KR100550463B1

KR100550463B1 - 리케챠와 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머

Info

Publication number: KR100550463B1
Application number: KR1020030073061A
Authority: KR
Inventors: 이승현; 박효순; 이정희
Original assignee: 학교법인 건국대학교
Priority date: 2003-10-20
Filing date: 2003-10-20
Publication date: 2006-02-13
Also published as: KR20050037792A

Abstract

본 발명은 리케챠와 쭈쭈가무시균을 동시에 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 리케챠와 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠와 쭈쭈가무시균의 동시 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, GroEL 단백질을 코딩하는 groEL 유전자를 표적으로 한 듀플렉스 PCR을 통해 효율적으로 Rickettsia와 Orientia tsutsugamushi 균을 동시에 검출할 수 있다.

리케챠, 쭈쭈가무시, 검출, 열성질환, DNA 칩, 프라이머

Description

리케챠와 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머{Primer for Detecting Rickettsia and Orientia tsutsugamushi}

도 1은 본 발명에 따른 4개의 프라이머를 이용한 듀플렉스 PCR을 수행한 후 전기영동을 한 결과를 나타낸 사진으로, (A)는 Rickettsia 6개 균주인 R. sibirica 246, R. conorii Indian Tick Typhus, R. japonica YH, R. akari MK, R. typhi Wilmington 및 R. prowazekii Breinl와 Orientia tsutsugamushi 5개 균주인 O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong, 대조균주로서 Coxiella burnetii, Ehrlichia sennetsu, Borrelia burgdorferi sensu lato 및 Borrelia hermsii에 대해 프라이머 RF-RR와 GF-GR를 동시에 듀플렉스 PCR(duplex-PCR)을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1번은 R. sibirica 246, 2번은 R. conorii Indian Tick Typhus, 3번은 R. japonica YH, 4번은 R. akari MK, 5번은 R. typhi Wilmington, 6번은 prowazekii Breinl이고, 7번은 O. tsutsugamushi Karp, 8번은 O. tsutsugamushi Kato, 9번은 O. tsutsugamushi Kawasaki, 10번은 O. tsutsugamushi Gilliam, 11번은 O. tsutsugamushi Boryong, 12번은 Coxiella burnetii, 13번은 Ehrlichia sennetsu, 14번은 Borrelia burgdorferi sensu lato, 그리고 15번은 Borrelia hermsii이다.

(B)는 R. japonica YH, R. typhi Wilmington, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100과 O. tsutsugamushi Kato 및 Leptospira 6개 균주인 L. interrogans Lai, L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans M06, L. interrogans M07, L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98, L. interrogans 102 및 L. interrogans 130에 대해 프라이머 RF-RR와 GF-FR를 동시에 듀플렉스 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1번은 R. japonica YH, 2번은 R. typhi Wilmington, 3번은 R. typhi 87-91, 4번은 R. typhi 87-100, 5번은 O. tsutsugamushi Kato, 6번은 L. interrogans Lai, 7번은 L. interrogans KK1, 8번은 L. interrogans KK2, 9번은 L. interrogans M06, 10번은 L. interrogans M07, 11번은 L. interrogans 2, 12번은 L. interrogans 23, 13번은 L. interrogans 98, 14번은 L. interrogans 102, 그리고 15번은 L. interrogans 130 이다.

발명의 분야

본 발명은 리케챠와 쭈쭈가무시 균을 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 리케챠와 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방법에 관한 것이다.

발명의 배경

우리나라는 가을에 열성 전염병이 많이 발생한다. 이러한 열성 전염병 대부분은 Rickettsia, Leptospira 및 Orientia 에 의해 발생한다.

리케챠는 이, 벼룩, 진드기(louse, mite, tick) 등의 절지동물(Arthropod)에서 살고 있다가 우발적으로 사람에게 전파되어 리케챠 질환을 일으킨다. 리케챠 질환은 작은 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포(endothelial cell)에서 증식하면서 혈관염을 일으킨다. 증상은 열이 나고 두통이 있으며 특징적인 피부발진을 동반한다.

리케챠는 크게 세 가지 군으로 나누어지는데, 유행성 발진티푸스(epidemic typus)를 일으키는 R. prowazekii, 뮤린 티푸스(murine typus: 발진열)를 일으키는 R. typhi가 포함된 티푸스 그룹, 약 20개의 균종이 포함된 반점열 그룹(Spotted fever group) 및 쭈쭈가무시병을 일으키는 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group)이다. Rickettsia는 6개의 질환이 지난 12년 동안 발생했을 정도로 지금도 새로운 질환 (균종)이 발생되고 있다.

쭈쭈가무시병은 리케챠 속의 스크럽 티푸스(Scrub typhus) 군에 속하는 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi)에 의한 것으로, 매개체인 털진드기의 유충이 사람의 조직액을 흡입할 때 구강 부위에 존재하던 균체가 사람에 직접 감염 되어 발병하게 된다. 그 증상은 잠복기 이후의 갑작스런 발열과 심한 두통, 구진, 발적 및 점상 출혈 등의 소견을 특징으로 한다.

쭈쭈가무시병은 전세계적으로 발생하며, 특히 말레이지아, 태국, 필리핀 등을 포함하여 중국, 일본 및 호주에서 빈발하고 있는데(Traub, R. & Wisserman, C.L., J. Med. Entem., 11:237, 1974; Rapmund, G. et al., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 63:251, 1969; Shirai, A. & Wisserman, C.L., Amer. J. Trop. Med. Hyg., 24:145, 1975; Shirai, A. et al., Jap. J. Med. Sci. Biol., 33: 231, 1980), 국내에서는 농촌 지방에서 괴질이라 불리어온 병에 걸린 환자 중 다수가 쭈쭈가무시병 환자임이 알려지게 되었다 (Chang, W.H. et al., 대한미생물학회지, 24: 399-409, 1989). 쭈쭈가무시 병은 주로 가을철에 발생하는데 이는 주로 매개충인 털진드기 유충(chigger)의 밀도와 관련된 것으로, 우리나라에서도 렙토트롬비디움 팔리둠 (Leptotrombidium pallidum)의 유충이 많이 출현하는 10~11월에 남한의 전지역에 걸쳐서 많이 발생하고 있다 (J. Korean Med. Sci., 31: 601, 1988).

현재 쭈쭈가무시 병의 진단은 환자의 혈액으로부터 오리엔티아 쭈쭈가무시 (Orientia tsutsugamushi)를 분리하여 확인하는 방법, 환자의 혈청 내에서 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi)에 대한 항체를 검출하는 방법 및 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 환자의 혈액 내에서 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi)의 DNA를 증폭하여 검사하는 방법이 있다. 이 중에서 균체를 배양하여 질병을 진단하는 방법은, 배양에 필요한 시간이 4 주 이상 요구되므로 실제 환자의 진단 목적으로는 합당하지 못하고, 현재 쭈쭈가무시병의 진단에 는 와일-펠릭스(Weil-Felix)법, 보체 결합 반응법, 간접 면역 형광 항체법, 면역 효소 측정법 및 면역 부착 적혈구 응집법 등의 혈청학적 방법이 쓰이고 있다.

그러나, 이들 혈청학적 방법 중에서 와일-펠릭스(Weil-Felix) 법은 쭈쭈가무시병 뿐 아니라 렙토스피라병, 변형균의 요도 감염 및 기타 열성 질환에서도 가양성 반응이 높게 나타나며 감수성이 매우 낮기 때문에 현재 쭈쭈가무시병의 진단 자체에는 사용되고 있지 않다. 또한, 보체 결합 반응은 검사 방법이 기술적인 면에서 매우 까다롭다는 단점이 있으며, 재현성이 낮을 뿐만 아니라, 정제된 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi) 항원을 필요로 하고, 항체 역가가 낮은 경우에는 음성 반응이 많아 쭈쭈가무시병 진단에 널리 사용되고 있지 못하다.

따라서, 현재는 간접 면역 형광 항체법 및 면역 효소 측정법이 가장 널리 사용되고 있는데, 이 두 가지 방법은 감수성과 특이도가 높으며 IgG와 IgM을 감별하여 측정할 수 있으므로 초기감염과 재감염을 구별할 수 있다는 장점이 있어 현재 WHO에서도 우선적으로 추천되고 있는 방법이다. 반면, 간접 면역 형광 항체법 검사는 필요한 항원을 얻기 위하여 조직 배양이나 계란 부화 등을 할 수 있는 시설이 요구되며 형광 현미경을 갖춘 검사실에서만 검사를 할 수 있다는 단점을 지니고 있으며, 면역 효소 측정법은 혈청을 1:10 또는 1:20 정도로 낮게 희석할 경우 가양성 반응이 나타난다는 단점이 있다. 또한, 이와 같은 혈청학적 진단에 사용되는 방법은 모두가 다량의 항원을 필요로 하고 있으나, 균을 배양하여 검사에 필요한 항원을 얻기 위해서는 세포 배양을 실시해야 한다는 어려운 점이 있다.

우리나라에서는 현재 리케챠 질환 중, 쭈쭈가무시병, 발진열, 발진티푸스만 보고 되고 있었다. 그러나 반점열 그룹(Spotted fever group: SFG)에 속하는 리케챠들이 중국, 일본, 러시아 등 아시아 전 지역에서도 보고되고 있어 국내 발생보고가 없었던 여러 Rickettsia 질환이 우리나라에도 존재할 가능성이 높아보였다.

본 발명자들은 진드기에서 염색체 DNA를 분리하여 16S rRNA 및 gltA 유전자를 이용하여 그동안 우리나라에서 보고되지 않았던 쭈쭈가무시병, 발진열, 발진티푸스 이외의 리케챠 즉, 반점열 그룹의 리케챠가 우리나라에도 존재함을 증명하였다.

그러나 반점열 그룹 균군을 포함한 리케챠 균군들에 의한 리케챠증과 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group: STG)에 의해 일어나는 쯔쯔가무시 병은 감염시 유사한 임상증상을 나타내 임상적으로 감별하기는 매우 힘들다. 이들의 치료를 위해서는 Rickettsia와 Orientia tsutsugamushi 감별하는 것이 절대적으로 필요하다. 원인균이 어떤 균군에 속하는지 확인되면 치료제의 선택을 달리해야 하므로, 초기 대응책으로 Rickettsia의 존재여부를 탐지하는 것과 더불어 원인균이 Rickettsia 인지, Orientia tsutsugamushi 인지를 빨리 감별하는 것이 필수적인 것이다.

이러한 리케챠 진단은 혈청학적 진단이 가장 많이 쓰인다. Rickettsia가 프로테우스(Proteus) 균주와 공통항원을 가지는 것을 이용한 바일-펠릭스(Weil-Felix)법은 검사의 특이도나 민감도가 떨어져 최근에는 사용하지 않고, 면역형광항체법, 면역효소법이 가장 흔히 사용되고 있다. 그러나 이 방법 또한 다른 박테리아 와의 교차 반응으로 위양성 반응이 많고, 반점열 그룹의 리케챠 균종을 구분할 수 없는 단점이 있다. 웨스턴 블롯 면역분석법(Western blot immunoassay)는 반점열 그룹의 Rickettsia 균종 구분에 유용하나, Rickettsia가 키우기 어렵고 검사시간이 많이 걸리는 단점이 있다.

Rickettsia 동정법으로는 16S rRNA 염기서열을 이용하는 방법을 많이 사용하지만, 이 방법은 염기서열이 너무 유사해, 균종 구분은 되지만 같은 균종내 구분에는 적합하지 않아 시트르산염 합성효소(citrate synthase: gltA)와 rOmpA (ompA)를 코딩하는 유전자의 염기서열 이용하는 방법들을 많이 사용하고 있다. 그러나 STG 균주들에게는 gltA와 ompA 유전자가 없어 TG(티푸스 그룹)와 SFG 균주들과 구분할 수 없다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 Rickettsia 또는 O. tsutsugamushi의 새로운 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 표준균주의 groEL 유전자 일부 분절의 특이 염기서열을 토대로 착안된 프라이머들을 동시에 사용할 경우, 검체내의 주형 DNA 종류(Rickettsia 또는 O. tsutsugamushi)에 따라 각기 다른 크기의 groEL DNA 분절이 단일 밴드로 증폭되고, 증폭된 PCR 산물의 크기에 의해 상기 균의 검출이 가능하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은 Rickettsia 및 O. tsutsugamushi를 동시에 검출할 수 있는 프라이머를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 함유하는 네스티드 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 필수적으로 함유하는 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시검출용 프라이머를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머를 함유하는 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시검출용 듀플렉스 PCR 키트를 제공한다.

삭제

본 발명은 또한, 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시검출용 DNA 칩을 제공한다.

본 발명의 DNA 칩을 이용하여 임상샘플의 상기 두 가지 균주 감염여부를 확 인하기 위하여 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드 또는 상기 올리고뉴클레오티드가 집적되어 있는 DNA 칩과 임상샘플로부터 추출한 DNA를 하이브리다이제이션 시켜 형광을 측정하는 등 공지의 검출방법으로 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균을 동시에 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 리케챠 균주는 R. sibirica, R. conorii, R. japonica, R. akari, R. typhi 및 R. prowazekii로 구성되는 군에서 선택되고, 쭈쭈가무시 균주는 O. tsutsugamushi인 것을 특징으로 할 수 있다.

삭제

본 발명에서는 GroEL 단백질이 샤페론(chaperone)으로써 모든 생물체에서 보존되어 있고, 세포 및 박테리아의 생존에 절대 필요하며, 특히 스트레스에 저항하는 단백질로 알려져 있어 Rickettsia 균주들의 진화를 잘 반영할 수 있으리라 판단되는 groEL 유전자를 중합효소 연쇄반응의 표적으로 선택하였다.

groEL 유전자는 STG 균주에도 존재해 TG와 SFG의 Rickettsia 균주들과 잘 구분되고 있다. 또한 16S rRNA 유전자의 시퀀스 동일성(sequence similarity)과 비교해 보았을 때, groEL 유전자가 더 다양성이 크다.

본 발명에서는 열성 전염병의 원인인 Rickettsia 및 Orientia의 검출을 보다 쉽고 정확하게 하기 위해 리케챠(Rickettsia) 및 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi) 균주 각각의 프라이머로 듀플렉스 PCR을 수행하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 네스티드 PCR을 통한 리케챠 균과 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi) 균의 검출을 예시하였으나, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 DNA 칩을 이용하여 리케챠 균과 오리엔티아 쭈쭈가무시(Orientia tsutsugamushi) 균을 검출하는 것은 당업자에게 있어 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 검체 균주의 준비

Rickettsia의 균주로는 R. sibirica 246 (ATCC; American type culture collection, VR-151), R. conorii Indian Tick Typhus (ATCC VR-597), R. japonica YH (ATCC VR-1363), R. akari MK (ATCC VR-148), R. typhi Wilmington (ATCC VR-144) 및 R. prowazekii Breinl (ATCC VR-142)을 사용하였고, Orientia tsutsugamushi 균주로는 O. tsutsugamushi Karp (ATCC VR-150), O. tsutsugamushi Kato (ATCC VR-609), O. tsutsugamushi Kawasaki (Ogawa, National Institute of Infectious Disease, Japan), O. tsutsugamushi Gilliam (국립보건원) 및 O. tsutsugamushi Boryong (국립보건원)를 검체균주로서 사용하였다. 대조균주로는 Coxiella burnetii (ATCC VR-145), Ehrlichia sennetsu (ATCC VR-367), Borrelia burgdorferi B31 (ATCC 35210) 및 Borrelia hermsii (Yanagihara, University of Shizuoka, Japan)를 사용하였다.

실시예 2: 듀플렉스 PCR의 수행

상기 실시예 1에서 준비된 균주들에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열 1 내지 4의 프라이머를 사용하여 듀플렉스 PCR을 수행하였다.

서열 1: 5'-GATAGAAGAAAAGCAATGATG -3'(RF)

서열 2: 5'-CAGCTATTTGAGATTTAATTTG-3'(RR)

서열 3: 5'-ATATATCACAGTACTTTG CAAC-3'(GF)

서열 4: 5'-GTTCCTAACTTAGATGTATCAT-3'(GR)

RF와 RR 프라이머 각각 10pmol, GF와 GR 프라이머 각각 20pmol과 DW, 주형 DNA 50ng을 섞어 최종 부피 20㎕를 맞춘 뒤, PCR 혼합물 튜브(AccuPower PCR PreMix, Bioneer, Korea)에 섞고, 첫번째 변성은 94℃ 5분, 26 싸이클로 변성은 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 연장(extension) 72℃ 45초 및 최종 연장 72℃ 5분으로 PCR(Perkin-Elmer Cetus, Model 9600 Thermocycler, Norwalk, U.S.A.)을 수행하였다. 듀플렉스 PCR 프라이머 세트의 올리고 뉴클레오티드 및 각 반응조건은 표 1에 나타낸 바와 같다.

균주	프라이머	PCR 반응조건	DNA 크기bp)
Rickettsia	GATAGAAGAAAAGCAATGATG(RF)	94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 45s 26cycles	229
	CAGCTATTTGAGATTTAATTTG(RR)
O. tsutsugamushi	ATATATCACAGTACTTTGCAAC(GF)		366
	GTTCCTAACTTAGATGTATCAT(GR)

실시예 3: PCR 산물의 전기영동이 수행 및 결과 확인

실시예 2의 PCR에서 생성된 산물을 1.2% 아가로스 겔에 전기영동 하였다.

상기의 듀플렉스-PCR에 사용한 프라이머 조합(RF-RR 및 GF-GR)에 따라 크기가 다른 밴드가 증폭되었다. 즉 프라이머 RF-RR의 경우, Rickettsia 6개 균주에서 229bp의 DNA 분절이 증폭되었다. R. sibirica 246, R. conorii Indian Tick Typhus, R. japonica YH, R. akari MK, R. typhi Wilmington 및 R. prowazekii Breinl이 이에 해당하는 균주였다.

GF-GR의 경우, Orientia tsutsugamushi 5개 균주에서 366bp의 DNA 분절이 증폭되었는데, O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong이 이에 해당된다. 그러나, C. burnetii, E. sennetsu Japan, B. burgdorferi sensu lato 및 B. hermsii HS1에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다.

프라이머 두 쌍을 이용하여 동시에 하는 듀플렉스 PCR을 수행함으로써, 검체에 존재하는 주형 DNA의 종류에 따라 Orientia tsutsugamushi 및 Rickettsia가 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭되고 이에 의하여, 그 크기에 따라 각 균주를 간 편하고 효과적으로 동정할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 4개의 프라이머를 이용한 듀플렉스 PCR을 수행한 후 전기영동을 한 결과를 나타낸 사진이다. 도 1에서 (A)는 Rickettsia 6개 균주인 R. sibirica 246, R. conorii Indian Tick Typhus, R. japonica YH, R. akari MK, R. typhi Wilmington 및 R. prowazekii Breinl와 Orientia tsutsugamushi 5개 균주인 O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong 그리고 Coxiella burnetii, Ehrlichia sennetsu, Borrelia burgdorferi sensu lato, Borrelia hermsii에 대해 프라이머 RF-RR와 GF-GR를 동시에 듀플렉스 PCR(duplex-PCR)을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1번은 R. sibirica 246, 2번은 R. conorii Indian Tick Typhus, 3번은 R. japonica YH, 4번은 R. akari MK, 5번은 R. typhi Wilmington, 6번은 prowazekii Breinl이고, 7번은 O. tsutsugamushi Karp, 8번은 O. tsutsugamushi Kato, 9번은 O. tsutsugamushi Kawasaki, 10번은 O. tsutsugamushi Gilliam, 11번은 O. tsutsugamushi Boryong, 12번은 Coxiella burnetii, 13번은 Ehrlichia sennetsu, 14번은 Borrelia burgdorferi sensu lato, 그리고 15번은 Borrelia hermsii이다.

도 1에서 (B)는 R. japonica YH, R. typhi Wilmington, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100과 O. tsutsugamushi Kato 및 Leptospira 6개 균주인 L. interrogans Lai, L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans M06, L. interrogans M07, L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98 , L. interrogans 102 및 L. interrogans 130)에 대해 프라이머 RF-RR와 GF-FR를 동시에 듀플렉스 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1번은 R. japonica YH, 2번은 R. typhi Wilmington, 3번은 R. typhi 87-91, 4번은 R. typhi 87-100, 5번은 O. tsutsugamushi Kato, 6번은 L. interrogans Lai, 7번은 L. interrogans KK1, 8번은 L. interrogans KK2, 9번은 L. interrogans M06, 10번은 L. interrogans M07, 11번은 L. interrogans 2, 12번은 L. interrogans 23, 13번은 L. interrogans 98, 14번은 L. interrogans 102, 그리고 15번은 L. interrogans 130 이다.

상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 리케챠 균주에 대해서는 229bp 크기의 단일 밴드가 검출되었고, 쭈쭈가무시병 균주에 대해서는 366bp 크기의 단일 밴드가 검출되었다.

상기와 같이, 특이적 프라이머 두 쌍을 이용하여 동시에 PCR을 수행함으로써, 검체에 존재하는 주형 DNA의 종류에 따라 Rickettsia 또는 O. tsutsugamushi 의 groEL DNA가 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭되었고, 그 크기에 따라 감염 균종을 확인할 수 있었다. 따라서, groEL 유전자 하나만을 표적으로 하여, 종래의 어떠한 방법보다도 간편하고 특이적으로 Rickettsia와 O. tsutsugamushi를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 특이적 프라이머 두 쌍을 이용하여 듀플렉스 PCR을 수행함으로써 검체에 존재하는 주형 DNA의 종류에 따라 Rickettsia 및 Orientia가 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭되고, 이에 의하여 그 크기에 따라 각 균주를 간편하고 효과적으로 동정 할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시 검출방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 의하면, groEL 유전자 하나만을 표적으로 하여, 종래의 어떠한 방법보다도 간편하고 특이적으로 Rickettsia와 O. tsutsugamushi를 검출하는 것이 가능하다.

<110> Konkuk University <120> Primer for Detecting Rickettsia and Orientia tsutsugamushi <130> KUPP03-041 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gatagaagaa aagcaatgat g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cagctatttg agatttaatt tg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 atatatcaca gtactttgca ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gttcctaact tagatgtatc at 22

Claims

서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 필수적으로 함유하는 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시 검출용 프라이머.
제1항에 있어서, 리케챠 균주는 R. sibirica, R. conorii, R. japonica, R. akari, R. typhi 및 R. prowazekii로 구성되는 군에서 선택되고, 쭈쭈가무시 균주는 O. tsutsugamushi인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항의 프라이머를 함유하는 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시검출용 듀플렉스 PCR 키트.
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서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 리케챠 균과 쭈쭈가무시 균의 동시검출용 DNA 칩.
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