CN112280878B - 一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物对、检测方法及应用。该方法本地数据库的初筛结果和在线比对的复筛结果发掘副溶血性弧菌中的可用于检测的特异性基因序列，利用发掘出的特异性靶基因结合传统靶基因构建双重实时荧光PCR方法，PCR引物对分别根据自筛靶基因VPA1585以及传统靶基因tlh设计而成，为保证检测方法的高特异性及灵敏度，采用双重实时荧光PCR方法，合理优化PCR反应体系，并创新创新性地使用第三代饱和荧光染料SYTO Green 9替换了传统实时荧光PCR体系中的非饱和荧光染料SYBR Green，可以快速、准确地鉴定出副溶血性弧菌。

Description

一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物、检测方法及应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、基于特异性靶点VPA1585和传统靶点tlh的引物及应用、和利用VPA1585与tlh相结合，构建双重实时荧光PCR体系，对副溶血性弧菌进行检测的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种人类病原体，广泛分布在海洋环境中，经常从各种生海鲜中分离出来，食用被副溶血性弧菌污染的为加工或未煮熟的海鲜产品可能会导致食物中毒，并导致急性肠胃炎的发展，尽管由副溶血性弧菌引发的肠胃炎通常是自限性的，但对于患有基础疾病如肝病或免疫疾病的人来说，可能危及生命。

目前针对副溶血性弧菌较为普遍且易行的检测方法为基于PCR的分子生物学方法，如实时荧光PCR、多重PCR、环介导等温扩增等，此类方法的精准度和特异性主要依赖于检测靶点的选择。目前常用的副溶血性弧菌检测靶点如tdh、trh、tlh、groEL及toxR基因，但上述基因在实际应用的检测过程中被发现具有一定的局限性或误检率，使得检测效率及准确度降低，且不能将PCR方法的优势完全发挥。挖掘副溶血性弧菌快速检测靶点基因可以提高检测效率、准确性以及可靠性，具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供如下1)-8)中任一种物质作为特异性靶点在非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌中的应用：1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；VPA1585。

本发明的第二个目的是提供检测如下1)-8)中任一种物质的制品在制备副溶血性弧菌检测试剂中的应用，其特征在于，1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；8)VPA1585。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测副溶血性弧菌的双重实时荧光PCR引物。

本发明的第四个目的是提供一种检测副溶血性弧菌试剂盒，所述试剂盒中包括引物VPA1585-F、VPA-1585-R以及tlh-F及tlh-R。

本发明的第五个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：(1)副溶血性弧菌特异性靶点挖掘；(2)双重实时荧光PCR体系建立；(3)双重实时荧光PCR方法特异性及灵敏度评估。通过本地数据库的构建及基因组比较分析等生物信息学方法获得副溶血性弧菌的特异性检测靶点，将特异性靶点与传统靶基因相结合以提高检测精准度和特异性，并创新性的将传统荧光PCR检测中使用的非饱和荧光染料SYBRGreen替换为饱和荧光染料SYTO Green 9，以提高方法的灵敏度和熔解曲线分辨率，较之普通PCR方法，可实现闭管检测，减少样品污染，并省去了电泳检测等繁琐操作；较之TaqMan探针法，无需合成荧光基团修饰探针，较为经济实惠；较之基于细胞培养的传统生物学方法，解决了检测结果不准确，检测过程复杂，检测周期长的问题，实现了副溶血性弧菌高特异性快速检测的目的。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

本发明请求保护如下1)-8)中任一种物质作为特异性靶点在检测副溶血性弧菌的应用：1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；VPA1585，其中，

所述VP0091碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述VP0289碱基序列如SEQ ID NO.2所示；所述VP0488碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述VP0811碱基序列如SEQ ID NO.4所示；所述VP1742碱基序列如SEQ ID NO.5所示；所述VPA0249碱基序列如SEQ ID NO.6所示；所述VPA1407碱基序列如SEQ ID NO.7所示；所述VPA1585碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

其中，所述检测为非疾病诊断目的的。

本发明还保护如下1)-8)中任一种物质作为特异性靶点在制备副溶血性弧菌检测试剂中的应用:1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；8)VPA1585，其中，

所述VP0091碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述VP0289碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

所述VP0488碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

所述VP0811碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述VP1742碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述VPA0249碱基序列如SEQ ID NO.6所示；

所述VPA1407碱基序列如SEQ ID NO.7所示；

所述VPA1585碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还保护检测如下1)-8)中任一种物质的制品在制备副溶血性弧菌检测试剂中的应用：1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；8)VPA1585，其中，

所述VP0091碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述VP0289碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

所述VP0488碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

所述VP0811碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述VP1742碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述VPA0249碱基序列如SEQ ID NO.6所示；

所述VPA1407碱基序列如SEQ ID NO.7所示；

所述VPA1585碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还请求保护一种用于检测副溶血性弧菌的双重实时荧光PCR引物，针对特异性基因VPA1585设计特异性引物：VPA1585-F及VPA-1585-R，针对传统靶点tlh选择已发表引物对：tlh-F及tlh-R；其中，

VPA1585-F：5’–ACGCTTGTTTACGACACCCA–3’，如SEQ ID NO.9所示；

VPA1585-R：5’–GAAACCGTCACTTTGGTCGC–3’，如SEQ ID NO.10所示；

tlh-F：5’–AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG–3’，如SEQ ID NO.11所示；

tlh-R：5’–GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC–3’，如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供一种简单易行的靶点挖掘方法(基于基因组比对挖掘的新型靶点)，可在较短时间内过滤掉目标菌株中的非特异性靶点，从而减少靶点筛选的工作量，缩短靶点筛选时间。通过本地数据库构建及比对完成靶点初筛，通过BLAST在线比对完成靶点复筛，对自筛靶点设计引物并使用Primer Blast进行引物评价，共获得8对特异性检测引物。在普通PCR体系中对引物的灵敏度及特异性进行验证，最终筛选出一对自设计引物VPA1585-F/R以及传统检测引物tlh-F/R用于构建双重实时荧光PCR体系。

本发明还保护上述PCR引物在检测副溶血性弧菌试剂盒中的应用。

本发明还保护一种检测副溶血性弧菌试剂盒，该试剂盒中包括引物VPA1585-F、VPA-1585-R以及tlh-F及tlh-R：其中，

VPA1585-F：5’–ACGCTTGTTTACGACACCCA–3’，如SEQ ID NO.9所示；

VPA1585-R：5’–GAAACCGTCACTTTGGTCGC–3’，如SEQ ID NO.10所示；

tlh-F：5’–AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG–3’，如SEQ ID NO.11所示；

tlh-R：5’–GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC–3’，如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供一种非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：(1)副溶血性弧菌特异性靶点挖掘；(2)双重实时荧光PCR体系建立；(3)双重实时荧光PCR方法特异性及灵敏度评估。

为确保检测的特异性及灵敏度，本发明提供了一种基于饱和荧光染料建立的新型双重实时荧光PCR检测体系，根据是否有“S”型扩增曲线、Ct值是否不超过35、熔解曲线是否有双峰及Tm值是否准确来对检测结果进行评估，简单易行且成本较低。检测体系的建立包含一下步骤：(1)副溶血性弧菌特异性检测靶点的筛选；(2)退火温度优化、扩增循环数优化、引物浓度及比例优化、dNTP浓度优化、Ex Taq聚合酶浓度优化；(3)荧光染料种类及浓度优化。使用实验室保存的副溶血性弧菌分离株、标准菌株及非副溶血性弧菌菌株，对所构建体系的特异性和灵敏度进行评估。

最终确定双重实时荧光PCR方法的反应体系组成为：采用20μL扩增体系，包括10×Ex Taq Buffer 2μL，dNTP Mixture 0.8μL，SYTO Green 9荧光染料4μL，Ex Taq酶01μL，VPA1585上下游引物(1μM)各0.9μL，tlh上下游引物(1μM)各0.6μL，2μL模板DNA，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

扩增程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40循环后进行熔解曲线分析，熔解曲线信号收集程序为：95℃15s；60℃60s；95℃15s，升温速度为0.1℃/S，VPA1585及tlh扩增片段的Tm值分别为84.09±0.5℃及86.9±0.5℃。

特异性检测中共使用65株菌株，包括33株副溶血性弧菌分离株、10株副溶血性弧菌标准株及22株非副溶血性弧菌标准株，其中只有副溶血性弧菌检测结果中出现“S”型扩增曲线、扩增曲线Ct值小于35、且溶解曲线在84.09±0.5℃及86.9±0.5℃处出现双峰，其他菌株在35个循环内均无扩增；即分别在84.09±0.5℃(VPA1585，电泳位置161bp)及86.9±0.5℃(tlh，电泳位置450bp)处出现两个熔解峰，可判断检测结果为阳性；反之，则为阴性。

灵敏度分析得到，以基因组为模板时，检测灵敏度为15.8fg/μL；菌液为模板时，检测灵敏度为60CFU/mL。

有益效果

本发明具有以下有益效果：

(1)采用本发明的检测方法可直接鉴定副溶血性弧菌，使用双重靶点对副溶血性弧菌进行检测，特异性高，仅以副溶血性弧菌为模板时可产生特异性扩增曲线以及具有明显双峰的熔解曲线；

(2)本发明的检测方法首次在副溶血性弧菌的检测中将饱和荧光染料SYTO Green9同实时荧光PCR方法相结合，检测特异性和灵敏度菌优于传统基于不饱和荧光染料SYBRGreen I的实时荧光PCR方法，以基因组为模板时，检测灵敏度为15.8fg/μL；菌液为模板时，检测灵敏度为60CFU/mL；不需要血清型实验，或是基于细胞培养的生理生化实验，检测时间缩短在12h以内。

(3)由于检测过程无需采用传统检测方法中必须使用的抗血清，可降低检测成本。本发明通过PCR检测特异性DNA片段，将自筛靶点和传统靶点结合使用，结果判定简单，且检测结果可靠，可满足一般实验室的检测需求。

附图说明

图1为引物浓度优化结果；A：引物浓度为0.01μM；B：引物浓度为0.02μM；C：引物浓度为0.03μM；D：引物浓度为0.04μM；E：引物浓度为0.05μM；F：引物浓度为分别为0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM及0.05μM。

图2为退火时间优化结果；A：退火时间为15S；B：退火时间为30S；C：退火时间为45S。

图3为退火温度优化结果；A：退火温度为58℃；B：退火温度为59℃；C：退火温度为60℃；D：退火温度为61℃；E：退火温度为62℃。

图4为引物比例优化结果；A：引物比例为tlh:VPA1585＝1:1时的扩增曲线；B：引物比例为tlh:VPA1585＝1:1时的熔解曲线；C：引物比例为tlh:VPA1585＝1:1.5时的扩增曲线；D：引物比例为tlh:VPA1585＝1:1.5时的熔解曲线；E：引物比例为tlh:VPA1585＝1:2时的扩增曲线；F：引物比例为tlh:VPA1585＝1:2时的熔解曲线。

图5为荧光染料种类及浓度优化结果；A：不同染料种类及浓度对Ct值的影响；B：不同染料种类及浓度对ΔRn值的影响。

图6为dNTP浓度及Ex Taq酶浓度优化结果；A：不同dNTP浓度及Ex Taq酶浓度对Ct值的影响；B：不同dNTP浓度及Ex Taq酶浓度对ΔRn值的影响。

图7为VPA1585-tlh双重实时荧光PCR体系优化后扩增结果；A：VPA1585-tlh双重实时荧光PCR体系优化后扩增曲线；B：VPA1585-tlh双重实时荧光PCR体系优化后熔解曲线。

图8为灵敏度检测结果及标准曲线；A：DNA模板灵敏度检测扩增曲线；B：菌液模板灵敏度检测扩增曲线；C：DNA模板灵敏度检测标准曲线；B：菌液模板灵敏度检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可以很容易地从公开是商业渠道获得。

1.副溶血性弧菌血清型特异性基因的筛选

NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for BiotechnologyInformation)收录了已完成测序工作不同微生物的全基因组序列，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/microbes/)基因组公共数据库中下载了已公布的33株副溶血弧菌全基因组序列(数据截止至2019年11月23日)，汇总33株菌株的CDS序列信息，之后使用Blast+软件(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)构建本地比对数据库。本研究选择标准菌株RIMD 2210633为参考菌株，该标准菌株研究较多，其血清型O3:K6，致病力强且为大流行菌株，寻找参考菌株在本地比对数据库中的高匹配CDS序列有助于后续特异性检测靶点的筛选。

参考菌株RIMD 2210633有2条染色体共4831条CDS序列，将每条CDS序列录入NCBI中费事费力，为提高筛选效率及精确度，利用计算机语言与Blast+软件，首先将CDS序列在已建立本地数据库中进行比对，设置比对条件为E-value<1e-200，将4831个CDS序列比对结果按照匹配值hits数高低进行排序，选择hits数较高(≥33)的CDS序列作为初步筛选结果。在复筛阶段，将候选靶点置于NCBI的Blastn系统(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行比对，根据比对结果，选择在副溶血性弧菌属内同源性较好(E-value<1e-200，Query Cover≥98％，Identities≥90％)且在非副溶血性弧菌内特异较高(E-value≥1e-20，Query Cover<6％)的CDS序列作为复筛结果，符合要求的序列作为特异性检测靶点进行后续研究。

2.引物的设计及评估

选取复筛结果中得到的特异性检测靶点CDS序列进行引物设计，将所得引物置于NCBI中Primer-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)系统中，选择nr(RefSeq non-redundant proteins)数据库进行比对，比对结果给出目标引物的扩增产物、熔解温度、自身互补(Self complementarity)、3’端自身互补(Self 3'complementarity)等信息，根据所给信息选择扩增产物仅为副溶血性弧菌、退火温度60℃左右、自身互补值小于6、3’端互补值小于3的引物为特异性引物并送往金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。

使用普通PCR方法对自筛得到的特异性引物及传统检测靶点引物tdh、trh、tlh、groEL及toxR进行评估，传统靶点信息见表2。采用25μL反应体系，体系组成为：2×TaqMaster Mix 10μL，上游引物及下游引物各1μL，DNA模板2μL，无菌水补足至25μL；PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，之后72℃稳定10min。PCR产物使用2％琼脂糖凝胶进行电泳观察，电压设定为130V，电泳时间为30min，选取特异性较好的引物进行后续检测体系的构建。

共筛选得到副溶血性弧菌特异性检测靶点268组，通过引物设计及评价最终确定8组特异性检测引物，8组靶点的序列信息见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8；8组引物信息扩增基因名称、序列信息及扩增片段大小见附表1。

在对副溶血性弧菌的检测中，自筛靶点VP0091、VP0289、VP0488、VP0811、VP1742、VPA0249、VPA1407及VPA1585在43株阳性菌株中均能检出，同样的，传统靶点groEL、tlh及toxR在43株阳性菌株中均能检出，而传统靶点tdh及trh检出率较低，分别为2株(2/43)及3株(3/43)。

另外，使用In silico simulation of molecular biology experiments工具(http://insilico.ehu.eus/)对自筛靶点和传统靶点进行PCR扩增实验模拟，结果证明，自筛靶点中VP0289、VP0488、VP0811、VP1742及VPA1585对弧菌属菌株库中所有副溶血性弧菌有扩增，而对库中所有非副溶血性弧菌无扩增；传统靶点中，虽均对非副溶血性弧菌无扩增，但靶点tlh仅对2株副溶血性弧菌有扩增(2/4)，groEL仅对1株副溶血性弧菌有扩增(1/4)，toxR、tdh及trh则对库中4株副溶血性弧菌均无扩增。

在普通PCR方法灵敏度检测中，靶点VP0488及VPA1585在以基因组DNA为模板时，灵敏度高于传统靶点tdh、toxR及trh，以菌液为模板时灵敏度高于传统靶点tdh及trh。

综上所述，8组自筛靶点中，VP0289、VP0488、VP0811、VP1742及VPA1585特异性高于传统靶点，其中VP0488及VPA1585两个靶点在特异性及灵敏度表现上最为优异。

3.基于饱和荧光染料的双重实时荧光PCR方法的建立

根据引物特异性、Tm值差异，选择自筛靶点VPA1585及传统靶点tlh引物组合进行双重实时荧光体系的构建。以说明书推荐体系为出发点，分别对体系的引物浓度及比例、退火时间、退火温度、荧光染料的种类及浓度、dNTP浓度及Ex Taq酶浓度进行筛选。

引物浓度优化：以说明书体系为出发点，先对单重实时荧光PCR体系中的引物使用量进行优化，使用浓度为1μM的引物工作液，引物浓度设置了0.01、0.02、0.03、0.04及0.05μM共5个浓度梯度，根据扩增曲线Ct值ΔRn值以及扩增曲线特征确定最佳引物浓度。

退火时间优化：其他条件不变，调整实时荧光PCR方法中的反应参数，选择对体系影响较大的退火时间进行调整，退火时间选取了15S，30S，45S共3个梯度，根据扩增曲线Ct值ΔRn值以及扩增曲线特征峰峰形及Tm值确定最佳退火时间。

退火温度优化：其他条件不变，调整实时荧光反应方法中的反应参数，选择对体系影响较大的退火温度进行调整，退火温度选择了58、59、60、61及62℃共5个梯度，根据扩增曲线Ct值ΔRn值以及扩增曲线特征确定最佳退火温度。

引物比例优化：保证单重体系最优体系组成及反应参数条件下进行双重体系引物比例优化，双重体系中，不同引物特异性扩增不同模板序列，对底物及酶存在竞争关系，使得体系扩增曲线不稳定或出现熔解曲线仅存在单峰的情况，需要对两个引物的添加比例进行优化，设置了引物比例VPA1585：tlh为1：1、1.5：1及2：1共三个比例，根据扩增曲线的Ct值、ΔRn值以及熔解曲线是否出现明显可区分的双峰进行引物比例的确定。

荧光染料优化：其他条件不变，对体系中的荧光染料进行了替换，荧光染料选择了SYBR Green I、SYTO Green 9、Eva Green、LC Green、Ly Green及CYBR Green及DNA Green共7种，以添加终浓度为0.5×、1×、1.5×及2×共设置了四个梯度，根据扩增曲线的Ct值、ΔRn值以及熔解曲线是否出现明显可区分的双峰确定最佳荧光染料种类及浓度。

dNTP浓度优化：其他条件不变，对双重实时荧光PCR体系中Ex Taq酶浓度优化，ExTaq酶浓度设置了0.0125U/μL、0.025U/μL、0.0375U/μL及0.05U/μL共四个梯度，根据扩增曲线的Ct值、ΔRn值以及熔解曲线是否出现明显可区分的双峰确定最佳dNTP浓度。

Ex Taq酶浓度优化：其他条件不变，将Ex Taq聚合酶终浓度调整为：0.0125U/μL、0.0250U/μL、0.0375U/μL、0.0500U/μL，根据扩增曲线的Ct值、ΔRn值以及熔解曲线是否出现明显可区分的双峰确定最佳dNTP浓度确定最佳Ex Taq酶使用浓度。

由此得到VPA1585-tlh双重实时荧光PCR的最佳体系为：方法采用20μL扩增体系，包括10×Ex Taq Buffer 2μL，dNTP Mixture 0.8μL，SYTO Green 9荧光染料4μL，Ex Taq酶0.1μL，VPA1585上下游引物(1μM)各0.9μL，tlh上下游引物(1μM)各0.6μL，2μL模板DNA，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

4.检测体系特异性及灵敏度评估

4.1灵敏度评价模板的制备

从纯化培养的琼脂平板上挑取副溶血性弧菌单菌落，接种于5mL 3％NaCl TSB液体培养基中，37℃，160rpm条件下培养8h。取1mL培养液，8000rpm离心5min收集菌体，弃上清，菌体用500μL生理盐水洗涤两次，加入100μL TE缓冲液重悬菌体，菌体管置于水浴锅中100℃煮沸10min，煮沸结束后冰上冷却10min，12000rpm离心5min，取上清液为PCR反应模板，-20℃保存备用。

从纯化培养的琼脂平板上挑取副溶血性弧菌单菌落，接种于5mL 3％NaCl TSB液体培养基中，37℃，160rpm条件下培养8h。取1mL培养液，8000rpm离心5min收集菌体，弃上清。依照Omega E.Z.N.A.

Bacterial DNA Kit试剂盒说明书方法提取菌株基因组DNA，基因组DNA通过NanoDrop-2000核酸浓度测定仪分析确定其质量及浓度。当260/280比值在1.8-2.0之间表明提取的基因组纯度较好，可直接用于PCR反应，-20℃保存备用。

4.2特异性检测

以副溶血性弧菌及非副溶血性弧菌基因组DNA为模板(特异性检测菌株见表3)，使用建立的双重实时荧光PCR方法进行扩增，检测方法的特异性，同时以传统靶点tlh基因、tdh基因、trh基因、groEL基因及toxR基因已发表引物作为对照。

4.3灵敏度检测

将-20℃冻存的基因组DNA模板10倍倍比稀释至10^-8，获得的稀释液作为模板使用建立的双重实时荧光PCR方法进行扩增，每个实验设置3个平行，进行DNA模板灵敏度评价，同时以tlh基因、tdh基因、trh基因、groEL基因及toxR基因已发表引物作为对照。

将过夜培养至对数生长期的副溶血性弧菌用生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-8，每个稀释梯度吸取1mL菌液使用热裂解法提取DNA为模板使用建立的双重实时荧光PCR方法进行扩增，每个实验设置3个平行，进行菌落灵敏度评价；同时选取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7及10^-8共5个稀释的梯度的稀释菌液进行平板涂布，涂布量为100μL，平板置于37℃过夜培养用于菌落计数。

特异性检测显示副溶血性弧菌均有预期扩增曲线产生，且熔解曲线具有可区分的双峰，而非副溶血性弧菌扩增结果中无扩增曲线的产生，且溶解曲线不具备可区分的双峰，说明所建立的双重实时荧光PCR体系仅对副溶血性弧菌产生特异性扩增，具有较好的特异性。

双重实时荧光PCR体系基因组DNA及菌液灵敏度可分别达到1.58×10^-5ng/μL及6×10CFU/mL，回归方程显示R²为0.9959，说明模板浓度和Ct值之间有较好的线性关系，该双重实时荧光PCR体系可用于模板的定量。

附表：

表1特异性靶点筛选结果

表2传统靶点信息

表3特异性评价所用的菌株及检测结果

注：“*”表示本室保存菌株；“+”表示阳性扩增结果；“—”表示阴性扩增结果。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物、检测方法及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2058

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 1

atgaatggaa aattaaacct tcccatcaat accgtgattg gtgtgtctct gctggtgtta 60

ttgcttgttc cagcactcta cttcgccaaa ccggtgctgt tacctatggt gataagtacg 120

ttcgtggcac tgctgtttag cccgctgatc aattattttg aagataaagg cctgccacgc 180

acgataactg tggtggtgac gttgacgtta ttggtgagtg tttcaatact cggtttagcg 240

gcgatatcag aacccgcgaa acaatggtgg gctgagttgc caagcatcgt ccaaaacgtt 300

tcgcaagaag tgaatgaagt gaccaaagcg tcgtcagagc acatgaacgc gccgcttgag 360

cttgccagtg acatgaacat tgacgagatg ggcaacaaca cggtgttttc tctgctgaaa 420

gcgctcgcga ccaccacacc aacgctgtta actcaggcga tgattgtgct gtttatggtg 480

tatttcatgc ttaatcatgg tcgaagtctg tttcgtaaat cggtatcgcg tttgcgtggt 540

ttttcgaaac aacgtcaggc ggtggagttg gtgcaggctc tgcagaaaga tttatcgcgc 600

tacatcggca ccattacttt ggtcaatgcg ggtttaggct tgtgtgttgg attggtgttt 660

tttgtcctcg gccttgaaga cccatttcta tggggtgcgt ttgcgggggt aatgaatttc 720

gctccgtatt tgggaccagt gatttcgatg gcgagctttg gttttgtcgc gtatttgcag 780

ctagattcgg tcagttttat gctgacagtg gtatcgatat atctgttgct gaatttaatc 840

gagagtcagt ttgtcacccc aactttgcta gggaggcggt ttaacctcaa cccgttggtc 900

atctttatgt ggctggtctt ttggggttgg ttgtggggcg gaatggggct gttgattggc 960

gtgccgctgt tggtgtgcat caacatttta gcggatcgtt tggcgctttg cggttcgacg 1020

aacatctaaa tgaatggaaa attaaacctt cccatcaata ccgtgattgg tgtgtctctg 1080

ctggtgttat tgcttgttcc agcactctac ttcgccaaac cggtgctgtt acctatggtg 1140

ataagtacgt tcgtggcact gctgtttagc ccgctgatca attattttga agataaaggc 1200

ctgccacgca cgataactgt ggtggtgacg ttgacgttat tggtgagtgt ttcaatactc 1260

ggtttagcgg cgatatcaga acccgcgaaa caatggtggg ctgagttgcc aagcatcgtc 1320

caaaacgttt cgcaagaagt gaatgaagtg accaaagcgt cgtcagagca catgaacgcg 1380

ccgcttgagc ttgccagtga catgaacatt gacgagatgg gcaacaacac ggtgttttct 1440

ctgctgaaag cgctcgcgac caccacacca acgctgttaa ctcaggcgat gattgtgctg 1500

tttatggtgt atttcatgct taatcatggt cgaagtctgt ttcgtaaatc ggtatcgcgt 1560

ttgcgtggtt tttcgaaaca acgtcaggcg gtggagttgg tgcaggctct gcagaaagat 1620

ttatcgcgct acatcggcac cattactttg gtcaatgcgg gtttaggctt gtgtgttgga 1680

ttggtgtttt ttgtcctcgg ccttgaagac ccatttctat ggggtgcgtt tgcgggggta 1740

atgaatttcg ctccgtattt gggaccagtg atttcgatgg cgagctttgg ttttgtcgcg 1800

tatttgcagc tagattcggt cagttttatg ctgacagtgg tatcgatata tctgttgctg 1860

aatttaatcg agagtcagtt tgtcacccca actttgctag ggaggcggtt taacctcaac 1920

ccgttggtca tctttatgtg gctggtcttt tggggttggt tgtggggcgg aatggggctg 1980

ttgattggcg tgccgctgtt ggtgtgcatc aacattttag cggatcgttt ggcgctttgc 2040

ggttcgacga acatctaa 2058

<210> 2

<211> 573

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 2

atgcaaaacg acgtattttt cgatctcact caacatggct tttcagaaga cgaagcctca 60

caactcatgg tctatggaca agagttagaa ttacccacta ggcacattct tagccatcaa 120

ggtgaattta gttctcacat ctacttcatt ctggaagggt tatgccacgc aagctatctc 180

acagagaaag gcaaagaatt cagcaaagag ttttattggg aaaaggactg ggtgatcggc 240

tttgaaagcg tgataaaagg tcaaccttca ccgtacttat tggaaacgct gaccgcatgt 300

catttattct gtttgcctat cgaggcattg catcaatggc gcgccgaaaa gcactcaatt 360

tacctaaaat tgctcgaaac gcagttgatg aacaaagaga ataaagaacg ttttatgctg 420

ttgtattcgc ctgaggaacg ttatcagcta ttttgccacc actacccaga tttagaacaa 480

cgcattaccg acagccaaat tgcggcttac ctcggcatta ccgctatcag cttaagccgt 540

attaaagcgc gtttagcaaa agacaacaaa taa 573

<210> 3

<211> 465

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 3

atgaagaaac ttgcacccgt agccttactt attgcatcgc tcgtaggttg tagtgctgtt 60

cctcaagtga actggcaaca aggcagccaa attacgatga atcaggtgaa tgttgaacta 120

aagagcaatc tttgggtgaa cttaatgcct gcgattgagg aagaacccga gcaagacgtt 180

caagagttga gtattcaagg tgctttgtat ctggaaggcg acaaacagct gcctgcgaat 240

ttgactgctg aggctctgat tataaagcag ggtactaccg agtggatgat tgatggtggg 300

gacttggaaa ctcgcactca cagcgaaaat cagtgggaag tgacgtttac ttggcaagtt 360

gaagccgata cagataaatc cgtcgacttg gcgttgctgc ttgatgatgc gggtaaacaa 420

cgttggcttg ttgaaaagca cgtgaagata aacaaggttt attag 465

<210> 4

<211> 516

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 4

atgcgcagca ccccaatcac aatcgcaatc ccaacagaaa aagccaccgt tatccgcagg 60

ccaacgccat actccgtcat ggattgttcg gaattaggga tcatcccgcc ttcagccgcc 120

acctctgagg cctcttctgc aacagcagtc aatgctggct ctgcgatagt ggttccaaac 180

cccaagcaaa acgcaaaaat caataaccaa aacacactgc cctttcgagc aaaggcttgt 240

gccatatttt cgccaatggg gaacaagccg agttctagcc cgaaaataaa aaacgtcagg 300

cctaaaatga ccaacaacaa accaaaaaga atcgagacca agttaggtaa aggctcttgc 360

agaaccacca attggaagaa ggtaataaca atcacaatag gaagaagatc gcgggcactg 420

ttaaacagag cgcggaacaa agcagtgagt gcttccatgc aaatcctccc tttgacgaac 480

aagttattgg ctctgaaggc gagacctgtc cggtga 516

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 5

atgcgcaatt tataccgact tgctttaatg ctgacgctgt ttttgttggg gtttgcgagt 60

gctgttgctt ggatgacatt accacaaatc aagttttcac ctcgggggat ggagtggggg 120

tggcactggg cgcactttga gccgttttct aatggtatcc aaaaggcgcg aacgcacgac 180

accaaacagc tattgttaag acgagtttac cttgacgatg cgatcgtcgt ttttgtatct 240

acgacgttag acaacaagtt tgaaatcgat gttgtgcagg agaaaacttg caaaccgaac 300

gccacaactt gggcatccgt atcagtgaat cgccagcgaa tggcgcatgt gccaatggtg 360

tgtgatagcg tcggacagag ttatttttac cgttacatag gtaagcattt agattcgcta 420

gaatttggcg ttgatgagtc tttcattacg gaagattttg cccattggcc aatcgcggat 480

attaaagttg atcagttcaa acagcaaaac gctaagtttt ttgaacagcg tggagagaag 540

gttgaacatc agtggttacg tgattaa 567

<210> 6

<211> 870

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 6

atgcaaaacc tcccaccact taatgccctg aaagcctttg aagcaacagc ccgtttgcga 60

agctttacaa aagctgcaaa agagctaaat gtcactcggg cggcggttag ccagcaagtt 120

aaatcgttgg aacttcagtt agacgcgata ctttttgagc gcaatggtgc gcagctttta 180

ttaacgcaag ctgcccaagc ctacttacct gttgttagcc agactttgca gatgttatct 240

gtagcaactc aacacctttt tgctcgccag aaaaatactc aactgacgct tcatgtcgct 300

cacagctttt gttctcaatg gttaatgccg cgcttggccg attttcatcg tcagcaccct 360

gatgtcgtgg taaaaatttc aacgactgcc aacacggtac cgaatgctag cgccattgcg 420

gatgtggaga tcatcaacgg ttatggagat tggcaatcag agcaggctgt tcaacttacc 480

caagaaaact ggatagtggt ggcgagccct ggttttttaa atcttaattc ggtcattcat 540

cttaccgata tcgcgctagc gcctaaactg tgcacgggcg gataccatga atcgtggcaa 600

gcttggctgc gttttcaggg ctataaaggc aaagtgagta aacctatcgc cgagtttgaa 660

cattccttac tagccattca agcggcggtg aatcagttag gcatactgct tgttagggac 720

tttttagtgg aggatgagct acaacaagga cttttggttc cgattggtgg atggtcaatg 780

ccaagcgcca gcgcgcatca tatggtggta agggaaagcg ataaaccgca agttgaggct 840

tttactcatt gggtcatgca aagtctataa 870

<210> 7

<211> 813

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 7

atgtccagaa atacgcctac taatcaacat gcgtcttggt atcagatatt aaaaagccaa 60

gaacgcccgg tgctgatata tcaaatgggt aaagtcggct cgagtgcgtt agaaaagtcg 120

attcctaact cgattcattt gcatgacctt atggcgattg atgctaacaa gcagatctct 180

ccagtgagag caaagctgca tcaaccaaac aagcattatg taaaacgtct gctcaagcga 240

agcgttatga gtcacatgct caaacgtaaa caagacgtgc gcatcatctc attggtgaga 300

gagccgattg gtagaaatat ctcgatgttc tttcaatctt tacctttctg gatggcagaa 360

aaatacctaa atgacgacag tgcaattcga tctgagcgtc cgcaattgtt gcaagaagct 420

ttcgaagagc acatgaatca ccactaccct ttggagtggt ttgataatga aatcaaaacg 480

ctaacaggga tcgacgtgtt caataaaccg ttcgatcatg aagctggttg ccaaacctac 540

caacaaggca acttttctct gctcgtaatt cgaagtgaca agctgaagca atcaccagct 600

accgttggcg attttctcgg ctatccagtt gatgtggtcc acgacaacca atcaaacaac 660

aaatggtact cctcgctgat caatgagttc aaaaacagct atcaacctaa acctgagttg 720

attgaggaaa tgttgtcatc caaattgacg acccactttt ttacttcaag tgaaatttcc 780

gaactcaaac aaaagtatca aatggcgcaa tga 813

<210> 8

<211> 489

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 8

atgtactctt caattgcgag caaaatgcag cggcttatag gcggtttcgt tgatctgttc 60

gtcgtcatta gcgttgtcgt tgttatcgcg ttgggtatca atttttggct ctatgacttc 120

cgtttatccc tgcaagaaaa cttcacgctt gtttacgaca cccacgcggt gtacctcctt 180

actgttccca ttcttctcgt gattaactgg tattggttga aggaagggca aaccatcggc 240

atgcgttttg ttggtatcaa agtggtgatg aaaaatggtc gtgccgcgac caaagtgacg 300

gtttccatcc ggcttggcat cagctaccta ctcgaaatgt ttattcctgg cgttccgttg 360

gtgaaccttg tgttgcttgt ttttcatcca gagcgacgtt tgttgcatga tttcctcacc 420

aagaccaaag tcgtgcaagc acctgacttg ctgctgtcta ttttgcatga tcaaaaaaag 480

ccacattga 489

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgcttgttt acgacaccca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaaccgtca ctttggtcgc 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccatcaatac cttttccttc tcc 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accgtcatat aggcgcttaa c 21

Claims (6)

1.VPA1585作为特异性靶点在非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌中的应用：其中，所述VPA1585碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

2.VPA1585作为特异性靶点在制备副溶血性弧菌检测试剂中的应用：其中，所述VPA1585碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

3.检测VPA1585的制品在制备副溶血性弧菌检测试剂中的应用：其中，所述VPA1585碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

4.一种用于检测副溶血性弧菌的双重实时荧光PCR引物，其特征在于：针对特异性靶点VPA1585设计特异性引物对：VPA1585-F及VPA-1585-R，针对传统靶点tlh选择已发表引物对：tlh-F及tlh-R；其中，

VPA1585-F：5’–ACGCTTGTTTACGACACCCA – 3’，如SEQ ID NO.9所示；

VPA1585-R：5’–GAAACCGTCACTTTGGTCGC – 3’，如SEQ ID NO.10所示；

tlh-F：5’ – AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG–3’，如SEQ ID NO.11所示；

tlh-R：5’ – GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC – 3’，如SEQ ID NO.12所示。

5.权利要求4所述的PCR引物在检测副溶血性弧菌试剂盒中的应用。

6.一种检测副溶血性弧菌试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括引物VPA1585-F、VPA-1585-R以及tlh-F及tlh-R：其中，

VPA1585-F：5’ – ACGCTTGTTTACGACACCCA – 3’，如SEQ ID NO.9所示；

VPA1585-R：5’ – GAAACCGTCACTTTGGTCGC – 3’，如SEQ ID NO.10所示；

tlh-F：5’ – AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG – 3’，如SEQ ID NO.11所示；

tlh-R：5’ – GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC – 3’，如SEQ ID NO.12所示。

Images