KR100544069B1 - 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용프라이머 - Google Patents

리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균을 동시 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 GroEL 단백질을 코딩하는 groEL 유전자를 표적으로 한 멀티플렉스 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia 균을 동시에 검출할 수 있다.
리케챠, 쭈쭈가무시, 렙토스피라, 검출, 열성질환, DNA 칩, 프라이머

Description

리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머{Primer for Detecting Rickettsia, Leptospira and Orientia tsutsugamushi}
도 1은 본 발명에 따른 6개의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 전기영동을 한 결과를 나타낸 사진으로, (A)는 오리엔티아(Orientia) 5개 균주인 O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong와 리케챠(Rickettsia) 6개 균주인 R. typhi Wilmington, R. prowazeki Breinl, R. akari MK, R. japonica YH, R. conorii Indian Tick Typhus, R. sibirica 246와 렙토스피라(Leptospira)의 4개 균주인 L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98 및 L. interrogans 102에 대해 프라이머 TF-TR, SF-SR 및 LF-LR를 동시에 멀티플렉스 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1은 O. tsutsugamushi Karp, 2는 O. tsutsugamushi Kato, 3은 O. tsutsugamushi Kawasaki, 4는 O. tsutsugamushi Gilliam, 5는 O. tsutsugamushi Boryong, 6은 R. typhi Wilmington, 7은 R. prowazeki Breinl, 8은 R. akari MK, 9는 R. japonica YH, 10은 R. conorii Indian Tick Typhus, 11은 R. sibirica 246, 12는 L. interrogans 2, 13은 L. interrogans 23, 14는 L. interrogans 98, 15는 L. interrogans 102를 나타낸다.
(B)는 리케챠 균주인 R. typhi Wilmington, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100, Leptospira 6개 균주인 L. interrogans Lai, L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans M06, L. interrogans M07 및 L. interrogans 130), 대조 균주로서 C. burnettii, E. sennetsu Japan, B. burgdorferi B31및 B. hermsii HS1에 대해 프라이머 TF-TR, SF-SR 및 LF-LR를 동시에 멀티플렉스 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1은 O. tsutsugamushi Karp, 2는 R. typhi Wilmington, 3은 R. typhi 87-91, 4는 R. typhi 87-100, 5는 R. conorii Indian Tick Typhus, 6은 L. interrogans Lai, 7은 L. interrogans KK1, 8은 L. interrogans KK2, 9는 L. interrogans M06, 10은 L. interrogans M07, 11은 L. interrogans 130, 12는 C. burnetii Henzerling, 13은 E. sennetsu Miyayama, 14는 B. burgdorferi B31, 15는 B. hermsii HS1을 나타낸다.
발명의 분야
본 발명은 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균을 동시 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출 용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방법에 관한 것이다.
발명의 배경
우리나라는 가을에 열성 전염병이 많이 발생한다. 이러한 열성 전염병 대부분은 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia 에 의해 발생한다.
리케챠는 이, 벼룩, 진드기(louse, mite, tick) 등의 절지동물(Arthropod)에서 살고 있다가 우발적으로 사람에게 전파되어 리케챠 질환을 일으킨다. 리케챠 질환은 작은 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포(endothelial cell)에서 증식하면서 혈관염을 일으킨다. 증상은 열이 나고 두통이 있으며 특징적인 피부발진을 동반한다.
리케챠는 크게 세 가지 군으로 나누어지는데, 유행성 발진티푸스(epidemic typus)를 일으키는 R. prowazekii, 뮤린 티푸스(murine typus: 발진열)를 일으키는 R. typhi가 포함된 티푸스 그룹, 약 20개의 균종이 포함된 반점열 그룹(Spotted fever group) 및 쭈쭈가무시병을 일으키는 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group)이다. Rickettsia는 6개의 질환이 지난 12년 동안 발생했을 정도로 지금도 새로운 질환 (균종)이 발생되고 있다.
렙토스피라 병은 나선균의 일종인 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)의 감염으로 발병되는 사람과 동물의 공통 감염병의 하나로 1887년 황달과 신질환을 동반한 급성 열성질환을 와일스 병(Well's disease)으로 명명하면서 감염성 질환으로 처음 소개되었다.
1918년 최초로 와일스병 환자로부터 원인균을 분리하여 스피로케타 익테로헤모레지아(Spirochaeta icterohaemorrhagiae)로 명명하였고, 후에 렙토스피라 익테로헤모레지아(Leptospira icterohaemorr hagiae)로 개칭되었다. 분류학상, 렙토스피라(Leptospira)는 렙토스피라세어(Leptospiraceae) 과에 속하며, 렙토스피라 속은 병원성 유무에 따라 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)와 렙토스피라 비프렉사(Leptospira biflexa)로 분류된다. 병원성이 있는 렙토스피라 인테로간스는 현재까지 19개의 혈청군으로 분류되어, 약 180여개의 혈청형(serovar)을 포함하고 있는 것으로 알려졌으며, 이들은 지역에 따라 혈청형 분포가 다른 것으로 알려져 있다.
와일즈병의 전형적인 임상증상 특징은 발병 초기에 발열, 두통, 근육통, 허탈감 등의 급성 열성질환이고, 심한 경우에는 내부 장기 출혈, 황달, 신부전증의 증세까지 유발된다. 렙토스피라 병의 역학적 특징은 감염된 동물(들쥐, 소, 말, 돼지 등)이나 보균자의 소변을 통해 배설된 균이 토양이나 물에서 생존하다가 사람의 상처난 피부, 코 및 입 등의 점막을 통해 침입하여 감염시키므로 주로 농부, 도살장 종사자, 야외 훈련하는 군인 등이 환자로 발견되며, 특히 홍수 발생 후는 배설물이 광범위한 지역을 오염시키므로 환자 발생이 증가한다.
이 질환은 유럽, 미주, 호주, 월남, 태국, 말레이시아, 대만, 중공, 일본 등지에서 발생하는 것으로 알려져 있고, 우리나라에서도 1942년 혈청학적으로 증명된 렙토스피라 병 환자가 보고되었으나, 이후 인체감염의 보고가 없었다가 1984년 처음으로 폐출혈 환자로부터 렙토스피라 균이 분리되어 이 질환이 국내에도 존재함이 확인되었다. 이후 국내에서는 쭈쭈가무시병, 신증후군 출혈열과 함께 3대 농춘 질환으로 알려져 있다.
이 질환의 진단은 환자의 혈액, 뇌척수막액 및 소변에서 균을 직접 분리 동정하거나, 혈청내 항체를 검출함으로써 이루어지는데, 이중 혈청학적 검사로는 슬라이드 응집반응, 보체결합반응, 수동적혈구 응집반응, 용혈반응, 라텍스 응집반응이 이용되고 있다. 가장 감수성이 높은 혈청형에 특이성을 나타내기 때문에 표준 방법으로 추천되고 있는 혈청학적 검사방법은 현미경 응집반응 검사이다.
그러나, 균의 분리 및 동정이나 현미경 응집반응 검사는 경험이 있는 실험실에서나 시행이 가능하고, 보체 결합 반응이나 용혈반응은 실험의 표준화 및 시행할 때 실제적으로 어려움이 많은 단점이 있다.
쭈쭈가무시 병은 리케챠 속의 스크럽 티푸스(Scrub typhus) 군에 속하는 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi)에 의한 것으로, 매개체인 털진드기의 유충이 사람의 조직액을 흡입할 때 구강 부위에 존재하던 균체가 사람에 직접 감염되어 발병하게 된다. 그 증상은 잠복기 이후의 갑작스런 발열과 심한 두통, 구진, 발적 및 점상 출혈 등의 소견을 특징으로 한다.
쭈쭈가무시 병은 전세계적으로 발생하며, 특히 말레이지아, 태국, 필리핀 등을 포함하여 중국, 일본 및 호주에서 빈발하고 있는데(Traub, R. & Wisserman, C.L., J. Med. Entem., 11:237, 1974; Rapmund, G. et al., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 63:251, 1969; Shirai, A. & Wisserman, C.L., Amer. J. Trop. Med. Hyg., 24:145, 1975; Shirai, A. et al., Jap. J. Med. Sci. Biol., 33: 231, 1980), 국내에서는 농촌 지방에서 괴질이라 불리어온 병에 걸린 환자 중 다수가 쭈쭈가무시병 환자임이 알려지게 되었다 (Chang, W.H. et al., 대한미생물학회지, 24: 399-409, 1989). 쭈쭈가무시 병은 주로 가을철에 발생하는데 이는 주로 매개충인 털진드기 유충(chigger)의 밀도와 관련된 것으로, 우리 나라에서도 렙토트롬비디움 팔리둠 (Leptotrombidium pallidum)의 유충이 많이 출현하는 10~11월에 남한의 전지역에 걸쳐서 많이 발생하고 있다 (J. Korean Med. Sci., 31: 601, 1988).
현재 쭈쭈가무시 병의 진단은 환자의 혈액으로부터 오리엔티아 쭈쭈가무시 (Orientia tsutsugamushi)를 분리하여 확인하는 방법, 환자의 혈청 내에서 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi)에 대한 항체를 검출하는 방법 및 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 환자의 혈액 내에서 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi)의 DNA를 증폭하여 검사하는 방법이 있다. 이 중에서 균체를 배양하여 질병을 진단하는 방법은, 배양에 필요한 시간이 4 주 이상 요구되므로 실제 환자의 진단 목적으로는 합당하지 못하고, 현재 쭈쭈가무시병의 진단에는 와일-펠릭스(Weil-Felix)법, 보체 결합 반응법, 간접 면역 형광 항체법, 면역 효소 측정법 및 면역 부착 적혈구 응집법 등의 혈청학적 방법이 쓰이고 있다.
그러나, 이들 혈청학적 방법 중에서 와일-펠릭스(Weil-Felix) 법은 쭈쭈가무시병 뿐 아니라 렙토스피라 병, 변형균의 요도 감염 및 기타 열성 질환에서도 가양성 반응이 높게 나타나며 감수성이 매우 낮기 때문에 현재 쭈쭈가무시병의 진단 자체에는 사용되고 있지 않다. 또한, 보체 결합 반응은 검사 방법이 기술적인 면에서 매우 까다롭다는 단점이 있으며, 재현성이 낮을 뿐만 아니라, 정제된 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi) 항원을 필요로 하고, 항체 역가가 낮은 경우에는 음성 반응이 많아 쭈쭈가무시병 진단에 널리 사용되고 있지 못하다.
따라서, 현재는 간접 면역 형광 항체법 및 면역 효소 측정법이 가장 널리 사용되고 있는데, 이 두 가지 방법은 감수성과 특이도가 높으며 IgG와 IgM을 감별하여 측정할 수 있으므로 초기감염과 재감염을 구별할 수 있다는 장점이 있어 현재 WHO에서도 우선적으로 추천되고 있는 방법이다. 반면, 간접 면역 형광 항체법 검사는 필요한 항원을 얻기 위하여 조직 배양이나 계란 부화 등을 할 수 있는 시설이 요구되며 형광 현미경을 갖춘 검사실에서만 검사를 할 수 있다는 단점을 지니고 있으며, 면역 효소 측정법은 혈청을 1:10 또는 1:20 정도로 낮게 희석할 경우 가양성 반응이 나타난다는 단점이 있다. 또한, 이와 같은 혈청학적 진단에 사용되는 방법은 모두가 다량의 항원을 필요로 하고 있으나, 균을 배양하여 검사에 필요한 항원을 얻기 위해서는 세포 배양을 실시해야 한다는 어려운 점이 있다.
Rickettsia, Leptospira 및 Orientia 세 가지 균은 간접 면역형광 분석(Indirect Immunoflurorescence Assay: IFA)을 이용하여 진단하고 있다. 그러나 이 방법은 배양이 쉽고, 빨리 자라는 균들에게는 어느 정도 유용하나, Rickettsia, Leptospira 및 Orientia 같이 배양도 어렵고 매우 느리게 자라는 균들은 검사하기가 쉽지 않아, 실제로 국립보건원과 일부 병원에서 이 질환들의 검사를 시행하고 있을 뿐이다. 또한 이 방법은 일부 박테리아들과 교차반응을 일으킨다. 즉, 지금까지 다른 감염병으로 잘못 진달될 가능성이 높다. 특히, 이 세 가지 균은 그 초기 임상증상과 발생시기, 발생장소 등이 유사하여 서로 오진될 가능성이 매우 높다.
이러한 단점을 보완하기 위해 각각의 균에 대해서 특이적인 유전학적 방법들이 많이 개발되었다. 그러나 이러한 방법들은 주로 각각의 세균에만 존재하는 유전자를 이용하므로, 우리나라와 같이 비슷한 시기에 비슷한 증상을 일으키는 세 균을 동시에 검출할 수 없다. 따라서, 세 균이 모두 갖고 있는 유전자를 사용하는 방법이 유용하다. 가장 많이 표준으로 사용되고 있는 16S rRNA를 생각할 수 있지만 염기서열이 너무 유사해 구분할 수 있는 검출법 개발이 사실상 불가능하다.
이에, 본 발명자들은 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia의 새로운 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 표준균주의 groEL 유전자 일부 분절의 특이 염기서열을 토대로 착안된 프라이머들을 동시에 사용할 경우, 검체내의 주형 DNA 종류(Rickettsia, Leptospira 또는 Orientia)에 따라 각기 다른 크기의 groEL DNA 분절이 단일 밴드로 증폭되고, 증폭된 PCR 산물의 크기에 의해 상기 3가지 균의 검출이 가능하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 비슷한 시기에 비슷한 증상을 일으키는 세 균(Rickettsia, Leptospira 및 Orientia)을 동시에 검출할 수 있는 프라이머를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 함유하는 네스티드 PCR 키트 및 상기 프라이머를 이용한 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방 법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열 1 내지 서열 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 필수적으로 함유하는 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머를 함유하는 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 멀티플렉스 PCR 키트를 제공한다.
삭제
본 발명은 또한, 서열 1 내지 서열 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 DNA을 제공한다.
삭제
본 발명에 있어서, 리케챠 균주는 Rickettsia typhi, R. prowazeki, R. akari, R. japonica, R. conorii 및 R. sibirica로 구성되는 군에서 선택되고, 렙토스피라 균주는 Leptospira interrogans이며, 쭈쭈가무시 균주는 Orientia tsutsugamushi인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 GroEL 단백질이 샤페론으로써 모든 생물체에서 보존되어 있고, 세포 및 박테리아의 생존에 절대 필요하며, 특히 스트레스에 저항하는 단백질로 알려져 있어 리케챠 균주들의 진화를 잘 반영할 수 있으리라 판단되는 groEL 유전자를 중합효소 연쇄반응의 표적으로 선택하였다.
groEL 유전자는 STG 균주에도 존재해 TG와 SFG의 리케챠 균주들과 잘 구분되고 있다. 그리고 16S rRNA 유전자 시퀀스 동일성(sequence similarity)과 비교해 보았을 때, groEL 유전자의 다양성이 더 크다.
본 발명에서는 열성 전염병의 원인인 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia의 검출을 보다 쉽고 정확하게 하기 위해 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi), 렙토스피라(Leptospira) 및 리케챠(Rickettsia) 균주 각각의 프라이머로 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
또한, 본 발명의 DNA 칩을 이용하여 임상샘플의 상기 세 가지 균주 감염여부를 확인하기 위하여 서열 1 내지 서열 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 또는 상기 올리고뉴클레오티드가 집적되어 있는 DNA 칩과 임상샘플로부터 추출한 DNA를 하 이브리다이제이션 시켜 형광을 측정하는 등 공지의 검출방법으로 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시병을 동시에 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 멀티플렉스 PCR을 통한 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 검출을 예시하였으나, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 DNA 칩을 이용하여 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균을 검출하는 것은 당업자에게 있어 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 검체 균주의 준비
본 발명에서는 오리엔티아 쭈쭈가무시(O. tsutsugamushi) 균주로, O. tsutsugamushi Karp (ATCC VR-150), O. tsutsugamushi Kato (ATCC VR-609), O. tsutsugamushi Kawasaki (National Institute of Infectious Diseases, Japan), O. tsutsugamushi Gilliam (국립보건원) 및 O. tsutsugamushi Boryong (국립보건원)의 5개 균주를 사용하였고, 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans) 균주로, L. interrogans KK1 (건국대학교 의과대학 미생물학교실), L. interrogans KK2 (건국대학교 의과대학 미생물학교실), L. interrogans Lai (건국대학교 의과대학 미생물학교실), L. interrogans M06 (건국대학교 의과대학 미생물학교실), L. interrogans M07 (건국대학교 의과대학 미생물학교실), L. interrogans 2 (CDC), L. interrogans 23 (CDC), L. interrogans 98 (네덜란드), L. interrogans 102 (국립보건원 분리주) 및 L. interrogans 130 (국립보건원 분리주)의 10개 균주를 사용하였으며, 리케챠 균주로는 R. typhi Wilmington (ATCC VR-144), R. typhi 87-91 (한림대학교 의과대학 미생물학교실), R. typhi 87-100 (한림대학교 의과대학 미생물학교실), R. prowazeki Breinl (ATCC VR-142), R. akari MK (ATCC VR-148), R. japonica YH (ATCC VR-1363), R. conorii Indian Tick Typhus (ATCC VR-597) 및 R. sibirica 246 (ATCC VR-151)를 사용하였다.
대조균주로는 C. burnettii (ATCC VR-145), E. sennetsu Japan (ATCC VR-367), B. burgdorferi B31 (ATCC 35210) 및 B. hermsii HS1 (Yanagihara Y, University of Shizuoka, Japan)을 사용하였다.
실시예 2: 멀티플렉스 PCR의 수행
상기 실시예 1에서 준비된 균주들에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열 1 내지 6의 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
서열 1: 5′-TTGCTGATGATGTAGACGGA-3′ (TF)
서열 2: 5′-GTTCCTAACTTAGATGTATCAT-3′ (TR)
서열 3: 5′-TTATCAAATTTACAACCGATGTT-3′(SF)
서열 4: 5′-CAGCTATTTGAGATTTAATTTG-3′ (SR)
서열 5: 5′-ATTTCAGCTAACAACGATAATAC-3′(LF)
서열 6: 5′-TAAATCTTCAGAAATCACTTGGC-3′(LR)
TF와 TR 프라이머 각각 20pmol, SF, SR, LF 및 LR 프라이머 각각 7pmol과 DW, 주형 DNA 50ng을 섞어 최종 부피 20㎕를 맞춘 뒤, PCR 혼합물 튜브(AccuPower PCR PreMix, Bioneer, Korea)에 섞고, 첫 번째 변성은 94℃ 5분, 26 싸이클로 변성은 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 연장(extension) 72℃ 45초 및 최종 연장 72℃ 5분으로 PCR(Perkin-Elmer Cetus, Model 9600 Thermocycler, Norwalk, U.S.A.)을 수행하였다. 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트의 올리고 뉴클레오티드 및 각 반응조건은 표 1에 나타낸 바와 같다.
균주 프라이머 PCR 반응조건 DNA 크기(bp)
O. tsutsugamushi TTGCTGATGATGTAGACGGA (TF) 94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 45s 26cycles 213
GTTCCTAACTTAGATGTATCAT (TR)
Rickettsia TTATCAAATTTACAACCGATGTT (SF) 397
CAGCTATTTGAGATTTAATTTG (SR)
Leptospira ATTTCAGCTAACAACGATAATAC (LF) 467
TAAATCTTCAGAAATCACTTGGC (LR)
실시예 3: PCR 산물의 전기영동의 수행 및 결과 확인
실시예 2의 PCR에서 생성된 산물을 1.2% 아가로스 겔에 전기영동 하였다.
상기의 멀티플렉스 PCR에 사용한 프라이머 조합(TF-TR, SF-SR 및 LF-LR)에 따라 크기가 다른 밴드가 증폭되었다. 즉, 프라이머 TF-TR의 경우, 오리엔티아 쭈쭈가무시에서 213bp의 DNA 분절이 증폭되었다. O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong이 이에 해당하는 균주였다.
SF-SR의 경우, 리케챠 8개 균주에서 397bp의 DNA분절이 증폭되었는데 R. typhi Wilmington, R. prowazeki Breinl, R. akari MK, R. japonica YH, R. conorii Indian Tick Typhus, R. sibirica 246, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100이 이에 해당한다.
LF-LR의 경우, 렙토스피라 10개 균주 (L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans Lai, L. interrogans M06,L. interrogans M07, L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98, L. interrogans 102 및 L. interrogans 130)에서 467bp의 DNA 분절이 증폭되었다. 단, C. burnettii, E. sennetsu Japan, B. burgdorferi B31 및 B. hermsii HS1은 증폭산물이 관찰되지 않았다.
도 1은 본 발명에 따른 6개의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행한 후 전기영동을 한 결과를 나타낸 사진이다. 도 1에서 (A)는 오리엔티아(Orientia) 5개 균주인 O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong와 리케챠(Rickettsia) 6개 균주인 R. typhi Wilmington, R. prowazeki Breinl, R. akari MK, R. japonica YH, R. conorii Indian Tick Typhus 및 R. sibirica 246와 렙토스피라(Leptospira) 4개 균주인 L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98 및 L. interrogans 102에 대해 프라이머 TF-TR, SF-SR 및 LF-LR를 동시에 멀티플렉스 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1은 O. tsutsugamushi Karp, 2는 O. tsutsugamushi Kato, 3은 O. tsutsugamushi Kawasaki, 4는 O. tsutsugamushi Gilliam, 5는 O. tsutsugamushi Boryong, 6은 R. typhi Wilmington, 7은 R. prowazeki Breinl, 8은 R. akari MK, 9는 R. japonica YH, 10은 R. conorii Indian Tick Typhus, 11은 R. sibirica 246, 12는 L. interrogans 2, 13은 L. interrogans 23, 14는 L. interrogans 98, 15는 L. interrogans 102를 나타낸다.
도 1에서 (B)는 리케챠 균주인 R. typhi Wilmington, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100, Leptospira 6개 균주인 L. interrogans Lai, L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans M06, L. interrogans M07 및 L. interrogans 130, 대조 균주로서 C. burnettii, E. sennetsu Japan, B. burgdorferi B31 및 B. hermsii HS1에 대해 프라이머 TF-TR, SF-SR 및 LF-LR를 동시에 멀티플렉스 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1은 O. tsutsugamushi Karp, 2는 R. typhi Wilmington, 3은 R. typhi 87-91, 4는 R. typhi 87-100, 5는 R. conorii Indian Tick Typhus, 6은 L. interrogans Lai, 7은 L. interrogans KK1, 8은 L. interrogans KK2, 9는 L. interrogans M06, 10은 L. interrogans M07, 11은 L. interrogans 130, 12는 C. burnetii Henzerling, 13은 E. sennetsu Miyayama, 14는 B. burgdorferi B31, 15는 B. hermsii HS1을 나타낸다.
상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 오리엔티아 균주에 대해서는 213bp, 리케챠 균주에 대해서는 397bp 및 렙토스피라 균주에 대해서는 467bp 크기의 단일 밴드가 검출되었다.
상기와 같이, 특이적 프라이머 세 쌍을 이용하여 동시에 멀티플렉스 PCR을 수행함으로써 검체에 존재하는 주형 DNA의 종류에 따라 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia가 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭되고 이에 의하여, 그 크기에 따라 각 균주를 간편하고 효과적으로 동정할 수 있었다.
본 발명은 리케챠, 렙토스피라 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 의하면 GroEL 단백질을 코딩하는 groEL 유전자를 표적으로 한 멀티플렉스 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia 균을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> Konkuk Unversity <120> Primer for Detecting Rickettsia, Leptospira and Orientia tsutsugamushi <130> KUP03-040 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiplex PCR primer <400> 1 ttgctgatga tgtagacgga 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiplex PCR <400> 2 gttcctaact tagatgtatc at 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiplex PCR primer <400> 3 ttatcaaatt tacaaccgat gtt 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiplex PCR primer <400> 4 cagctatttg agatttaatt tg 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiplex PCR primer <400> 5 atttcagcta acaacgataa tac 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiflex PCR primer <400> 6 taaatcttca gaaatcactt ggc 23

Claims (7)

  1. 서열 1 내지 서열 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 필수적으로 함유하는 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머.
  2. 제1항에 있어서, 리케챠 균주는 Rickettsia typhi, R. prowazeki, R. akari, R. japonica, R. conorii 및 R. sibirica로 구성되는 군에서 선택되고, 렙토스피라 균주는 Leptospira interrogans이며, 쭈쭈가무시 균주는 Orientia tsutsugamushi인 것을 특징으로 하는 프라이머.
  3. 제1항의 프라이머를 함유하는 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 멀티플렉스 PCR 키트.
  4. 삭제
  5. 서열 1 내지 서열 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 리케챠 균, 렙토스피라 균 및 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 DNA 칩.
  6. 삭제
  7. 삭제
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