KR102417665B1 - 렙토스피라증 진단용 조성물 및 실시간 ｐｃｒ을 이용한 렙토스피라증 진단방법 - Google Patents

렙토스피라증 진단용 조성물 및 실시간 ｐｃｒ을 이용한 렙토스피라증 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 렙토스피라증 진단용 조성물 및 실시간 PCR을 이용한 렙토스피라증 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하는, 렙토스피라 균 검출용 조성물, 상기 검출용 조성물을 포함하는 렙토스피라증 진단용 키트 및 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 렙토스피라 균 검출용 조성물 및 이를 이용한 렙토스피라증 진단방법은 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으며, 기존 알려진 검출 방법에 비해 정확도 및 민감도가 우수하므로 실시간 PCR을 통한 간단한 방법으로 렙토스피라증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

렙토스피라증 진단용 조성물 및 실시간 ＰＣＲ을 이용한 렙토스피라증 진단방법{Composition for detecting Leptospirosis and method of diagnosing Leptospirosis using the same}
본 발명은 렙토스피라증 진단용 조성물 및 실시간 PCR을 이용한 렙토스피라증 진단방법에 관한 것이다.
렙토스피라증은 나선균의 일종인 렙토스피라 균의 감염으로 발병되는 사람과 동물의 공통 감염병의 하나로, 1887년 황달과 신질환을 동반한 급성 열성질환을 와일스병(Weil's disease)으로 명명하면서 감염성 질환으로 처음 소개되었다.
1918년 최초로 와일스병 환자로부터 원인균을 분리하여 스피로게타 익테로헤모레지아(Spirochaeta icterohaemorrhagiae)로 명명하였고, 후에 렙토스피라 익테로헤모레지아(Leptospira icterohaemorrhagiae)로 개칭되었다.
이러한 렙토스피라증에 대한 원인병원체로는 Leptospira interrogans, L. alstoni, L. kirschneri, L. noguchii, L. alexane ri, L. welii, L. borgpetersenii, L. santarosai, L. kmetyi, L. mayottensia 등 10종이 병원성 세균으로 알려져 있다.
Spirochaetales목에 속하는 Leptospira속은 L. interrogans와 L. biflexa의 2가지 종(species)으로 분류되며, L. interrogans는 병원성 렙토스피라가 속하며 240개 이상의 혈청형이 있고 23개의 혈청군으로 나뉘며 국내에는 serovar lai, yeonchon, hongchon, serovar canicola 등이 존재한다.
설치류와 소, 돼지, 개 등의 일부 가축이 감염원으로 감염된 동물들은 만성적으로 보균상태를 유지하면서 렙토스피라균을 소변으로 배설하여 흙, 진흙, 지하수, 개울, 논둑 물, 강물 등을 오염시키며, 사람과 동물은 오염된 소변에 직접 접촉하거나 오염된 물이나 환경에 간접적으로 노출되어 감염된다. 고위험군은 농부, 광부, 오수처리자, 낚시꾼, 군인, 동물과 접촉이 많은 직종 종사자 등 직업, 활동성 등으로 노출위험이 높은 성인 남자에서 호발되며, 홍수 후 벼세우기나 추수기 벼베기 작업과 관련하여 집단 발생 가능성이 있는 것으로 알려져 있다.
렙토스피라증의 임상증상으로는 가벼운 감기증상부터 치명적인 웨일씨 병(Weil’s desease)까지 다양하며, 무증상 감염증도 많고, 황달이 없는 경증환자가 현증감염의 90%이며, 황달이 나타나는 중증환자(웨일씨 병)는 5~10%로 발생한다.
또한 렙토스피라증은 유럽, 미주, 호주, 베트남, 태국, 말레이시아, 대만, 중국, 일본 등지에서 발생하는 것으로 알려져 있고, 우리나라도 1942년 혈청학적으로 증명된 렙토스피라증 환자의 발생이 보고되었으나, 이후 인체감염의 보고가 없었다가 1984년 처음으로 폐출혈 환자로부터 렙토스피라균이 분리되어 이 질환이 국내에 존재함이 확인되었다. 이후 국내에서는 쯔쯔가무시병, 신증후출혈열, 발진열과 함께 제3군 법정 전염병으로 지정되어 있다.
한편, 렙토스피라증을 진단하기 위해 현재 사용되고 있는 진단 방법으로는 회복기 혈청의 항체가가 급성기에 비하여 4배 이상 증가하는 현상을 검출하거나 현미경응집법으로 단일항체가가 1:800이상 여부를 분석하는 방법이 있으며, 혈청학적 검사로 급성기와 회복기에 2주 이상 기간을 두고 채혈한 혈청에서 수동혈구응집 법(Passive Hem Agglutination) 또는 현미경응집법 (microscopic agglutination test , MAT)으로 항체가가 4배 이상 증가 시 확인 진단하거나, 현미경 응집법으로 1:200 이상 항체가를 보이는 경우 추정진단이 가능하다.
그러나 항체가의 상승은 증상 발생 1-2주 후에 항체가가 상승하므로 초기진단은 어려운 문제점이 있으며, 종래 방법들로는 렙토스피라증을 정확하고 신속하게 진단하는 효과가 낮은 문제점이 있다.
그러므로 렙토스피라증을 신속하고 정확하면서도 편리하게 진단할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 10-0868560
따라서, 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하는, 렙토스피라 균 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 렙토스피라증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하는, 렙토스피라 균 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 렙토스피라 균은 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 렙토스피라 균 검출용 조성물을 포함하는, 렙토스피라증 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은, (1) 렙토스피라증이 의심되는 환자의 분리된 시료에서 핵산을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 제3항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)를 통해 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자를 확인하는 단계;를 포함하는, 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (1)의 시료는 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 소변일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR 증폭은 컨벤셔널 중합효소 연쇄반응(C-PCR:conventional PCR), 네스티드 중합효소 연쇄반응(N-PCR:nested PCR), 다중 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 및 역전사 중합효소연쇄반응으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 렙토스피라 균 검출용 조성물 및 이를 이용한 렙토스피라증 진단방법은 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으며, 기존 알려진 검출 방법에 비해 정확도 및 민감도가 우수하므로 실시간 PCR을 통한 간단한 방법으로 렙토스피라증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 다양한 혈청형의 L. interrogans 균주들에 존재하는 IS1500 유전자들의 assembly(A) 및 alignment(B) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 렙토스피라균의 검출효능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 렙토스피라증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 새로운 렙토스피라 균 검출용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 렙토스피라증의 발병 원인이 되는 렙토스피라 균의 감염에 대한 정확하고 신속한 진단 및 치료를 위해, 렙토스피라 균을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 방법을 연구하던 중, 렙토스피라 균에 멀티카피로 존재하는 검출용 타겟 유전자로서, 렙토스피라의 IS(insertion sequence) 1500 유전자를 렙토스피라 균 검출을 위한 새로운 타겟 마커로 사용할 수 있음을 확인하였고, 동정된 IS(insertion sequence) 1500 유전자에 특이적으로 결합하여 렙토스피라 균의 감염여부를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 발굴하였다.
한편 앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 렙토스피라증 진단을 위한 종래 방법은 MAT(microscopic agglutination test) 검사법을 이용하여 1주 간격으로 2회 이상 검사하여 항체역가가 4배 이상 증가되는 것을 확인하거나, 증상이 생긴 후 1주일 이내의 혈액, 4~10일 후의 뇌척수액, 또는 10일 이후의 소변에서 렙토스피라를 분리 배양하여 확인하는 방법이 있으나, 그러나 배양법은 결과를 얻기까지 수 주일이 필요하므로 진단에 따른 시간이 많이 소요되는 문제가 있어 조기 진단이 어려운 문제점이 있다. 또한, 신증후군 출혈열, 쯔쯔가무시증, 수막염, 뇌염, 간염 등의 다른 질환과 구별하여 진단할 수 있어야 한다.
이러한 점에서 본 발명은 렙토스피라증을 높은 민감도와 특이도로 간편하고 신속하게 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하며, 다른 질환과도 구별이 가능하여 종래 방법에 비해 보다 정확도가 우수한 새로운 렙토스피라증 진단방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 렙토스피라증의 감염 원인 균 중 하나인 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 내에서 멀티카피로 존재하는 유전자로서 8 카피 이상으로 존재하는 IS(insertion sequence) 1500 유전자를 선별하였고, IS(insertion sequence) 1500 유전자에 특이적으로 결합할 것으로 예상되는 다양한 염기서열로 구성된 프라이머 및 프로브들을 디자인 하였다. 각기 다른 염기서열로 구성된 많은 프라이머 및 프로브들 중에서 렙토스피라 균의 IS(insertion sequence) 1500에 대하여 민감도 및 특이도가 월등히 우수한 프라이머 및 프로브를 발굴하였으며, 발굴된 프라이머를 IS1500-290F 프라이머(5-GATTGCCACAACAGATTC-3; 서열번호 1) 및 IS1500-475R 프라이머(5-AATCGACCAACCCACTAC-3; 서열번호 2)로 명명하였고, 상기 프로브는 IS1500-anti-312P 프로브(5-AGTTCGGAGCAACCCGATTCCCA-3; 서열번호 3)로 명명하였다.
한편, 본 발명의 실험에 의하면, IS(insertion sequence) 1500 유전자 서열을 토대로 디자인한 많은 프라이머 및 프로브가 상기 유전자를 정확하게 증폭할 수 있는 것이 아님을 확인하였고, 서열번호 1~2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용할 경우에만 렙토스피라 균의 IS(insertion sequence) 1500 유전자를 특이적으로 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하는, 렙토스피라 균 검출용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
본 발명에서 상기 프라이머 및 프로브는 렙토스피라 균, 바람직하게는 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans)의 IS(insertion sequence) 1500 유전자에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 IS(insertion sequence) 1500 유전자는 서열번호 22로 이루어진 염기서열을 갖는다.
나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는 종래 개발된 렙토스피라 균 검출용 프라이머와 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 방법을 통해 검출능을 비교 분석하였는데, 종래 프라이머에 비해서도 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 경우가 더 우수한 민감도 및 특이도를 보인다는 것을 확인하였다.
뿐만 아니라, 본 발명의 일실시예에서는 렙토스피라균 검출을 위한 타겟 유전자로 알려진 Hap1 및 16s rRNA를 본 발명에서 발굴한 새로운 검출 타겟 유전자인 IS(insertion sequence) 1500와 검출 민감도 및 특이도를 비교하였는데, 그 결과, 본 발명의 방법은 100%의 특이도 및 92.3%의 민감도를 나타낸 반면, Hap1를 타겟 유전자로 한 경우의 민감도는 9.1%로 나타났고, 16s rRNA를 타겟 유전자로 한 경우의 민감도는 0%인 것으로 나타났다.
이를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 발굴한 멀티카피 유전자인 렙토스피라 균의 IS(insertion sequence) 1500를 타겟 유전자로 하고, 본 발명에서 발굴한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법을 수행할 경우, 종래 방법에 비해 렙토스피라 균의 검출을 월등히 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 서열번호 1 및 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용한 실시간 PCR을 통해 증폭한 증폭산물은 186bp의 크기를 갖는 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 IS(insertion sequence) 1500 유전자의 단편이다.
본 발명에 따른 상기 렙토스피라 균 검출용 조성물은 렙토스피라 균의 IS(insertion sequence) 1500 유전자를 특이적으로 높은 민감도 및 정확도로 검출할 수 있는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물로서, 분석하고자 하는 시료에 렙토스피라 균이 존재하는지의 여부를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 렙토스피라증의 진단을 위한 진단용 조성물로도 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하는, 렙토스피라증 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 검출용 또는 진단용 조성물은 상기에서 언급한 본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브 이외에 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용할 수 있는 성분, 예를 들면 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+ 이온, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1
Figure 112020122654512-pat00001
10 mM TrisHCl, 10
Figure 112020122654512-pat00002
40 mM KCl(pH9.0)을 사용할 수 있고, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한 상기 조성물은 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등을 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소 연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소 연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용 가능하다. 상기와 같은 건조 방법은 사용되는 효소의 종류 및 양에 따라 상이하게 적용될 수 있다.
상기 조성물은 한 반응 튜브 내에 혼합시킨 후 동결하거나 건조시켜 안정화된 상태로 제조하여 사용하게 됨으로써, 중합효소 연쇄반응 동안에 별도의 혼합과정이 필요하지 않으므로 반응 중 혼합으로 인한 오류를 방지 할 수 있으며, 안정성, 반응성 및 보관성을 향상 시킬 수 있다.
상기의 조성물은 프라이머 쌍 및 프로브를 제외한 나머지 성분인 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+ 이온, DNA 중합효소들이 이미 함유된 시중에 판매되는 제품을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는, 렙토스피라증 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 진단용 키트에는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하고 있어 렙토스피라증을 높은 정확도로 신속하게 조기에 진단할 수 있다.
상기 진단은 분석하고자 하는 검체 시료에 렙토스피라 균이 포함되어 있는지 여부를 판별하기 위해 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 사용할 수 있으며, 상기 중합효소연쇄반응은 일반적인 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 등을 포함한다. 본 발명의 일실시예에서는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
본 발명의 진단 키트는 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브 이외에도, 역전사효소, 중합효소, 중합효소연쇄반응을 위한 주형 DNA(template DNA)로서 상보적 DNA(cDNA), 및 버퍼 등의 반응 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 일반적인 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응 등에 사용될 수 있는데, 이 경우 분석하고자 하는 시료로부터 분리된 렙토스피라 균의 DNA 유전체를 대상으로 PCR 방법을 수행할 수 있고, 또는 렙토스피라균의 RNA 유전체로부터 역전사효소 (reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사 (reverse transcription) 반응을 별도로 수행하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 이를 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용할 수 있다.
중합효소연쇄반응의 결과물은 아가로즈 겔 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머쌍 및 프로브에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 렙토스피라증을 진단할 수 있다.
또한 본 발명에서는 렙토스피라 균의 IS(insertion sequence) 1500 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 3의 프로브(probe)를 사용하였는데, 상기 프로브는 각 말단에 형광물질 및 소광체(quencher)를 결합시켜 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 프로브의 5말단에는 형광물질이 결합되고 3말단에는 소광체가 결합된 것일 수 있으며, 프로브의 5말단 에는 적색, 녹색, 청색 등 특정 파장을 방출하는 형광물질이 결합되고 3말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합될 수 있다. 형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않는다. 반면, DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소의 exonuclease activity에 의해 결합되어 있던 형광물질이 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 중합효소연쇄반응이 진행되는 동안, 이러한 형광신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 증가한 형광신호를 바탕으로 바이러스 유전자 존재 유무를 판별할 수 있다. 이러한 프로브의 사용은 실시간 중합효소연쇄반응에 유용하게 사용될 수 있다.
나아가 본 발명은 렙토스피라증 감염 진단방법을 제공할 수 있으며, 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
바람직하게 상기 렙토스피라증 감염 진단을 위한 정보 제공 방법은, (1) 렙토스피라증이 의심되는 환자의 분리된 시료에서 핵산을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 진단 키트를 사용하여 실시간 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)를 통해 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자를 확인하는 단계;를 포함한다.
또한, 추가로 상기 시료에서 핵산으로 RNA를 분리할 경우, 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 주형으로 본 발명의 진단 키트를 사용하여 실시간 PCR 증폭을 수행할 수 있다.
상기 시료는 이에 제한되지는 않으나, 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 소변일 수 있다.
또한 상기 방법에서 렙토스피라균 IS 1500 유전자의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법을 통해 수행할 수 있다.
또한 본 발명의 방법에 있어서, 상기 렙토스피라증은 렙토스피라 균에 의해 감염되어 유발되는 질병을 지칭한다.
이상 본 발명에서 고안한 렙토스피라 균의 IS 1500 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍 및 서열번호 3의 프로브를 이용할 경우, 렙토스피라 균을 높은 민감도와 정확도로 신속하게 검출할 수 있다는 장점이 있으며, 하기 본 발명의 실시예를 통해 실제 렙토스피라증으로 진단받은 환자들의 시료 및 렙토스피라균으로 감염시킨 질병유발 마우스를 대상으로 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RCR 분석 결과, 90% 이상의 높은 민감도와 100%의 특이도로 진단이 가능함을 확인하였을 뿐만 아니라 매우 빠른 시간에 높은 정확도로 진단이 가능하다는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명에서 고안한 렙토스피라 균 검출용 조성물을 이용한 렙토스피라증 진단 방법 및 렙토스피라증 진단을 위한 정보 제공방법은 렙토스피라 균을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있으며, 실시간으로 렙토스피라 균의 검출이 가능하기에 약물 투여에 따른 증상의 개선정도를 모니터링 할 수 있고, 나아가 타질환과 렙토스피라증의 질병을 높은 특이도로 구별할 수 있어 보다 정확한 치료법의 선택에도 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
렙토스피라균 검출을 위한 타겟 유전자 선별 및 프라이머와 프로브 제작
본 발명자들은 종래 렙토스피라증 진단을 위해 사용되는 타겟 유전자로 알려진 rpoB 유전자, hap1 유전자, 16S rRNA가 아닌 진단의 민감도 및 정확도를 향상시킬 수 있는 새로운 타겟 유전자를 발굴하기 위해, 상기와 같은 단일 카피(single copy) 유전자가 아닌 멀티 카피(multicopy)로 렙토스피라균 특이적으로 존재하는 타겟 유전자를 발굴하기 위해, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 내에서 멀티 카피로 존재하는 유전자들을 찾아 분석하였다.
L. interrogans내에서 멀티 카피로 존재하는 유전자들을 스크리닝하던 중 L. interrogans 균주에 따라 삽입서열(IS: insertion sequence) 유전자가 적어도 8 copy이상 존재함을 확인할 수 있었다. 이에 L. interrogans의 IS1500 유전자를 타겟으로 서열을 분석하여 보존된 부위를 분석하였다. L. interrogans에 해당하는 균주들에 대한 IS1500 유전자 서열정보는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
L. interrogans의 IS1500 서열 정보
GenBank Accession no. sp. serovar strain
CP011410 L. interrogans Bratislava PigK151
KF648557 L. interrogans Canicola Gui44
AE016823 L. interrogans Copenhageni Fiocruz L1-130
CP012603 L. interrogans Hardjo Norma
CP013147 L. interrogans Hardjo-prajitno Hardjoprajitno
U13012 L. interrogans icterohaemorrhagiae 　
AE010300 L. interrogans Lai 56601
AE010301 L. interrogans Lai 56601
CP001221 L. interrogans Lai IPAV
CP001222 L. interrogans Lai IPAV
KJ586855 L. interrogans Lai 56601
CP006723 L. interrogans Linhai 56609
CP006724 L. interrogans Linhai 56609
CP006725 L. interrogans Linhai 56609
CP006726 L. interrogans Linhai 56609
CP011931 L. interrogans Manilae UP-MMC-NIID LP
CP011933 L. interrogans Manilae UP-MMC-NIID LP
CP011934 L. interrogans Manilae UP-MMC-NIID HP
U13013 L. interrogans pomona 　
또한, 다양한 혈청형의 L. interrogans 균주들에 존재하는 insertion sequence (IS) 유전자의 카피수를 분석한 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
다양한 혈청형의 L. interrogans 균주들에 존재하는 IS 유전자 카피수
L. interrogans IS1500
serovar Copenhageni 8 copies
serovar Lai 7 copy　
Strain RZll 11 copies
strain Verdun at least 8 copies
다양한 혈청형의 L. interrogans 균주들에 존재하는 IS 1500 유전자들의 조합(assembly) 및 alignment에 대한 분석결과는 도 1의 A 및 B에 각각 나타내었다. 다음으로, 본 발명자들은 L. interrogans의 IS 1500을 타겟유전자로 하여 이를 검출할 수 있는 특이적 프라이머 및 프로브들을 하기 표 3과 같이 디자인하였다.
렙토스피라균 검출을 위한 고안된 프라이머 및 프로브
No. Name 서열(5'->3') 길이 서열번호 산물크기(bp)
1 IS1500-290F GATTGCCACAACAGATTC 18 1 186
IS1500-475R AATCGACCAACCCACTAC 18 2
IS1500-anti-312P AGTTCGGAGCAACCCGATTCCCA 23 3
2 IS1500-QF CTTGCTCCGTAAATTGAA 18 4 171
IS1500-QR GTCTCGTTCAGGATTCTA 18 5
IS1500-QP CCGAAGCAACCGAACTAAGCC 21 6
3 lepto-IS1500_567F CAAGGAAAACAGGAGAAA 18 7 153
lepto-IS1500_719R CCCGAAAGAGRATCTTAA 18 8
lepto-IS1500_590P TCGGATTGCCACAACAGATTCTAA 24 9
4 lepto-IS1500_567F CAAGGAAAACAGGAGAAA 18 10 181
lepto-IS1500_747R GATCCAGTATTACACAAAGA 20 11
lepto-IS1500_590P TCGGATTGCCACAACAGATTCTAA 24 12
5 lepto-IS1500_567F CAAGGAAAACAGGAGAAA 18 13 192
lepto-IS1500_758R TCGAGAATAAAGATCCAG 18 14
lepto-IS1500_590P TCGGATTGCCACAACAGATTCTAA 24 15
6 IS1500-55F GTGTCTCGTTCAGGATTC 18 16 176
IS1500-230R GTTCTTGCTCCGTAAATTG 19 17
IS1500-anti-192P CCGAAGCAACCGAACTAAGCC 21 18
7 IS1500-459F AGTGGGTTGGTCGATTTCAA 20 19 99
IS1500-557R TGGATCCTCGATCCGAATGAA 21 20
IS1500-500P TGTGCACCGCTCTTTCCAAAGCA 23 21
<실시예 2>
렙토스피라균 검출을 위한 최적의 프라이머와 프로브 선별
상기 실시예 1에서 디자인한 표 3의 L. interrogans의 IS 1500 타겟 유전자를 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 대상으로 실시간 RT-PCR을 수행하여, 민감도 및 특이도 검사를 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 표 3의 프라이머 및 프로브들 중에서, 1번째(No.1)의 프라미어(서열번호 1 및 2) 및 프로브(서열번호 3)를 사용한 경우, 다른 프라이머 및 프로브를 사용한 군에 비해서 더 우수한 민감도 및 특이도를 나타내었다. 따라서 1번째(No.1)의 프라미어(서열번호 1 및 2) 및 프로브(서열번호 3)를 사용할 경우, 기존의 렙토스피라증 검출 및 진단을 위한 검사법보다 시간과 비용을 모두 절약할 수 있으며, 검출 효과가 우수함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명의 프라이머 및 프로브에 대한 렙토스피라균 검출의 민감도 및 특이도 분석
본 발명자들은 본 발명에서 고안한 렙토스피라균 검출 또는 진단용 프라이머와 프로브(상기 표 1의 서열번호 1~3)를 종래 렙토스피라증 진단을 위한 프라이머 및 진단방법과 비교하여 민감도 및 특이도 우수성에 대한 분석을 수행하였다.
이를 위해, 검출방법에 대한 실험군 분류는 하기 표 4와 같다. 또한, 하기 표 4에서 Lipl32 (hap1) C-PCR 은 FEMS Microbiol Lett. 2005 Feb15;243(2):437-45 문헌(Polymerase Chain Reaction Assay Specific for Pathogenic Leptospira Based on the Gene hap1 Encoding the Hemolysis-Associated protein-1)에 기재된 방법으로 수행하였고, 16s C-PCR은 in Clinical Samples. J Clin Microbiol. 1992 Sep; 30(9): 2219-2224. 문헌(Polymerase Chain Reaction for Detection of Leptospira spp.)에 기재된 방법으로 수행하였으며, IS1500을 타겟 유전자로 하고 본 발명의 프라이머 세트와 프로브를 이용한 IS1500 real time PCR은 95℃에서 5분 동안 열변성시키고, 95℃에서 5초 반응시킨 다음, 55℃에서 5초간 어닐링 반응을 수행하고, 형광값을 수득하는 과정을 45 사이클 반복 수행하였으며, 이후 25℃에서 반응을 종료시켰다.
PCR 타겟 유전자 프라이머 또는 프로브
Lipl32 (hap1)
C-PCR
수행		 Lipl32 (hemolysis-associated protein-1 (Hap1)) Adia 217F 프라이머(서열번호 24)
5‘-CCGTGATTTTCCTAACTAAGG-3’
Adia 218R(서열번호 25)
5‘-CAGATTACTTAGTCGCGTCAGA-3’
16s C-
PCR
수행		 16s rRNA Lepto A(서열번호 26)
5‘-GGCGGCGCGTCTTAAACATG-3’
Lepto B(서열번호 27)
5‘-TTCCCCCCATTGAGCAAGATT-3’
IS1500 real time
PCR 수행
(본 발명의 방법)		 IS1500 IS1500-290F(본 발명의 서열번호 1)
IS1500-475R(본 발명의 서열번호 2)
IS1500-anti-312P
(본 발명의 서열번호 3)
또한 시료로는 Leptospira interrogans 균을 감염시켜 렙토스피라증이 발병된 마우스의 혈액 및 렙토스피라증으로 진단받은 환자 유래의 혈액을 각각 사용하였다.
이들 시료는 민감도 확인을 위해 사용되었다.
또한, 특이도 확인을 위한 검체로 표준균주 및 L. interrogans 이외의 다른 균으로 각각 감염시킨 마우스 유래의 혈액, 신장 조직, SPF(Specific pathogen free) 마우스 조직을 사용하였다. 또한 타질환으로 확인된 환자로부터 분리된 검체 시료를 사용하여 분석을 진행하였다.
또한, 본 발명의 실험에서 사용된 감염동물 모델은 하기 표 5에 기재된 바와 같다.
감염동물 모델 목록
L. interrogans injected Rat
Serovar Organ
Australis_R1 Blood
Australis_R2 Blood
hebdomadis_R1 Blood
Icterohaemorrhagiae_R1 Blood
Icterohaemorrhagiae_R2 Blood
Canicola_R1 Blood
Canicola_R2 Blood
Lai_R1 Blood
Lai_R2 Blood
Ictero/Copenhageni_R1 Blood
Ictero/Copenhageni_R2 Blood
Hardjo_R1 Blood
Hardjo_R2 Blood
<3-1> 동물모델을 이용한 렙토스피라균 검출의 민감도 및 특이도 분석
상기 기술한 Leptospira sp. 및 L. interrogans 균으로 감염된 마우스로부터 혈액 및 신장조직을 각각 수득한 후, 상기 시료를 대상으로 상기 표 4의 각 방법을 통해 렙토스피라균 검출의 민감도 및 특이도를 분석하였다.
동물모델에서의 특이도 분석결과
Leptospira 감염동물모델 결과 전체
양성 음성
Leptospira specific IS1500 Real-time PCR 양성 12 0 12
음성 1 18 19
전체 13 18 31
동물모델에서의 민감도 분석결과
민감도 비교 Lipl32(hap1)
C-PCR		 16s rRNA
C-PCR		 IS1500
Real-time PCR
Positive No. 1 0 12
Total No. 11 13 13
Sensitivity (%) 9.1% 0% 92.3%
그 결과, 상기 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 발굴한 IS1500 유전자를 타겟으로 하고 서열번호 1~3의 프라이머 및 프로브를 이용한 real time RT-PCR 분석에 대한 민감도(진단의 Ct cutoff value < 38) 가 92.3% (12/13) [95% CI: 62-99.5%]로 나타났고, 특이도는 100% (18/18) [95% CI: 78.1-100%]로 나타났다.
이러한 결과는 기존의 다른 Conventional PCR(9.1%(Lipl32), 0%(16s)) 보다 본 발명의 방법이 더 우수한 민감도를 나타냄을 알 수 있었다.
<3-2> 렙토스리파증 환자로부터 분리된 검체를 이용한 민감도 및 특이도 분석
렙토스피라증으로 진단 받은 환자의 혈액, 소변, 가래 검체를 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 분석을 통해 렙토스피라증 진단에 대한 민감도 및 특이도를 분석하였다.
렙토스피라증 환자의 혈액, 소변, 가래 검체를 이용한 실시간 PCR 확인 결과
성명 날짜 Lab No. specimen IS1500
real time PCR 수행에 따른 ct값
(본 발명의 방법수행)
강정O 2019-10-14 2019-697 WB(전혈) 36.55
강정O 2019-10-16 2019-701 WB 35.31
이승O 2018-07-30 2018-780 plasma(혈장) 31.67
한인O 2020-07-27 2020-596 WB 34.7
한인O 2020-07-27 2020-596 Sputum(가래) 35.59
이삼O 2007-08-10 2007-109 Urine(소변) 32.95
박점O 2020-08-25 2020-670 WB 31.22
박귀O 2020-09-14 2020-704 WB 35.04
이명O 2020-10-21 2020-971 WB 37.09
이명O 2020-10-21 2020-971 Urine 31.11
cf> UD : undetected
그 결과, 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브를 이용하여 실제 렙토스피라증 환자 유래의 검체들을 대상으로 L. interrogans의 IS 1500 타겟 유전자를 검출할 수 있는지 실시간 PCR 방법을 수행한 결과, 실제 각 시료들로부터 타겟 유전자인 L. interrogans의 IS 1500 유전자가 검출됨을 확인할 수 있었다.
또한 타질환으로 진단된 환자로부터 수득한 검체를 대상으로 본 발명의 방법을 적용한 결과, 하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 타질환 및 건강한 환자의 검체에서는 L. interrogans의 IS 1500 타겟 유전자가 검출되지 않아 100% 특이도를 나타낸다는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.
타질환 및 건강검진 환자를 대상으로 한 특이도 검사 결과
0 Sample 진단 IS1500 Q-PCR
1 2016-201 Orientia tsutsugamushi Undetermined
2 2016-202 O. tsutsugamushi Undetermined
3 2016-211 O. tsutsugamushi Undetermined
4 2016-214 O. tsutsugamushi Undetermined
5 2016-216 O. tsutsugamushi Undetermined
6 2016-228 O. tsutsugamushi Undetermined
7 2016-355 O. tsutsugamushi Undetermined
8 2017-1054 O. tsutsugamushi Undetermined
9 2017-1057 O. tsutsugamushi Undetermined
10 2017-1058 O. tsutsugamushi Undetermined
11 2017-1062 O. tsutsugamushi Undetermined
12 2017-651 Salmonella gastroenteritis Undetermined
13 2017-1381 Cholangitis (담광염) Undetermined
14 2017-1383 Pneumonia (폐렴) Undetermined
15 2017-1389 Pneumonia (폐렴) Undetermined
16 2017-1355 Pneumonia (폐렴) Undetermined
17 2017-1380 Bronchitis (기관지염) Undetermined
18 2017-487 Bacteremia Undetermined
19 2017-567 Bacteremia Undetermined
20 2017-605 Bacteremia Undetermined
21 2017-610 Bacteremia Undetermined
22 2017-635 Bacteremia Undetermined
23 2017-714 Abscess Undetermined
24 2017-1386 Bacteremia Undetermined
25 2017-600 AIDS Undetermined
26 2017-683 Syphilis Undetermined
27 2015-011 건강검진환자 Undetermined
28 2015-012 건강검진환자 Undetermined
29 2015-013 건강검진환자 Undetermined
30 2015-014 건강검진환자 Undetermined
31 2015-015 건강검진환자 Undetermined
32 2015-016 건강검진환자 Undetermined
33 2015-017 건강검진환자 Undetermined
이상의 결과를 통해, 렙토스피라증의 원인균인 L. interrogans의 IS 1500 유전자를 검출 타겟 유전자로 사용하면서 상기 타겟 유전자를 높은 민감도와 특이도로 검출 및 증폭시킬 수 있는 본 발명에서 고안된 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행할 경우, 종래 검출 또는 진단방법에 비해 렙토스피라증을 정확하고 신속하게 우수한 정확도 및 민감도로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chosun University <120> Composition for detecting Leptospirosis and method of diagnosing Leptospirosis using the same <130> NPDC89389 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-290F primer <400> 1 gattgccaca acagattc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-475R primer <400> 2 aatcgaccaa cccactac 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-anti-312P probe <400> 3 agttcggagc aacccgattc cca 23 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-QF primer <400> 4 cttgctccgt aaattgaa 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-QR primer <400> 5 gtctcgttca ggattcta 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-QP probe <400> 6 ccgaagcaac cgaactaagc c 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_567F primer <400> 7 caaggaaaac aggagaaa 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_719R primer <400> 8 cccgaaagag ratcttaa 18 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_590P probe <400> 9 tcggattgcc acaacagatt ctaa 24 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_567F primer <400> 10 caaggaaaac aggagaaa 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_747R primer <400> 11 gatccagtat tacacaaaga 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_590P probe <400> 12 tcggattgcc acaacagatt ctaa 24 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_567F primer <400> 13 caaggaaaac aggagaaa 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_758R primer <400> 14 tcgagaataa agatccag 18 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lepto-IS1500_590P probe <400> 15 tcggattgcc acaacagatt ctaa 24 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-55F primer <400> 16 gtgtctcgtt caggattc 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-230R primer <400> 17 gttcttgctc cgtaaattg 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-anti-192P probe <400> 18 ccgaagcaac cgaactaagc c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-459F primer <400> 19 agtgggttgg tcgatttcaa 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-557R primer <400> 20 tggatcctcg atccgaatga a 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IS1500-500P probe <400> 21 tgtgcaccgc tctttccaaa gca 23 <210> 22 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. interrogans IS 1500 gene sequence <400> 22 atggaaactc atcgatttga gtattcgatt caaagcatgg ctaacgtttt aggagtgtct 60 cgttcaggat tctatcaatt tctaaaacgg agtaaaaacg aattagaaaa atataatcct 120 gaacttgtcg agttcattcg ggaaacgtgg ctaacaagcc gtaagaatta cggcttagtt 180 cggttgcttc gggaagtgaa gaaagtgtat tcaatttacg gagcaagaac ggttcgaaaa 240 gtgatgaaac tttgtgaaat tcaaggaaaa caggagaaac gttttcggat tgccacaaca 300 gattctaatc atgggaatcg ggttgctccg aacttagttc aacggaattt caaaccgaat 360 cagaagaatc ggatctgggt ttcagatatt acttttttaa gatcctcttt cgggtggatt 420 tatctttgtg taatactgga tctttattct cgaaaagtag tgggttggtc gatttcaaat 480 tctaatgatt ctaagttagt gtgcaccgct ctttccaaag caatcgaatg tagaaatcct 540 cctaagggtt tagtttttca ttcggatcga ggatccaatt attgttcgta cgaaactcga 600 aggtatctgt taaataataa actaagaagg agtaatagta gaaagggaaa ttgttgggac 660 aacgcagtcg ctgagtcctt ctttggttct ctgaaaagag aaatggaata taattacttt 720 tataaaattc aagaagccga agaattactt tttgatcata tagaggttta ttataataga 780 cacagatctc attcgtcatt agactttgtg agtcctgtgc aatttgaagt aaatgctgcg 840 taa 843 <210> 23 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR product <400> 23 gattgccaca acagattcta atcatgggaa tcgggttgct ccgaacttag ttcaacggaa 60 tttcaaaccg aatcagaaga atcggatctg ggtttcagat attacttttt taagatcctc 120 tttcgggtgg atttatcttt gtgtaatact ggatctttat tctcgaaaag tagtgggttg 180 gtcgatt 187 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adia 217F primer <400> 24 ccgtgatttt cctaactaag g 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adia 218R primer <400> 25 cagattactt agtcgcgtca ga 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lepto A primer <400> 26 ggcggcgcgt cttaaacatg 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lepto B primer <400> 27 ttccccccat tgagcaagat t 21

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;를 포함하는, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍; 및 서열번호 3의 프로브;는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 검출용 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 감염에 의한 렙토스피라증 진단용 키트.
  5. (1) 렙토스피라증이 의심되는 환자의 분리된 시료에서 핵산을 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 제4항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)를 통해 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자를 확인하는 단계;를 포함하는,
    렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 감염에 의한 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 (1)의 시료는 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 감염에 의한 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) IS 1500 유전자는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 감염에 의한 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 PCR 증폭은 컨벤셔널 중합효소 연쇄반응(C-PCR:conventional PCR), 네스티드 중합효소 연쇄반응(N-PCR:nested PCR), 다중 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 및 역전사 중합효소연쇄반응으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 렙토스피라 인테로간스(L. interrogans) 감염에 의한 렙토스피라증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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