros dos bacteriofagos de la presente invencion.

La invencion se explicara ahora con mayor detalle mediante los Ejemplos y las Figuras expuestos a continuation.

Ejemplos

- Ejemplo 1. Origen y aislamiento de los bacteriofagos.

Se aislaron bacteriofagos llticos frente a R. solanacearum de varios rlos de Castilla-Leon, Extremadura y Andalucla, en las proximidades de campos afectados de marchitez bacteriana. Una selection de estos bacteriofagos se purifico y se comprobo su actividad lltica en el laboratorio frente a R. solanacearum, tal y como se muestra en la Fig. 1.

De entre ellos, se eligieron tres bacteriofagos (vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2), de distintos orlgenes, para proseguir la caracterizacion.

- vRsoP-WF2: aislado del rlo Tormes en las proximidades de Salamanca.

- vRsoP-WM2: aislado del rlo Cayo en la provincia de Badajoz.

- vRsoP-WR2: aislado del rlo Yator en la zona de las Alpujarras, en la provincia de Granada.

Los tres bacteriofagos se purificaron por pases sucesivos de calvas en medio general LPGA (extracto de levadura [5 g] - peptona [5 g] - glucosa [10 g] - agar [20 g], disueltos en agua destilada [1 litro]; la glucosa se esteriliza por filtration y se anade posteriormente al resto del medio esterilizado por autoclavado) junto con celulas huesped de una cepa de referencia de R. solanacearum (cepa IVIA 1602.1, depositada en la Coleccion Francesa de bacterias asociadas a plantas [CFBP] con el numero CFBP 4944 y en la coleccion de libre acceso de la DSMZ con el numero DSM 100387). Este metodo es tambien el preferido para la amplificacion en medio solido de cualquiera de los bacteriofagos de la presente invencion.

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Una vez purificados, se procedio a la caracterizacion de su actividad lltica por rango de temperatura y pH y rango de huespedes tal y como se describe a continuation.

1.1. Rango de temperatura.

La actividad lltica observada de los bacteriofagos caracterizados frente a la cepa de R. solanacearum seleccionada (IVIA-1602.1) se observa entre 14 °C y 31°C en los tres casos.

Dentro de este intervalo, la temperatura rutinaria de incubation de los bacteriofagos para su multiplication en el huesped, tanto en medio solido como en medio llquido, en condiciones de laboratorio, esta entre 28-30°C, porque son los valores que se consideran optimos para el crecimiento de R. solanacearum en dichas condiciones.

Tambien se ensayaron mezclas de dos (vRsoP-WF2 - vRsoP-WM2, vRsoP-WF2- vRsoP- WR2, vRsoP-WM2 - vRsoP-WR2) o de los tres bacteriofagos (vRsoP-WF2 - vRsoP-WM2 - vRsoP-WR2). Cualquiera de las cuatro mezclas de bacteriofagos tambien presento actividad dentro del mismo rango de temperatura.

1.2. Rango de pH.

La actividad lltica observada de los bacteriofagos caracterizados frente a la cepa de R. solanacearum seleccionada (IVIA-1602.1) en las distintas aguas de riego ensayadas, procedentes de rlo, acequia y lago, fue positiva en todas ellas a pHs que oscilaron entre 6,5 y 9,0. Del mismo modo, las mezclas de los bacteriofagos presentaron actividad lltica en las mismas aguas de riego y, por tanto, dentro del mismo rango de pH. No se han determinado hasta el momento los valores de pH mlnimos y maximos de actividad lltica de los bacteriofagos.

1.3. Salinidad

Puesto que se ha descrito que R. solanacearum puede crecer en presencia de NaCl en concentraciones del 1%, e incluso, en ocasiones, hasta del 2%, se ensayo la actividad lltica de los bacteriofagos en agua salobre de distintos orlgenes, con concentraciones salinas de aproximadamente 1,5%, observandose actividad lltica en los tres bacteriofagos. Las cuatro mezclas de bacteriofagos de la invention citadas en el punto 1.1. tambien mostraron actividad lltica en las condiciones de salinidad ensayadas.

1.4. Luz visible

Dado que la luz visible en ocasiones puede afectar la actividad lltica de los bacteriofagos, se ensayo dicha actividad en condiciones de luz y oscuridad. Se observo que, tras 48 h ininterrumpidas de exposition a luz intensa (aproximadamente 15.000 luxes), la actividad

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iltica fue similar a la observada en condiciones de oscuridad, por lo que la presencia de luz no parece afectar a la actividad Utica de los bacteriofagos objeto de la invention. Igualmente, las distintas mezclas de bacteriofagos ensayadas presentaron similar actividad Utica tanto en presencia de luz como en oscuridad.

1.5. Aireacion

Puesto que R. solanacearum es una bacteria aerobia y normalmente se cultiva en medio llquido con agitation (aireacion), se determino el efecto de la ausencia de aireacion sobre la actividad Utica, puesto que en condiciones de campo la aireacion no siempre esta asegurada (por ejemplo durante el almacenamiento en depositos). Se observo actividad tanto en presencia como en ausencia de agitacion, de la misma magnitud, siendo mas rapida con aireacion. Del mismo modo, las mezclas de los bacteriofagos presentaron actividad Utica tanto con aireacion como sin ella.

1.6. Especificidad.

La especificidad se ensayo en placas Petri frente a cespedes bacterianos de las cepas de R. solanacearum en el medio de cultivo general LPGA, sobre los cuales se vertieron dos gotas de una suspension de cada uno de los tres bacteriofagos (Fig. 2). La actividad lltica se visualizo por la aparicion de areas de aclaramiento por lisis de bacterias en el cesped bacteriano en el lugar donde se depositaron las gotas de las suspensiones de bacteriofagos (Fig. 2, que corresponde al ensayo con la cepa de R. solanacearum IVIA- 1602.1).

Segun los datos de experimentation, la actividad lltica de los bacteriofagos caracterizados fue positiva para 35 cepas de R. solanacearum de distintos orlgenes, huespedes y anos de aislamiento (Tabla 1). Entre ellas, 13 son de ambito internacional y/o de referencia. Las restantes son todas ellas cepas aisladas en Espana, pertenecientes a la coleccion propia del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA).

Tabla 1. Cepas de R. solanacearum sensibles a la action lltica de los tres bacteriofagos de la presente invencion.

CODIGO CEPA

PAIS DE ORIGEN HUESPED ANO

Cepas internacionales

NCPPBa 1115

Reino Unido (Ex Egipto) Patata 1961

NCPPB 1584

Chipre Patata 1963

NCPPB 2505

Suecia Patata 1972

NCPPB 2797

Suecia Solanum dulcamara 1974

BR 264

Reino Unido Solanum dulcamara 1993

Bordeaux 11-47

Francia Berenjena 1994

Nantes 9-46

Francia Tomate 1994

550

Belgica (Ex Turqula) Patata 1995

IPO-1609

Holanda Patata 1995

Port 448

Portugal Patata 1995

W 12

Belgica Patata 1996

WE 4-96

Reino Unido Agua de rlo 1996

Tom 1

Reino Unido Tomate 1997

Cepas espanolas

IVIAb-1602.1

Canarias Patata 1996

IVIA-2049.53

Canarias Suelo 1999

IVIA-2068.58a

Canarias Patata 1999

IVIA-2068.61a

Canarias Patata 1999

IVIA-2093.3.1

Canarias Patata 1999

IVIA-2093.5T.1a

Canarias Patata 1999

IVIA-2128.1 b

Castilla-Leon Patata 1999

IVIA-2128.3a

Castilla-Leon Patata 1999

IVIA-2167.1a

Castilla-Leon Agua de rlo 1999

IVIA-2167.2b

Castilla-Leon Agua de rlo 1999

IVIA-2528.A1-2

Castilla-Leon Agua de rlo 2001

IVIA-2528.A3.1

Castilla-Leon Agua de rlo 2001

IVIA-2528.54.A2

Castilla-Leon Agua de rlo 2001

IVIA-2751.11

Extremadura Agua de rlo 2003

IVIA-2762.1

Extremadura Tomate 2003

IVIA-2762.4

Extremadura Tomate 2003

IVIA-3090.1

Andalucla Tomate 2005

IVIA-3090.5

Andalucla Tomate 2005

IVIA-3205.A.22

Castilla-La Mancha Agua de rlo 2006

IVIA-3243

Andalucla Tomate 2006

IVIA-3359.9

Castilla-La Mancha Agua de rlo 2007

IVIA-3359.10

Castilla-La Mancha Agua de rlo 2007

aNCPPB: National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Reino Unido. bIVIA: Coleccion de Bacterias del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Espana.

5 Las cepas de la NCPPB estan disponibles en esta coleccion internacional. El resto de cepas esta disponible en la coleccion de bacterias fitopatogenas del IVIA.

Tambien se ensayo la especificidad frente a otras especies de bacterias fitopatogenas y diversos aislados bacterianos de agua de rlo, para evaluar el posible impacto de los bacteriofagos aislados sobre la microbiota del agua natural.

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La actividad iltica fue negativa para los 14 aislados bacterianos de agua de rlo con los que se realizaron los ensayos, seleccionados de varias muestras de agua por presentar distinta morfologla colonial entre si y con respecto a la del huesped. La actividad tambien resulto negativa para las 11 cepas de bacterias fitopatogenas ensayadas, pertenecientes a otros generos, lo que demuestra la especificidad de los bacteriofagos seleccionados por R. solanacearum. Se obtuvieron los mismos resultados con las cuatro posibles mezclas de dichos bacteriofagos antes mencionadas.

- Ejemplo 2. Caracterizacion estructural: caracterizacion morfologica y molecular.

2.1. Caracterizacion morfologica.

Se realizo un estudio de la morfologla de los bacteriofagos seleccionados por microscopla electronica de transmision de las partlculas vlricas tras tincion negativa con acido fosfotungstico. Se observo en ellos la morfologla caracterlstica de los bacteriofagos de la familia Podoviridae: cabezas poligonales de entre 40 y 60 nm de diametro, sin envoltura, y con colas cortas (Fig. 3). Los bacteriofagos de dicha familia se caracterizan tambien por poseer un genoma de ADN de doble cadena, hecho que se confirmo en los ensayos que se describen a continuation.

2.2. Caracterizacion molecular.

2.2.1. Extraction del ADN de los tres bacteriofagos.

Se obtuvieron suspensiones concentradas de las capsidas de los tres tipos de bacteriofagos a partir de los correspondientes lisados bacterianos (filtrados y tratados con DNAsa y RNAsa para degradar los acidos nucleicos bacterianos), mediante protocolo de precipitation de capsidas con polietilenglicol. Tras el tratamiento de estas capsidas con proteinasa K, se realizo la extraccion del ADN genomico de dichos aislados segun protocolo con adicion de fenol, cloroformo y alcohol isoamllico. Tras comprobar que su concentration y pureza eran los adecuados, se analizaron por electroforesis en gel de agarosa para comprobar su integridad como paso previo al analisis de restriction (ver apartado 2.2.2) y a su purification para su posterior secuenciacion (ver apartado 2.2.3).

2.2.2. Analisis de restriccion de los genomas de los tres bacteriofagos.

A partir de los ADN genomicos obtenidos de los tres bacteriofagos se realizo un analisis de restriccion de los mismos con diversas enzimas de restriccion, elegidas por dar un patron de bandas en bacteriofagos del genero T7 de la familia Podoviridae. Estas enzimas fueron: Kpnl, Seal, Spel y Xmnl. Se ensayo tambien PstI porque es una enzima

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utilizada para cortar el genoma de los bacteriofagos de la especie anteriormente denominada R. solanacearum descritos en la patente japonesa JP4532959-B2 (numero de publication JP2005278513).

Como se aprecia en la Fig. 4, el perfil de bandas obtenido con estas cinco enzimas de restriction es aparentemente el mismo para los tres bacteriofagos: se observa una digestion completa con XmnI y digestiones parciales con Kpnl, Seal y Spel, mientras que no hay una digestion apreciable con Pstl. Estos resultados indican la proximidad genetica de los tres bacteriofagos entre si, y la diferencia con respecto a los bacteriofagos de la solicitud de patente japonesa JP4532959-B2, cuyos genomas si son cortados por PstI.

2.2.3. Secuenciacion masiva de los ADN genomicos de los tres bacteriofagos y analisis bioinformatico.

A partir de los ADN genomicos obtenidos pertenecientes a cada uno de los tres bacteriofagos, se procedio a la secuenciacion masiva de sus bases nucleotldicas y posterior analisis bioinformatico y anotacion completa de las secuencias genomicas encontradas (SEQ ID NO:1, correspondiente a vRsoP-WF2; SEQ ID NO:2, correspondiente a vRsoP-WM2 y SEQ ID NO:3, correspondiente a vRsoP-WR2). Esta parte se encargo a la empresa Valgenetics, S.L. (Parque Cientlfico de la Universidad de Valencia, Valencia, Espana).

Las principales conclusiones obtenidas fueron las siguientes:

El ensamblaje de las secuencias obtenidas por secuenciacion masiva rindio unas secuencias ensambladas finales con un 100% de fidelidad, cuyos tamanos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Tamano de las secuencias genomicas obtenidas para cada bacteriofago.

SEQ ID NO:

Bacteriofago Tamano en pares de bases (pb)

1

vRsoP-WF2 40.409

2

vRsoP-WM2 40.861

3

vRsoP-WR2 40.408

Los resultados indicaron que cada una de las secuencias mayoritarias incluidas en las muestras de SEQ ID NO:1 (correspondiente a vRsoP-WF2), SEQ ID NO:2

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(correspondiente a vRsoP-WM2) y SEQ ID NO:3 (correspondiente a vRsoP-WR2) es facilmente identificable como un genoma completo de un bacteriofago perteneciente al genero de virus similares a T7 (T7-like virus), cuya especie tipo es el bacteriofago de enterobacterias conocido como T7 (Enterobacteria phage T7), que pertenece a la familia Podoviridae.

La comparacion de los genomas de los tres bacteriofagos mostro que presentaban entre ellos una identidad del 99% a lo largo del genoma. No obstante, el analisis de estas secuencias hizo patente la presencia de pequenas diferencias genomicas en forma de mutaciones, inserciones y deleciones distribuidas a lo largo del genoma. Estas diferencias son mas elevadas entre la secuencia de SEQ ID NO:2 (correspondiente a vRsoP-WM2) y las secuencias de SEQ ID NO:1 (correspondiente a vRsoP-WF2) y SEQ ID NO:3 (correspondiente a vRsoP-WR2), las cuales son casi identicas. Asl, la secuencia de SEQ ID NO:2 contiene una insertion de 468 nucleotidos en comparacion con las secuencias de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3. La Fig. 5 muestra el extracto del alineamiento de secuencias que corresponde a esta zona de la insercion. Las pequenas diferencias encontradas en las secuencias nucleotldicas indican que los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 son bacteriofagos distintos de una misma especie vlrica (Tabla 3).

Tabla 3. Comparacion de las secuencias de los genomas de los bacteriofagos vRsoP-

WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2

Secuencia comparada (SEQ ID NO:)

Secuencia patron de comparacion (SEQ ID NO:) Cobertura* Identidad**

1

2 98% 99%

1

3 100% 99%

2

3 99% 99%

* Homologla entre las secuencias de los genomas comparados, en porcentaje.

** Nucleotidos coincidentes dentro de las zonas de homologla de los genomas comparados, en porcentaje.

Adicionalmente, mediante los analisis BlastN y Blast2Seq realizados con las herramientas de uso publico accesibles a traves de la pagina web del Centro Nacional de Information Biotecnologica de EE.UU. (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), se comprobo que los genomas de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 exhiben algunas regiones con alta identidad (alrededor de un 70%) con los bacteriofagos de: Ralstonia RSB1, Vibrio

VP4 y, sobre todo, Rhizobium RHEphOI, todos ellos del tipo de los bacteriofagos similares a T7 (T7-like) (Tabla 4). Estas regiones (correspondientes al 5-23% del genoma completo de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2) pertenecen a regiones altamente conservadas.

5 Tabla 4. Comparacion de las secuencias de los genomas de los bacteriofagos vRsoP- WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 con genomas de varios bacteriofagos T7-like.

Secuencia comparada (SEQ ID NO:)

Genoma del virus con la secuencia patron de comparacion (n° Acceso GenBank) Cobertura* Identidad**

1

0 Ralstonia RSB1 (AB597179.1) 2% 84%

1

0 T7 (NC_001604.1) 5% 67%

1

0 Rhizobium RHEph01 (JX483873.1) 19% 68%

1

0 Vibrio VP4 (NC_007149.1) 5% 70%

2

0 Ralstonia RSB1 (AB597179.1) 15% 66%

2

0 T7 (NC_001604.1) 5% 67%

2

0 Rhizobium RHEph01 (JX483873.1) 23% 68%

2

0 Vibrio VP4 (NC_007149.1) 4% 70%

3

0 Ralstonia RSB1 (AB597179.1) 15% 66%

3

0 T7 (NC_001604.1) 5% 67%

3

0 Rhizobium RHEph01 (JX483873.1) 22% 68%

3

0 Vibrio VP4 (NC_007149.1) 2% 70%

* Homologla entre las secuencias de los genomas comparados, en porcentaje.

** Nucleotidos coincidentes dentro de las zonas de homologla de los genomas comparados, en porcentaje.

10 Estos resultados revelan que, excepto en estas zonas conservadas dentro de los bacteriofagos T7-like, los genomas de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 contienen una secuencia nucleotldica altamente divergente de la de los demas bacteriofagos depositados en el GenBank. Por lo tanto, estas elevadas diferencias en secuencia nucleotldica avalan que los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y 15 vRsoP-WR2 corresponden a una nueva especie dentro del genero de los virus T7-like.

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Por otra parte, la identification de los marcos abiertos de lectura (ORF: open reading frame) y de elementos caracteristicos de bacteriofagos revelo que las secuencias de los genomas de los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2 poseen una organization genomica y expresion de los ORFs similar entre ellos, y a la del bacteriofago T7 en parte del genoma (Fig. 6).

En resumen, los tres bacteriofagos de la presente invention son tres aislados de la misma especie vrnca, tratandose de una nueva especie catalogada como perteneciente al genero T7 de la familia Podoviridae, con organizacion muy similar pero distinta a la de los bacteriofagos T7 depositados en el GenBank (Fig. 6). Los nuevos bacteriofagos presentan secuencias distintas a los bacteriofagos T7, solo se parecen en algunas zonas muy conservadas, como las relacionadas con la replication y la encapsidacion.

- Ejemplo 3. Supervivencia de los tres bacteriofagos en agua natural de rio.

Se ensayo la capacidad de supervivencia de los tres bacteriofagos seleccionados en dos tipos diferentes de agua de rio: Tormes, de Salamanca, y Turia, de Valencia. Estos dos tipos de agua presentaron diferencias destacables en los principales parametros fisico- quimicos consultados de su composition: en concreto con el agua del rio Turia los valores fueron comparativamente unas 100 veces mayores para el Mn, 10 veces mayores para el Fe, entre 5 y 10 veces mayores para los cloruros y el triple de nitratos; con el agua del rio Tormes los valores fueron aproximadamente 4 veces mas altos de fosfatos; los valores medios de pH estuvieron en torno a 8,13 en el agua del rio Turia y 7,36 en el agua del rio Tormes. Los rangos de temperatura medioambiental oscilaron entre 3,5 a 20,9°C para el rio Tormes y de 11,5 a 22,0°C para el rio Turia, es decir, ambos rangos se encuentran dentro de los valores de temperatura utilizados para los ensayos de supervivencia de los bacteriofagos, que fueron de 4°C, 14°C y 24°C, y a los valores de pH de 7,2 para el agua del rio Tormes y 8,1 para el agua del rio Turia.

Sorprendentemente, se observo que todos los bacteriofagos mantuvieron su actividad lrtica frente a R. solanacearum tras mas de cinco meses en estas condiciones, en ausencia del huesped ya que, previamente a la inoculation, el agua se habia filtrado por 0,22 pm y autoclavado.

La Fig. 7 muestra sendas graficas con la evolution de las unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml) tanto en el agua del rio Tormes (panel A) como en agua del rio Turia (panel B), en las muestras incubadas a 14°C. Se observa que las UFC/ml se mantienen en ausencia de R. solanacearum. Las curvas de supervivencia de los tres bacteriofagos en las muestras mantenidas a 4°C y 24°C fueron similares.

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Asl, cabe destacar que los tres bacteriofagos se mantienen activos y con niveles altos de actividad lltica a las tres temperaturas ensayadas durante mas de 5 meses.

Ademas, a 4°C y 14°C se pudo confirmar la supervivencia y mantenimiento de la actividad lltica de todos los bacteriofagos durante un perlodo de tiempo tan prolongado como tres anos. Este resultado es interesante de cara a su conservation dentro de este rango de temperaturas cuando se requieran perlodos tan prolongados de almacenamiento.

- Ejemplo 4. Biocontrol de la marchitez bacteriana causada por R. solanacearum.

4.1. Capacidad de control de las poblaciones bacterianas en agua natural de rlo.

Puesto que los tres bacteriofagos objeto de la invention presentaron una actividad lltica similar a distintas temperaturas y pHs en las aguas naturales ensayadas, inicialmente se eligio uno de ellos como modelo (bacteriofago vRsoP-WF2) para realizar los ensayos de biocontrol de la marchitez bacteriana causada por R. solanacearum.

Se realizo un ensayo de coinoculacion de bacteria-bacteriofago en agua de rlo esteril, en un sistema cerrado y controlado en el laboratorio, para la cuantificacion simultanea de los niveles poblacionales de ambos microorganismos con respecto al tiempo. Para ello, la bacteria se inoculo a una concentration de 106 unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml) en el medio llquido (agua de rlo esteril) y el bacteriofago se anadio a una concentracion de 103 unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml). Como se observa en la Fig. 8, se confirmo que las poblaciones de la bacteria inoculada (cepa de referencia IVIA-1602.1 de R. solanacearum) descendlan significativamente en pocas horas por la actividad lltica de los bacteriofagos inoculados (bacteriofago vRsoP-WF2), practicamente desapareciendo la bacteria patogena al cabo de unas 10 horas.

4.2. Ensayos de biocontrol de marchitez bacteriana en plantas huesped: bacteriofago vRsoP-WF2.

Se ensayo la capacidad del bacteriofago de agua de rlo vRsoP-WF2 para el biocontrol de la enfermedad causada por R. solanacearum en dos experiencias independientes, regando plantas de un huesped susceptible (plantas de tomate) con una concentracion de la cepa bacteriana de referencia IVIA 1602.1 (105 UFC/ml) y dos concentraciones diferentes de dicho bacteriofago (106 y 109 UFC/ml), y sus diluciones decimales (105 y 108 UFC/ml, respectivamente), en condiciones de temperatura y humedad optimas para el desarrollo de la enfermedad. El procedimiento experimental se muestra en la Fig. 9.

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Los resultados de ambas experiencias se muestran en la Fig. 10. Globalmente, la incidencia de la enfermedad disminuyo hasta el 0-5% en plantas regadas con el patogeno y el bacteriofago, en experimentos independientes, mientras que en los controles sin bacteriofagos la incidencia de la marchitez fue del 25-50%.

4.3. Ensayos de biocontrol de marchitez bacteriana en plantas huesped: aislados vRsoP- WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2, y sus combinaciones.

De manera similar a las experiencias de biocontrol en planta realizadas con el bacteriofago vRsoP-WF2 descritas en el apartado 4.2, se llevo a cabo un macroensayo, en el que se pudo estudiar simultaneamente la capacidad de biocontrol de cada uno de los tres bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2, tanto por separado como a traves de mezclas con combinaciones de ellos dos a dos y la mezcla de los tres. Se considera un macroensayo porque se realiza con un elevado numero de plantas, lo que requiere del espacio suficiente para su incubacion y de, al menos, dos personas cualificadas para su ejecucion. En todos los casos se inocularon plantas de tomate, que son un huesped susceptible del patogeno, ensayandose aproximadamente 35 plantas por condition experimental, lo que supone unas 315 plantas. Dichas plantas se mantuvieron en camara climatica de las dimensiones adecuadas, en ciclos dla/noche de 16 h de luz a 26°C y 8 h de oscuridad a 22°C y una humedad de aproximadamente el 70%, en condiciones de contention biologica en un laboratorio de bioseguridad. En el citado macroensayo, la concentration de R. solanacearum (cepa IVIA 1602.1) en el agua de riego fue de 105 UFC/ml, mientras que la concentracion total de bacteriofagos fue de 107 UFC/ml en todas las condiciones experimentales ensayadas.

La grafica de la Fig. 11 muestra los resultados obtenidos. Dichos resultados indican que:

- el bacteriofago vRsoP-WR2 es el mas efectivo de los tres, dando lugar a una mayor disminucion de la marchitez bacteriana cuando se anade al agua de riego a la misma concentracion que los otros dos bacteriofagos,

- son mas efectivas cualquiera de las mezclas de bacteriofagos (bien las combinaciones binarias, o la combinacion que incluye a los tres) que los bacteriofagos por separado.

Todos estos experimentos demuestran la potencialidad de los bacteriofagos llticos de la presente invention, aislados en varios puntos diferentes de la geografla espanola, para el biocontrol de R. solanacearum y, por lo tanto, la aplicabilidad de esta actividad lltica tanto en el tratamiento del agua medioambiental de uso agricola, o de otros usos, contaminada

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con este patogeno, como en la prevention y/o control de la enfermedad que causa en campo. Esta capacidad de biocontrol es especialmente importante si se tiene en cuenta que no hay actualmente metodos de control eficaces en suelo, ni disponibles en agua. Y, en el presente caso, como se ha discutido previamente y se demuestra en los experimentos anteriores, los agentes de biocontrol proporcionados por la presente invention presentan la inesperada caracterlstica de su elevada supervivencia en agua en condiciones de temperatura medioambiental habituales en Espana, lo que es una ventaja tanto para su aplicacion a las plantas mediante el agua de riego y para el control y prevencion de la presencia de R. solanacearum en la misma, como para el facil y prolongado mantenimiento de las formas de comercializacion de los bacteriofagos de la invencion previamente a su utilization. Dicho mantenimiento puede tener lugar en medio acuoso durante largo tiempo sin perdidas severas de la actividad Utica y ni siquiera requerirla, antes de su aplicacion directa al agua, de la dilution previa de los bacteriofagos o de su mezcla con algun tipo de soporte flsico o qulmico que actuara como vehlculo para facilitar su interaction con la bacteria diana o que garantizara su estabilidad hasta conseguirlo, de forma que la aplicacion al agua de riego o a corrientes o reservorios de agua en los que se quiera controlar posibles contaminaciones con R. solanacearum podrla ser, por ejemplo, por simple vertido sobre dicha agua.

Deposito de microorganismos

Los bacteriofagos vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2, con capacidad para lisar celulas de R. solanacearum han sido depositados en la coleccion alemana de cultivos microbianos Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche-Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, siguiendo las normas del Tratado de Budapest para el deposito de microorganismos para fines de patentes, en las siguientes fechas y se les ha asignado el siguiente numero de acceso (Tabla 5).

Tabla 5. Datos del deposito de los bacteriofagos en la coleccion alemana DSMZ.

Material

Fecha de Deposito Numero de acceso

vRsoP-WF2

15 de abril de 2015 DSM 32039

vRsoP-WM2

15 de abril de 2015 DSM 32040

vRsoP-WR2

15 de abril de 2015 DSM 32041

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Referencias

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Claims (31)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un bacteriofago con capacidad de lisar celulas de Ralstonia solanacearum seleccionado del grupo de:

   a) vRsoP-WF2 (DSM 32039), vRsoP-WM2 (DSM 32040), vRsoP-WR2 (DSM 32041), o

   b) un podovirus cuyo genoma presenta la secuencia de SEQ ID NO:1 (correspondiente a vRsoP-WF2), SEQ ID NO:2 (correspondiente a vRsoP- WM2) o SEQ ID NO:3 (correspondiente a vRsoP-WR2).
2. 2. Bacteriofago segun la reivindicacion 1, que es el bacteriofago vRsoP-WM2 (DSM 32040) o el bacteriofago vRsoP-WR2 (DSM 32041).
3. 3. Una composition que comprende al menos uno de los bacteriofagos de la reivindicacion 1, o combinaciones de los mismos.
4. 4. Composicion segun la reivindicacion 3, que comprende una de las siguientes combinaciones de bacteriofagos:

   a) vRsoP-WF2 y vRsoP-WM2;

   b) vRsoP-WF2 y vRsoP-WR2;

   c) vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2;

   d) vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 y vRsoP-WR2.
5. 5. Composicion segun la reivindicacion 4, en la que cada uno de los bacteriofagos de la combination esta presente en la misma concentration.
6. 6. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que esta en forma de suspension en agua o en una solucion acuosa.
7. 7. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la concentracion total de bacteriofagos con capacidad de lisar celulas de R. solanacearum oscila entre 102 y 108 9 unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml).
8. 8. Composicion segun la reivindicacion 7, en la que la concentracion total de

   bacteriofagos con capacidad de lisar celulas de R. solanacearum oscila entre 105 y 109 unidades formadoras de calvas por mililitro (UFC/ml).

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9. 9. Composition segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, que comprende un vehiculo y/o excipiente agronomicamente aceptable.
10. 10. Composition segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, que adicionalmente comprende un agente de control quimico de R. solanacearum o un agente de control biologico de R. solanacearum distinto de un bacteriofago de la revindication 1 o 2.
11. 11. Composition segun la revindication 10, que adicionalmente comprende un agente de control biologico de R. solanacearum que es un bacteriofago lrtico o lisogenico con actividad frente a dicha bacteria.
12. 12. Uso de un bacteriofago de la revindication 1 o 2 o de una composition de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 para el control de R. solanacearum en agua de cursos naturales, corrientes de agua canalizadas, reservorios naturales de agua, reservorios artificiales de agua, agua de riego y reservorios de aguas de riego, que va a ser utilizada para el riego de cultivos.
13. 13. Uso segun la revindication 12, en el que el bacteriofago de la reivindicacion 1 o 2 o la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 se anade a un reservorio natural de agua o a un reservorio artificial de agua.
14. 14. Uso segun la revindication 13, en el que el agua se mantiene en el reservorio a una temperatura comprendida entre 4°C y 30°C, o la temperatura media del agua del reservorio esta comprendida entre 4°C y 24°C, ambos valores incluidos.
15. 15. Uso segun la revindication 14, en el que el agua se mantiene en el reservorio a una temperatura comprendida entre 4°C y 24°C.
16. 16. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el pH del agua esta en el intervalo de 6,5 a 9,0, ambos valores incluidos.
17. 17. Uso de un bacteriofago de la revindication 1 o 2 o de una composition de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 para el control de R. solanacearum en suelo, mediante la adicion de uno o mas de los bacteriofagos de la reivindicacion 1 o 2 o

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    de una composition de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 a dicho suelo a traves del agua de riego con la que se irriga el suelo, tratada previamente con el o los bacteriofagos mencionados o con la mencionada composition.
18. 18. Un procedimiento para prevenir o tratar la marchitez provocada por R. solanacearum en una planta, que comprende las etapas de:

    a) anadir al agua que vaya a utilizarse para regar la planta una composition de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11;

    b) regar la planta con dicha agua.
19. 19. Procedimiento segun la revindication 18, en el que el pH del agua esta en el intervalo de 6,5 a 9,0, ambos valores incluidos.
20. 20. Procedimiento segun la revindication 18 o 19, en el que el agua a la que se le ha anadido previamente al riego, la composition de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, se mantiene a una temperatura comprendida entre 4°C y 30°C o una temperatura media comprendida entre 4°C y 24°C, ambos valores incluidos.
21. 21. Procedimiento segun la revindication 20, en el que el agua se mantiene a una temperatura comprendida entre 4°C y 24°C.
22. 22. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 que comprende una etapa en la que el agua de riego se mantiene en un reservorio natural o artificial desde que se anade la composition y previamente al regar la planta con dicha agua.
23. 23. Procedimiento segun la revindication 22 en el que, previamente a regar la planta con el agua, el agua de riego se mantiene en un reservorio artificial que es un deposito sin cobertura superficial o un deposito cubierto.
24. 24. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, que comprende una etapa previa en la que la composition de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 que se anade al agua de riego se mantiene a una temperatura de entre 4°C y 14°C, ambas incluidas.

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25. 25. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que el riego se produce por un sistema de riego por inundacion parcial o total, por goteo, subterraneo mediante tuberlas perforadas, por exudacion a traves de tuberlas porosas, o por aspersion.
26. 26. Procedimiento segun la reivindicacion 25, en el que el riego se produce por inundacion parcial.
27. 27. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, en el que la planta se esta cultivando en un campo, en un vivero, en un invernadero o en cultivo hidroponico.
28. 28. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, en el que la planta es de una especie perteneciente a la familia de las solanaceas y susceptible y/o tolerante a R. solanacearum o de cualquier otra especie susceptible y/o tolerante a R. solanacearum.
29. 29. Procedimiento segun la reivindicacion 28, en el que la planta se selecciona del grupo de plantas de patata (Solanum tuberosum), tomate (Solanum lycopersicum), pimiento (Capsicum annuum), berenjena (Solanum melongena).
30. 30. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, que adicionalmente comprende una etapa previa a la aplicacion de dicho procedimiento en la que el agua de riego es sometida a otra u otras estrategias de control qulmico, flsico, y/o biologico frente al mismo patogeno de la planta u otros.
31. 31. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30, que comprende una etapa opcional en la que se aplican al suelo de crecimiento de la planta compuestos de cobre, antibioticos y/o fumigantes del suelo.