CN113637779A - 一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，包括以下步骤:S1：获取待测血液样本，并提取DNA模板；S2：利用引物及探针的组合进行实时荧光RPA检测，根据扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌；其中引物和探针以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点进行设计。本发明具有极高的特异性和灵敏度，在较高浓度下(3.5×10⁶cfu/mL)实时荧光RPA法可以在最短3.32min获得阳性结果。本发明实时荧光RPA方法对血浆样本中的抑制成分具有很好的耐受性，可以对简单的煮沸法处理的临床血浆样本进行直接扩增，缩短了整个检测时间。另外，本发明实时RPA方法可以和便携式设备相结合，在拟态弧菌暴发现场的临床诊断中，将是监测拟态弧菌感染的一种非常有用的方法。

Description

一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法。

背景技术

拟态弧菌(Vibrio mimicus)作为弧菌属中的主要致病菌之一，广泛分布于包括淡水、海水等自然环境中以及与之接触的野生或养殖水生动物体内，常常导致人和水生动物的患病。因其形态、生理生化特征、患病的临床变现以及基因组特性均与霍乱弧菌(Vibriocholera)极为相似，早期曾被认为是同一种病原菌。在快速扩增繁殖过程，拟态弧菌能产生包括溶血素、肠毒素、包外金属蛋白酶在内的多种毒力因子。因此，人们在食用被拟态弧菌感染的水产品后往往会引起细菌性肠炎，导致急性霍乱样腹泻(cholera-like diarrhea)或痢疾样腹泻(dysentery-like diarrhea)，严重的情况下会导致死亡。近年来，拟态弧菌引起的食物中毒事件在全世界时有发生。我国多地也曾出现过因拟态弧菌感染引起的食物中毒事件。在这些拟态弧菌临床感染病例中，研究者已多次分离出一种与霍乱弧菌产生的霍乱毒素(CT)具有相同的免疫生物学反应的不耐热肠毒素，而且近期有报道称，从我国的淡水鲶鱼中分离到一株毒性更强，传染性更高的拟态弧菌，这表明该菌随着地域环境的变化，其致病性有突变增强的趋势。虽然与拟态弧菌相关的疾病暴发通常是零星的，但目前绝对有必要重新考虑该菌在人与环境中的感染的风险。早期和快速诊断是管理和预防拟态弧菌感染的关键。因此，需尽快建立病原菌的快速、简便、灵敏的检测方法，实现对该病原菌在临床特别是在设备相对落后的基层社区医院的快速检测，这对于提升我们的公共卫生安全保障能力，提高弧菌感染性疾病应急响应水平有着极为重要的意义。

目前，对于拟态弧菌的检测，传统的生理生化实验并结合显微镜观察，仍然是金标准。但该方法繁琐、耗时且往往需要实验人员具备丰富的个人经验。同时由于拟态弧菌在形态和多种生化指标上与霍乱弧菌极为相似，常常导致误判。随着生物技术的不断发展，一些科研人员成功将PCR技术应用于拟态弧菌的检测和分析。但由于PCR技术本身固有的缺点，如需要整套的用于核实扩增检测的仪器设备、一定的实验条件以及操作程序复杂等，大大限制了其在拟态弧菌的实际诊断检测(尤其是快速的基层现场诊断检测)中的应用。近年来，等温核酸扩增技术出现突破了原有PCR扩增的温控条件，降低了核酸扩增对于设备的要求，因此得到了迅速的发展。这其中重组酶聚合酶介导核酸扩增技术(RPA)因其在反应条件及时间的优势格外引人关注。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，建立一种基于实时RPA的以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点的拟态弧菌快速检测方法。在此基础上，对实时RPA法进行了优化，并通过对人工感染的血液样品的检测评价了该方法在实际应用中的重现性和稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，包括以下步骤:

S1：获取待测血液样本，并提取DNA模板；

S2：利用引物及探针的组合进行实时荧光RPA检测，根据扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌；其中引物和探针以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点进行设计。

可选的，所述S2中的引物包括vmhR-F1和vmhR-R1，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F1的序列为TAACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R1的序列ATGCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

可选的，所述S2中的引物包括vmhR-F2和vmhR-R2，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F2的序列为AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R2的序列为ACCGCCCGTACCACCAACCAACAATC。

可选的，所述S2中的引物包括vmhR-F3和vmhR-R3，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F3的序列为AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R3的序列为GCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

可选的，从5’至3’方向，所述S2中探针的序列为CAACTCTACGTACGTGCAGGTGCCGCCA[FAM-dT]^a T[THF]^b A[BHQ-dT]^d GCTTTAGGAACTG(C3-spacer)^d，其中FAM-dT为6羧基荧光素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，THF为四氢呋喃间隔，BHQ1-dT为淬灭基团，C3-spacer为C3间隔臂修饰的阻断基团。

可选的，所述S2中引物和探针设计的具体步骤为：

S21：获取拟态弧菌vmhA基因序列；

S22：通过在线比对软件进行同源性比对，寻找同源性保守区域，确定扩增的目标基因序列；

S23：根据TwistAmp DNA扩增实验设计手册设计针对保守区域的引物和探针。

可选的，所述实时荧光RPA的反应体系包括：14.75μL缓冲液、3.6μL去离子水、上下游引物各1.05μL、1.25μl Mg²⁺、0.3μL探针及3μLDNA模板，其中上下游引物的浓度分别为10μM，探针的浓度为10μM。

可选的，所述S1中提取DNA模板的方法为试剂盒提取法或煮沸法。

可选的，所述实时荧光RPA检测拟态弧菌的定量检测限为0.137pg/25μL或0.006pg/μL；所述定量检测限的测定包括以下步骤：

Ⅰa利用设计的引物及探针结合实时荧光定量RPA分别扩增若干指定的菌株DNA，观察拟态弧菌与非拟态弧菌DNA是否存在交叉反应，若否，则进行Ⅱa；若是，则重新设计引物和探针；所述若干指定的菌株包括拟态弧菌及多种非拟态弧菌，

Ⅱa制备一系列浓度梯度稀释后的拟态弧菌的DNA模板,并采用实时荧光RPA法检测；

Ⅲa对实时荧光RPA检测不同浓度梯度的拟态弧菌的数据进行采集，获得实时荧光RPA扩增Cq值的分布特征；

Ⅳa根据实时荧光RPA扩增Cq值的分布特征，采用二次多项式回归模型对实时荧光RPA数据进行回归，建立Cq值与浓度的回归方程；

Ⅴa根据灵敏度试验和特异性试验结果绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积和约登指数，代入Ⅳa建立的实时荧光RPA的二阶多项式回归方程计算定量检测限。

可选的，所述实时荧光RPA检测拟态弧菌的最佳反应温度为41℃；所述最佳反应温度的筛选包括以下步骤：

Ⅰb设置了37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃六个反应温度对实时荧光RPA的反应温度进行筛选；

Ⅱb测定各反应温度下实时荧光RPA达到仪器检测阀值的Cq值，选择最低Cq值所对应的反应温度作为最佳反应温度。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明具有极高的特异性和灵敏度，在低至3.5×10³cfu/mL的感染浓度下，本发明实时荧光RPA法可在10～11min内检测到创伤弧菌，而传统的实时荧光PCR检测需要约45min，并且检测时间随着细胞数量的增加而减少。在较高浓度下(3.5×10⁶cfu/mL)实时荧光RPA法可以在最短3.32min获得阳性结果。

2、本发明实时荧光RPA方法对血浆样本中的抑制成分具有很好的耐受性，可以对简单的煮沸法处理的临床血浆样本进行直接扩增，进一步简化了检测步骤，缩短了整个检测时间。另外，本发明实时RPA方法可以和便携式设备相结合，在拟态弧菌暴发现场的临床诊断中，特别是在资源有限的情况下，将是监测拟态弧菌感染的一种非常有用的方法。

附图说明

图1为本发明中实时荧光RPA检测拟态弧菌的最佳引物和探针组合分析图。

图2为本发明中温度优化实验的荧光曲线图，其中实时荧光RPA分别在37℃，38℃，39℃，40℃，41℃和42℃进行。

图3为各反应温度下实时荧光RPA达到仪器检测阀值的Cq值的柱状图，其中实时荧光RPA分别在37℃，38℃，39℃，40℃，41℃和42℃进行。

图4为实时荧光RPA特异性检测结果图；其中图中各条曲线表示的含义为：1为拟态弧菌ATCC33653；2为河流弧菌LMG7894；3为河流弧菌ATCC33812；4为霍乱弧菌BMZ147005；5为鳗弧菌H080701；6为创伤弧菌ATCC27562；7.为创伤弧菌HMO2；8为创伤弧菌HMYJ；9为创伤弧菌HMM16；10为创伤弧菌HMZ2；11为副溶血弧菌CGMCC1.1997；12为哈维弧菌CGMCC1.1599；13为哈维弧菌NBV269；14为哈维弧菌9-S29；15为大肠杆菌ATCC25922；16为大肠杆菌HM7039；17为鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311；18为肺炎克雷伯菌ATCC33495；19为无模板阴性对照。

图5为实时荧光RPA和实验荧光PCR检测不同浓度梯度拟态弧菌的扩增曲线，其中(a)为实时荧光RPA，(b)为实验荧光PCR检测；

图6为实时荧光RPA和实时荧光PCR检测创伤弧菌的灵敏度回归分析图，其中(a)为实时荧光PCR与logDNA浓度的平均Cq值(n＝3)，R²＝0.9975(线性回归)；(b)实时荧光RPA与logDNA浓度实时反应的平均Cq值(n＝8)，R²＝0.8628(线性回归)和0.9907(二次多项式回归)。

图7为使用R.Triangle中的“glm”软件包对不同浓度梯度的8次重复测试的数据进行Probit回归分析图。

图8为实时荧光RPA检测拟态弧菌的ROC曲线图，采用R中的“pROC”软件包，根据前期实时荧光RPA的灵敏度试验和特异性试验结果组成的数据(n＝102)绘制ROC曲线

图9为使用R.Triangle中的“glm”软件包对8次采样数据进行Probit回归分析，得出总体准确度(阳性率)达到95％时所对应的检测限图；其中(a)为扩增模板是按照制造商提供的说明书使用试剂盒获得，(b)为扩增模板是利用煮沸法(boling法)提取获得。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

1.材料与方法

1.1菌株与培养条件

本发明收集了含拟态弧菌在内的14株弧菌和4株其他菌株，共18株菌株。其中，8株菌种购自中国厦门的中国海洋培养宝库(MCCC)或中国北京的中国微生物培养宝库(CGMCC)，3种菌株(霍乱弧菌，河流弧菌和鳗弧菌)，由宁波大学陈教授提供。其他菌株均从临床样本或养殖水中分离，并经16S rRNA测序确认。本发明中所有菌株详细信息见表1。

表1本发明中涉及到的相关菌株

1.2纯培养菌株和人工污染样本的DNA提取

各种菌株基因组DNA用专用细菌基因组DNA抽提试剂盒(Omega Bio-tek,Inc.,Norcross,美国)提取。用核酸浓度测定仪Nanodrop ND-1000(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA USA)测量抽提的各种菌株DNA数量与质量(A260/A280)。各种菌株DNA样品的A260/A280的比值均在1.8–2.0，样品保存-20℃冰箱。

对于人工污染样本，分别采用试剂盒法和沸水法提取DNA模板。具体而言，每个加标污染的血浆样本被分为两部分。其中一部分用MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒进行处理，获得DNA模板。另一部分采用煮沸法处理，获得DNA模板。即，将加入1ml的血浆样品煮沸15分钟，然后在16000×g离心1分钟。收集上清作为粗DNA模板。

1.3用于实时RPA检测拟态弧菌的引物和探针设计

从GenBank上获取已报道的拟态弧菌vmhA基因序列(序列号为：U68271.1，GU137291.1，GU137290.1，GU137289.1，GU137288.1，GU137293.1，GU137292.1)。通过ClustalW在线比对软件进行同源性比对，寻找同源性保守区域，确定扩增的目标基因序列，根据TwistAmp DNA扩增实验设计手册设计了针对保守区域的引物和探针。所有引物和探针均由上海生工有限公司合成，经BLAST筛选后鉴定特异性。引物和探针的序列见表2。

表2本发明中设计的引物与探针

FAM-dT,6羧基荧光素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；THF,四氢呋喃间隔；BHQ1-dT,淬灭基团.C3-spacer,C3间隔臂修饰的阻断基团

1.4拟态弧菌的实时荧光PCR检测

对于创伤弧菌的实时PCR，参考相关文献并对反应条件做了一些小的改进。简单地说，使用引物vmhTM-F和vmhTM-R以及探针vmhTM-P(表2)在Roche480热循环仪上进行实时PCR。反应体系为25μL，该体系含有12.5μL 2×SYGB Green I混合液、0.5μL的每个引物(10μM)、1μL的探针(10μM)、3μL的DNA模板(或3μL的无核酸水作为空白对照)。反应条件为：95℃变性5min，然后95℃变性5s，60℃变性30s，共40个循环。

1.5实时荧光RPA检测拟态弧菌的条件优化

在通过比对获得的vmhA基因保守区域内设计了上下游3组引物以及1条荧光探针(表2)，由上海生工生物合成有限公司(上海)合成。通过TwistAmp Exo kit试剂盒筛选出最佳的引物对，以用于后续的反应体系的优化。实时荧光RPA反应条件为：25μL反应体系包括：14.75μL缓冲液,3.6μL去离子水,上下游引物各1.05μL(10μM),1.25μl Mg²⁺,0.3μL的探针(10μM)和3μLDNA模板。以去离子水替代DNA模板，作为阴性对照组。用罗氏荧光定量PCR仪采集荧光信号，并分别设置37℃,38℃，39℃，40℃,41℃和42℃六个反应温度对实时荧光RPA的反应温度进行筛选。

1.6实时荧光RPA和PCR检测拟态弧菌的特异性和灵敏度的比较分析

为了评价实时荧光RPA检测拟态弧菌的特异性，实时荧光定量RPA分别扩增若干指定的菌株DNA，该若干指定的菌株DNA如表1中所罗列的菌株(包含拟态弧菌和其他非拟态弧菌)。为了分析实时荧光RPA的灵敏度，制备了拟态弧菌基因组DNA的连续的10倍稀释液。以基因组DNA含量在100ng～0.01pg范围内为模板，每次反应25μL，每个稀释浓度梯度样本重复8次分析。于此同时采用相同系列稀释度的基因组DNA进行荧光定量PCR。所有浓度梯度样本的测试都重复3次。

1.7人工感染拟态弧菌的血浆样品检测

为评价实时荧光RPA法在临床标本中检测拟态弧菌的效果，将实时荧光定量RPA法与实时荧光定量PCR法对人工污染血浆标本的诊断效果进行比较。血浆标本经实时荧光定量PCR检测为阴性后，将制备不同浓度(3.5×10¹～3.5×10⁷cfu/mL)的创伤弧菌100μL加入的900μL的确认为阴性的血浆样品中，形成不同浓度(3.5×10⁰～3.5×10⁶cfu/mL)拟态弧菌感染后的血浆样品。然后采用“1.2纯培养菌株和人工污染样本的DNA提取”的方法获取DNA模板，并进行后续的实时荧光定量RPA法或实时荧光定量PCR法扩增检测。

1.8数据统计分析

为了分析灵敏度，对实时荧光RPA法和实时荧光PCR法扩增结果分别进行线性回归。为了进一步提高回归精度，对实时荧光RPA在原本的线性回归的基础上进一步进行了二阶多项式回归。所有回归均在Microsoft Excel(Microsoft,USA)中进行计算。为了获得实时荧光RPA检测限(LOD)，对灵敏度分析中的6个浓度梯度所获得的数据使用R.的“glm”软件包进行probit进行回归分析，以获得实时荧光RPA法在检测拟态弧菌时，总体准确度达到95％时所对应的DNA模板浓度。定量检测限(LOQ)是指在检测反应的特异性和灵敏度都到达最大化时所对应的最低DNA模板浓度，通常是通过ROC曲线获取最佳分界点(最大的Youden指数)后，计算该分界点的DNA模板浓度而获得。为了获得实时荧光RPA检测拟态弧菌的定量检测限(LOQ)，采用R.中的“pROC”软件包，根据灵敏度试验和特异性试验结果绘制ROC曲线，并使用相同的软件包计算ROC曲线下面积和约登指数，代入先前建立的实时荧光RPA的二阶多项式回归方程计算LOQ。

2.实验结果

2.1实时荧光RPA检测拟态弧菌的引物对和反应条件的筛选优化

本发明针对拟态弧菌的vmhA基因的保守区设计的3对引物和1个探针进行了筛选。在20分钟中内所有的引物探针组合均能对反应体系中的拟态弧菌DNA模板进行扩增。但与其他引物相比，F2/R2引物在扩增时间和信号强度方面表现得最好(如图1所示)。因此，本发明选择该引物组进行后续的相关实时荧光RPA的拟态弧菌的检测。对于反应温度的筛选，设置了37℃,38℃，39℃，40℃,41℃和42℃六个反应温度，结果显示随着温度的升高，反应时间有缩短的趋势(如图2所示)，单因素方差分析显示，各温度间反应时间(Cq值)(如图3所示)差异显著(p<0.05)。因此，选择反应所需时间最低的41℃作为实时荧光RPA测定拟态弧菌的最佳反应温度。

2.2实时荧光RPA检测拟态弧菌的特异性和灵敏度分析

对于特异性，我们用前序实验中获得引物和探针，分别扩增若干指定的菌株DNA，该若干指定的菌株DNA如表1中所罗列的菌株(包含拟态弧菌在内的18株细菌的DNA)。结果如图4所示，未观察到与其他细菌菌株DNA的交叉反应，仅在拟态弧菌中观察到阳性信号。这说明我们选择的引物/探针组合是本研究中拟态弧菌的特异性引物/探针组合。

对于灵敏度，我们分别用实时荧光RPA和实时荧光PCR检测一系列浓度梯度稀释后的拟态弧菌的DNA模板(100ng-0.01ng)，结果如图5显示，在一系列稀释后的浓度梯度中，实验荧光RPA和实时PCR的最低检测浓度一致，均达到1pg/25μL或0.04pg/μL(如图5a和图5b所示)。对于定量分析，我们分别对实时荧光RPA和实时荧光PCR检测不同浓度梯度的拟态弧菌的数据进行了回归分析。结果显示，相对于实时荧光RPA，实时荧光PCR检测的对数DNA浓度与Cq值呈现更好的线性相关性，相关系数达到R²＝0.9975(如图6a所示)，而实时荧光RPA的线性相关系数仅为R²＝0.8628(如图6b所示)。为了进一步提高回归精度，根据实时荧光RPA扩增Cq值的分布特征，尝试对实时RPA进行二次多项式回归。logDNA浓度与Cq值的相关系数R2有了显著提高，最终达到0.9907(如图6b所示)。

2.3测定实时荧光RPA检测拟态弧菌的LOD和LOQ

为了获得实时荧光RPA检测限(LOD)，对灵敏度分析中的6个浓度梯度每个浓度梯度下8次重复实验所获得的数据使用R.的“glm”软件包进行probit进行回归预测分析显示(如图7所示)，实时荧光RPA法在检测拟态弧菌时，总体准确度(阳性率)达到95％时所对应的DNA模板浓度为0.369pg/25μL或0.015pg/μL。定量检测限(LOQ)是指在检测反应的特异性和灵敏度都到达最大化时所对应的最低DNA模板浓度，通常是通过ROC曲线获取最佳分界点(最大的Youden指数)后，计算该分界点的DNA模板浓度而获得。为了获得实时荧光RPA检测拟态弧菌的定量检测限(LOQ)，采用R.中的“pROC”软件包，根据灵敏度试验和特异性试验结果绘制ROC曲线(如图8所示)，并使用相同的软件包计算ROC曲线下面积和约登指数，代入先前建立的实时荧光RPA的二阶多项式回归方程计算LOQ。最终计算结果显示，实时荧光RPA检测拟态弧菌的LOQ值为0.137pg/25μL或0.006pg/μL。

2.4实时荧光RPA检测人工感染的血液样品中拟态弧菌的评估分析

为了评价荧光实时RPA在临床样本中检测拟态弧菌的效果，我们通过人为添加不同浓度的拟态弧菌到血浆中构建模拟的临床阳性样本，比较了实时荧光RPA法和实时荧光PCR法检测人工感染后的血浆样品的阳性检出结果。结果显示，实时荧光RPA检测结果与实时荧光PCR检测结果一致(表3)。但是，实时RPA在节省时间方面具有压倒性优势。在低至3.5×10³cfu/mL的添加浓度下，实时RPA可在10～11min内检测到拟态弧菌，而实时荧光PCR检测需要约45min(Cq值为35.13～34.8)。检测时间随着细胞数量的增加而减少。在较高浓度下实时荧光RPA法可以在最短3.32min获得阳性结果(表3)。这些结果有力地说明了实时RPA技术具有快速、灵敏的显著优势。同时，为了进一步缩短检测时间，简化实验步骤，我们比较了常规的试剂盒提取法(Kit法)和更为便捷的煮沸法(Boiling法)对血浆样本进行处理后的检测效果，根据表3中的数据显示，本研究中发明的实时荧光RPA方法面对通过Kit法和Boiling法处理的血浆样本其检测结果一致，均能在低至3.5×10³cfu/mL的添加浓度下出现阳性检测结果。然而，进一步分析实时荧光RPA对低浓度(3.5×10³cfu/mL)V.mimicus血浆样品的检测性能，发现两种方法的灵敏度存在差异。Boiling法处理的样品灵敏度为100％(8次实验均为阳性结果)，而Kit法处理的样品灵敏度仅为37.5％(8次实验均为3次阳性结果)，结果表明，不同方法的处理会影响实时荧光RPA的检出限。Probit回归分析显示，Kit法预处理样品的实时RPA的LOD为5.18×10³cfu/mL(如图9a所示)。而Boiling法预处理样品的LOD为1.29×10³cfu/mL(如图9b所示)，约为Kit法的4倍。从本研究来看，Boiling法更适合血浆样本的处理，采用Boiling法能进一步简化临床血液中检测拟态弧菌的步骤，缩短整个检测时间。

表3.实时荧光RPA和实时PCR检测人工感染样品的比较

^a：Kit代表采用试剂盒方法提取的模板DNA

^b：Boiling代表采用煮沸方法提取的模板DNA

总体而言，我们成功发明了一种基于荧光实时RPA技术快速检出临床血浆样品中拟态弧菌的方法。该方法具有极高的特异性和灵敏度，在低至3.5×10³cfu/mL的感染浓度下，本发明的实时荧光RPA法可在10～11min内检测到创伤弧菌，而传统的实时荧光PCR检测需要约45min。并且检测时间随着细胞数量的增加而减少。在较高浓度下(3.5×10⁶cfu/mL)实时荧光RPA法可以在最短3.32min获得阳性结果。同时，我们发明的实时荧光RPA方法对血浆样本中的抑制成分具有很好的耐受性，可以对简单的煮沸法处理的临床血浆样本进行直接扩增，进一步简化了检测步骤，缩短了整个检测时间。另外，我们发明的这种实时RPA方法可以和便携式设备相结合，在拟态弧菌暴发现场的临床诊断中，特别是在资源有限的情况下，将是监测拟态弧菌感染的一种非常有用的方法。

以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于,包括以下步骤:

S1：获取待测血液样本，并提取DNA模板；

S2：利用引物及探针的组合进行实时荧光RPA检测，根据扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌；其中引物和探针以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点进行设计。

2.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F1和vmhR-R1，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F1的序列为TAACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R1的序列ATGCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

3.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F2和vmhR-R2，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F2的序列为AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R2的序列为ACCGCCCGTACCACCAACCAACAATC。

4.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F3和vmhR-R3，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F3的序列为AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R3的序列为GCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

5.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，从5’至3’方向，所述S2中探针的序列为CAACTCTACGTACGTGCAGGTGCCGCCA[FAM-dT]^aT[THF]^bA[BHQ-dT]^dGCTTTAGGAACTG(C3-spacer)^d，其中FAM-dT为6羧基荧光素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，THF为四氢呋喃间隔，BHQ1-dT为淬灭基团，C3-spacer为C3间隔臂修饰的阻断基团。

6.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中引物和探针设计的具体步骤为：

S21：获取拟态弧菌vmhA基因序列；

S22：通过在线比对软件进行同源性比对，寻找同源性保守区域，确定扩增的目标基因序列；

S23：根据TwistAmp DNA扩增实验设计手册设计针对保守区域的引物和探针。

7.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述实时荧光RPA的反应体系包括：14.75μL缓冲液、3.6μL去离子水、上下游引物各1.05μL、1.25μl Mg²⁺、0.3μL探针及3μLDNA模板，其中上下游引物的浓度分别为10μM，探针的浓度为10μM。

8.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S1中提取DNA模板的方法为试剂盒提取法或煮沸法。

9.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述实时荧光RPA检测拟态弧菌的定量检测限为0.137pg/25μL或0.006pg/μL；所述定量检测限的测定包括以下步骤：

Ⅰa利用设计的引物及探针结合实时荧光定量RPA分别扩增若干指定的菌株DNA，观察拟态弧菌与非拟态弧菌DNA是否存在交叉反应，若否，则进行Ⅱa；若是，则重新设计引物和探针；所述若干指定的菌株包括拟态弧菌及多种非拟态弧菌，

Ⅱa制备一系列浓度梯度稀释后的拟态弧菌的DNA模板,并采用实时荧光RPA法检测；

Ⅲa对实时荧光RPA检测不同浓度梯度的拟态弧菌的数据进行采集，获得实时荧光RPA扩增Cq值的分布特征；

Ⅳa根据实时荧光RPA扩增Cq值的分布特征，采用二次多项式回归模型对实时荧光RPA数据进行回归，建立Cq值与浓度的回归方程；

Ⅴa根据灵敏度试验和特异性试验结果绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积和约登指数，代入Ⅳa建立的实时荧光RPA的二阶多项式回归方程计算定量检测限。

10.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述实时荧光RPA检测拟态弧菌的最佳反应温度为41℃；所述最佳反应温度的筛选包括以下步骤：

Ⅰb设置了37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃六个反应温度对实时荧光RPA的反应温度进行筛选；

Ⅱb测定各反应温度下实时荧光RPA达到仪器检测阀值的Cq值，选择最低Cq值所对应的反应温度作为最佳反应温度。

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