JP3310281B2 - ノーワーク及び関連のウィルスを検出し同定するための方法と試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は食品薬品局（FDA）の助成及び奨励金によ
り一部支援されている。

発明の分野 本発明はノーワーク・ウィルスの合成クローン及びノ
ーワークとその関連のウィルスに対するプローブを作る
ことに関している。またこの発明はノーワーク及び関連
のウィルスの検出及び同定法に関している。

発明の背景 ノーワーク・ウィルスは米国における二番目に多い病
気である急性腸炎をおこす最も重要なウィルス性病原体
の一つである（Dingleら、1953年;Kapikan and Chanoc
k,1985年）。ウィルス性腸炎の42％以上のケースはノー
ワークまたはノーワーク様のウィルスによっていると考
えられている（Kaplanら、1982年）。ノーワーク・ウィ
ルスが水や食物で伝染することは報告されており、特
に、大きな伝染性の病気がハマグリ、トリガイ、カキ等
を含む汚染された貝類を食べておこることがある（Murp
hyら、1979年;Gunnら、1982年;Wilsonら、1982年;Gill
ら、1983年;DuPont,1986年;Morseら、1986年;Sekine
ら、1989年）。魚や貝に関連した食物の毒が最近増えて
いることは注目されており、魚貝類の消費が増加するこ
ととともに医師によるこれらの実体の認識が高まったこ
とにもよっている（Eastaugh and Shepherd,1989年）。
ノーワーク・ウィルスは1973年に発見された。しかし、
このウィルスについての知識は細胞培養で増やすことが
できず、またウィルス培養のための適当な動物モデルが
みつかっていないために、ごく限られたものになってい
る。それ故、発症者あるいはボランティアから得られた
糞便試料がウィルスの唯一の源である。糞便中のウィル
スの濃度は通常低く、そのためウィルスを通常の電子顕
微鏡で検出することはできない（Dolinら、1972年;Kapi
kianら、1972年;Thornhillら、1975年）。ノーワーク・
ウィルスを検出する現在の方法は免疫電顕やラジオイム
ノアッセイ（RIA）やビオチン−アビジン酵素結合イム
ノアブソーベントアッセイ（ELISA）のような、ヒトか
らとった急性期または回復期の血清を使用した方法があ
る。今日、動物からの抗血清はウィルス性抗原の量が十
分でないか性質が異常のために得られていない。ウィル
ス体の生物物理学的性質を予備的にみると、この粒子は
一つのポリペプチドをもっている（Greenbergら、1981
年）が、ウィルスの染色体を特徴づける努力は成功して
いない。それ故、これらウィルスは分類もされていない
ままである。

引用された関連情報 1. Dingle J.,Badger G.,Feller A.et al.,1953年，
「一群のクリーブランド家系における病気の研究:1.研
究計画と概観」Am.J.Hyg.58,16〜30。

2. Dolin R.,Blacklow NR,DuPont H,Buscho RF;Wyatt
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3. Dolin R,Blacklow NR,DuPont H,Formal S,Buscho R
F,Kasel JA,Chames RP,Hornick R,and Chanock RM.1971
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4. DuPont HL,1986年，「生の貝類の消費−−リスクは
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5. Eastaugh J.Shepherd S.1989年，「魚や貝類の消費
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6. Gill ON,Cubitt WD.McSwiggan DA,Watney BM and B
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11. Jiang X,Esters MK,Metcalf TG,and Melnick JL,19
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る種かき試料中のＡ型肝炎ウィルスの検出」Appl.Envir
on.Microbiol.52,711〜717。

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ィルスによって起されたカキからの腸炎のオーストラリ
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17. Sekine S,Okada S,Hayashi Y,Ando T,Terayama T,Y
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ける急性腸炎発症における小さな円形をしたウィルスの
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18. Thornhill TS,Kalica AR,Wyatt RG,Kapikian AZ,an
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ボランティアにおける実験的に起された腸炎中の糞便に
みられるノーワーク粒子の外殻のパターン」J.Infect,D
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19. Wilson R,Anderson LJ,Holman RC,Gary GW,and Gre
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20. Hayashi Y,Ando T,Utagawa E,Sekine S,Okada S,Ya
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急性腸炎発症と関連した円形をしたウィルスのウエスタ
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21. アメリカ合衆国特許No.4,358,535.1982年11月９日
発明者 Fahkow S and Moseley SL「臨床検査的微生
物学における特異的なDNAプローブ」 22. アメリカ合衆国特許No.4,751,080.1988年６月14日
発行。発明者 Wyatt RG,Kapikian AZ,Chanock RM,Midt
hum K,Flores J,Hoshino Y,「ロタウィルス病に対する
ワクチン」。

23. アメリカ合衆国特許No.4,814,268.1989年３月21日
発行。発明者 Kreider JW and Howett M.K.,「培養し
にくいヒトウィルスの増殖法とそれによる精製された懸
濁液を作る方法」。

発明の要約 本発明の目的にcDNAライブラリーを合成しクローニン
グすることによってノーワーク・ウィルス及びその関連
のウィルスを特徴づけることである。

cDNAのアミノ酸配列を推定することがこの発明の関連
した目的である。

この発明のもう一つの目的はノーワーク及び関連のウ
ィルスに対するポリクロナール及びモノクロナール抗体
を調製する方法を開発することである。

この発明のさらにもう一つの目的はノーワーク及び関
連のウィルスを検出するためのプローブを作る方法を開
発することである。

この発明のさらなる目的はウィルスを含むと思われる
試料中のノーワーク及び関連のウィルスを検出するため
の方法においてcDNAまたはその断片または誘導体を使う
ことである。

目的を完成しようとするために、ここに示す実施例に
よればノーワーク・ウィルスのcDNAクローンの断片の染
色体センス鎖のヌクレオチド配列は以下のものが含まれ
る。

上のヌクレオチド配列の中にRNA依存性RNAポリメラー
ゼがみられる領域がある。RNA依存性RNAポリメラーゼは
染色体のヌクレオチド配列の4543番目の塩基と4924の間
にある。RNAポリメラーゼとそれに対応するオリゴヌク
レオチドは以下の配列を含んでいる。

このオリゴペプチドやこのcDNAと一緒に見つけられる
全体の染色体を表わす他のcDNA、あるいはその他のオリ
ゴヌクレオチドあるいは全cDNAの断片などが診断用の製
造物やワクチンを作るのに用いられる。

本発明のその他の目的、特徴あるいは利点などはここ
に以下に示す選択された発明の実施例の記述から明らか
であろう。

図表の簡単な説明 図１ CsCl密度勾配精製後のノーワーク・ウィルスの電
顕像。

図2a 陽性のノーワークcDNAクローンを検索するための
³²Pで標識したプラスミドDNAによる糞便試料のハイブリ
ダイゼーション。２人のボランティアから採って対にし
た糞便［ノーワーク・ウィルスで感染する前（ｂ）と感
染後（ａ）］からの核酸をゼータバインド濾紙に滴下し
た。レプリカした濾紙を用意して50℃と65℃で各テスト
クローン（pUC−27,pUC−593,pUC−13,pUCNV−953）と
ハイブリダイズさせた。ノーワークに感染後の糞便検体
にのみ反応した（感染前には反応しない）一つのクロー
ン（pUCNV−953）が潜在的に陽性のクローンと考えら
れ、さらにキャラクタリゼーションに選抜された。

図2b ３人のボランティアの感染後違った時（Ｂ＝病気
の急性期前、Ａ＝急性期、Ｐ＝急性期をすぎた後）の糞
便試料を別々に３セットの³²P−標識したpUCNV−953ク
ローンのドットブロットハイブリダイゼーション。核酸
が直接、あるいはRNAアーゼで処理した後、または滴下
前にDNAアーゼで処理した後濾紙に滴下した。二重鎖の
同質のcDNA（pUCNV−953）を糞便検体と同じ処理後にス
ポットした。

図3a pGEMNV−953から作られたssRNAプローブとのCsCl
密度勾配中のノーワーク・ウィルスのドットブロットハ
イブリダイゼーション。CsCl密度勾配での各フラクショ
ンから50μとってゼータバインド濾紙にスポットし
た。同じ濾紙を２つ作って夫々を２つのssRNAプローブ
でハイブリダイズさせた。２つの鎖はcRNA（ウィルスの
核酸と明らかにハイブリダイズする）とvRNA（データは
示さないがウィルスの核酸とハイブリダイズしない）と
呼ばれた。このグラフはドットブロットハイブリダイゼ
ーションで同じCsCl密度勾配の各画分からのノーワーク
・ウィルスのEMカウントを示している。各区画から５区
画をカウントし区画当りのウィルスの数の平均を計算し
た。

図４ ノーワーク・ウィルスRNAの³²P標識クローンpUCN
V−953とのハイブリダイゼーション。部分精製されたウ
ィルスから抽出した核酸を既に報告された（Jiangら、1
989年）ようにネイティブゲル電気泳動にかけた。それ
からゲルを80℃で１時間乾燥し、³²P標識pUCNV−953挿
入体でハイブリダイズした。レーン１はE.coliからとっ
た23Sと16S rRNA（Miles Laboratories Inc.,Napervill
e,イリノイ州60566）。レーン２と４はノーワーク・ウ
ィルスを含んだ部分精製された糞便検体からの全核酸。
レーン３はHAVのRNA。

図５ 第一のノーワーク・ウィルスcDNAクローンの染色
体センス配列のヌクレオチド配列。このcDNA中の長いオ
ープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列も示さ
れている。

図６ pUC−13ライブラリーから分離したノーワーク・
ウィルス特異的なクローンの物理的地図。この地図はノ
ーワーク・ウィルスの染色体が8kbで100までの特徴づけ
られたクローンからなるサブセット（最も大きい４つ）
だけを示している。少くとも7kbの核酸を示すcDNAが予
め感染された糞便試料とあとで感染させた試料とハイブ
リダイズすることによって同定された。また、元のpUCN
V−953とその後の陽性クローンの５′−末端プローブで
ライブラリーを再検索することによっても同定されてい
る。クローンpUCNV−4145の３′−末端にポリ（Ａ）尾
部（〜80塩基）が存在する。クローンpUCNV−1011もボ
ランティアの事後感染試料で特異的にハイブリダイズし
た（事前感染試料ではしない）。（図７をみよ）。

図７ ノーワーク・ウィルスの染色体の３′−及び５′
−末端を示す³²P標識したプローブでの糞便試料のドッ
トブロットハイブリダイゼーション。糞便試料をノーワ
ーク・ウィルスに感染してから異なる時期（ａ〜ｅ）に
５人のボランティアから採取した。（ａ）列の試料は、
はじめの感染24時間後のまだ症状の現われない時に採取
した。残りの検体は感染後２から５日目に採取した。核
酸を抽出し、ゼータバインド濾紙にスポットして固定化
した。３′−及び５′−末端プローブを各々pUCNV−953
クローン、及びpUCNV−1011クローンから得た（クロー
ンについての記載は図６をみよ）。

図８ ノーワーク・ウィルスはRNA指向性ポリメラーゼ
配列模様をコードしている。ノーワーク・ウィルスpUCN
V−4095（NV）の部分の推定アミノ酸配列がＥ型肝炎ウ
ィルス（HEV）Ｃ型肝炎ウィルス（HCV）、Ａ型肝炎ウィ
ルス（HAV）、日本脳炎ウィルス（JE）、ポリオウィル
ス（polio）、口蹄疫ウィルス（FMD）、脳脊髄炎ウィル
ス（EMC）、シンドビス・ウィルス（SNBV）、タバコモ
ザイクウィルス（TMV）、アルファルファモザイクウィ
ルス（AMV）、スズメノチャヒキモザイクウィルス（BM
V）、ササゲモザイクウィルス（CpMV）の推定されてい
るRNA指向性RNAポリメラーゼをコードしていると思われ
る部分のアミノ酸残基の一致を比べている。NV以外のウ
ィルスの配列はReyesら、「Science,247,1335〜1339」
の図３からとった。

図９ ノーワーク・ウィルス染色体を増幅させるのに用
いた３セットのプライマー。

発明の詳細な記述 この発明の目的や精神からはなれることなく、ここに
開示された発明に対していろいろな置きかえや修正がで
きることは、この技術分野に通じた者にとってはあきら
かである。

ここに用いられる「断片」という言葉はポリクロナー
ルあるいはモノクロナール抗体を作らせることのできる
ペプチド断片を産生するために発現させることを必要と
する染色体またはそれから得られるクローンの断片と定
義する。免疫原となりうるには５アミノ酸からなるペプ
チドでよいが通常15アミノ酸またはそれ以上のペプチド
を要する。これには、ペプチドの性質に左右され、予め
予測することはできない。

ここに用いられている「誘導体」という言葉はノーワ
ーク染色体を表わすDNAのより大きな部分または付加的
なcDNAのことで、元のcDNA及びそれから推定されるアミ
ノ酸配列を直接あるいはそれを使うことによって検出さ
れるDNAを指す。従ってクローンpUCNV−1011は誘導体で
あるが、元のクローンと重複していないし、同じ配列を
もっていない。誘導体の定義の中にはDNA断片のRNAカウ
ンターパートや１つあるいはそれ以上の塩基が置換して
いるDNAあるいはcDNA断片やあるいは標識や末端構造がD
NAやcDNAの読み取りや発現に影響することなく付加され
たDNAまたはcDNAも含まれる。

分子クローニングのためのノーワーク・ウィルスの生産 ノーワーク・ウィルスは成人ボランティアに安全をテ
ストされたノーワーク・ウィルス（8F II a）を投与す
ることによって作られた。ボランティア研究に用いられ
たウィルス株はAlbert Kapikian博士（メリーランド州
ベセスダ市、国立衛生研究所、アレルギー・感染病研究
室）によって供与された。このウィルスはオハイオ州ノ
ーワークで急性腸炎の発症からとったものであった（Do
linら、1971年）。TBSで8F II aを1/100に希釈した液2m
を80mのミリＱ水（ミリポア社、マサチュセッツ州
ベドフォード01730）と共に１人ずつ経口投与された。
各人ともウィルス投与２分前と５分後に炭酸水素ナトリ
ウム液を投与された。ボランティアによる試験はベイラ
ー医科大学、メソジスト病院及びジェネラル医学研究セ
ンターにおいてヒト臨床試験研究審査委員会によって承
認された。ジェネラル医学研究センターにおいてボラン
ティアはウィルスを投与され、そこでボランティアは入
院して４日間厳密な医師監視下におかれた。全ての糞便
は集められ、あとで使うために−70℃に保存された。

糞便試料からのノーワーク・ウィルスの精製 糞便試料のTBS 10％液を3000rpm、15分間低速度での
遠心分離して清澄にした。得られた上清液を0.5％のツ
ヴィッタージェント３−14界面活性剤（Calbiochem Cor
p社、カリフォルニア州La Jolla市）の存在下でジェネ
トロンで２〜３回抽出した。水相中のウィルスを50.2Ti
ローター（ベックマン・インストルメント社、カリフォ
ルニア州パロアルト市94304）を用いて40％ショ糖クッ
ションを通して36,000rpm、90分間遠沈させることによ
って濃縮した。沈澱をTBSに懸濁し、CsCl液（屈折率で
1.368）と混合し、そしてSW50.1ローター（ベックマ
ン）で約35,000rpm、24時間遠沈した。CsCl密度勾配を
底部から孔をあけて分画し、各画分をEM検査によりウィ
ルスを追跡した。ノーワーク・ウィルスを含むピーク画
分を集め、試料中のCsClをTBSで希釈し、約35,000rpmで
１時間ウィルスを遠沈して取り出した。精製したウィル
スは約−70℃で保存した。

精製したウィルスからの核酸の抽出 一つの抽出法はCsCl密度勾配から得られた精製ノーワ
ーク・ウィルスをプロティナーゼＫバッファー（0.1Mト
リス塩酸、pH7.5、12.5mM EDTA,0.15M NaCl,1％w/v SD
S）中でプロティナーゼＫ（400μg/m）と約37℃、約3
0分間処理することを含んでいる。それからその試料を
フェノール・クロロホルムで１回、クロロホルムで１回
抽出した。水層中の核酸を0.2M酢酸ナトリウムの存在下
で2.5容量のエタノールで沈澱すること、次いで15分間
マイクロ遠心分離で沈澱させることによって濃縮した。

cDNA合成と増幅されたcDNAのクローニング 合成とクローニング法は精製されたノーワーク・ウィ
ルスから抽出された核酸を10mM CH₃HgOHで変性させるこ
とを含む。それからcDNAは準備されたランダムヘキサヌ
クレオチドプライマーを含むcDNA合成キット（アマシャ
ム社、イリノイ州アーリントンハイツ市60005）を用い
て合成した。２回目の鎖合成の後、反応混液をフェノー
ル・クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、
次いでエタノール沈澱した。DNAの増幅はDNA標識のため
のランダムプライムキット（プロメガ社、ウィスコンシ
ン州マジソン市53711−5305）を使って行われた。変性
（100℃、２分間）再縫合（室温に冷して２分間）そし
て伸長（室温30分間）をKlenow断片（プロメガ社）を添
加後８サイクル行った。DNAライブラリーはSma I部位に
対合２本鎖末端連絡をもったpUC−13の中に構築され
た。

ライブラリーの陽性クローン検索 検索の一方法として、形質転換したDH5アルファ細菌
細胞（BRL）からの白色のコロニーを拾い上げ、各々の
クローンについてマスタープレートとプラスミドDNAの
ミニプレップ両方を調製した。挿入部を含むクローンを
アガロースゲルでプラスミドDNAの電気泳動して同定し
た。挿入されたDNAはアガロースゲルから切り出してラ
ンダムプライマーとKlenowDNAポリメラーゼを使って、
例えばプライム・ア・ジーン 標識システム（プロメガ
社）のような系を使って³²Pで標識した。酵素や蛍光
剤、化学発光や生物発光基質のようなアイソトープや生
化学標識体も使われる。２人のボランティア（543と54
4）から得て対にした糞便試料（ノーワーク感染の前
後）から抽出した核酸をゼータバインド濾紙（AFM,Cun
o,コネティカット州メリデン市）上にスポットした。レ
プリカした濾紙片を作り、夫々65℃でフォルムアミドを
使わずに個々の標識プラスミドプローブとハイブリダイ
ズした。陽性と思われるクローンは感染前後の糞便で異
なる反応によって判定された。感染後の糞便で反応した
（感染前には反応しない）クローンを陽性と考え、マス
タープレート上のこれらクローンをさらにキャラクタリ
ゼーションに付した。一度ノーワーク・クローンが同定
されれば、それは付加的に重複しているクローンを同定
するためにcDNAライブラリーを再検査するのに使われ
た。これら付加的なクローンをもったcDNAライブラリー
の再検査によって最終的に全ノーワーク・ウィルス染色
体を表わすクローンを同定できる。

次のような実施例を説明のために提供するが、これが
いかなることによってもこの発明を限定するものではな
い。

実施例１ 電子顕微鏡確定 ノーワーク・ウィルスのより良い診断と分子的特徴づ
けのために、cDNAライブラリーを糞便試料から分離した
ウィルス体から抽出した核酸から作製した。ノーワーク
・ウィルスは糞便からＡ型肝炎やロタウィルスに対して
先に使われた方法で分離された（Jiangら、1986年）。
基本的にノーワーク・ウィルスを投与されたボランティ
アから採取した糞便試料を脂質と水不溶性物質を除くた
めジェネトロンで処理した。水相中のウィルスを40％シ
ョ糖クッションを通して沈澱させた。得られたペレット
を再懸濁し、超音波をかけ、等密度遠心分離のためのCs
Cl密度勾配にかけた。図１はCsCl密度勾配遠心分離後の
分離したノーワーク・ウィルスの電子顕微鏡像を示して
いる。約10⁹個の粒子がはじめのcDNAライブラリーを作
ったときに糞便500gから得られた。

実施例２ 初めのcDNA合成、クローニング及びスクリー
ニング cDNAライブラリーは、これら分離されたウィルスから
プロティナーゼＫ処理した後フェノール・クロロホルム
抽出、そしてエタノール沈澱をすることによって抽出さ
れた核酸から作られた（Jiangら、1986年、1987年）。
ウィルスの染色体の性質がわかっていないので、抽出さ
れた核酸をcDNA合成の前にメチル水銀ヒドロオキシドで
変性させた。ランダムプライムcDNAをグブラー・ホフマ
ン法（cDNA合成システムプラス、アマシャム社製）で合
成し、cDNAの少量を得た。この少量のcDNAの直接クロー
ニングは成功しなかった。それ故、DNAの増幅ステップ
をクローニングの前にDNAポリメラーゼのKlenow断片と
ランダムプライマーとでDNAのコピーを多く合成するこ
とで行った。変性、ランダムプライマーとDNAポリメラ
ーゼのKlenow断片の添加、再接合、伸長の循環がこの手
法に含まれる。この方法によって標識されたヌクレオチ
ドが生成物の中に直鎖状にとり込まれているのが、合成
のサイクル数が増えるにつれて増えて観察された。行わ
れるサイクル数は過剰の小さな断片の合成を避けるため
に限定した（10以下）。ノーワークのcDNAの場合には、
８サイクルの増幅を行い、約215μｇのDNAを得たがそれ
は出発のテンプレートcDNAから少くとも100倍の増幅さ
れたものである。この増幅cDNAは対合連結によってpUC
−13の中にクローン化され、陽性のクローン（pUCNV−9
53）を分離した。

陽性のノーワーク・ウィルス・クローンを得るため
に、陽性挿入部を含むプラスミドDNAの微小標品をアガ
ロースゲル電気泳動によって検査した。ゲル中のより大
きなクローンの挿入部を切り出し、「プライム・ア・ジ
ーン 標識システム（プロメガ社）」を使ってゲル中の
DNAでプローブを作った。これらのプローブを夫々２人
のボランティアから対にした糞便試料（ノーワーク感染
前後の対）とハイブリダイズさせた。（図2a）。１クロ
ーン（pUCNV−953）が両者の感染後の糞便試料と反応
し、感染前には反応しなかった。

実施例３ クローンpUCNV−953のウィルス性起原の確定 クローンpUCNV−953のウィルス起原をさらに確かめる
ために、さらに６つの対にした糞便試料をテストし、同
じ結果を得た。図2bはこの病気の感染後異なる時期に採
取した糞便とこのクローンをドットブロットハイブリダ
イズした結果を示している。急性期の糞便でのみ強い信
号が得られたが病気の前後ではみられない。この結果
は、ノーワーク下痢症患者からとった血清を使ってウィ
ルス性抗原についてのRIA分析した結果及びウィルス粒
子の検査のために試料を免疫電顕（IEM）の結果と一致
していた。この結果はまたこの病気の経緯中の糞便中の
ウィルス像とも一致している（Thornhillら、1975
年）。ノーワーク・ウィルス精製過程から得られるCsCl
勾配の画分とこのクローンをハイブリダイズしたとき、
ハイブリダイゼーションと電顕のウィルス粒子数の間に
は相関がみられた（図３）。ハイブリダイゼーションの
信号とウィルス粒子数ともにそのピークは1.38g/cm³の
密度の画分にあり、それはノーワーク・ウィルスの生物
物理学的性質について既報のものと一致している。最後
に、高度に精製したノーワーク・ウィルスをアガロース
ゲルで電気泳動してハイブリダイゼーションすることに
よって検査した。ノーワーク・ウィルスではみられるが
HAV（図４）やロタウィルスではみられない単一のハイ
ブリダイゼーション・バンドが観察された。pUCNV−953
cDNAの配列解析によってこのクローンは511bpであるこ
とが示された（図５）。この部分染色体cDNAはアミノ酸
配列が推定されるオープン・リーディング・フレームを
コードしている（図５）。Gen Bank（ベイラー医科大学
のEugeneソフトウェア、分子生物学情報源）によって他
の配列を比較してもヌクレオチドあるいは推定アミノ酸
配列に有意なホモロジーはみつからなかった。

実施例４ ウィルスの染色体を特徴づけるためのノーワ
ーク・ウィルスcDNAの利用 pUCNV−953 cDNAを転写ベクターpGEM−3Zf（＋）にサ
ブクローン化し、増殖させた。それからSP6とT7ポリメ
ラーゼを使ってin vitroで転写してssRNAプローブを生
産した。２つの逆向きのセンスssRNAプローブを別々に
ウィルスの核酸とハイブリダイズしたとき一つだけの鎖
がウィルスと反応しこれはウィルスの染色体が一本鎖で
あることを示している。図2bに示されるように、ハイブ
リダイゼーション信号は濾紙の上にそれを添加する前に
ウィルスの核酸をRNAアーゼ（DNAアーゼではない）で処
理することによって除かれたが、それはウィルスの染色
体がssRNAを含んでいることを示している。pUCNV−953
の配列をコンピュータで分析することによって挿入され
たDNAの２つの鎖のうちの１つに長いオープン・リーデ
ィング・フレームがみつかった。このコードしている鎖
と同じ配列をもったssRNAプローブはウィルスの核酸と
反応しないが、その相補的なssRNAプローブはハイブリ
ダイゼーション試験で反応する。それ故、ノーワーク・
ウィルスは陽性のセンス単鎖RNA染色体を含んでいる。
このノーワーク・ウィルス染色体の大きさは分子量マー
カーとアガロースゲルで精製したウィルスRNAの移動度
を比較することにもとづき約8kbと測定された。この大
きさはピコルナウィルス〔HAV及びポリオウィルス（図
４）〕のそれより若干大きい。

第二のcDNAライブラリーを再検査するために使われる
pUCNV−953 cDNAは次のようにして作られた。ノーワー
クあるいは関連のウィルスのクローンを精製したノーワ
ーク・ウィルスから得た核酸から分離することによって
合成した。cDNAは逆転写酵素とランダムプライマーを用
いて合成された。DNAの二番目の鎖はcDNAから合成され
た。そして少くともDNA1コピーがプラスミドまたはクロ
ーニング、発現ベクターの中に挿入された。そのライブ
ラリーを元のpUCNV−953 cDNAでスクリーニングしてノ
ーワークまたは関連の染色体の断片（または完全な形
の）を含むクローンを同定した。一方、少くとも１コピ
ーのDNAをラムダZAPII （ストラティジーン社）のよう
なクローニング及び発現ベクターに挿入し、そのcDNAラ
イブラリーをノーワークまたは関連の染色体の断片また
は完全な形を含む組換えファージをスクリーニングして
同定した。その他のcDNAも作られこの方法でみつけられ
た。ライブラリーを再検査するのにこれらの付加的なcD
NAを使うことによって新しいクローンを検出させた（図
６）。オリジナルのpUCNV−953と付加的な重複していな
いcDNA（pUCNV−1011）をプローブとして使うことでウ
ィルスを検出することを確認した（図７）。他の重複し
ているcDNA（pUCNV−4145）と重複していないcDNA（pUC
NV−4095）がノーワーク及び関連のウィルスを検出する
プローブとして有用である。

かくしてcDNAまたはそれからの断片または誘導体がノ
ーワーク及び他の関連のウィルスの染色体の検出するた
めの検査に使うことができる。検出法にはノーワーク・
ウィルス染色体を直接検出し、結合した量を測定するた
めの標識したcDNAまたはssRNAプローブが含まれる。一
方、小さなオリゴヌクレオチドプローブ（10ヌクレオチ
ドかそれ以上）とポリメラーゼ鎖反応増幅法がノーワー
ク及び関連のウィルス染色体の検出に使われる。cDNAに
おいてオープン・リーディング・フレームを発現させる
ことが診断製品やワクチンに使われる抗血清やモノクロ
ナール抗体を作るのに使われる。

上記の方法論を作って以下のようなノーワーク・ウィ
ルス染色体のヌクレオチド配列が同定されている。

配列の中にはヌクレオチド5354と5355のＧとＣの間にさ
らに塩基Ｇが加わることがありうる。

また上のヌクレオチド配列の4543から4924までの塩基
の中にRNA依存RNAポリメラーゼがある。

この染色体の部分がRNAポリメラーゼであるという事
実は他の陽性センスRNAウィルスにあるRNAポリメラーゼ
と比較することで確められている。（図８） 実施例５ ノーワーク・ウィルス染色体の配列を検出す
ることに基づく診断検査 ウィルスは臨床的な検体や汚染した水、食品検体にお
いては少量しか存在しないのでノーワーク・ウィルスを
検出するためにはバイブリダイゼーション法が選ばれ
る。以前にはノーワーク・ウィルスの染色体が知られて
おらず、配列についての情報が使えないのでノーワーク
とその関連の核酸を検出する可能性はなかった。ノーワ
ーク・ウィルスのcDNAから作られたプローブあるいはノ
ーワーク・ウィルス染色体配列から作られたプライマー
が診断用製品のための染色体を増幅させる方法を確立さ
せる。ノーワーク・ウィルスだけを同定させるプローブ
とノーワーク群の中の他のウィルスを同定するためのプ
ローブがこれら試薬の多くあるいは全てに共通な配列を
検出するためのノーワークに特異的な試験法も、あるい
は普遍的な試験法の開発を可能にする。

過去において糞便試料中のウィルスRNAのRT−PCRによ
る検出で遭遇する一つの大きな困難は、逆転写酵素とTa
qポリメラーゼの両方の酵素活性を阻害する何かわから
ない因子が存在することであった（WildeらJ.Clin.Micr
obiol 28,1300〜1307,1990年）。これらの因子は核酸抽
出の通常の方法では除くことがむずかしかった。セチル
トリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）やオリゴｄ
（Ｔ）セルロースを使ってウィルスRNAをこの阻害因子
と特異的に分ける技術が開発された。これらの技術は核
酸を選択的に沈澱させるが酸に不溶の多糖類を上清に残
したままにするCTABの独特な特性に基づいていた。得ら
れる核酸はさらにオリゴｄ（Ｔ）セルロースに吸着さ
せ、そして溶出することによって精製された。このステ
ップはポリ（Ａ）尾部を欠いた無関係の核酸を取除く。
この技術によって、ノーワーク・ウィルスは少量の糞便
試料（10％懸濁液で400μ）でもPCRによって容易に検
出された。例えば、少量の糞便中の低濃度に存在するRN
Aウィルスの染色体をRT−PCR及びランダムプライマーを
用いてRT−PCRによってウィルスRNAを増幅するステップ
を行った後にクローン化することが可能であることをこ
の技術分野に通じた者は認識するだろう。さらに、糞便
から阻害因子を除くことができる現在、糞中に存在する
他のウィルス（DNAウィルス、poly（Ａ）尾部をもたな
いRNAウィルスなど）の核酸を検出しクローン化するこ
ともできよう。

CTABとオリゴｄ（Ｔ）セルロースによる抽出法とそれ
に続くRT−PCRによるウィルスRNAの検出は糞便試料に用
いられるが水や食品試料についても使われる。糞便試料
は蒸留水に懸濁され（約10％,w/v）、ジェネトロンで一
回抽出される。上清のウィルスは約８％の終濃度でポリ
エチレングリコールで沈澱された。ウィルスのペレット
はSDSの存在下に約37℃，約30分間プロティナーゼＫ
（約400μg/m）で処理されてから、フェノール・クロ
ロホルムで１回そしてクロロホルムで１回抽出された。
約５％のCTABと約0.4M Naclの溶液を試料:CTAB＝約5:2
の割合で添加された。室温で約15分間、そして45℃で約
５分間反応させた後、核酸（ウィルスのRNAを含む）を
約30分間微量遠心分離機で遠沈することで採集した。得
られたペレットを約1MのNaclに懸濁し、クロロホルムで
２回抽出した。水層にあるウィルスのRNAはRT−PCR反応
に直接使われるかまたは、オリゴｄ（Ｔ）セルロースで
吸着／溶出によってさらに精製された。

オリゴｄ（Ｔ）セルロースによる吸着／溶出の回分法
はポリ（Ａ）尾部をもったRNAの精製に用いられた。こ
の方法においては、上記のようにして部分精製された核
酸またはフェノール・クロロホルムで、直接抽出された
RNA（CTAB処理はしない）は結合用緩衝液（約0.5M Nacl
と10mMのトリス、pH7.5）中でオリゴｄ（Ｔ）セルロー
スと混合した（約２〜4mg/試料）。混合液は約４℃で約
１時間、穏やかに振とうしながら反応させ、それから約
２分間微量遠心分離機で遠沈した。オリゴｄ（Ｔ）セル
ロースのペレットは３〜４回結合緩衝液で洗ってそれか
らポリ（Ａ）尾部をもったRNAを1 X TE緩衝液（約10mM
トリス、1mM EDTA,pH7.5）で溶出した。オリゴｄ（Ｔ）
セルロースを除くため遠心分離して上清を集め、そして
上清中のウィルスRNAをエタノールで沈殿させた。この
段階で得られたRNAは基本的に阻害因子を含まず、RT−P
CRに使うことができる。

予備的な試験では、ノーワーク・ウィルスのRNAはCTA
B法を用いて糞便試料0.05g以下で検出できた。CTABまた
はオリゴｄ（Ｔ）のいずれかだけで抽出したRNAにほ痕
跡の阻害活性がみられたが、これはRT−PCRの前に抽出
された核酸を希釈する（1:2）ことによって容易に除か
れた。CTABとオリゴｄ（Ｔ）法を組合せると高品質の、
阻害因子を含まない、ウィルス染色体のRT−PCR検出と
クローニングに直接使うことのできるRNAを得ることが
できた、少量の糞便からクローン化するこの方法の開発
で、この技術分野に通じた者は我々がいまや、染色体の
５′−末端を表わしているものを含む残りの染色体に対
するcDNAを得ることができることがわかるだろう。

PCRでの検出のために上記の染色体のヌクレオチド配
列に基づくプライマーが作られた。これらのプライマー
には以下のものが含まれる。すなわちプライマー1:CACG
CGGAGGCTCTCAATでヌクレオチドの7446から7463に位置し
ている。プライマー4:ヌクレオチド7009から7026に位置
しているGGTGGCGACAGGCCCTCC.プライマー8:ヌクレオチ
ド1409から1426に位置するTCAGCAGTTATAGATATG,プライ
マー9:ヌクレオチド612から629に位置するATGCTATATACA
TAGGTC.プライマー16:ヌクレオチド4010から4027に位置
するCAACAGGTACTACGTGAC,プライマー17:ヌクレオチド46
54から4671に位置しているTGTGGCCCAAGATTTGCT.これら
のプライマーは逆転写とポリメラーゼ・チェーン・リア
クション法（RT−PCR）を用いたウィルスの検出に有用
であることが示されている。図９はこれらプライマーを
用いたデータを示している。

実施例６ ノーワーク・ウィルス蛋白に対するポリクロ
ーナル抗体とモノクローナル抗体の作製 cDNA断片またはそれの誘導体にコードされている蛋白
が原核生物あるいは真核生物の発現系において生産さ
れ、診断検査法のためにポリクローナル抗体を製作する
ために動物を免疫するのに使われる。原核生物の宿主は
E.coli,S.tymphimurium,Serratia marcescens,Bacillus
subtilisのようなグラム陰性、グラム陽性の細菌が含
まれる。真核生物の宿主にはPichia pastorisのような
酵母や昆虫、哺乳動物細胞が含まれる。免疫される動物
はモルモット、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、あるいは
ウマやその他のトリのような非哺乳類や非ネズミの属が
含まれる。発現した蛋白を免疫応答刺激を高めるために
フロイント・アジュバントのようなアジュバントと混合
して、これらの動物に繰り返し免疫することによってそ
の蛋白に対する抗体が作られる。

一方、部分cDNA配列から（或いは、元のまたは他のク
ローンで検出される付加的なcDNAの配列を決めることに
よって確かめられた他の配列から）推定されるアミノ酸
配列にマッチさせるように作られた15アミノ酸より大き
な合成ペプチドがウシ血清アルブミンまたはリゾチーム
のようなキャリアー蛋白に結合されるか、またはグルタ
ルアルデヒドで処理することによって架橋され、そして
診断検査のためのポリクローナル抗体を生産するために
動物に免疫するのに使われる。

発現される蛋白または合成ペプチドで免疫された動物
の血清を免疫電顕やウエスタン・ブロット（免疫ブロッ
ト）、ブロッキングELISAのような免疫学的な分析法で
検査してノーワークや関連のウィルスに対する抗体が作
られているかどうかを調べる。発現された蛋白あるいは
合成ペプチドとの反応はポリクローナル血清の特異性を
示している。ノーワーク群において他のウィルスとの反
応（スノウ・マウンテン例、ハワイ例、タウントン例な
ど）は交差反応するエピトープを認識する試薬が作られ
ていることを示している。

上述したような免疫源を投与され、ポリクローナル抗
体を産生していることを示しているBalb/cマウスに免疫
原を追加投与し、それから屠殺した。その脾臓を摘出
し、ハイブリドーマとするためにミエローマ細胞と脾細
胞の融合を行った。この融合で生じたハイブリドーマを
発現蛋白やペプチド、ウィルス粒子などとの反応でスク
リーニングしてノーワーク・ウィルスに対するモノクロ
ーナル抗体を産生している細胞を選択した。ノーワーク
関連のウィルスでそのようなハイブリドーマをスクリー
ニングすることでこれらウィルスに対するモノクローナ
ル抗体を分泌しているハイブリドーマもとらえることが
できる。

この発明に特徴的な新しい特色が特許の請求範囲にみ
られる。本発明はまたここに含まれるその他のものと同
じくその目的を実施し、そして述べられている目標や利
点を得るために適合される。この発明についてのここに
選んで示された内容は開示のために示されたものでここ
に述べられた合成や使い方の詳細には多くの変更ができ
ることはこの技術分野に通じる者にとって明白である。
しかしながら、開示した特定の形にこの発明を限定する
つもりはないが逆にその意向が本発明の意図するところ
や展開の中で作り方や使い方やそれに当るものに加えら
れる変更法や修正の全てをカバーすることを理解すべき
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ５７３，５０９ (32)優先日 平成２年８月27日(1990．8．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 ジャン，ジ アメリカ合衆国，77030 テキサス，ヒ ューストン，ドライデン ナムバー８, 1956番地 (72)発明者 グレイアム，デェイヴィッド ワイ. アメリカ合衆国，77054 テキサス，ヒ ューストン，ミシレ 4051番地 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 5/10 C12N 9/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 の配列をもったcDNA又はその断片であって、該断片は15
   塩基以上のヌクレオチドであるcDNA又はその断片。
2. 【請求項２】以下に示す配列のRNA依存性RNAポリメラー
   ゼcDNA又は15塩基以上のヌクレオチドであるその断片。
3. 【請求項３】以下に示す配列のRNA依存性RNAポリメラー
   ゼアミノ酸配列又は15アミノ酸残基以上のペプチドであ
   るその断片。