CN111118038B

CN111118038B - 一种冬生疫霉的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用

Info

Publication number: CN111118038B
Application number: CN202010041623.9A
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 胡涛; 汪澳华; 焦彬彬; 严娟; 廖婷婷; 陈贞鹏
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN111118038A; AU2020101971A4

Abstract

本发明公开了一种冬生疫霉的检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其专用检测引物和检测方法，该检测靶标Phibe_s00003g00002.1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，公开了特异性检测靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA检测技术的特异性引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，探针序列如SEQ ID NO：5所示。本发明发现了新的检测靶标，且基于该靶标的快速检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时本发明设计的引物及探针组合用于RPA‑LFD检测技术，其特异性强，灵敏度高，为冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的检测提供了新的技术平台。

Description

一种冬生疫霉的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种冬生疫霉的特异性新检测靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用。

背景技术

疫霉(Phytophthora)，任何植物一旦被它侵染就会在劫难逃，损伤严重。所以，拉丁文Phytophthora被描述为：植物的毁坏者。Phyto，在原来的希腊语中是植物的意思，phthora则是破坏的意思。疫霉(Phytophthora)正式报道有100多个种,许多疫霉都有严重危害农业生产安全的记录，可以说个个是农作物的毁坏者，轻则造成缺苗断垄，重则造成严重的产量损失，甚至绝产。因此，防止外来有害检疫性疫霉菌传入我国具有重要意义。我国进境检疫性名录中包括冬生疫霉Phytophthora hibernalis、丁香疫霉P.syringae、栎树猝死病菌P.ramorum、大豆疫霉病菌P.sojae、栗疫霉黑水病菌P.cambivora、马铃薯疫霉绯腐病菌P.erythroseptica、草莓疫霉红心病菌P.fragariae、树莓疫霉根腐病菌P.rubi、雪松疫霉根腐病菌P.lateralis、苜蓿疫霉根腐病菌P.medicaginis、菜豆疫霉病菌P.phaseoli共11种疫霉菌。柑橘是一种性喜温暖湿润气候的经济型水果，在全世界138个国家(地区)有种植，产量和面积均占百果之首^[1]。我国是柑橘生产大国，柑橘产业在我国农业经济发展中占有重要地位，从2007年起，我国已经成为全球柑橘年产量最大的国家。1925年，首次在澳大利亚西部柑橘果实上发现冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)。目前冬生疫霉主要寄主为柑橘、苹果、番茄等植物，可引发水果褐腐病、枝枯病和叶枯病，导致果实变褐、腐烂、直至植株死亡。该病菌首次在澳大利亚西部的柑桔果实上发现，目前在欧洲的绝大部分国家，以色列、土耳其、美国加州、澳大利亚、新西兰、巴西等国家和地区均有分布，尤其以意大利、葡萄牙等国柑橘受害严重。2015年，上海口岸从进口美国脐橙和柚子中，截获冬生疫霉。目前中国尚未有冬生疫霉(P.hibernalis)分布的报道。传统的冬生疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松针适合用于诱捕冬生疫霉菌。传统方法在冬生疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区(ITS)或者elicitin基因。这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以此为靶标设计的引物难以将不同种区分开来。

不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对提升对冬生疫霉的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

发明内容

针对现有技术中冬生疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种新的冬生疫霉的检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其靶标建立的RPA-LFD检测引物组合物。本发明另一目的是提供上述冬生疫霉的RPA-LFD检测方法。本发明建立的快速检测冬生疫霉的方法，通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为冬生疫霉的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本研究根据已公布的疫霉基因组序列(樟疫霉P.cinnamomi，大豆疫霉P.sojae，橡树疫霉P.ramorum，致病疫霉P.infestans，辣椒疫霉P.capsici)以及CGRB测序中心获得的疫霉基因组序列，包括冬生疫霉(P.hibernalis)、丁香疫霉(P.syringae)、烟草疫霉(P.nicotianae)、豇豆疫霉(P.vignae)、栗黑水疫霉(P.cambivora)、樟疫霉(P.cinnamomi)、樟疫霉变种等共计15种疫霉的全基因组序列分析，通过Blast序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得冬生疫霉特异性检测靶标1719个；随机从冬生疫霉1719个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物。采用PCR技术对设计的特异性引物进行验证。特异性评价选择与冬生疫霉不同种(丁香疫霉；栗黑水疫霉；寄生疫霉；致病疫霉；木香疫霉；草莓疫霉；苎麻疫霉等)和不同属的菌(平头炭疽菌；茄镰刀菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮轮枝菌；终极腐霉)的DNA作为模板，进行PCR验证，最终获得1个冬生疫霉检测新靶标基因Phibe_s00003g00002.1。

第一方面，本发明提供了冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

ATGCCATGGGCTCTAGACCACCCGCCTCTAACTGCGAAACGGTCTTCGCTGGACGAGATTGACTATACGTGTAGACGTCGGTTCCGCTTTTTGCCTGAAGAAATTGGACTACTAGACGAAGCGCTTGACCTGCCCGAGTACATCTATACTGCACAGAACTGCCCTGTCCCTAGGAAGGAGGCGCGGTGTCTGCTGTTGCGTCGAGTGGCATATCCGAATCGCCTGAAAGATTTAGAAGTTGAGTTTGGTCGCCAGGAGTGTACTATGCTCGACTGTCAATATCACACTGGCATGTGTCTTCAACAAGATAAAAAAAGATGGAGTTCGATCAGCGCATAA(SEQ ID NO.1)

第二方面，本发明提供了冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

MPWALDHPPLTAKRSSLDEIDYTCRRRFRFLPEEIGLLDEALDLPEYIYTAQNCPVPRKEARCLLLRRVAYPNRLKDLEVEFGRQECTMLDCQYHTGMCLQQDKKRWSSISA(SEQ ID NO.2)

第三方面，本发明提供了检测新靶标Phibe_s00003g00002.1在检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)中的应用。

第四方面，本发明提供了冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1的检测引物及探针组合，所述检测引物中，正向引物序列如SEQID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述探针序列如SEQ ID NO：5所示。

Phi2RPA-F：ATGCCATGGGCTCTAGACCACCCGCCTCTAACTG(SEQ ID NO：3)；

Phi2RPA-R：TTATGCGCTGATCGAACTCCATCTTTTTTTATC(SEQ ID NO：4)；

Phi2RPA-P：5'-FAM-AGACGAAGCGCTTGACCTGCCCGAGTACAT-THF-TATACTGCACAGAAC-C3spacer-3'；(SEQ ID NO：5)。

第五方面，本发明提供了检测引物和探针组合在检测冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)中的应用。

第六方面，本发明提供了一种检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的试剂盒，至少包括1次用量以上的所述的检测引物(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)和探针(SEQ IDNO：5)组合。

进一步地，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的Twist Amp反应单元管、缓冲液Buffer、MgAc、去离子水、HybriDetect assay buffer、侧流层析试纸条。

第七方面，本发明提供了所述试剂盒在检测冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)中的应用。

第八方面，本发明提供了一种检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的方法，包括以下步骤

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，利用所述的引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)和探针(SEQ IDNO.5)组合或所述的检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)试剂盒进行RPA扩增；

其中，所述RPA扩增：向装有冻干酶粉的0.2mL Twist Amp反应单元管(Twist Ampnfo kits，Twist)中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物(SEQ ID NO.3)2.1μL，10μM的下游引物(SEQ ID NO.4)2.1μL，探针(SEQ ID NO.5)0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。

3)应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；

取RPA反应产物10μL加入190μL的HybriDetect assay buffer(MileniaBiotec,Giessen,Germany)进行稀释，稀释后取10μL滴在试纸条的Hybri Detect 1 strip。另一端试纸条垂直插入100μL的HybriDetect assay buffer中，室温放置5min。

当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)。

与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明提供了一个新的高信赖度特异性分子检测新靶标Phibe_s00003g00002.1，并基于新靶标建立灵敏、准确、高通量的RPA-LFD检测技术体系，对提升疫霉属的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

2)操作方便：本发明提供的检测冬生疫霉的RPA-LFD方法克服了现有技术中冬生疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测冬生疫霉的问题。本发明检测方法在等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)，不需要复杂仪器，能较好满足对冬生疫霉的现场检测。

3)本发明的方法与常规PCR相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在25℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。这样就实现了恒温扩增，不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源RPA反应就可以发生，极大的扩展了RPA使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。PCR反应时间需要1个半小时，而RPA仅需要反应15分钟，大大缩短了检测时间，而且RPA比PCR有更高的特异性与灵敏度，是普通PCR的10倍。

4)本发明可以用于带菌植株组织中冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的快速检测，只需约0.5h即可完成检测过程，是一种检测冬生疫霉的有效手段。本发明为冬生疫霉的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，可用于冬生疫霉的高灵敏度快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1基于冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA-LFD侧流层析试纸条特异性检测结果图；图中，1：冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；2：雪松疫霉(P.lateralis)；3：丁香疫霉(P.syringae)；4：栗黑水疫霉(P.cambivora)；5：瓜类疫霉(P.melonis)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：恶疫霉(P.cactorum)；8：大豆疫霉(P.sojae)；N：阴性对照。图1中显示1号有2条带，其中一条带为质控线(Control Line)，一条线为检测线(Test Line)，因此呈阳性，其余只有一条质控线(Control Line)的条带呈阴性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；说明新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1具有种间的特异性。

图2是基于冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA-LFD的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1：冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；2：终极腐霉(Pythium ultimum)；3：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；4：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；5：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；7：稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)；N：阴性对照；图2中显示第1条有2条带，其中一条带为质控线(Control line)，一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)；其余只有一条质控线(Control line)的条带呈阴性。说明新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1具有属间的特异性。

图3基于冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)新发掘检测新靶标Phibe_s00003g00002.1的普通PCR特异性检测结果图；图中，1：冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)；2：雪松疫霉(P.lateralis)；3：丁香疫霉(P.syringae)；4：栗黑水疫霉(P.cambivora)；5：瓜类疫霉(P.melonis)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：恶疫霉(P.cactorum)；8：大豆疫霉(P.sojae)；9：棕榈疫霉(P.palmivora)；10：终极腐霉(Pythiumultimum)；11：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；12：平头炭疽菌(Colletotrichumtruncatum)；13：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；14：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)；15：稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)；N：阴性对照。。只有冬生疫霉能够扩增出300bp的特异性条带，而其它疫霉以及真菌无扩增。

图4基于冬生疫霉新检测靶标Phibe_s00003g00002.1设计的特异性引物普通PCR灵敏度验证电泳图。

图5是基于冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)新检测靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA-LFD侧流层析试纸条检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的灵敏度试验结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

通过全基因组序列比对获得了1700多个冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)特异性基因，并从中发掘出高信赖度特异性分子检测靶标Phibe_s00003g00002.1，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

并基于该新靶标建立灵敏、准确的RPA-LFD检测技术体系。该RPA-LFD检测技术体系所使用的RPA-LFD检测引物组合物：由正向引物Phi2RPA-F(SEQ ID NO：3)、反向引物Phi2RPA-R(SEQ ID NO：4)和探针Phi2RPA-P(SEQ ID NO：5)组成；各引物及探针序列具体如下：

Phi2RPA-F：ATGCCATGGGCTCTAGACCACCCGCCTCTAACTG(SEQ ID NO：3)；

Phi2RPA-R：TTATGCGCTGATCGAACTCCATCTTTTTTTATC(SEQ ID NO：4)；

采用该引物组合物检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的方法：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的RPA-LFD引物组合物进行RPA-LFD；

样品检测：向装有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应单元管(TwistAmp Basickits，Twist)中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。其中，所述RPA引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。扩增产物大小不超过500bp。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL灭菌ddH₂O。RPA反应结束后，应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control line)，一条位于检测区(Test line)，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)。

实施例2

为了验证RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性，以冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)菌株和其它疫霉以及病原菌为供试材料(表1)，RPA侧流层析试纸条检测方法的结果显示冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control Line)，一条位于检测区(Test Line)，则结果为阳性，其它疫霉以及病原菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test Line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)。

选择与冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)不同种(雪松疫霉；丁香疫霉；栗黑水疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉等)和不同属的菌(终极腐霉；木贼镰孢菌；平头炭疽菌；大丽轮枝菌；大丽轮枝菌；立枯丝核菌；稻瘟病菌等)的DNA作为模板，进行RPA-LFD(侧流层析试纸条检测)。

表1用于冬生疫霉PCR检测的真菌和卵菌菌株及检测结果

按照实施例1的方法进行检测，检测结果如图1-3所示。

图1是基于冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)新发掘检测新靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA-LFD侧流层析试纸条特异性检测结果图；图中1：冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；2：雪松疫霉(P.lateralis)；3：丁香疫霉(P.syringae)；4：栗黑水疫霉(P.cambivora)；5：瓜类疫霉(P.melonis)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：恶疫霉(P.cactorum)；8：大豆疫霉(P.sojae)；N：阴性对照。图1中显示1号有2条带，其中一条带为质控线(Control Line)，一条线为检测线(Test Line)，因此呈阳性，其余只有一条质控线(Control Line)的条带呈阴性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；说明新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1具有种间的特异性。

图2是基于高信赖度特异性分子检测新靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA-LFD侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1：冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)；2：终极腐霉(Pythium ultimum)；3：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；4：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；5：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)；7：稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)；N：阴性对照；图2中显示第1条有2条带，其中一条带为质控线(Control line)，一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；其余只有一条质控线(Control line)的条带呈阴性。说明新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1具有属间的特异性。可见，以实施例1设计的引物进行RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果显示2条棕色条带(图2)，目标条带清析，能有效检测出冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。

实施例3

用同样浓度的冬生疫霉的标准菌株的基因组DNA作为扩增模板，采用上下游引物Phi2RPA-F/Phi2RPA-R进行PCR扩增反应，图3是基于高信赖度特异性分子检测靶标Phibe_s00003g00002.1的普通PCR的特异性检测结果图检测结果，只有冬生疫霉能够扩增出300bp的特异性条带，而其它疫霉以及真菌无扩增。基于新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1设计的上下游引物同样适用于普通PCR的扩增，再次证明新发掘检测靶标Phibe_s00003g00002.1具有种间的特异性。1：冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；2：雪松疫霉(P.lateralis)；3：丁香疫霉(P.syringae)；4：栗黑水疫霉(P.cambivora)；5：瓜类疫霉(P.melonis)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：恶疫霉(P.cactorum)；8：大豆疫霉(P.sojae)；9：棕榈疫霉(P.palmivora)；10：终极腐霉(Pythium ultimum)；11：木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)；12：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；13：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；14：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；15：稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)；N：阴性对照。

实施例4

用同样浓度的冬生疫霉的标准菌株的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增反应，比较两种方法的灵敏度；重复实验3次，以确定PCR法检测冬生疫霉基因组DNA的灵敏度；3次重复实验的结果一致。在基因组DNA浓度为1ng·μL^-1时，PCR检测能够检测出特异性条带，结果如图4所示，证明发生特异性扩增，检测结果判为阳性。利用本发明的RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果如图5所示目标条带清析。由此可见，基于同一新发掘靶标Phibe_s00003g00002.1，结果表明RPA检测浓度为100pg·μL^-1，而PCR检测浓度为1ng·μL^-1时仍能看到目标条带，说明RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度要比PCR方法高出10倍。但PCR检测过程需要2.5h，而RPA检测时间仅需30min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种冬生疫霉的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1及其应用

<130> 2020

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> 冬生疫霉（Phytophthora hibernalis）

<400> 1

atgccatggg ctctagacca cccgcctcta actgcgaaac ggtcttcgct ggacgagatt 60

gactatacgt gtagacgtcg gttccgcttt ttgcctgaag aaattggact actagacgaa 120

gcgcttgacc tgcccgagta catctatact gcacagaact gccctgtccc taggaaggag 180

gcgcggtgtc tgctgttgcg tcgagtggca tatccgaatc gcctgaaaga tttagaagtt 240

gagtttggtc gccaggagtg tactatgctc gactgtcaat atcacactgg catgtgtctt 300

caacaagata aaaaaagatg gagttcgatc agcgcataa 339

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 冬生疫霉（Phytophthora hibernalis）

<400> 2

Met Pro Trp Ala Leu Asp His Pro Pro Leu Thr Ala Lys Arg Ser Ser

1 5 10 15

Leu Asp Glu Ile Asp Tyr Thr Cys Arg Arg Arg Phe Arg Phe Leu Pro

20 25 30

Glu Glu Ile Gly Leu Leu Asp Glu Ala Leu Asp Leu Pro Glu Tyr Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Gln Asn Cys Pro Val Pro Arg Lys Glu Ala Arg Cys Leu

50 55 60

Leu Leu Arg Arg Val Ala Tyr Pro Asn Arg Leu Lys Asp Leu Glu Val

65 70 75 80

Glu Phe Gly Arg Gln Glu Cys Thr Met Leu Asp Cys Gln Tyr His Thr

85 90 95

Gly Met Cys Leu Gln Gln Asp Lys Lys Arg Trp Ser Ser Ile Ser Ala

100 105 110

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atgccatggg ctctagacca cccgcctcta actg 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ttatgcgctg atcgaactcc atcttttttt atc 33

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> THF修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> C3 spacer修饰

<400> 5

agacgaagcg cttgacctgc ccgagtacat tatactgcac agaac 45

Claims

1.一种冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的特异性新检测靶标Phibe_s00003g00002.1，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1，其特征在于，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1或2所述的检测靶标Phibe_s00003g00002.1在检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)中的应用。

4.权利要求1所述的冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的特异性检测新靶标Phibe_s00003g00002.1的RPA检测引物及探针组合，其特征在于，所述检测引物中，正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述探针序列如SEQ IDNO：5所示。

5.权利要求4所述的检测引物和探针组合在检测冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)中的应用。

6.一种检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求4所述的检测引物和探针组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的Twist Amp反应单元管、缓冲液Buffer、MgAc、去离子水、HybriDetect assay buffer、侧流层析试纸条。

8.权利要求7所述的试剂盒在检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)中的应用。

9.一种检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，利用权利要求4所述的引物和探针组合或权利要求6所述的检测冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的试剂盒进行RPA扩增；

3)应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)。