JPH05502582A - 新規な分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な分析方法 本発明の背景および従来技術 マラリアはプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属に属す原生動物寄生虫に よって引き起こされる。この寄生虫のライフサイクルは、２期から、すなわちを 椎動物内での無性生殖期および（通常アノフエレス属の）蚊体内での有性生殖期 から成っている。ヒトマラリアの原因となるプラスモジウム属の四つの種は熱帯 熱マラリア原虫（Ｐｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　、三日熱マラリア原虫（Ｐ、　ｖ ｉｖａｘ）　、四日熱マラリア原虫（Ｐ、　ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラ リア原虫（Ｐ　θｖａｌｅ）である。

これらのうち最初の二つが最も普通である。熱帯熱マラリア原虫は時として致命 的である最も重度のマラリアを引き起こす。さらに、この寄生虫は汎用される抗 マラリア薬に対する耐性を生じる。様々な国における三日熱マラリア原虫を原因 とする症例頻度は約５０〜８０％である。

四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫の存在はまれである。

現在のマラリア診断法は血液塗抹標本検査によるものである。この方法は煩瑣で ありしかも専門性を要する。

さらに熟練した鏡検技士でも最大で１日あたり６０枚のスライドしか検査できな い。血清学診断も行い得るが、抗体が存続し続けるため今感染したのか過去に感 染したのか区別できない。新世代の診断テストの探究には、寄生虫の有無を示す 寄生虫核酸の検出の可能性が含まれている。この種のテストはフィンガー・ブリ ック（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｃｋ　；指に針を刺すこと）により採取できる極く少 量（５〜５０μｌ）　Ｌか要せず、また高感度かつ迅速である。

Ｉｈｌ中５中側０個うわずかな寄生虫でも核酸ハイブリダイゼーションにより検 出できる（１）。−日に何百という検体を若干の初期訓練でもって分析すること ができる。このアッセイは感度が高い故に血液銀行において輸血用血液のスクリ ーニングに用いることができる。

核酸ハイブリダイゼーションはキャリアーとしての仲介生物種を同定するために 昆虫組織検体に対して行うこともできよう。かかる情報は、マラリアの地理的伝 播を抑えるための仲介物コントロール措置の強化に役立つであろう。あるいはま たがかる領域にキモブロンィラキシス（ｃｈｅｍｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を 採用することができ、またこの手法の評価を核酸ハイブリダイゼーションを用い て行うことができる。

二本鎖ＤＮＡは相補的性質を有する。ある温度および塩濃度条件の下で、ＤＮＡ の相補鎖を変性させまたは離解することができまた再現性よく再会合させること ができる。この再会合はＤＮＡと相補ＲＮＡの間でも生じ得る。再会合するＤＮ ＡおよびＲＮＡには（アイソトープ式または非アイソトープ式）検出デバイスに より標識でき、そして適宜の検出方法を用いることができる。

三日熱マラリア原虫の場合は、潜在的ＤＮＡプローブ配列についての報告が全く ない。三日熱マラリア原虫を検出するための核酸配列の開発は、地理的に限局さ れた地域における三日熱マラリア原虫発生を決定するのに重要であろう。″プロ ーブという用語は、生物学的にまたは合成的に得られる一組のＤＮＡ配列を表す 。

核酸ハイブリダイゼーションは、寄生虫が潜んでいる（　ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ ）疑いのあるいがなる生物学的検体についても行うことができる。例えば血液は 標準的方法（２）により、直接採取し、アルカリに可溶化しそしてニトロセルロ ースまたは同様の固体支持体にスポットすることができる。ＤＮＡをそれら支持 体に固定し、そしてそのプローブと標的核酸の特異的再アニーリングに適した温 度、イオン強度等の条件下に特異的プローブと接触させる（３）。プローブがア イソトープ標識（通常３２Ｐ）を有する場合は、ラジオオートグラフィーを行っ て陰性検体がら陽性検体を検出する。プローブが非アイソトープ標識例えばビオ チン（４）を有している場合には、酵素系例えばアビジン−アルカリ性ホスファ ターゼが用いられ、そして一連の事象を経た後、テストに陽性な検体が発色する 。

もう一つの方法（５）にむいては、分析すべき血液または組織検体を直接カオト ロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤例えば４Ｍグアニジンチオンアネートに集 めることができる。

ハイブリダイゼーション過程は溶液中で行われ、次にその混合物は、標的−プロ ーブハイブリッドだけの結合を助長し、プローブ過剰分はマトリックスに結合し ない条件の下に、固体支持体を通して濾過する。このマトリックスに対してラジ オオートグラフィーまたは比色検体を行うことができる。このハイブリダイゼー ション方式は一末鎖ＲＮＡプローブを用いるときに特に有用である。

本発明の詳細 な説明は、三日熱マラリア原虫に特異的なりＮＡ配列および三日熱マラリア原虫 に対するこれらプローブのヌクレオチドの確認を記載するものである。これら諸 確認に基づき、核酸ハイブリダイゼーションを用いた三日熱マラリア原虫の特異 的検出のための診断方法が開発された。このテストは迅速、高感度であり、そし て疫学的調査目的に大規模に用いることができる。

本発明は以下に関するものである・ １　下記の日付および寄託番号でｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＢ）、　（Ｔ ｏｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａ−ｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ、＾ｂｅｒｄｅｅｎ）に形質転 換大腸菌として寄託されている新規構築物またはプラスミドｐＡＲＣ１１，７、 ｐＡＲＣ１４５およびｐＡＲＣ１１５３：ｐＡＲＣ１１７：　ＮＣＪＢ　４０１ １４、Ｅ、Ｃｏ１１　ＲＲＩ　Ｍ２Ｓ　ｐＡＲＣ１１７，１９８９年２月１５日 ｐＡＲＣ１４５：　ＮＣＩＢ　４０１１０．　Ｅ、Ｃｏ１１　ＲＲＩ　１１１５ 　ｐＡＲＣ１４５，１９８９年２月７日 ｐＡＲＣ１１５３：　ＮＣｒＢ　４０１０８、Ｅ、Ｃｏ１１　ＲＲＩ　ＭＩ５　 ｐＡＲＣ１１５３，１９８９年２月７日 形質転換に用いられる大腸菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　ＭＩ５は、ｔｈｅ　Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（＾ＴＣＣ ）　（米国メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌ　ｌｅ）からＮｏ、　３５］０２とし て入手できる標準的な研究室用菌株である。これら形質転換大腸菌株に適した培 地はＬ［３（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）培地であるが、これは大腸菌菌体の 増殖のための標準培地である。ＬＢ培地はＢａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（１， ０ｇ／／）、酵母エキス（５９／／）、塩化ナトリウム（１０ｇ／ｊりを含有す る。

２、ｐＡＲＣ１１７、ｐＡＲＣ１，４５およびｐＡＲＣ１１５３のＤＮＡ配列お よび少なくとも２０個の連続ヌクレオチドより成るそれらの下位構造体。

３、ｐＡＲＣ１１７について後述の如く同定されたヌクレオチド配列より成る三 日熱マラリア原虫検出用ＤＮＡプローブ。

４、ｐＡＲＣ１４５について後述の如く同定されたヌクレオチド配列より成る三 日熱マラリア原虫検出用ＤＮＡプローブ。

５、ｐＡＲＣ１１５３について後述の如く同定されたヌクレオチド配列より成る 三日熱マラリア原虫検出用ＤＮＡプローブ。

６、　放射性または非放射性標識された形の、ｐＡＲＣ１１７、ｐＡＲＣ１４５ およびｐＡＩ？ｃ　１１５３のいずれかについて同定されたヌクレオチド配列よ り成るプローブを三日熱マラリア原虫ゲノム中のそれぞれの相同配列とハイブリ ダイズさせ、そして三日熱マラリア原虫ゲノムに結合した標識プローブを検出す ることより成るを椎動物または無を椎動物の生物学的検体中の三日熱マラリア原 虫検出方法。

本発明を病気診断によって例示するが、それらに限定されるものではない。疫学 的スクリーニング、法医学的調査、食品汚染の測定、公衆衛生調査、予防医学、 感染原固体診断に関する獣医学的および農業的応用も本開示に包含され得る。

三日熱マラリア原虫特異的ＤＮＡ配列の同定三日熱マラリア原虫は未だイン・ビ トロ培養されていないので、この寄生虫のゲノムＤＮＡは感染患者血液から採取 した。軟層をできるだけ除いた後、標準的方法（６）によりゲノムＤＮＡを調整 し、酵素Ｓａｕ　３＾で消化しそして既知プラスミドベクターｐＵＣ１８のＢａ ａ　１１１部位にクローン化した。鑑別スクリーニング方式で複製（ｄｕｐｌｉ −ｃａｔｅ）フィルターをニック・トランスレーションされた三日熱マラリア原 虫ＤＮＡおよびニック・トランスレーションされた健常人ＤＮＡを用いてスクリ ーニングすることにより種物異的ＤＮＡ配列を同定した。ｐＡＲＣ１１７、ｐＡ ＲＣ１４５およびｐＡＲＣ１１５３と記される三日熱マラリア原虫の三種類の特 異的プローブを得、そしてそれらをＭ１３ベクターにサブクローン化しそしてそ れらのＤＮＡ配列をジーデオキシ鎖成長停止反応法（７）により決定した。

それらはいずれも配列決定した領域内に特徴的な反復要素を有していなかった。

アップデートされたデータバンクを用いたコンピュータによる相同性サーチを行 ったところ、公表されたいずれのヌクレオチド配列に対しても有意な相同性がみ られなかった。最高の相同性はｐＡＲＣ１１７とラットバルバアルブミン（ｐａ ｒｖａＬｂｕ＋５ｊｎ）について得られた（約４１％）。この数値はあらゆる実 際上の目的にとって取るに足らないものである。

三日熱マラリア原虫に対する前記プローブは特異的であり、また熱帯熱マラリア 原虫の単離物（第１図）とは交叉反応しなかった。

特異的三日熱マラリア原虫プローブ使用検出手順の脱型 核酸ハイブリダイゼーションには主に二つの手順がある。一つの方法では、検体 核酸は固体支持体に固定され、一方ブローブ配列は溶液中にある（２）。他方の 方法では、検体核酸とプローブ配列のいずれもが溶液中にある（５）。

すなわち、一つの核酸ハイブリダイゼーション・アッセイは、血液または組織検 体を固体支持体例えばニトロセルロースにスポットしそれを次に適切な温度等の 条件の下に（アイソトープ／非アイソトープ的に標識された）プローブでハイブ リダイズすることより成る（３）。この方法は文献に十分記載されており、また マラリア診断において多くの研究者により用いられてきた（８）。しかしながら 組織検体は、寄生虫ＤＮＡ抽出用に処理してからドツト・プロット・アッセイ（ ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　ａｓｓａｙ）に用いる必要がある。このことは大量スクリー ニングに用いられる診断アッセイの設計上望ましくない。本発明者の経験上、マ トリックスへの感染血液の直接スポットは満足できるものではなかった。

赤血球膜タンパク質および血中のその他の血漿成分、おそらくはタンパク質、お よび使用する場合にはその池の組織は寄生虫ＤＮＡのマトリックスへの結合を立 体的に障害する。その結果、ハイブリダイゼーション過程の間に、スポットされ た検体がマトリックスから脱着して特異的信号が失われる。この問題は予め検体 を洗浄して障害となる血漿成分を除去することにより克服できるがこの場合には テストが煩瑣なものとなってしまうし、また極（少量の血液をスポットすること により克服できるがこの場合には検出感度が失われることとなろう。

そこで、本発明者らは、検体処理を全く要しない、そしてフィルターハイプリダ イゼーソヨン方式よりも迅速に実施できる溶液ハイブリダイゼーション方式を用 いた。

このテストは以下のステップを用いる ａ）組織検体をカオトロピック塩または変性剤の溶液に直接集める、例えば２５ ｐ１の血液を５０μｌの６Ｍグアニジンチオンアネートに集める。プローブがア イソトープ標識を有する場合、４Ｍ濃度のグアニジンチオシアネートをカオトロ ピック塩として用いることができる。プローブが非アイソトープ（例えばビオチ ン）であって酵素反応により検出する必要がある場合には、グアニジンチオンア ネートはニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）フィル ターおよびその池の類似のマトリックスに結合し、引き続き反応に用いられる酵 素接合体を変性してしまうので使用できない。しかしながら、それらマトリック スを前処理しておけばグアニジンチオシアネートを非アイソトーププローブと共 に用いることができる。

本発明において塩酸グアニジンを可溶化剤として用いるときは、それがグアニジ ンチオシアネートと同程度に有効であることがわかる。それは、固体マトリ１． クスに結合せず従って非アイソトーププローブに使用できるという付加的な利点 を有する。

ｂ）プローブ（１ｎｇ）を添加する。添加プローブは好ましくは一本鎖核酸、Ｄ ＮＡまたはＲＮＡであり、これは従来技術において十分文献に記載されている方 法により、生物学的にまたは合成的に得ることができる。Ｒ，ＮＡがプローブと して好ましい。

Ｃ）検体を５分間８５℃に加熱しそして室温（約２８〜３５℃）で２時間放冷す る。

ｄ）　次に検体をＲＮＡ５ｅ　＾含有塩溶液を用いて少なくとも１０倍希釈し、 そして更に１５分間インキュベートする。

−末鎖ＤＮＡがプローブとして用いられる場合には、／＼イブリダイズしなかっ たプローブはヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーにより除去することが できる。

ｅ）次に検体をマトリックス例えばニトロセルロースまたはポリビニリデンフル オライドフィルターを通して濾過しそしてそれらフィルターをＲＮＡ５ｅ　Ａ含 有塩溶液に各々１５分間ずつ２回洗浄する。

ｆ）次に適切な検出方法を行う。

ハイブリダイゼーションプローブの調製ハイブリダイゼーションプローブは、ゲ ノム要素を適切なベクターにクローン化することにより調製できる。

これらベクターはプラスミド（大腸菌プラスミド）、フィラメンタスファージ（ Ｍ１３）　、ラムボイドバクテリオファージ、サルモネラファージおよび酵母で あってよい。

当該技術分野において文献に記載されたいずれのベクターも使用できる。

ハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡポリメラーゼおよび（α−３２Ｐ）ｄ ＮＴＰを用いて３２ｐによるニックトランスレーションにより放射性に標識でき る。非放射性標識には、Ｂｉｏ−ｄＵＴＰをニックトランスレーション反応に用 いることができる。短オリゴヌクレオチドプローブは［γ−３２Ｐ］または［α −３２Ｐ］ｄＮＴＰを用いてそれぞれそれらの５′または３′末端を末端標識す ることができる。

３２ｐで標識された一本鎖ＤＮＡプローブはＭ１３ベクター系を用いて得ること ができる（９）。−末鎖ＤＮＡプローブは、Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ、他のデオキシリ ボヌクレオチドおよびＴａｇＤＮＡポリメラーゼの存在下にポリメラーゼ鎖成長 反応によりビオチンで標識することができる（１０）。

ＲＮＡハイブリダイゼーションを用いたハイブリダイゼーションアッセイでは、 ＤＮＡに相補的な標識ＲＮＡを調製する。かかる系の構築方法は当該技術におい て十分文献に記載されている（１１）。本発明はかかるアンセイをも包含する。

従って本発明は、二本鎖ＤＮＡ、−末鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの三日熱マラリア原 虫ゲノム検出用プローブとしての使用を包含する。

実施例１ この実施例は、三日熱マラリア原虫に対して種物異的プローブを得る方法の例示 である。

ｌ　三日熱マラリア原虫感染血からの全ＤＮＡを単離し、酵素Ｓａｕ　３Ａで消 化し、そしてプラスミドベクター、ｐｕｃ　１８のＢａｍ旧部位にクローン化す る。

２、　クローンは二つのニトロセルロースフィルターにスポットされたレプリカ であった。一方のフィルターはニソクトランスレーノヨンされた放射性ヒトＤＮ Ａでスクリーンされ、他方のフィルターは二ノクトランスレーンヨンされた放射 性三日熱マラリア原虫ＤＮＡでスクリーンされた。

３　ハイブリダイズされたレプリカをオートラジオグラフィーにかけてハイブリ ダイゼーション信号を得る。

４　三日熱マラリア原虫ＤＮＡと反応したがヒトＤＮＡとは反応しないクローン は種物異的であるとし、三日熱マラリア原虫用ハイブリダイゼーションプローブ として用いるために選択した。

５　このようにして三つのクローンを同定した。これらのクローンをそれぞれｐ ＡＲＣ１，１，７、ｐＡＲＣ１４５およびｐＡＲＣ１１５３と記す。各クローン のヌクレオチド配列を標準的方法により決定したところ次の結果が得られた。

ｐＡｌ？ｃ　１．１７のヌクレオチド配列・５’　−−−−−−＾Ｔ　ＧＴＡ　 ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＴＡＡＧＧＡ　ＴＴＴ　Ｃ ＡＴ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＧ＾＾Ｇ　ＡＡＧ　ＣＡ ＣＴ＾＾ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＧＴ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　Ｔ−−− −−３’ｐＡＲＣ１４５のヌクレオチド配列 ５’−−−−−−−ＣＣＡＡＧ　ＴＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　Ｇ ＧＧ　ＣＣＡＧＣＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＣＡ　ＴＴＧ 　ＴＣＴ　ＣＴＣＴＧＡ　ＧＧＴＣＴＧ　ＴＡＧ　ＧＣＣＡＧ＾＾ＧＣＴＣＣＣ ＣＡ　ＧＣＡＣＴＴ　ＡＧＡ　ＣＣＣＴＡＣＴＡＡ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＴＡＧ　 ＡＧＡ　ＧＴ＾＾ＧＧ　ＧＧＣＡＧＣＣＡＴ　ＣＡＣＴＴＡＴＣＡ　ＣＴＧ　Ｇ ＣＴ　ＧＴＣＣＴＧ　ＡＧＧ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＴＧ ＧＣＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＧＣＣＴＧ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　Ｃ ＴＣＣＡＡ　ＧＡＧＴＣＣＴＡＧ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　Ｔ＾＾＾ＣＡ　ＧＴＧ　Ｃ ＡＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＴＣＴ　ＧＧＧＧＧＧ　ＡＡＧ　Ｇ−−−−−３’ ｐＡＲＣ１１５３のヌクレオチド配列。

５’−一−−−−ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＴＧＡ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＴＴＴ　 ＴＴＧ　ＡＴＧＧＡ＾＾ＣＣＴＧＡ　ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＧＴ＾＾ＴＴ　 ＡＴＧ　ＴＧＡ　ＴＴＡ　ＧＡＣＴＣＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　Ａ ＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡＧ　ＣＴＡ　ＧＣＣＴＣＣＴＣＴ　ＧＡＣ ＡＣＴ　ＡＧＣＴＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧ＾＾ＣＧ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＧＧＡＧＡＧ 　ＣＡＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＴＧＣＡＴＴ　ＣＣＴ　ＧＣＣＴＣＴ　ＴＴＴ　ＣＴ Ｔ　ＣＣＴＴＧＴ　ＴＡＣ丁ＣＣＣＡＡ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　Ａ ＴＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＴＣＣＣＡＣＴＧＴ　ＴＴＣＣＴＣＣＴＴ　ＴＡＡ　ＡＴ Ｔ　＾＾ＴＴ＾＾　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＴＴＴ＾ＡＴ　ＧＴＴ　ＧＧＣＡＡＡ　Ｔ ＡＡ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＴＡＴ　ＡＴＴＴＡＴ　ＧＧ Ｇ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＯＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＧＴ Ａ　ＴＡＣＡＴＴ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＴＧＧ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＴＡＡ　ＧＣＴ 　ＡＡＴ　ＴＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＡＴＡＴ　ＴＡＣＣＴＣＡＣＡ　ＴＡＡ　ＴＣ Ａ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＧＡＧＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＡ　 ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＡＡＧ　ＴＡＴＡＴ Ａ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＴＡＴ　ＴＡＡ　ＣＴＡ　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＣＣ Ｔ　ＣＡＴ　ＴＧＴ＾ＣＡ　ＡＴＡ　ＴＧＴ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＣＴＴＡ　 ＴＴＣＣＴＣＣＴＡ　ＡＧＴ　ＡＴＡＡＴＴ　ＴＴＧ　ＴＡＣＴＣＴ　ＴＴＧ　 ＡＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ　ＧＡＣＣＣＣＴＣＡ　ＡＴＧ　ＣＣＣＡＣＣ ＣＴＣＴＧＧ　ＴＡＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＣＴＡＣＴＣＴＴＴＧ　ＣＴＴ　 ＴＴＣＡＡＣＴＴＴ　ＴＡＴ　ＡＧＡ　ＴＴＣＣＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＡＧ ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＧＴＡ　ＴＴＴ　ＧＴＣＴＴＴ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　Ｇ ＧＣＴＴＡ　ＴＴＴＣＣＴ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＣＴＣＴＡＧ　 ＧＴＧ　−−−−−−３’実施Ｍ　２ この実施例は特異的ハイブリダイゼーションプローブの調製例である。

ｐＡＲＣ１１７、ｐＡＲＣ１４５およびｐＡｌ？ｃ　１１５３中のインサートＤ ＮＡを大腸１ｉｌＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよび［α −”Ｐ’ＪｄＮＴＰの存在下に二ツクトランスレーションを行うことにより標識 することによってハイブリダイゼーションプローブを作った（　１０’ｃｐｍ〜 ５Ｘ　１０’ｃｐ＊　ｐｇ　Ｄ　Ｎ　Ａの比活性が得られる）。−末鎖または合 成的に誘導されたＤＮＡの５′末端をポリヌクレオチドキナーゼおよび「α−３ ２ＰＩＡＴＰを用いて末端標識することができる。またそれらの３′末端をター ミナルトランスフェラーゼおよび［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを用いて標識すること もできる。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｉｏ−ｄＵＴＰを用いたポリメ ラーゼ鎖成長反応によりビオチン化−末鎖ＤＮＡを合成することもできる。

一本鎖または二本鎖核酸を光活性化可能なビオチンによりビオチン化することが できる。さらに核酸の化学的ビオチン化を行うこともできる。

一本鎖ＲＮＡは対象とするＤＮＡを適当なベクター中のサルモネラファージ５Ｐ ｆ３プロモーターの断片に融合することにより作ることができる。そのベクター は大腸菌に伝達できる。このベクターのＤＮＡはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼを 用いてインビトロで転写することができる。

この過程で、高比活性の放射性ＲＮＡは［α−３２Ｐ］ＵＴＰを用いて得ること ができる。このＲＮＡのビオチン化も可能である。

実施例３ この実施例は実施例１に記載の三つの三日熱マラリア原虫クローン、すなわちｐ ＡＲＣ１１７、ｐＡＲＣ１４５およびｐＡＲＣ１１５３の種特異性を例示するも のである。

三日熱マラリア原虫の九種類の異なる単離物のゲノムＤＮＡを調製しそしてニト ロセルロースフィルターにスポットした。そのフィルターを放射性の各三日熱マ ラリア原虫特異的プローブでプローブ処理した。

それらプローブは三日熱マラリア原虫検体とだけ反応し、熱帯熱マラリア原虫や ヒトＤＮＡとは反応しない（第１図）。

実施例４ この実施例は溶液ハイブリダイゼーション方式を用いた三日熱マラリア原虫アッ セイの例示である。

感染面（２０μｌ）または組織を実施例２に記載の如（放射性標識されたｌｎｇ のｐＡＲＣ１１７ＲＮＡプローブを含む５０μｌのグアニジンチオシアネートに 直接とる。

検体を８５℃に５分間加熱しそして室温に２時間放置する。

次に検体を１０ｎｇ　ＲＮＡ５ｅ　＾含有２ＸＳＳＣ中で１０倍希釈しそして室 温でさらに１５分間インキュベートする。

次に検体をニトロセルロースまたはＰＶＤＦフィルターマトリックスを通して濾 過し、そしてＲＮＡ５ｅ　＾緩衝剤含有２ｘ　ＳＳＣ中で２回、各１５分間洗浄 する。

そのフィルターを乾燥しそしてフィルムを用いてオートラジオグラフィーにかけ てハイブリダイゼーション信号を生じさせる。

記載のアンセイは実施しやすく、また大量検査の際の末端フィールド条件に（ｉ ｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｆｉｅｌｄ　ｃｏｎｄｉｔｊ−ｏｎｓ）存在するよ うな検査室装備はほとんど必要ない。

実施例５ この実施例は、実施例４に記載の如きグアニジンチオシアネートの代わりに塩酸 グアニジンを用いた溶液／％イブリダイゼーション方法の例示である。

カオトロープとしての４Ｍグアニジンチオシアネートおよびタンパク質接合体に より検出される非放射性プローブは両立できない。そのカオトロピック塩はニト ロセルロースおよびＰｖＤＦに結合しそして発色に用いられるタンパク質接合体 を変性させる。

塩酸グアニジンを可溶化剤として用いるときは、グアニジンチオシアネートと同 程度に有効である。それはマトリックスにトロセルロースまたはＰＶＤＦフィル ター）に結合しないので、タンパク質接合体により検出される非放射性プローブ を用いることが可能になる。

グアニジンチオシアネート溶液を濾過して通す前にフィルターを例えば３％ＢＳ ＾で前処理しておいた場合にのみ、グアニジンチオシアネートを前述の非放射性 プローブと併用することができる。

参　考　文　献 １、　Ｐｏ１ｌａｃｋ、　Ｙ、、　Ｍｅｔｚｇｅｒ、　Ｓ、、　Ｓｈｅｍｅｒ、 　Ｒ，、Ｌａｎｄａｕ。

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Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６３．２８１゜ ６、Ｐａｎｙｉｍ、Ｓ、、ｆｉｌａｉｒａｔ、Ｐ、およびＹｕｔｈａｖｏｎｇ、 ＹＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　 ｔｏ　［？ｅｓｅａｒｃｈｏｎ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｐａｔｈ ｏｇｅｎｓ　ｗｉｔｈ　５ｐｅｃｉａｌ　ｒｅｆｅ−ｒｅｎｃｅ　ｔｏ　Ｐｌａ ｓｍｏｄｉａ−ｆＨＯｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ。

７、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、＾、Ｒ，，Ｂａｒｒｅｌｌ、 　Ｂ、Ｇ−。

Ｓａｉ　ｔｈ、＾、Ｇ、Ｉ’１．およびＲｏｅ、Ｂ、＾、（１９８０）、Ｊ、Ｍ ｏ１Ｒｉｏｔ、　１４３．１６１ ８、　Ｈｏ１ｇ＋ｂｅｒｇ、Ｍ、、Ｂｊｏｒｋｍａｎｎ、＾　、Ｆｒａｎｚｅｎ 、Ｌ、。

Ａｓ１ｕｎｄ、　Ｌ、、　Ｌｅｂｂａｄ、　Ｍ、、　Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ　Ｕ 、およびＷｉｇｚ−１１、Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、Ｒ，、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、およ びＭｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ第１図・ 三日熱マラリア原虫プローブｐＡＲＣ１１７（Ａ）、ｐＡＲＣ１４５（Ｂ）およ びｐＡｌ？ｃ　１１．５３（Ｃ）の特異性。三つのクローンから単離された二本 鎖インサートをプローブとしてテストした。Ｐｖｌ〜Ｐｖ９は元種類の三日熱マ ラリア原虫感染面検体からのＤＮＡ調製物を表わす。ＦＣＫ　２およびＴ９は熱 帯熱マラリア原虫ＤＮＡ調製物を表わす。ＮＵは健常人ＤＮＡを表わす。

・・・　− ・・ ・・・・ ＞　＞　＞＞　＞　＞ ＣＬ　ＣＬ　ＣＬ　ＣＬ　Ｑ−ＣＬ ）＞＞＞＞＞ ユ　０−　ユ　ユ　Ｏ−二 ｖ−Ｎ　−Ｊ　Ｌ／’ｌ　（ ）））〉＞＞ Ｑ−ｃＬＣＬ　Ｏ＋Ｏ＋” 要　約　書 三日熱マラリア原虫に特異的なりＮＡ配列のプローブおよびそれを得る方法が開 示されている。これらの核酸配列は核酸のハイブリダイゼーションアッセイによ る三日熱マラリア原虫で起るマラリアの検査に有用であることが分かった。この アッセイの高感度と実行の容易さからこのアッセイはを推動物および無を推動物 の血液および他の器官の分析のために使用できる。

国際調査報告 □＋＋ｅ＜ｎ１ｉ。。Ｉ□Ａ、□９．１１゜、。ＰＣＴ／ＳＥ　９０１００８０ １国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．構築物ｐＡＲＣ１１７、寄託番号ＮＣＩＢ４０１１４。
2. ２．構築物ｐＡＲＣ１４５、寄託番号ＮＣＩＢ４０１１０。
3. ３．構築物ｐＡＲＣ１１５３、寄託番号ＮＣＩＢ４０１０８。
4. ４．【配列があります】 なる配列を有するＤＮＡ断片。
5. ５．【配列があります】 なる配列を有するＤＮＡ断片。
6. ６．【配列があります】 なる配列を有するＤＮＡ断片。
7. ７．請求項４、５および６のいずれかに記載のヌクレオチド配列または三日熱マ ラリア原虫ゲノムに特異的にハイブリダイズするその隣接（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕ ｓ）セグメントより成るハイブリダイゼーションプローブ。
8. ８．適切なベクター中の請求項７記載のハイブリダイゼーションプローブ。
9. ９．ベクターが大腸菌プラスミド、フィラメンタスファージ（Ｍ１３）、ラムボ イドバクテリオファージ、コスミド、サルモネラファージおよび酵母より選択さ れる請求項８記載のハイブリダイゼーションプローブ。
10. １０．ベクターが大腸菌プラスミドである請求項９記載のハイブリダイゼーショ ンプローブ。
11. １１．大腸菌プラスミドがｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９である請求項１１記載の ハイブリダイゼーションプローブ。
12. １２．ベクターがサルモネラＳＰ６ファージプロモーターまたはＴ７ファージプ ロモーターを含む請求項９〜１１のいずれかに記載のハイブリダイゼーションプ ローブ。
13. １３．３２Ｐ、１２５Ｉ、発色団基またはレポーター基で標識された請求項７〜 １２のいずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブ。
14. １４．レポーター基がビオチンである請求項１３記載のハイブリダイゼーション プローブ。
15. １５．請求項７〜１４のいずれかに記載のプローブを三日熱マラリア原虫ゲノム 中の各々の相同配列とハイブリダイズさせそして三日熱マラリア原虫ゲノムに結 合したプローブを検出することより成る、脊椎動物または無脊椎動物の生物学的 検体中の三日熱マラリア原虫の検出方法。
16. １６．ハイブリダイゼーションプローブが前記ＤＮＡ、（一本鎖）相補ＤＮＡま たはＲＮＡの配列を含むベクターより成る請求項１５記載の方法。
17. １７．その配列をベクターにクローン化することより成る、前記請求項４、５お よび６のいずれかに記載のヌクレオチド配列または三日熱マラリア原虫ゲノムに 特異的にハイブリダイズする隣接セグメントより成るハイブリダイゼーションプ ローブの調製方法。
18. １８．ベクターが大腸菌プラスミド、フィラメンタスファージ（Ｍ１３）、ラム ボイドバクテリオファージ、コスミド、サルモネラファージおよび酵母より選択 されることを特徴とする請求項１７記載のハイブリダイゼーションプローブの調 製方法。
19. １９．ベクターが請求項１０〜１４のいずれかに記載の請求項１８記載の方法。