CN108034737A - 用于检测单核细胞增生李斯特菌的rpa引物和探针及检测方法 - Google Patents

用于检测单核细胞增生李斯特菌的rpa引物和探针及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、探针和检测方法。本发明所述的RPA引物和探针是基于单核细胞增生李斯特菌actA基因设计，引物序列见SEQ ID No.1、2和3。所述的探针长度为45‑52bp，在探针中间距5’端30bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要通过阻塞基团C3Spacer修饰，其序列见SEQ ID No.4。相对于现有技术，本发明的检测方法可以在15min内完成检测，可快速检测样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌，并且所建立的RPA方法特异性强，灵敏度高，不需要特殊仪器，在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

Description

用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物和探针及检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测单核细胞增生李斯特菌的引物和探针及检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌是最重要的食源性致病菌之一，是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，开发单核细胞增生李斯特菌的快速检测方法具有重要的意义。
目前单核细胞增生李斯特菌的检测方法传统培养方法，免疫学方法以及PCR方法。虽然传统培养方法对实验设备的要求不高，可操作性较强，但是检测的周期较长，检测效率低，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求。而免疫学检测方法存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性。PCR检测方法的不足之处在于扩增反应受多种因素的影响，需要投入比较昂贵的仪器，易出现非特异性扩增，检测时间相对较长。这些方法均不利于现场快速检测。
重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年提出的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物结合，形成酶和引物的复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有被应用于单核细胞增生李斯特菌的检测应用中。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物及探针。
本发明的另一目的是提供一种含有RPA引物及探针的试剂盒。
本发明的再一目的是提供一种检测单核细胞增生李斯特菌的RPA方法。
为了实现本发明的目的，本发明所述的检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物，是根据actA基因设计的，其序列如下：
上游引物SEQ ID No.1：5’-CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGATG-3’
下游游引物SEQ ID No.2：5’-CGTCGATTTTATCACGTACCCATTTACCCG-3’。
一种用于检测单核细胞增生李斯特菌RPA引物前述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自前述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
本发明所述的检测单核细胞增生李斯特菌的RPA探针是根据actA基因设计的，长度为45-50bp，且在探针中间距5’端30bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要通过阻塞基团C3Spacer修饰，其序列如下：
探针SEQ ID No.3
5’-CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGATGAGTCTACACCACAACC-3’。
本发明提供含有所述上游引物SEQ ID No.1、下游引物SEQ ID No.2中一种或者几种及探针SEQ ID No.3的用于检测单核细胞增生李斯特菌的试剂盒。
所述的试剂盒包含RPA反应管，缓冲液，标准阳性模板。
本发明还提供所述的RPA引物、和探针及其试剂盒在检测单核细胞增生李斯特菌中的应用。
本发明提供一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA法，其具体步骤如下：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)根据前述序列组成合成RPA特异性引物，和RPA特异性探针；
(3)在RPA反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光。
RPA反应体系以50uL计为：
RPA反应条件为：37-42℃(优选39℃)，15-25min(优选15min)。
所述的方法在检测单核细胞增生李斯特菌中实现了良好的应用。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
(1)本发明将RPA技术与荧光检测相结合，可以快速准确的检测单核细胞增生李斯特菌。
(2)该方法的灵敏度与PCR方法相差无几，但特异性要比目前的PCR方法要强，可以从常见致病菌以及李斯特菌属中特异性检测到单核细胞增生李斯特菌，对单核细胞增生李斯特菌的快速检测提供了技术支持，同时可以免除昂贵仪器的投入，便于在基层推广使用。
附图说明
图1为RPA方法的建立。其中曲线1为单核细胞增生李斯特菌CICC21632；曲线2为空白对照。
图2为RPA方法对李斯特菌属菌种特异性实验。其中曲线1为单核细胞增生李斯特菌CICC21632，曲线2-7分别为英诺克李斯特菌，绵羊李斯特菌，斯氏李斯特菌，格式李斯特菌，威氏李斯特菌以及空白对照的扩增结果。
图3为RPA方法对常见致病菌特异性验证实验。其中曲线1为单核细胞增生李斯特菌CICC21632，曲线2-8分别为金黄色葡萄球菌，大肠O157，志贺氏菌，阪岐肠杆菌，沙门氏菌，副溶血性弧菌以及空白对照的扩增结果。
图4为RPA灵敏度实验。其中，曲线1：单核细胞增生李斯特菌1.8×105cfu/reaction，曲线2：单核细胞增生李斯特菌1.8×104cfu/reaction，曲线3：单核细胞增生李斯特菌1.8×103cfu/reaction，曲线4：单核细胞增生李斯特菌180cfu/reaction，曲线5：单核细胞增生李斯特菌18cfu/reaction，曲线6：空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可通过商业途径获得。
下述实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号为TAEXO02KIT，其中RPA反应管包含RPA反应所需的重组酶、聚合酶等，使用时，利用缓冲液将其溶解，整个RPA反应在RPA反应管中进行。
实施例1
靶基因的选取与RPA引物探针的设计及筛选
利用生物信息学知识以及相关分析软件，对单核细胞增生李斯特菌常见的毒力基因进行分析，诸如hly、inl、actA等，通过对单核细胞增生李斯特菌的这些基因与其他微生物进行比对分析，将actA作为待选靶基因，并选择特异性较高的序列片段。根据RPA对引物和探针的设计要求，设计特异性引物及探针，之后再次将引物与探针的序列与单核细胞增生李斯特菌同源性高的物种进行比对，从中选择特异性高的引物及探针。之后对同过对待选引物及探针进行试验比较分析，从中选择特异性高，扩增效率高的一个组合。筛选得到的引物及探针序列分别如所示(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)。其中探针需要被修饰，在探针中间距5’端30bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要同过阻塞基团C3Spacer修饰。
上游引物SEQ ID No.1:5’-CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGATG-3’
下游引物SEQ ID No.2:5’-CGTCGATTTTATCACGTACCCATTTACCCG-3’
探针SEQ IDNo.3:5’-CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGA-(FAM-dT)-G-(dSpacer)-G-(BHQ1-dT)-CTACACCACAACC-C3spacer-3’
引物及探针交由上海生物工程有限公司合成。
实施例2
单核细胞增生李斯特菌RPA方法的建立
将单核细胞增生李斯特菌CICC 21632接种到营养肉汤中，放置在摇床上，按照每种细菌最适生长温度度培养过夜，吸取1mL培养菌液滴加到1.5mL离心管内，12 000r/min离心2min，弃去上清液，加入500μL无菌生理盐水，充分悬浮混匀，12 000r/min离心1min，弃上清，重复添加无菌生理盐水，再离心，弃上清。添加50μL生理盐水，100℃水浴10-15min，待冷却室温12000r/min离心1min，上清液于-20℃保存备用。
以单核细胞增生李斯特菌CICC 21632的DNA作为模板，同时设置空白对照，利用实施例1中的RPA引物及探针进行RPA扩增，并利用荧光收集装置收集荧光，结果图1所示。
RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液29.5uL、去离子水11.2uL、上下游引物各2.1uL、探针0.6uL、模板2uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15min。
实施例3
对所建立的RPA方法进行特异性试验分析
本实施例中采用的标准菌株均有广州环凯微生物有限公司代为购买，具体信息如表1所示。
表1用于RPA特异性分析的菌株
以表1中菌株DNA作为RPA反应模板，利用实施例1中的RPA引物及探针进行RPA扩增。
RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液29.5uL、去离子水11.2uL、上下游引物各2.1uL、探针0.6uL、模板2uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15min。
扩增结果如图2和图3所示，从结果中可以知道，只有阳性对照单核细胞增生李斯特菌CICC 21632的扩增结果呈阳性，李斯特菌属的其他菌以及其他常见致病菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。该结果表明，本发明RPA引物、RPA探针以及RPA方法的特异性良好。
实施例4
利用RPA引物及探针检测单核细胞增生李斯特菌的灵敏度分析
以单核细胞增生李斯特菌CICC 21632为模板，利用实施例1中的RPA引物及探针进行扩增，其中不同反应中，DNA的总含量分别相当于1.8×105cfu/reaction,、1.8×104cfu/reaction、1.8×103cfu/reaction、1.8×102cfu/reaction、18cfu/reaction。
RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液29.5uL、去离子水11.2uL、上下游引物各2.1uL、探针0.6uL、模板2uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15min。
灵敏度的实验结果如图4所示，有结果可知，本发明RPA法的检测下限可以达到18cfu/reaction。充分说明该方法的灵敏度与PCR方法相差无几，但特异性要比目前的PCR方法要强。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方法对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之进行稍微修改，改进，修饰、替代等，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>深圳市计量质量检测研究院
<120>用于检测单核细胞增生李斯特菌的rpa引物和探针及检测方法
<130>
<160>3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
CTTAG ATTCT AGCAT GCAGT CAGCG GATG 29
<210>2
<211>30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>2
CGTCG ATTTT ATCAC GTACC CATTT ACCCG 30
<210>3
<211>45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>3
CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGATGAGTCTACACCACAACC 45

Claims (10)

1.用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物，其特征在于，所述的RPA引物是基于单核细胞增生李斯特菌的actA基因设计的，其引物序列如下：
上游引物SEQ ID No.1:5’-CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGATG-3’
下游引物SEQ ID No.2：5’-CGTCGATTTTATCACGTACCCATTTACCCG-3’。
2.一种用于检测单核细胞增生李斯特菌RPA引物，其特征在于，采用权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
3.用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA探针，其特征在于，所述探针是基于单核细胞增生李斯特菌的actA基因设计的，所述探针的长度为45-50bp，且在探针中间距5’端30bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要通过阻塞基团C3Spacer修饰，其序列如下：
探针SEQ ID No.3:
5’-CTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCGGATGAGTCTACACCACAACC-3’。
4.一种用于检测金黄色葡萄球菌的RPA探针，其特征在于，采用权利要求3所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
5.一种用于RPA法检测单核细胞增生李斯特菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的RPA引物和权利要求3所述的RPA探针。
6.根据权利要求1所述的的RPA引物，或者根据权利要求3所述的RPA探针，或者根据权利要求5所述的检测单核细胞增生李斯特菌的RPA试剂盒在检测单核细胞增生李斯特菌中的应用。
7.一种检测单核细胞增生李斯特菌的RPA方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)根据权利要求1的序列组成合成RPA特异性引物，和根据权利要求3的序列组成合成RPA特异性探针；
(3)在RPA反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，RPA反应体系以50uL计为：
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：37℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
10.权利要求7-9任一项所述的方法在检测单核细胞增生李斯特菌中的应用。
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