CN110218803B

CN110218803B - 针对人鼠共患病病原微生物的pcr引物对、试剂盒及其用途

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Publication number: CN110218803B
Application number: CN201910420563.9A
Authority: CN
Inventors: 栗冬梅; 刘起勇; 张燕君; 宋秀平; 康央
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-05-20
Also published as: CN110218803A

Abstract

本发明公开了一种针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对，分别用于扩增问号钩端螺旋体、莫氏立克次体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体、土拉弗朗西斯菌、贝氏柯科斯体和巴尔通体的特异性基因。使用该PCR引物对，根据TSP原理建立起了高敏感性和特异性地单独或组合检测如上七种病原体的方法。

Description

针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对、试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于微生物学领域，特别涉及七种鼠传病病原微生物的多重PCR检测方法及其试剂与应用。

背景技术

鼠传疾病是指由鼠类引起的、在人与人/动物之间传播的人兽共患传染病，也称人鼠共患病。鼠类能将某些病毒、细菌、立克次体、原虫和蠕虫等病原体传播给人类和家畜，是多种人畜共患病病原体的储存宿主。近年来，随着全球化进程加快，人类活动增强，人和物的流动性增强，鼠传疾病流行区域也不断扩大，多种新发鼠传疾病出现还有部分老传染病复燃^[1-3]，如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans，Lep)引起的钩体病和莫氏立克次体(Rickettsiae typhi，Rt)引起的地方性斑疹伤寒是我国法定传染病，多年来一直困扰我国人民的身体健康，由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum，Ap)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，Ft)、贝氏柯科斯体(Coxiella burnetii，Cb)和巴尔通体(Bartonella，Bar)引起的传染病是近年来新发和重复复燃的传染病，传播速度快，散播面积广，危害性大，其中Cb引发的疫区遍布全球，成为分布最广的人兽共患病之一^[4]，所引起的疫情造成巨大的卫生经济负担，使得鼠传疾病的防控工作面临挑战。

及时准确地检测病原体是预防控制鼠传疾病的关键步骤之一，为进一步制定防控策略和持续监测提供基础。传统检测方法如分离培养、血清学检测法等操作通量小、灵敏度较低，以核酸分子检测技术为基础的各种高通量检测方法应运而生，如蔡婧等^[5]用多重实时荧光探针法实现对3种致病型伯氏疏螺旋体分型检测，通过设计1对通用引物和3条特异探针完成检测，最低检测极限可达5copies/μl，但该方法因检测通道数有限限制了被检病原种类数；Jana等^[6]建立了一种将DNA微阵列与PCR技术结合检测蜱传病原体的方法，基于16S可变区同时检测贝氏柯科斯体、立克次体和土拉弗朗西斯菌，检测极限分别是10copies/μl，100copies/μl，1copies/μl，该方法操作复杂且费用昂贵。

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发明内容

本发明运用微生物数据分析云平台筛选基因设计引物，建立一种高效、快速、简便的多重鼠传病原菌检测方法，为一系列鼠传疾病病原的检测、监测、食品卫生监查、流行病学调查研究方面等应用提供有效手段。

本发明建立一种基于QIAxcel毛细管电泳系统的7种鼠传疾病病原菌多重PCR检测方法。应用微生物数据分析云平台“special marker gene”工作流筛选恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum，Ap)、莫氏立克次体(Rickettsiae typhi，Rt)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，Ft)、贝氏柯科斯体(Coxiella burnetii，Cb)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans，Lep)和巴尔通体(Bartonella，Bar)特异基因，并设计引物。根据温度转换PCR(Temperatureswitch PCR，TSP)原理构建特异性嵌合引物，建立多重PCR(Multiplex PCR，mPCR)反应体系，应用QIAxcel毛细管电泳系统对扩增产物进行检测，评价该体系灵敏度、特异性和可重复性。通过对模拟样品和野外样品进行检测，评价该方法的样品检测能力。结果显示该方法特异性检测均只出现单一目的条带，无交叉反应；多引物单模板灵敏度检测极限为11～76copies/μl，多引物多模板灵敏度检测极限为20～200copies/μl。经样品检测显示，多重PCR法检测能力与单重实时荧光定量PCR法相当，优于普通单重PCR法。本发明运用QIAxcel毛细管电泳系统建立的多重PCR方法可高效、快速、灵敏地同时检测7种鼠传病原菌，为一系列鼠传疾病的监测预防提供了有效手段。

较为具体地，本发明第一方面提供了一种针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对，所述PCR引物对选自针对恙虫病东方体的引物对、针对莫氏立克次体的引物对、针对嗜吞噬细胞无形体的引物对、针对土拉弗朗西斯菌的引物对、针对贝氏柯科斯体的引物对、针对问号钩端螺旋体的引物对和针对巴尔通体的引物对中的任一对、任两对、任三对、任四对、任五对、任六对或共七对。

在一些实施方式中，所述针对恙虫病东方体的引物对是针对GenBank号为AM494475.1的基因的引物对；

所述针对莫氏立克次体的引物对是针对GenBank号为AE017197.1的基因的引物对；

所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对是针对GenBank号为CP000235.1的基因的引物对；

所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对是针对GenBank号为AJ749949.2的基因的引物对；

所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对GenBank号为AE016828.3的基因的引物对；

所述针对问号钩端螺旋体的引物对是针对GenBank号为AE010300.2的基因的引物对；

所述针对巴尔通体的引物对是针对GenBank号为BX897699.1的基因的引物对。

在一些实施方式中，所述针对恙虫病东方体的引物对是针对GenBank号为AM494475.1的基因组碱基序列中第1350022位-第1350510位所在基因或其同源基因的引物对；

所述针对莫氏立克次体的引物对是针对GenBank号为AE017197.1的基因组碱基序列中第280273位-第282033位所在基因或其同源基因的引物对；

所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对是针对GenBank号为CP000235.1的基因组碱基序列中第80911位-第82092位所在基因或其同源基因的引物对；

所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对是针对GenBank号为AJ749949.2的基因组碱基序列中第1196328位-第1196651位所在基因或其同源基因的引物对；

所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对GenBank号为AE016828.3的基因组碱基序列中第1935473位-第1936219位所在基因或其同源基因的引物对；

所述针对问号钩端螺旋体的引物对是针对GenBank号为AE010300.2的基因组碱基序列中第99185位-第100006位所在基因或其同源基因的引物对；

所述针对巴尔通体的引物对是针对GenBank号为BX897699.1的基因组碱基序列中第103924位-第104511位所在基因或其同源基因的引物对。

在一些实施方式中，所述针对恙虫病东方体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.1(上游引物)和SEQ ID NO.2(下游引物)所示；

所述针对莫氏立克次体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.3(上游引物)和SEQ ID NO.4(下游引物)所示；

所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.5(上游引物)和SEQ ID NO.6(下游引物)所示；

所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对的特异性序列碱基分别如SEQ ID NO.7(上游引物)和SEQ ID NO.8(下游引物)所示；

所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.9(上游引物)和SEQ ID NO.10(下游引物)所示；

所述针对问号钩端螺旋体的引物对的特异性序列碱基分别如SEQ ID NO.11(上游引物)和SEQ ID NO.12(下游引物)所示；

所述针对巴尔通体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.13(上游引物)和SEQ ID NO.14(下游引物)所示。

在一些实施方式中，所述PCR引物对的每一对中的一条上游共价连接有相同的上游通用引物部分，形成上游嵌合引物；所述PCR引物对的每一对中的另一条上游共价连接有相同的下游通用引物部分，形成下游嵌合引物；

在一些实施方式中，所述上游通用引物部分如SEQ ID NO.15所示；所述下游通用引物部分如SEQ ID NO.16所示。

具体地，每一对PCR引物中的上游引物的5’端与上游通用引物部分的3’端连接，从而形成新的嵌合上游引物；每一对PCR引物中的下游引物的5’端与下游通用引物部分的3’端连接，从而形成新的嵌合下游引物；对于上述7种病原微生物的引物对，都分别在上下游引物中连接了上游通用引物部分和下游通用引物部分，由此形成7对嵌合引物。

以恙虫病东方体的引物对为例，所述针对恙虫病东方体的引物对：

上游引物包含如SEQ ID NO.1所示的特异性碱基序列，所述针对恙虫病东方体的引物对的上游引物中还包含如SEQ ID NO.15所示的上游通用引物碱基序列，如SEQ IDNO.1所示的特异性碱基序列的5’端与如SEQ ID NO.15所示上游通用引物碱基序列的3’端共价连接，两段引物序列共价连接后形成的上游引物也称为针对恙虫病东方体的嵌合上游引物。

下游引物包含如SEQ ID NO.2所示的特异性碱基序列；所述针对恙虫病东方体的引物对的下游引物中还包含如SEQ ID NO.16所示的下游通用引物碱基序列，如SEQ IDNO.2所示的特异性碱基序列的5’端与如SEQ ID NO.16所示下游通用引物碱基序列的3’端共价连接，两段引物序列共价连接后形成的下游引物也称为针对恙虫病东方体的嵌合下游引物。

基于以上原理分别得到：针对莫氏立克次体的嵌合上下游引物对、针对嗜吞噬细胞无形体的嵌合上下游引物对、针对土拉弗朗西斯菌的嵌合上下游引物对、针对贝氏柯科斯体的嵌合上下游引物对、针对问号钩端螺旋体的上下游嵌合引物对、针对巴尔通体的上下游嵌合引物对。

本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第一方面中任一项所述的PCR引物对。

本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的PCR引物对在制备针对人鼠共患病病原微生物的检测制剂中的用途。

本发明第四方面提供了一种用于非诊断目的的人鼠共患病病原微生物的检测方法，所述方法包括如下步骤：

S1：提取待测样本的DNA，得到待测模板；

S2：使用如本发明第三方面所述的PCR引物对对所述待测模板进行PCR反应，得到PCR产物；

S3：对所述PCR产物进行表征，获得检测信息。

在一些实施方式中，在所述步骤S2中，使用本发明第一方面所述的PCR引物对(即，嵌合上游引物、嵌合下游引物)、上游通用引物和下游通用引物进行PCR反应，其中，所述上游通用引物与所述上游通用引物部分或其5’部分相同(其5’部分意思是所述上游通用引物部分5’端的序列，比如，上游通用引物3’部分有一两个碱基的去除，仍然能够发生杂交反应)；所述下游通用引物与所述下游通用引物部分或其5’部分相同(其5’部分意思是所述下游通用引物部分5’端的序列，比如，下游通用引物3’部分有一两个碱基的去除，仍然能够发生杂交反应)；

所述PCR反应分三个阶段进行：

第一阶段：退火温度为55℃-62℃；可选55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃中任一两个温度之间的范围或55℃-62℃之间的任一温度；

第二阶段：退火温度为66℃-72℃；可选66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃中任一两个温度之间的范围或66℃-72℃之间的任一温度；

第三阶段：退火温度为43℃-49℃，可选43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃中任一两个温度之间的范围或43℃-49℃之间的任一温度。

在一些实施方式中，在所述步骤S2中，如本发明第三方面所述的PCR引物对(嵌合上游引物、嵌合下游引物)中的任一条引物的浓度为30-60nmol/L。

在一些实施方式中，在所述步骤S2中，所述上游通用引物的浓度350-450nmol/L，比如，350nmol/L、360nmol/L、370nmol/L、380nmol/L、390nmol/L、400nmol/L、410nmol/L、420nmol/L、430nmol/L、440nmol/L、450nmol/L中的任两浓度之间的范围或350-450nmol/L范围内任意浓度值；所述下游通用引物的浓度350-450nmol/L，比如，350nmol/L、360nmol/L、370nmol/L、380nmol/L、390nmol/L、400nmol/L、410nmol/L、420nmol/L、430nmol/L、440nmol/L、450nmol/L中的任两浓度之间的范围或350-450nmol/L范围内任意浓度值；

在一些实施方式中，在所述步骤S2中，所述PCR反应的热循环为：

95℃5min；

95℃30s，55℃-59℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，66.5℃-71.5℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，43.5℃-48.5℃90s，72℃60s，循环20次；

72℃10min。

在一些实施方式中，在所述步骤S3中，所述表征是通过毛细管凝胶电泳检测所述PCR产物。

在一些实施方式中，在所述步骤S2中，所述针对恙虫病东方体的引物对中每一条的浓度为：50nmol/L；

所述针对莫氏立克次体的引物对中每一条的浓度为：40nmol/L；

所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对中每一条的浓度为：30nmol/L；

所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对中每一条的浓度为：30nmol/L；

所述针对贝氏柯科斯体的引物对中每一条的浓度为：50nmol/L；

所述针对问号钩端螺旋体的引物对中每一条的浓度为：50nmol/L；

所述针对巴尔通体的引物对中每一条的浓度为：60nmol/L。

不同引物的扩增效率不同，通过调节引物浓度，使各引物扩增效率趋于一致。具体操作方法：观察PCR产物凝胶电泳条带亮度，通过调节引物浓度，使各引物扩增条带亮度趋于一致。

在一些实施方式中，所述上游通用引物的浓度400nmol/L；所述下游通用引物的浓度400nmol/L。

在一些实施方式中，由于使PCR反应中通用引物的扩增为主导，为了避免特异性引物对间的扩增偏好性，上下游通用引物的浓度为远高于上面各对引物的浓度。

在一些实施方式中，所述PCR反应的热循环为：

95℃5min；

95℃30s，58℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，69.5℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，45.5℃90s，72℃60s，循环20次；

72℃10min。

前述不同的方案在本领域技术人员可预期的范围内可以任意组合或调整接近的范围。

附图说明

图1示出了特异性嵌合引物的设计原理。

图2示出了引物特异性检测的电泳图谱。

图3示出了Bar引物特异性检测的电泳图谱。

图4示出了基于QIAxcel系统多引物单模板灵敏度检测结果的电泳图谱。

图5示出了基于琼脂糖凝胶电泳多引物单模板灵敏度检测结果的电泳图谱。

图6示出了基于QIAxcel系统多引物多模板灵敏度检测结果的电泳图谱。

图7示出了基于琼脂糖凝胶电泳多引物多模板灵敏度检测结果的电泳图谱。

图8示出了模拟样品Rt，Ot，Ap单病原感染灵敏度检测结果的电泳图谱。

图9示出了模拟样品Bar，Lep，Cb，Ft单病原感染灵敏度检测的电泳图谱。

图10示出了模拟样品多病原感染灵敏度检测的电泳图谱。

图11示出了TSP扩增原理示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

术语说明：本申请所述“非诊断目的的检测”表示不同时满足(1)以有生命的人体或动物体为对象；和(2)以获得疾病诊断结果或健康状况为直接目的的检测，包括但不限于：空气、水源、土壤等环境中样本微生物的检测，农产品或加工的食品样本中微生物的检测，以及餐具、床单、衣服等生活用品的样本中微生物的检测等方面。

主要试剂、材料与仪器

Platinum multiplex PCR master mix(货号：4464268)购自Applied Biosystems公司，Size marker(25-500bp)、Alignment marker(15-600bp)和QIAxcel DNA highresolution kit毛细管电泳卡夹购自凯杰企业管理有限公司。本实验所用引物、探针均由北京擎科生物有限公司合成。

各阳性菌株核酸为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存，包括Ot，Ap，Ft，Rt，Cb，Lep，Bar具体包括Bc(克氏巴尔通体，B.clarridgeiae)、Bd(道志巴尔通体，B.doshiae)、Be(伊丽莎白巴尔通体，B.elizabethae)、Bg(格拉汉姆巴尔通体，B.grahamii)、Bh(汉赛巴尔通体，B.henselae)、Bk(克勒巴尔通体，B.koehlerae)、Bq(五日热巴尔通体，B.quintana)、Bt(特利波契巴尔通体，B.tribocorum)。

实施例1：特异基因筛选和引物设计

在微生物数据分析云平台(https://analysis.mypathogen.org)上分别上传目的微生物问号钩端螺旋体(GenBank登录号：AE010300.2)、莫氏立克次体(GenBank登录号：AE017197.1)、恙虫病东方体(GenBank登录号：AM494475.1)、嗜吞噬细胞无形体(GenBank登录号：CP000235.1)、土拉弗朗西斯菌(GenBank登录号：AJ749949.2)、贝氏柯科斯体(GenBank登录号：AE016828.3)和巴尔通体(GenBank登录号：BX897699.1)的基因组序列、分别对比分类学相近似的其他微生物基因组序列和前述7种目的微生物的基因编码序列(coding sequences，CDS)，选择“special marker gene”工作流运行，得到目的微生物的特异基因，其中，问号钩端螺旋体的特异基因为其基因组碱基序列中第99185位-第100006位(简称Lep特异基因)，莫氏立克次体的特异基因为其基因组碱基序列中第280273位-第282033位(简称Rt特异基因)，恙虫病东方体的特异基因为其基因组碱基序列中第1350022位-第1350510位(简称Ot特异基因)，嗜吞噬细胞无形体的特异基因为其基因组碱基序列中第80911位-第82092位(简称Ap特异基因)，土拉弗朗西斯菌的特异基因为其基因组碱基序列中第1196328位-第1196651位(简称Ft特异基因)，贝氏柯科斯体的特异基因为其基因组碱基序列中第1935473位-第1936219位(简称Cb特异基因)，巴尔通体的特异基因为汉赛巴尔通体基因组碱基序列中第103924位-第104511位(简称Bar特异基因)。根据特异基因序列在Primer premiers 5软件上设计特异性引物，具体引物序列可参见如下表1，其中，“特异部分名称”指不包含与通用引物同源或互补部分的嵌合引物的特异性序列的名称，即嵌合引物序列中去除通用引物部分的剩余部分的名称。

从人鼠共患病致病微生物的远源物种拟南芥基因组中选取一段非同源性通用序列(通用引物)，上游通用引物GF 5’-TTCTTCCGCCTGATT-3’(SEQ ID NO.15)，下游通用引物GR 5’-TGTTGGCATTCTCGT-3’(SEQ ID NO.16)。

如表1所示，针对每个待检测目的基因，设计一对嵌合引物，上游嵌合引物F和下游嵌合引物R，上游嵌合引物F的非下划线部分为上游嵌合引物的特异性序列，上游嵌合引物F的下划线部分为上游嵌合引物的通用序列，所有基因的上游嵌合引物的通用序列与上游通用引物GF相同。下游嵌合引物R的非下划线部分为下游嵌合引物的特异性序列，下游嵌合引物R的下划线部分为下游嵌合引物的通用序列，所有基因的下游嵌合引物的通用序列与下游通用引物GR相同。各个嵌合引物的特异性序列部分参见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14(参见表1和图1)。

图1中，粗平行线表示待检测目的基因片段，与粗平行线不平行的细线表示嵌合引物的通用序列，与粗平行线两端平行的细线表示嵌合引物的特异性序列，“V”形部分整体表示嵌合引物。

根据微生物数据分析云平台筛选得到特异基因序列，设计多重PCR反应体系引物组如下(表1)。

表1 引物序列

实施例2：多重PCR体系的建立与优化

先建立单重PCR反应，反应体系：针对7种微生物中的一种的上下游嵌合引物CF、CR各1μl(1μmol/L)，上下游通用引物GF、GR各1μl(10μmol/L)，2×master mix 12.5μl，模板2μl，ddH₂O 6.5μl。反应条件：95℃5min；阶段1：95℃30s，60℃1min，72℃1min，循环10次；阶段2：95℃30s，69℃1min，72℃1min，循环10次；阶段3：95℃30s，45℃1min，72℃1min，循环20次；72℃10min。设置梯度PCR优化引物浓度。在单重反应基础上，依次增加引物，提高反应重数，并优化引物浓度、延伸时间和循环数。产物经QIAxcel毛细管电泳检测(下同)。

以Cb单重反应为例，退火温度优化如下，根据引物设计原理设置温度梯度PCR，设置阶段3中通用引物退火温度分别为43.5℃，44.5℃，45.5℃，46.5℃，47.5℃，48.5℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物条带亮度确定通用引物最适退火温度。同理，分别设置阶段1中Cb特异性引物退火温度分别为55℃，56℃，57℃，58℃，59℃；设置阶段2中Cb特异性嵌合引物退火温度分别为66.5℃，67.5℃，68.5℃，69.5℃，70.5℃，71.5℃，确定引物最适退火温度。本申请未示出相应的电泳凝胶图谱。

由于设计各病原菌特异性引物时退火温度一致，因此已优化的Cb单重反应退火温度直接适用于多重PCR反应。

在单重反应阶段只优化了引物退火温度，引物浓度的优化和多重体系的建立是同时进行的，其余参数的优化是在多重体系建立之后进行。

引物浓度的优化和多重体系的建立如下：在Cb单重反应基础上进行二重PCR反应，体系中增加Ap特异性嵌合引物，并设置Ap特异性嵌合引物在体系中终浓度分别为30nmol/L，40nmol/L，50nmol/L，60nmol/L，以Cb质粒标准品和Ap质粒标准品为模板(两种模板拷贝数浓度保持一致)。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物条带亮度确定Ap特异性嵌合引物最适引物浓度，使引物在最适浓度时Cb和Ap条带亮度保持一致。本申请未示出相应的电泳凝胶图谱。

同理，依次增加反应重数，确定各病原菌特异性嵌合引物在体系中最适引物浓度。通过对一系列反应条件与体系优化，确定最优多重PCR反应体系：针对7种微生物的上下游引物(表1所示的嵌合引物)的混合引物MF、MR各1μl(1μmol/L)，上下游通用引物GF、GR各1μl(10μmol/L)，2×master mix 12.5μl，模板2μl，ddH₂O 6.5μl。反应条件：95℃5min；阶段1：95℃30s，58℃90s，72℃60s，循环10次；阶段2：95℃30s，69.5℃90s，72℃60s，循环10次；阶段3：95℃30s，45.5℃90s，72℃60s，循环20次；72℃10min。其中混合引物MF、MR为7种目的微生物特异性嵌合引物按比例混合配制，使各引物在体系中的最适终浓度为：Ap和Ft的嵌合上下游引物分别各30nmol/L，Rt的嵌合上下游引物各40nmol/L，Ot、Lep、Cb的嵌合上下游引物分别各50nmol/L，Bar的嵌合上下游引物各60nmol/L。本申请未示出相应的电泳凝胶图谱。

实施例3：多重PCR体系特异性与灵敏度检测

本发明共设计7个质粒标准品，为实施例1所使用的各自特异基因插入T载体形成的含有各自特异性基因的重组质粒，具体为：Ap、Cb、Bar、Lep的特异基因分别独立插入pUC57-Simple质粒，Ot、Ft、Rt的特异基因分别独立插入pMD-19T-Simple质粒，形成各自重组质粒。本发明所述混合质粒、混合质粒标准品均是指这7个质粒标准品的混合物。

根据拷贝数浓度换算公式：拷贝数浓度(copies/μl)＝[DNA浓度(ng/μl)/碱基数×660]×6.02×10²³，将质粒标准品按10倍比稀释至100～10⁵copies/μl。

(一)多引物单模板灵敏度检测

根据实施例2部分配制反应体系，以阳性菌株核酸和非目的菌核酸为模板，产物经QIAxcel毛细管电泳检测，分析该体系特异性。

根据实施例2部分配制反应体系，以如上所述不同稀释度质粒标准品为模板，每个稀释度做3个重复，产物经琼脂糖凝胶电泳和QIAxcel毛细管电泳检测，并且非同日进行3次平行实验，分析该体系的可重复性。

以Ot，Ap，Lep，Cb，Ft，Bar，Rt阳性菌株核酸分别为模板用多重PCR体系检测，Bar检测所用的具体巴尔通体菌种包括：Bc，Bd，Be，Bg，Bh，Bk，Bq，Bt。产物经毛细管电泳检测显示每个反应只出现单一特异性条带，无交叉反应。混合7种质粒标准品为模板用多重PCR体系检测(本发明此处及下文所述多重PCR体系均是指同时将表1所示7中微生物的引物混合使用，采用实施例2的优化方法，进行PCR检测的体系)，作为阳性对照(图2)。图2中，泳道1-7依次为：Ot，Ap，Lep，Cb，Ft，Bar(此处用的是Bar的一种：Bh阳性菌株核酸)，Rt阳性菌株核酸，泳道8为：混合质粒标准品阳性对照。PCR产物经QIAxcel毛细管电泳系统检测，只需将扩增产物置于样品板处，无需任何处理，电泳结果由PC端软件自动呈现电泳图。从图2中可以看出，本发明的多重PCR体系对7种微生物的检测具有特异性。

巴尔通体属可检出Bc，Bd，Be，Bg，Bh，Bk，Bq，Bt共8种常见巴尔通体(图3)。经毛细管电泳多次检测，目的条带大小为：Bar 158±3bp，Lep188±3bp，Cb 254±3bp，Ft 290±3bp，Rt 308±3bp，Ap 334±3bp，Ot 432±3bp，该8种巴尔通体均通过表1所示Bar的嵌合引物扩增。图3中，泳道1-8：Bc，Bd，Be，Bg，Bh，Bk，Bq，Bt，泳道9：混合质粒标准品阳性对照。从图3中可以看出，本发明的多重PCR体系能够对前述8种常见巴尔通体进行检测，均具有特异性。

采用实施例2的反应体系进行非特异性检测，非特异性检测分别选用牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，长角血蜱，猫蚤，小鼠和人的基因组作为模板，用实施例2所述多重PCR体系检测，均未扩增出目的条带(未示出相应照片)，证明引物特异性良好。

多引物单模板灵敏度检查结果如图4所示，图4中，(a)泳道1：7种混合质粒标准品阳性对照，泳道2-5：单一质粒标准品Lep模板浓度依次为1.7×10⁴～1.7×10¹copies/μl，十倍等比稀释，泳道6-9：单一质粒标准品Rt模板浓度依次为1.5×10⁴～1.5×10¹copies/μl，十倍等比稀释；(b)泳道1：混合质粒标准品阳性对照，泳道2-5：单一质粒标准品Ft模板浓度依次为1.8×10⁴～1.8×10¹copies/μl，十倍等比稀释，泳道6-9：单一质粒标准品Ap模板浓度依次为7.6×10⁴～7.6×10¹copies/μl，十倍等比稀释；(c)泳道6：混合质粒标准品阳性对照，泳道1-5：单一质粒标准品Bar模板浓度依次为1.6×10⁵～1.6×10¹copies/μl，十倍等比稀释，泳道7-11：单一质粒标准品Cb模板浓度依次为1.1×10⁵～1.1×10¹copies/μl，十倍等比稀释；(d)泳道1-5：单一质粒标准品Ot模板浓度依次为1.7×10⁴～1.7×100copies/μl，十倍等比稀释。经QIAxcel毛细管电泳检测，多引物单模板灵敏度检测下限均在11～76copies/μl范围内(图4)，各病原菌检测下限分别为Cb 1.1×10¹copies/μl，Rt1.5×10¹copies/μl，Ap 7.6×10¹copies/μl，Ot 1.7×10¹copies/μl，Ft 1.8×10¹copies/μl，Lep 1.7×10¹copies/μl，Bar 1.6×10¹copies/μl。

琼脂糖凝胶电泳检测中，采用与实施例2中相同的电泳条件，采用多引物单模板扩增(相同浓度模板相同反应程序采用同一批扩增产物，以便产物条件平行)，不用毛细管电泳，而采用琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度结果参见图5。在图5中，(a)表Ft检测结果，泳道1-6：Ft模板浓度按10倍比稀释(下同)依次为1.8×10⁶-1.8×10¹copies/μl，泳道7：DNA marker 100bp；(b)表Ot、Bar和Lep检测结果，泳道1-5：Ot模板浓度依次为1.7×10⁶-1.7×10²copies/μl；泳道6-10：Bar模板浓度按10倍比稀释依次为1.6×10⁶-1.6×10²copies/μl；泳道11-14：Lep模板浓度依次为1.7×10⁵-1.7×10²copies/μl；泳道15：空白对照(模板为无菌ddH₂O)，M表DNA marker 100bp；(c)表Cb、Rt和Ap检测结果，泳道1-5：Cb模板浓度依次为1.1×10⁵-1.1×10¹copies/μl；泳道6-10：Rt模板浓度依次为1.5×10⁵-1.5×10¹copies/μl；泳道11-15：Ap模板浓度依次为7.6×10⁵-7.6×10¹copies/μl，泳道16：DNAmarker 100bp。

由此可知，本发明的多引物单模板方法比琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提高10倍(见附图4-5)。

(二)多引物多模板灵敏度检测

多引物多模板灵敏度检测：根据最小公倍数计算法，将各质粒标准品取一定量配制成混合模板，使各标准品在混合模板中拷贝数一致，将混合模板按10倍比稀释为2×10⁰～2×10⁵copies/μl。检测方法同上。

多引物多模板灵敏度检查结果如图6所示，图6中，泳道1-5：混合质粒模板中每种质粒的浓度分别为2×10⁵～2×10¹copies/μL，泳道6为空白对照(模板为无菌ddH₂O)。采用实施例2所述检测程序，结果显示：在2×10¹copies/μl可检测到5种病原菌Rt、Ft、Cb、Lep和Bar，比普通琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提高10倍。在2×10²copies/μl可检测到7种病原菌。

琼脂糖凝胶电泳检测中，采用与实施例2中相同的电泳条件，采用多引物单模板扩增(相同浓度模板相同反应程序采用同一批扩增产物，以便产物条件平行)，不用毛细管电泳，而采用琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度结果参见图7。在图7中，泳道1-5：混合质粒模板中每种质粒的浓度分别为2×10⁵～2×10¹copies/μL，泳道6为空白对照(模板为无菌ddH₂O)，泳道7为DNA marker 100bp。由于琼脂糖凝胶电泳分辨率低，Ft和Rt条带大小相近，并不能清楚区分，所以只呈现出6条目的带。

由此可知，本发明的多引物多模板方法比琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提高10倍(见附图6-7)。经多次重复检测，实验结果保持一致，证明该体系可重复性好。

实施例4：模拟样品检测

(一)单病原感染灵敏度检测

单病原感染样品制备：在10μl SPF(specific pathogen free，无特定病原体)级的鼠脾核酸中加入10μl不同稀释度的阳性菌株核酸，制成菌株核酸浓度为10^-5～10ng/μl的模拟样品，本发明中所有“阳性菌株核酸”均指提取的核酸。浓度指病原体核酸浓度。核酸浓度是经微量核酸浓度测定仪NanoDrop-1000测定；经实施例2所建立的多重PCR反应体系检测，以7种混合质粒为阳性对照，以鼠脾核酸为阴性对照。

为确定核酸浓度和基因拷贝数间对应关系，将不同稀释度的Bh菌悬液进行分离培养记录菌落数并测定核酸浓度，具体操作如下：

(1)用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)将Bh标准菌株制成2.1麦氏浊度(McFarland，McF)的菌悬液，用无菌PBS溶液将该菌悬液按10倍比稀释成2.1×10^-7-2.1×10^-1mcf。

(2)配制含5wt％去纤维羊血的胰蛋白大豆琼脂培养基。取20g胰蛋白大豆琼脂培养基粉于500ml锥形瓶中，加无菌蒸馏水至450ml，用橡胶塞封口，封口处再包一层牛皮纸，进行高压灭菌20min。取25ml脱纤维羊血加入25ml无菌蒸馏水中，静置2min待血液呈澄清深红色，将其加入450ml灭菌培养液中，混匀，铺板。将培养基平板置于含5％CO₂的37℃培养箱中，过夜观察，确保培养基平板没有污染。

(3)配制脑心浸液营养肉汤培养基。取1.86g脑心浸液营养培养基粉末于50ml蒸馏水中，混匀，分装至小试管中，用橡胶塞封口，封口处再包一层牛皮纸，进行高压灭菌20min。冷却至室温后于4℃储存备用。

(4)取(1)中稀释液各150μl滴至含5％去纤维羊血的胰蛋白大豆琼脂培养基上，加以适量脑心浸液营养肉汤培养基，用1μl的接种环涂布均匀，置于5％CO₂的37℃培养箱养，每个稀释度做两个平行板。

(5)培养10d，观察微生物菌落数。

(6)配制5％Chelex 100溶液。0.5g Chelex 100加入10ml灭菌超纯水中，调PH至10。

(7)用Chelex 100法提取150μl、2.1mcf的Bh菌液核酸。取50μl 5％Chelex 100溶液加入150μl菌液中，混匀，100℃沸水浴煮10min，室温放置5min，3000-5000r/min离心5min，取上清。并用微量核酸浓度测定仪NanoDrop-1000检测其纯度和浓度。

(8)解剖法取SPF级昆明小鼠脾脏，用磁珠法组织基因组DNA提取试剂盒提取鼠脾核酸。用微量核酸浓度测定仪NanoDrop-1000检测其纯度和浓度，将其稀释至约10ng/μl。鼠脾核酸提取步骤如下：

(a)根据磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(预封装)(购自北京百泰克生物技术有限公司，货号AU19014)提取鼠脾核酸，先在运行板的第1列和第7列每个孔分别加入125μl裂解液TR，加入0-10mg组织样本(需剪碎)、20μl蛋白酶K、4μl RNase。

(b)将深孔板平稳的放置到核酸自动提取仪中，然后将搅拌套插入卡槽中。

(c)选择核酸提取仪默认程序，点击“运行”开始实验。

(d)运行结束后，从第6列和第12列中吸取DNA溶液转移至1.5ml干净离心管中，DNA可以存放在2-8℃，如果需要长期存放，请放置在-80℃。

用微量核酸浓度测定仪NanoDrop-1000检测核酸纯度和浓度。

经QIAxcel毛细管凝胶电泳系统检测显示(图8，图9)，单病原感染样品灵敏度检测极限如下：Ot 10ng/μl，Rt 1ng/μl，Ap和Lep为10^-2ng/μl，Cb、Ft和Bar(Bh)为10^-4ng/μl。根据培养结果显示，150μl、2.1×10^-6mcf的Bh菌液培养第10天时Bh菌落数为65，所以1ml、2.1mcf的Bh菌悬液含有菌落数为4.3×10⁸(计算方法：65÷0.15×10⁶＝4.3×10⁸)。因1ml、2.1mcf菌悬液核酸浓度为71.5ng/μl，所以10^-4ng/μl的Bh菌悬液含菌落数为6×10²(计算方法：4.3×10⁸×10^-4÷71.5＝6×10²)，即Bh单病原感染样品的灵敏度检测极限为6×10²copies/μl。在图8中，(a)、(b)、(c)分别为Rt，Ot，Ap的单病原感染灵敏度检测电泳胶图，图中所标示10-10^-4代表模拟样品的不同浓度，P为混合质粒阳性对照，N为阴性对照鼠脾核酸。在图9中，(a)从左至右分别为Bar，Lep(b)从左至右分别为Cb，Ft，P为混合质粒阳性对照。图9中所标示10-10^-5代表模拟样品的不同浓度。

(二)多病原感染灵敏度检测

多病原感染样品制备：根据最小公倍数计算法，将7种阳性菌株核酸混合，使混合核酸中各病原菌核酸浓度保持一致，在10μl SPF级鼠脾核酸中加入10μl不同稀释度的混合核酸，制成混合菌株(总)浓度为10^-5～10ng/μl的模拟样品。根据实施例2的方法配制反应体系进行检测，以混合7种质粒为阳性对照，以鼠脾核酸为阴性对照。

用QIAxcel毛细管凝胶电泳系统检测多病原感染模拟样品的灵敏度如图10所示，图10中所标示10-10^-5代表模拟样品的不同浓度，P为混合质粒阳性对照，N为阴性对照。

从图10中可见：Ot的检测极限为10ng/μl，Rt的检测极限为1ng/μl，Ap和Lep的检测极限为10^-2ng/μl，Cb的检测极限为10^-3ng/μl，Ft和Bar的检测极限为10^-4ng/μl。相比单病原感染，多病原感染时Cb检测灵敏度降低10倍。

实施例5：野外样品检测

对北京市86份野外鼠脾样品进行检测，通过常规方法获得样品的基因组DNA，按照实施例2的方法配制多重PCR反应体系，检测结果与常规单重PCR法(简称常规PCR法)、实时荧光定量PCR法(简称qPCR法)相比较，通过Kappa值分析，评估该方法的样品检测能力。

常规PCR法所用引物参见表2，PCR反应程序为常规程序(其中，前四微生物的检测使用的是巢式PCR法，各使用了内外两套引物，后三种微生物的检测使用的是普通PCR法，各使用了一对引物)，具体热循环程序与表2中所标示文献中记载的方法相同。

表2 常规PCR法引物序列

实时荧光定量PCR法所用引物参见表3，实时荧光定量PCR反应程序具体热循环程序与表3中所标示文献中记载的方法相同。

表3 单重qPCR法引物序列

收集北京市86只野外啮齿类动物，包括大林姬鼠3只(3％)，褐家鼠18只(21％)，鼩鼱1只(1％)，社鼠35只(41％)，小家鼠29只(34％)。用多重PCR法、qPCR法和常规PCR法对野外鼠脾样品同时进行检测，检测结果如下(表4)，多重PCR法检出阳性数为21(24％)，qPCR法检出阳性数为21(24％)，常规PCR法检出阳性数为6(7％)。以qPCR法检测结果为标准，分析多重PCR法的检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及Kappa值如下(表5)，对于Bar检测，Kappa值为1，两种方法检测结果完全一致；对于Lep检测，Kappa值为0.79，两种方法检测结果基本一致；对于Ap检测，多重PCR法检测到一份阳性，qPCR法和常规PCR法未检测到阳性。

据检测结果显示，86份样品中检出阳性样品数22份，均为单病原感染，常规PCR法检出阳性数6份，其中5份为Bar感染，1份为Lep感染；多重PCR法检出阳性数21份，其中18份为Bar感染，2份为Lep感染，1份为Ap感染；qPCR法检出阳性数21份，其中18份为Bar感染，3份为Lep感染。因此，Bar、Lep和Ap感染率分别为21％，3％和1％。

表4 样品检测情况

注：—表示检测阴性

表5 多重PCR法和qPCR法检测样品情况比较

注：/表示算式分子为零，无值。

鼠类繁殖力强，活动性广，是许多人兽共患病病原菌的宿主和传播媒介，能将多种病原微生物传播给人类和家畜，对公共卫生和安全造成巨大隐患。自上世纪50年代起，我国建立了多种鼠传疾病的单病原体监测系统，对鼠传疾病进行系统的监测和预防，但随着各种鼠传疾病病原体变种增加，感染人数增多，单病原体检测不仅费时费力，且检测数据不能进行综合有效的分析。因此，急需多重病原体检测方法为鼠传疾病综合监测提供技术支持。

本研究建立的多重PCR方法根据TSP(Temperature Switch PCR)原理，在特异性引物5’端加一段通用引物，构成特异性嵌合引物。在多重PCR反应体系中，含有1对通用引物及7对特异性嵌合引物，根据退火温度不同反应分为三个阶段完成(图11)，第一阶段退火温度为58℃，使嵌合引物的特异性部分与模板结合引发扩增，第二阶段退火温度为69.5℃，使嵌合引物与模板以及第一阶段的扩增产物结合引发扩增，第三阶段退火温度为45.5℃，使通用引物与第一阶段扩增产物和第二阶段扩增产物模板结合引发扩增。通过设置反应体系中通用引物浓度为特异性嵌合引物的10倍，使整个PCR反应以通用引物为主导完成，避免各病原特异性引物间的扩增偏好性。PCR产物经QIAxcel毛细管凝胶电泳仪检测，使用预制胶卡夹免去繁琐制胶步骤，样品经虹吸作用自动上样，并进行分离与检测，检测分辨率可达3～5bp，12份样品最快只需3min，检测过程方便快捷。多重PCR反应三个阶段的退火温度分别为特异性引物退火温度58℃、特异性嵌合引物退火温度69.5℃和通用引物退火温度45.5℃，通过设置通用引物浓度和通用引物扩增阶段的反应循环数，使整个PCR反应以通用引物为主导完成，避免各病原的特异性引物间的扩增偏好性。本发明如此设计均是根据温度转换开关(Temperature Swithch PCR，TSP)原理所制定，因为不同的引物对会有不同的扩增偏好性，为解决这一问题，可以通过设置嵌合引物，使反应分阶段进行并以通用引物为主导(体现在通用引物浓度高，通用引物扩增阶段循环数多)完成扩增。如果只有嵌合引物，没有通用引物或通用引物浓度不高的话，并不能避免引物的扩增偏好性。

该反应特异性良好，多引物对单模板灵敏度检测极限在11～76copies/μl范围内，随质粒标准品拷贝数增加，反应体系容易出现非特异性的二聚体条带，但大小均在110bp左右，与最小的目的片段156bp可明显区分。多引物多模板灵敏度检测在20copies/μl时可检测到5种病原菌Ft，Rt，Cb，Lep和Bar，比同等条件下的琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度提高10倍，相比单模板检测灵敏度，Ot，Ap检测灵敏度下降，原因可能是多模板检测时多组引物间存在相互抑制与竞争。

本研究利用模拟样品对该体系进行初步验证，单病原感染灵敏度检测极限为：Ot10ng/μl，Rt 1ng/μl，Ap和Lep为10^-2ng/μl，Cb、Ft、Bar(Bh)为10^-4ng/μl。多病原感染灵敏度检测极限为：除Cb外其余病原检测灵敏度同单病原感染灵敏度一致，Cb检测灵敏度下降10倍，为10^-3ng/μl，原因可能是多模板检测时引物扩增时存在相互抑制与竞争等干扰。根据Bh分离培养法测得10^-4ng/μl的Bh对应菌落克隆数为6×10²，该灵敏度低于标准品灵敏度检测结果，分析原因可能是：1.质粒标准品与实际病原菌的检测存在一定差异，要引起一定关注；2.宿主鼠核酸对病原菌检测存在一定干扰；3.核酸提取时残留有PCR抑制因子，应选择手工法提取核酸或采用减少PCR抑致因子的提取方式。

据样品检测结果显示(表4)，常规PCR法、qPCR法和多重PCR法检出率分别为7％，24％和24％，其中多重PCR法和qPCR法检出率一致，说明两者检测能力相当，常规PCR法检出率低于后两者，说明常规PCR法检测能力低于多重PCR法和qPCR法。经方法一致性检验分析，多重PCR法和qPCR法在检测Bar方面，Kappa值为1，检测能力完全一致；在检测Lep方面，Kappa值为0.79，检测能力基本一致；不一致样品经常规PCR法检测证明：多重PCR法漏检一份Lep阳性样品，差异无统计学意义；在检测Ap方面只有多重PCR法检测到一份阳性，其它两种方法均未检测到，由于多重PCR法检测灵敏度高，暂定认为该样品为真阳性。

北京市86份野外鼠脾样品共检出阳性样品22份，均为单病原感染。其中，Bar、Lep和Ap感染率分别为21％，3％和1％，提示该地区存在潜在的Bar感染风险，要引起适当关注。

多病原感染宿主时，不同病原菌间会存在互作作用，体现在一种病原菌的侵染会增加或降低宿主对其它病原菌的易感性；另有研究发现啮齿动物中存在巴尔通体和立克次体的共感染、Ap和Cb的共感染、Lep、Ap和Ft的共感染等。因此，啮齿动物多病原感染的流行性特征及作用机理还需要更深入的研究，本研究所建立的同时检测7种病原的多重PCR法为多病原感染研究提供了良好的技术支持。

QIAxcel毛细管凝胶电泳系统结果判读时，该系统会将电泳峰图中超出基线阈值的信号检出为峰，每个检出峰都将被映射到相应的或相邻的参照Marker峰(已知峰值的大小与浓度)，从而确定该峰的大小与浓度。本研究的参照峰是根据25～500bp的SizeMarker，在体系的建立与样品检测过程中确保使用同一参照峰，保证判读标准一致性。在检测野外样品过程中，由于受宿主核酸干扰，容易产生很多小杂峰造成假阳性，通过适当提高阈值线使杂峰不被检测到，提高程度不超过最高信号值的5％。

本研究应用微生物数据分析云平台筛选病原体特异基因并设计引物，建立了同时检测7种鼠传病原体的多重PCR方法，通过对模拟样品和野外样品检测，说明该方法检测能力qPCR法相当，优于普通单重PCR法，主要优势为：1.检测灵敏度高，和qPCR法相当，均高于常规PCR法；2.检测速度快；3.操作简便，使用预制胶卡无需制胶，经虹吸作用自动上样；4.同时检测7种病原体。该方法实现在单管中灵敏、特异、快速自动化地检测7种鼠传病原菌，为鼠传疾病的快速诊断提供实验室支持，发展了鼠传多病原整合检测技术，为今后实现多种鼠传病原菌综合监测提供技术可行性。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对、试剂盒及其用途

<130> C1CNCN190275_IV190067

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggttgaaa tggtgcgaga t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaaggttt tatgcaatgg ac 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtgacagg gcaaggttat g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgataaatgg ctcggattgt tc 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggacgaatg tgctgctgg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acaccgtgct cccgatacc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttgggact gtggtactgg t 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattaggttt aagtatgcgt aggc 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggattggttc ccattccct 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgtttgatt cttggtgctt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtggcggagc aatatgtaat 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctttcaatc ttcagtgtct ggac 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaatgtatc ttcgctctac gg 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgcatcatca aacctcacac c 21

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttcttccgcc tgatt 15

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgttggcatt ctcgt 15

Claims

1.一种针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对，所述PCR引物对由针对恙虫病东方体的引物对、针对莫氏立克次体的引物对、针对嗜吞噬细胞无形体的引物对、针对土拉弗朗西斯菌的引物对、针对贝氏柯科斯体的引物对、针对问号钩端螺旋体的引物对和针对巴尔通体的引物对组成；

所述针对恙虫病东方体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

所述针对莫氏立克次体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；

所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；

所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示；

所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；

所述针对问号钩端螺旋体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示；

所述针对巴尔通体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

2.如权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于：

所述PCR引物对的每一对中的一条上游共价连接有相同的上游通用引物部分，形成上游嵌合引物；所述PCR引物对的每一对中的另一条上游共价连接有相同的下游通用引物部分，形成下游嵌合引物。

3.如权利要求2所述的PCR引物对，其特征在于：

所述上游通用引物部分的碱基序列如SEQ ID NO.15所示；所述下游通用引物部分的碱基序列如SEQ ID NO.16所示。

4.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一项所述的PCR引物对。

5.如权利要求1-3中任一项所述的PCR引物对在制备针对人鼠共患病病原微生物的检测制剂中的用途。

6.一种用于非诊断目的的人鼠共患病病原微生物的检测方法，所述方法包括如下步骤：

S1：提取待测样本的DNA，得到待测模板；

S2：使用如权利要求1-3中任一项所述的PCR引物对对所述待测模板进行PCR反应，得到PCR产物；

S3：对所述PCR产物进行表征，获得检测信息。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：

在所述步骤S2中，使用如权利要求1-3中任一项所述的PCR引物对、上游通用引物和下游通用引物进行PCR反应，其中，所述上游通用引物与所述上游通用引物部分或其5’部分相同；所述下游通用引物与所述下游通用引物部分或其5’部分相同；

所述PCR反应分三个阶段进行：

第一阶段：退火温度为55℃-62℃；

第二阶段：退火温度为66℃-72℃；

第三阶段：退火温度为43℃-49℃。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：

在所述步骤S2中，如权利要求1-3中任一项所述的PCR引物对中的任一条引物的浓度为30-60nmol/L。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：

在所述步骤S2中，所述上游通用引物的浓度350-450nmol/L；所述下游通用引物的浓度350-450nmol/L。

10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：

在所述步骤S2中，所述PCR反应的热循环为：

95℃5min；

95℃30s，55℃-59℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，66.5℃-71.5℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，43.5℃-48.5℃90s，72℃60s，循环20次；

72℃10min。

11.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：

在所述步骤S3中，所述表征是通过毛细管凝胶电泳检测所述PCR产物。

12.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：

在所述步骤S2中，所述针对恙虫病东方体的引物对中每一条的浓度为：50nmol/L；

所述针对巴尔通体的引物对中每一条的浓度为：60nmol/L。

13.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于：

所述上游通用引物的浓度400nmol/L；所述下游通用引物的浓度400nmol/L。

14.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于：

所述PCR反应的热循环为：

95℃5min；

95℃30s，58℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，69.5℃90s，72℃60s，循环10次；

95℃30s，45.5℃90s，72℃60s，循环20次；

72℃10min。