ES2398413T3 - Kit de detección de SRSV - Google Patents
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Abstract
Un kit de detección de SRSV que consiste esencialmente en: (a) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 1,y (b) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 2,y (c) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 3,y (d) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 4, y (e) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 5 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 5,y (f) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 6 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 6,y (g) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 7 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 7,y (h) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 8,y (i) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 9, y (j) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 o unanticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO:, y (k) un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 oun anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ IDNO: 11.
Description
Kit de detección de SRSV
Esta invención se refiere a un kit para detectar y distinguir uno o más virus pequeños de estructura redonda (denominados en adelante "SRSV" por sus siglas en inglés) en un espécimen.
Los SRSV son un grupo de virus causantes de la gastroenteritis viral humana, remontándose el descubrimiento del primero de los mismos a 1972. Son conocidos por causar la gastroenteritis aguda infantil y también brotes de intoxicaciones alimentarias o similares entre adultos y niños de preescolar o de escuela primaria. Debido a la incapacidad para hacer proliferar estos SRSV mediante cultivo celular y a la carencia de modelos animales capaces de mostrar sensibilidad a los mismos, apenas se encuentran disponibles antígenos de SRSV y anticuerpos anti-SRSV, dando como resultado un retraso en el desarrollo de métodos inmunoserológicos para la detección de los virus.
En tales circunstancias, se logró clonar con éxito el gen del virus de Norwalk, un SRSV, en 1993, conduciendo a la determinación de la secuencia de bases de su genoma completo [Patente Japonesa (PCT) 6-506823 A]. Con posterioridad, se desarrollaron métodos de PCR que son útiles para amplificar una parte de una región de ARN polimerasa, y hasta la fecha se han encontrado 14 virus relacionados con SRSV. Como resultado de los análisis de aproximadamente 120 aminoácidos en estas regiones de las ARN polimerasa, se considera que los SRSV están diferenciados grosso modo en dos genogrupos, esto es, el Genogrupo I que incluye la cepa del virus de Norwalk como prototipo y el Genogrupo II que incluye la cepa del Virus Snow Mountain como prototipo.
A medida que se desarrollaron análisis genéticos de virus relacionados con SRSV, se tuvo conocimiento de que existía una diversidad sustancial incluso en el mismo genogrupo. Por otra parte, se encontró que con un método de RT-PCR que hacía uso de cebadores para los genes de las cepas de virus de Norwalk y de virus Snow Mountain como prototipos de los respectivos genogrupos, ninguno de los SRSV es detectable y también que es muy difícil diseñar cebadores o ajustar las condiciones de la RT-PCT para lograr una amplificación eficaz de los SRSV.
Mientras tanto, se prepararon antígenos contra algunos de los virus, tales como la cepa del virus de Norwalk y la cepa del virus Snow Mountain, mediante expresión genética, se obtuvieron anticuerpos, y también se desarrollaron métodos de detección de SRSV dependientes de ELISA haciendo uso de tales anticuerpos. No obstante, todavía fue imposible detectar ninguno de los SRSV causantes de la gastroenteritis debido a la diversidad de los SRSV.
En Japón, por otra parte, en 1997 se determinó que los SRSV eran los factores causantes de las intoxicaciones alimentarias tal como de definieron en el Food Sanitation Act de manera que, si se desencadena una intoxicación alimentaria por SRSV, se requiere la determinación de su ruta de infección. Por consiguiente se desea un método que detecte fácilmente y de manera segura e identifique los SRSV en las heces de un sujeto o en los alimentos.
El documento de HALE A et al, "Expression and self-assembly of grimsby virus: Antigenic distinction from Norwalk and Mexico viruses" CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, vol. 6, núm. 1, Enero 1999, páginas 142-145 describe la secuencia que codifica la proteína de la cápsida de GRV, su uso en la preparación de VLP de GRV, el uso de estas últimas para preparar antisuero hiperinmunitario anti-GRV, y la especificidad del serotipo de dichos antisueros hiperinmunitarios anti-GRV, anti-MXV y anti-NV (véase p. ej. la Tabla 2).
Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un kit que puede detectar fácilmente de un espécimen un virus relacionado con SRSV conocido hasta la fecha y pueda discriminar de manera segura su serotipo y genogrupo.
A la vista de las circunstancias anteriores, los autores de la presente invención han continuado con una investigación genética e inmunológica sobre los virus relacionados con SRSV. Como resultado, se ha encontrado que el uso combinado de anticuerpos obtenidos a partir de péptidos de virus relacionados con SRSV, incluyendo péptidos de virus novedosos encontrados recientemente, puede detectar la mayor parte de los SRSV en los especímenes y pueden discriminar de manera segura los Serotipos y los genogrupos de los SRSV, conduciendo a la realización de la presente invención.
Específicamente, la presente invención proporciona: 1. Un kit de detección de SRSV que consiste esencialmente en:
- (a)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 1, y
- (b)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 2, y
- (c)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 3, y
- (d)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 4, y
- (e)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 5 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 5, y
- (f)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 6 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 6, y
- (g)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 7 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 7, y
- (h)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 8, y
- (i)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 9, y
- (j)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 10, y
- (k)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 11.
- 2.
- Un kit de detección de SRSV de acuerdo con el apartado 1, en donde dichos anticuerpos han sido preparados mediante inmunización con partículas de tipo virus.
- 3.
- Un kit de detección de SRSV de acuerdo con el apartado 1, para distinguir los serotipos de los SRSV.
- 4.
- Un kit de detección de SRSV para discriminar el genogrupo de los SRSV, consistiendo el kit esencialmente en
- (a)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 1, y
- (b)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 2, y
- (c)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 3, y
- (d)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 4.
- 5.
- Un kit de detección de SRSV para discriminar el genogrupo de los SRSV, consistiendo el kit esencialmente en
- (e)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 5 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 5, y
- (f)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 6 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 6, y
- (g)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 7 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 7, y
- (h)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 8, y
- (i)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO:
9 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 9, y
- (j)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 10, y
- (k)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 11.
- 6.
- Un kit de detección de SRSV de acuerdo con los apartados 1 a 5, en donde los anticuerpos están inmovilizados sobre portadores de anticuerpos en fase sólida adecuados para capturar SRSV.
- 7.
- Un gen de Hu/NLV/Chiba/407/1987/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por el SEQ ID NO: 15; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4.
- 8.
- Un gen de Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por el SEQ ID NO: 20; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9.
- 9.
- Un gen de Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por el SEQ ID NO: 21; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10.
- 10.
- Un gen de Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por el SEQ ID NO: 22; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11.
- 11.
- Un anticuerpo anti-SRSV específico para partículas de tipo virus que consisten en el péptido del SEQ ID NO: 4, el SEQ ID NO: 9, el SEQ ID NO: 10 o el SEQ ID NO: 11.
La FIG. 1 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Seto
124/1989/JP.
La FIG. 2 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa
Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP.
La FIG. 3 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Chiba
407/1987/JP.
La FIG. 4 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Narita
104/1997/JP.
La FIG. 5 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Sanbu
809/1998/JP.
La FIG. 6 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Ichikawa
754/1998/JP.
La FIG. 7 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Chitta
1876/1996/JP.
La FIG. 8 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Kashiwa
47/1997/JP.
La FIG. 9 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Mie
7k/1994/JP.
La FIG. 10 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP.
La FIG. 11 es una micrografía electrónica (x 100.00) de partículas de tipo virus derivadas de la cepa Hu/NLV/Osaka
10-25/1999/JP.
Mejores Modos de Llevar a Cabo la Invención
El kit de detección de SRSV de acuerdo con la presente invención se caracteriza por el uso de anticuerpos contra los péptidos que constituyen los virus relacionados con SRSV que tienen las 11 secuencias de aminoácidos específicas o al menos 80% de homologías con las secuencias de aminoácidos de los grupos (a) a (k). De estos, los péptidos pertenecientes al grupo (d), al grupo (i), al grupo (j) y al grupo (k) son péptidos novedosos diferentes de cualquiera de los virus relacionados con SRSV registrados en el GeneBank hasta la fecha (Tabla 1, que se describirán con posterioridad en la presente memoria). Debido a la incorporación de los 11 anticuerpos, incluyendo los anticuerpos contra estos péptidos novedosos, en el kit, se pueden detectar sin omisión los virus relacionados con SRSV.
Los péptidos que constituyen los virus relacionados con SRSV útiles en la presente invención abarcan sus mutantes en cada uno de los cuales se han suprimido, remplazado o añadido uno o más aminoácidos de su secuencia de aminoácidos correspondiente; y también sus mutantes en cada uno de los cuales se han suprimido, remplazado o añadido una o varias bases a una secuencia de bases que codifica su correspondiente secuencia de aminoácidos.
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1 en el grupo (a) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos humana incluyen uno derivado de la cepa Desert Shield/90/SA (Núm. de Acceso Genebank U04469).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 en el grupo (b) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos incluyen aquellos derivados de la cepa KY-89/89J (Núm. de Acceso Genebank L23828) y la cepa Norwalk/68/US (Núm. de Acceso Genebank M876611).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 en el grupo (c) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos incluyen uno derivado de la cepa Southampton/91/UK (Núm. de Acceso Genebank L07418).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 en el grupo (d) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón.
El péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 tiene una homología de menos de 75% en el gen estructural (SEQ ID NO: 15) con cualquiera de las cepas de virus relacionados con SRSV (Tabla 1, que se describirán con posterioridad en la presente memoria) registrados en el GeneBank hasta la fecha, y es un péptido que tiene una secuencia novedosa no referida hasta la fecha hasta la fecha.
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 5 en el grupo (e) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos incluyen aquellos derivados de la cepa Bristol/93/UK (Núm. de Acceso Genebank X76716), la cepa Lordsdale/93/UK (Núm. de Acceso Genebank X86557), y la cepa Camberwell/94/AU (Núm. de Acceso Genebank U46500).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 6 en el grupo (f) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos incluyen aquellos derivados de la cepa Mexico/89/MEX (Núm. de Acceso Genebank U22498), la cepa Auckland (Núm. de Acceso Genebank U460391), la cepa Toronto/77/CA (Núm. de Acceso Genebank U02030), y la cepa OTH-25/89/J (Núm. de Acceso Genebank L23830).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 7 en el grupo (g) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos incluyen aquellos derivados de la cepa Snow Mountain/76/US (Núm. de Acceso Genebank U70059) y la cepa Melksham/89/UK (Núm. de Acceso Genebank X81879).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8 en el grupo (h) u péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón, mientras los ejemplos de los péptidos que tienen cada uno una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos incluyen uno derivado de la cepa Hawaii/71/US (Núm. de Acceso Genebank U07611).
Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9 en el grupo (i) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón.
El péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9 tiene una homología de menos de 75% en el gen estructural (SEQ ID NO: 20) con una cualquiera de las cepas de virus relacionados con SRSV (Tabla 1, que se describirán con posterioridad en la presente memoria) registrados en el GeneBank hasta la fecha, y es un péptido que tiene una secuencia novedosa no referida hasta la fecha.
5 Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 en el grupo (j) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón.
10 El péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 tiene una homología de secuencia de menos de 70% en el gen estructural (SEQ ID NO: 21) con una cualquiera de las cepas de virus relacionados con SRSV (Tabla 1, que se describirá con posterioridad en la presente memoria) registrados en el GeneBank hasta la fecha, y es un péptido que tiene una secuencia novedosa no referida hasta la fecha.
15 Es ilustrativo del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 en el grupo (k) un péptido que constituye un virus de la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP obtenido de las heces de un paciente infectado con SRSV en Japón.
El péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 tiene una homología de
20 secuencia de menos del 70% en el gen estructural (SEQ ID NO: 22) con una cualquiera de las cepas de virus relacionados con SRSV (Tabla 1, que se describirán con posterioridad en la presente memoria) registrados en el GeneBank hasta la fecha, y es un péptido que tiene una secuencia novedosa no referida hasta la fecha.
Tabla 1
- Cepa de virus
- Núm. de Acceso Genebank
- Desert Shield/90/SA
- U04469
- Norwalk/68/US
- M876611
- KY-89/89J
- L23828
- OTH-25/89/J
- L23830
- Southampton/91/UK
- L07418
- Lordsdale/93/UK
- X86557
- Bristol/93/UK
- X76716
- Camberwell/94/AU
- U46500
- Toronto/77/CA
- U02030
- Mexico/89/MEX
- U22498
- Snow Mountain/76/US
- U70059
- Melksham/89/UK
- X81879
- Auckland
- U460391
- Hawaii/71/US
- U07611
Los péptidos que constituyen virus relacionados con SRSV en estos grupos (a) a (k) incluyen, además de los péptidos anteriormente descritos, péptidos parciales que contienen cada uno una secuencia de aminoácidos específica en su correspondiente péptido y tiene una antigenicidad equivalente a la del correspondiente péptido.
30 De acuerdo con un análisis de homología de aproximadamente 120 aminoácidos de regiones de la ARN polimerasa de los péptidos que constituyen virus relacionados con SRSV, estos péptidos que constituyen virus relacionados con SRSV pueden ser clasificados en dos genogrupos. Descrito de manera específica, se pueden clasificar en el Tipo I al cual pertenecen los péptidos de los grupos (a) a (d) y el Tipo II al cual pertenecen los péptidos de los grupos (e) a
35 (k).
A partir de las heces de un paciente infectado con SRSV, se extrajo ARN viral utilizando el método del bromuro de 40 cetiltrimetilamonio (CTAB) o similar, se formó el ADNc por medio de un cebador de oligo-dT y una transcriptasa inversa, y utilizando el ADNc y cebadores capaces de amplificar regiones del gen estructural de los virus asociados con SRSV individuales, se llevó a cabo la PCR para amplificar los fragmentos génicos estructurales.
Dicho fragmento génico estructural se inserta en un plásmido llevando a cabo una vez una clonación TA con un vector de clonación de E. coli.
En cuanto al vector de clonación utilizable aquí, es posible utilizar un vector de clonación conocido tal como un vector derivado de un plásmido obtenido utilizando como anfitrión células procarióticas representadas por E. coli o a partir de un bacteriófago representado por el fago ë, y se desea utilizar de manera apropiadamente combinada un vector de clonación y su célula anfitriona. Los ejemplos específicos del vector de clonación incluyen pBR322, pUC19 y pCRII. La inserción del ADN se puede llevar a cabo mediante un método conocido per se en la técnica, y tras la formación de dicho vector, se desea utilizar células de E. coli ya que permiten una fácil manipulación genética.
Al disponer de los fragmentos de los genes que constituyen el virus individual obtenido anteriormente de los grupos
- (a)
- a (k) expresados con un sistema de expresión adecuado o al utilizar partículas de tipo virus creadas a partir de los péptidos que constituyen el virus mediante ingeniería genética, se pueden obtener anticuerpos contra los respectivos virus. A continuación se realizará una descripción sobre la expresión en la que se utiliza E. coli y también sobre la creación de las partículas de tipo virus.
- (1)
- Expresión por E. coli
Cada uno de los plásmidos con las regiones génicas estructurales de los respectivos virus relacionados con SRSV incorporados en ellas, es digerido con una endonucleasa de restricción que no escinde la región del gen estructural. Después, se recoge la región del gen estructural y se incorpora, por ejemplo, en pGEX (vector de expresión de la proteína de fusión GST; producto de Pharmacia AB), pTrc99A (vector de expresión de E. coli; producto de Pharmacia AB), pTrxFus (vector de expresión de proteína de fusión de tiorredoxina; producto de Invitrogen Corporation), pET (vector de expresión que hace uso del promotor pT7RNA; producto de Novagen Inc.), un vector de expresión de proteína de unión a maltosa, o un vector de expresión de proteína de fusión a galactosidasa. En este momento, la región del gen estructural que se va a incorporar puede tener toda su longitud o puede ser una región parcial, prefiriéndose que la región parcial contenga al menos un epítopo antigénico de un SRSV. Los vectores de expresión génica con las regiones del gen estructural incorporadas como se ha descrito más arriba son transformados mediante una cepa de E. coli adaptada para la expresión del gen, por ejemplo, la cepa BL21, la cepa DH10B, la cepa JM109 o la cepa XL1-Blue. La expresión del gen se puede llevar a cabo cultivando los transformantes así obtenidos en un medio de cultivo líquido general, por ejemplo, caldo L. Para la expresión se prefiere añadir un promotor de la expresión del gen, por ejemplo, IPTG o, cuando se utiliza un promotor PL, aplicar un choque térmico.
La purificación de un péptido expresado de este modo se puede llevar a cabo siguiente un método de purificación general para proteínas expresadas, que hace uso de E coli. Si la proteína expresada está en forma disuelta, por ejemplo, su purificación se puede llevar a cabo mediante cromatografía de afinidad haciendo uso de una columna de GST o una columna para proteínas de unión a maltosa. Si la proteína expresada está en una forma insoluble, su purificación se puede lograr llevando a cabo una cromatografía de afinidad haciendo uso de un quelato de Ni.
(2) Creación de partículas de tipo virus SRSV
Un plásmido con una región de un gen estructural de un virus relacionado con SRSV incorporada en el es digerido con una endonucleasa de restricción que no escinde la región del gen estructural. A continuación, la región del gen estructural se recoge y se incorpora, por ejemplo, en un vector de transferencia de baculovirus tal como pVL1393. El vector de transferencia y un ADN de baculovirus lineal, del cual se ha suprimido una región génica esencial para la proliferación, se someten a transfección en células de insecto de manera que se induce la recombinación homóloga para formar el baculovirus recombinante diana.
Infectando con el baculovirus recombinante así obtenido células de insecto tales como células Sf9 o células Tn5 e incubando las células de insecto infectadas en condiciones de crecimiento adecuadas de una manera conocida per se en la técnica, se expresa la proteína estructural de SRSV. Permitiendo que la proteína estructural experimente un auto-ensamblaje, se pueden producir partículas de tipo virus. El uso de un método de purificación bioquímico, por ejemplo, la centrifugación se hace posible aislar y purificar las partículas de tipo virus. Se puede confirmar si se han formado o no tales partículas de tipo virus sometiendo el producto auto-ensamblado a tinción negativa con acetato de uranilo y examinando el producto auto-ensamblado teñido al microscopio electrónico.
Las partículas de tipo virus obtenidas como se ha descrito más arriba no tienen infectividad ya que no contienen ningún gen internamente. Sin embargo, tienen una antigenicidad equivalente a la de las partículas de virus ya que estructuralmente tienen sustancialmente la misma forma que las partículas de virus.
4. Adquisición de anticuerpos contra virus relacionados con SRSV
Inmunizando un animal con el péptido que constituye el virus así obtenido o con las partículas de tipo virus, se puede preparar un anticuerpo anti-virus relacionado con SRSV. Por lo demás, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
La preparación de un anticuerpo inmune haciendo uso de partículas de tipo virus se puede llevar a cabo, por ejemplo, como se describirá a continuación. De una manera conocida per se en la técnica, se inmuniza un conejo con partículas de tipo virus de uno de los virus relacionados con SRSV, y a partir del suero separado, se puede obtener un anticuerpo IgG (anticuerpo anti-SRSV) contra las partículas de tipo virus. Para la separación y aislamiento del anticuerpo, se puede utilizar un método tal como la cromatografía en DEAE Sefarosa.
Utilizando los 11 tipos de partículas de tipo virus de los grupos (a) a (k) obtenidos como se ha descrito anteriormente y sus correspondientes anticuerpos anti-SRSV, se midieron sus reactividades cruzadas. Como se mostrará más abajo en la Tabla 2, no se mostró absolutamente ninguna reactividad cruzada entre los virus relacionados con SRSV individuales. De acuerdo con el método de detección de SRSV de la presente invención, es posible por lo tanto discriminar simultáneamente los serotipos de los 11 tipos de SRSV. Esto también indica la posibilidad de discriminar el Genogrupo I y el Genogrupo II entre sí al mismo tiempo.
5. Detección de virus relacionados con SRSV
Para la detección de uno o más SRSV en un espécimen por los anticuerpos anti-SRSV individuales obtenidos como se ha descrito, se pueden utilizar inmunoanálisis empleados convencionalmente que hacen uso de reacciones antígeno-anticuerpo, por ejemplo, radioinmunoanálisis mediante la técnica sándwich, análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) y similares, siendo particularmente preferido ELISA. Descrito específicamente, los 11 tipos de anticuerpos anti-SRSV se vierten por separado en una microplaca para preparar una placa de escrutinio de SRSV. Una dilución de una emulsión fecal, que se ha preparado a partir de heces de un paciente infectado con SRSV, se añade a los pocillos de la placa, y después se deja que reaccione. Después de eso se añaden los anticuerpos-anti-SRSV marcados con peroxidasa (POD) de los respectivos virus y se dejan reaccionar. Después de añadir una solución de sustrato (TMB que contiene peróxido de hidrógeno) y dejar que reaccione, se añade ácido sulfúrico 0,6 N para detener las reacciones. Midiendo la absorbancia (450 nm/630 nm) de cada pocillo por medio de un lector de placa automático para ELISA, se puede detectar el SRSV o los SRSV.
Cuando se desea llevar a cabo solamente la detección de uno o más SRSV en un espécimen, se puede preparar un kit de detección utilizando una microplaca con los 11 tipos de anticuerpos anti-SRSV mezclados e inmovilizados en ella. Para discriminar también los serotipos de los uno o más SRSV, se puede preparar un kit de detección utilizando microplacas con los 11 tipos de anticuerpos anti-SRSV inmovilizados por separado sobre ellas.
Adicionalmente, la discriminación de los genogrupos es posible por medio de un kit que hace uso de una microplaca con anticuerpos contra los péptidos de los grupos (a) a (d) mezclados e inmovilizados sobre ella (placa con Tipo I) o una microplaca con anticuerpos contra los péptidos de los (e) a (k) mezclados e inmovilizados sobre ella (placa con Tipo II).
Por otra parte, la inmovilización de los anticuerpos anti-SRSV individuales útiles en la presente invención con un portador tal como látex o cuenteas magnéticas hace posible capturar de manera segura uno o más virus relacionados con SRSV en un espécimen. El portador con uno o más virus asociados a SRSV capturados sobre él puede ser recuperado mediante centrifugación en el caso del látex o mediante un imán en el caso de las cuentas magnéticas. Después de la recuperación, se pueden extraer los ARN del virus y utilizarlos.
Ejemplo
Los kits de detección de SRSV de acuerdo con la presente invención se describirán específicamente más adelante en la presente memoria basándose en Ejemplos.
Ejemplo 1 Clonación de genes estructurales de virus relacionados con SRSV
(1) Síntesis de ADNc
Se añadieron PBS (9 mL) y "Daiflon" (1 mL) a heces (0,5 a 1,0 g) de un paciente con SRSV, seguido de homogeneización. El producto homogeneizado se centrifugó después a 3.000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se recogió en forma de una emulsión fecal al 10%.
Utilizando una alícuota de 1 L de la emulsión fecal, se extrajo el ARN del SRSV por medio del método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), y el ARN se suspendió eventualmente en una solución de pirocarbonato de dietilo al 0,1% (30 IL). Utilizando la suspensión, se preparó ADNc por medio de transcriptasa inversa derivada del cebador Oligo-dT(12-18) y AMV (Virus de la Mieloblastosis Aviar) (producto de SEIKAGAKU CORPORATION).
(2) Aislamiento de regiones de genes estructurales
Utilizando el ADNc preparado en el apartado (1) y cebadores para la amplificación de las regiones de genes
estructurales mostradas más abajo, se llevó a cabo la PCR. Después de la PCR, se separaron los fragmentos de
genes estructurales amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa, y a continuación se recuperaron
utilizando "SuprecTM-01" (TAKARA).
gen Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP:G1/F2 (SEQ ID NO: 23), Oligo-dT(33) (SEQ ID NO: 24)
gen Hu/NLV/Seto 124/1989/JP:G1/F2 (SEQ ID NO: 23), G1/R0 (SEQ ID NO: 25)
gen Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP:G1/F2 (SEQ ID NO: 23), Oligo-dT(33) (SEQ ID NO: 24)
gen Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP:D5 (SEQ ID NO: 26), CV-U4 (SEQ ID NO: 27)
gen Hu/NLV/Narita104/1997/JP:97k104/F1 (SEQ ID NO: 28), 97k104/R1 (SEQ ID NO: 29)
gen Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP:G2/F3 (SEQ ID NO: 30), MV-R1 (SEQ ID NO: 31)
gen Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP:G2/F3 (SEQ ID NO: 30), SMV-R1 (SEQ ID NO: 32)
gen Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP:G2/F3 (SEQ ID NO: 30), G2/R0 (SEQ ID NO: 33)
gen Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP: 97k104/F1 (SEQ ID NO: 28), Oligo-dT(33) (SEQ ID NO: 24)
gen Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP:G2/F3 (SEQ ID NO: 30), Oligo-dT(33) (SEQ ID NO: 24)
gen Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP:GFCR7 (SEQ ID NO: 34), Oligo-dT(33) (SEQ ID NO: 24)
(3) Clonación de genes estructurales
Se llevó a cabo la clonación TA de los fragmentos de genes estructurales recuperados en un vector de clonación de
E. coli, pCRII (producto de Invitrogen Corporation). A partir de estos clones se obtuvieron plásmidos con los genes estructurales de los virus incorporados, pCRII/645, pCRII/124, pCRII/258, pCRII/Chiba, pCRII/104, pCRII/809, pCRII/754, pCRII/76, pCRII/47, pCRII/7k, y pCRII/10-25.
Ejemplo 2 Determinación de las secuencias de bases
La determinación de las secuencias de bases de los genes estructurales de la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP, la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP, la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP, la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP, y la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP se llevó a cabo de la manera descrita más abajo.
En primer lugar, se dispuso en cebador (primer cebador) en las cercanías del promotor de la polihedrina de pVL1393 como vector de transferencia, y mediante el método de terminación con colorante, se llevó a cabo una reacción de marcaje utilizando un "Cycle Sequencing Kit FS" (producto de Perkin-Elmer Corp.). La concentración de ADN del vector de transferencia empleado fue de 0,4 Ig/IL, mientras que la concentración del cebador de secuenciación utilizado fue de 3,2 pmoles/IL. Después de la reacción, se eliminó el exceso de pigmento fluorescente utilizando una columna de centrifugación Centriprep (fabricada por Perkin-Elmer Corp.). La mezcla de reacción se secó completamente por medio de un liofilizador de vacío, y el producto liofilizado se suspendió en un tampón de muestra especial (20 IL; producto de Perkin-Elmer Corp.). Después de la agitación, la suspensión se sometió a precipitación centrífuga. El producto precipitado se secó a 95°C durante 2 minutos. Después de la extinción, se analizó por medio de un secuenciador automático ("ABI Genetic Analyzer 310").
Utilizando la secuencia de bases determinada por el primer cebador, se colocó un nuevo cebador de secuenciación (segundo cebador) en el lado 3' de la secuencia de bases. Utilizando este segundo cebador, se llevó a cabo una reacción de marcaje mediante un kit de secuenciación cíclica de una manera similar a la mencionada más arriba. Después de la reacción, se llevó a cabo una operación similar a la mencionada más arriba, y se analizó la secuencia de bases por medio de un secuenciador automático. Como se ha descrito más arriba, se colocó un cebador se secuenciación en el lado 3' de la secuencia de bases determinada en cada ciclo, y se realizó la determinación de la secuencia de bases. Repitiendo este procedimiento, se determinaron las secuencias de bases de los extremos 5' a los extremos 3' de los 11 tipos de genes estructurales de virus relacionados con SRSV (SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 22). Entre estas, se confirmó que las secuencias de bases representadas por el SEQ ID NO: 15 (la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP), el SEQ ID NO: 20 (la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP), el SEQ ID NO: 21 (la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP) y el SEQ ID NO: 22 (la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP) eran secuencias novedosas no referidas hasta la fecha.
Ejemplo 3 Creación de baculovirus recombinante capaz de producir partículas de tipo virus
(1) Construcción de vectores de transferencia
Los plásmidos con las regiones de los genes estructurales incorporadas, que se habían obtenido en el Ejemplo 1(3), fueron digeridos por medio de una endonucleasa de restricción que no escinde las regiones de genes estructurales. Con posterioridad a la separación mediante electroforesis en gel de agarosa, se recuperaron las regiones de genes estructurales mediante "SuprecTM01" (TAKARA). Los fragmentos génicos recuperados se incorporaron a vectores de transferencia de baculovirus pVL1393 (producto de Invitrogen Corporation), que habían sido digeridos con la misma endonucleasa de restricción, para preparar los vectores de transferencia.
(2) Creación de baculovirus recombinantes
Se disolvieron ADN de baculovirus (0,5 Ig; "Baculo-Gold") y uno de los vectores de transferencia (1 Ig) obtenidos en el apartado (1) en agua destilada (8 IL). La solución resultante se mezcló con una dilución 1/2 de lipofectina (cantidad equivalente), y la mezcla obtenida de este modo se dejó a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Después se suspendieron células Sf9 (1 x 105 células) en un medio de cultivo para células de insecto, "Ex-cell 400", se adsorbieron a 26,5°C durante 30 minutos en una placa de Petri de plástico (diámetro: 3,5 cm), se añadió gota a gota a las células una mezcla del vector de transferencia y "Baculo-Gold", seguido de incubación a 26,5°C. Veinticuatro horas más tarde, el medio de cultivo se remplazó por "TC100" (producto de GIBCO BRL Life Technologies; referido más adelante en la presente memoria como "TC100") que contenía suero bovino fetal al 10% y BTB al 2% (productos de GIBCO BRL Life Technologies), y se continuó la incubación adicionalmente.
(3) Purificación de baculovirus recombinantes
Después de que cada uno de los baculovirus recombinantes obtenidos en el apartado (2) fuera incubado durante 5 días, se diluyó el sobrenadante de cultivo 1/10 con un medio de cultivo para células de insecto tal como TC100. Se tomó una alícuota de 0,1 mL del sobrenadante diluido, y se inoculó en 3 x 106 células Sf9 cultivadas en una placa de Petri de plástico de 3,5 cm de diámetro. Después de una adsorción a 26,5°C durante 60 minutos, se puso encima el medio de cultivo TC100 (2 mL) que contenía 1% de Agarosa ME (agarosa de bajo punto de fusión), seguido de incubación a 26,5°C. A los cuarto día del inicio de la incubación, se añadió en la parte superior TC100 adicional (1 mL) que contenía 0,005% de rojo neutro, seguido de incubación a 26,5°C. Al día siguiente, las placas formadas se separaron raspando con una micropunta de pipeta, y se suspendieron en medio de cultivo TC100.
(4) Producción de siembras de baculovirus recombinante y medición de sus potencias infectivas
Cada una de las suspensiones obtenidas en el apartado (3) se inoculó a 1 x 107 células Sf9. Con posterioridad a la adsorción a 26,5°C durante 60 minutos, se añadió TC100, seguido de incubación a 26,5°C durante 3 a 4 días. El cultivo se centrifugó a 2.500 rpm durante 10 minutos a 4°C, y se recogió el sobrenadante de cultivo. El sobrenadante de cultivo recogido se inoculó a 1 x 107 células Sf9. Después de la adsorción a 26,5°C durante 60 minutos, se añadió TC100, seguido de incubación a 26,5°C durante 3 a 4 días.
A continuación, se inoculó el sobrenadante de cultivo a 3 x 107 células Sf9 en una placa de Petri de plástico de 3,5 cm de diámetro. Con posterioridad a la adsorción a 26,5°C durante 60 minutos, se añadió en la parte superior medio de cultivo TC100 (2 mL) que contenía 1% de Agarosa ME (agarosa de bajo punto de fusión), seguido de incubación a 26,5°C. El cuarto día después del inicio de la incubación, se añadió en la parte superior TC100 (1 mL) que contenía 0,005% de rojo neutro, seguido de incubación a 26,5°C. Al día siguiente, las placas formadas se midieron para calcular la potencia infectiva del baculovirus recombinante. Esto se registró como la potencia infectiva del baculovirus recombinante.
Ejemplo 4 Creación de partículas de tipo virus
(1) Expresión de proteínas estructurales utilizando baculovirus recombinantes
Las células Sf9 fueron infectadas con cada uno de los baculovirus recombinantes a una M.O.I. (Multiplicidad de infección) de 1 a 10. Tras la infección, se añadió una suspensión del baculovirus recombinante gota a gota a las células, y el baculovirus recombinante se sometió a adsorción durante aproximadamente 60 minutos con sacudimiento suave. Después de eso, se añadió TC100 como medio de cultivo para células de insecto, seguido de incubación a 26,5°C durante 5 a 6 días.
(2) Identificación de las proteínas expresadas
Se tomaron muestras del sobrenadante de cultivo de cada una de las infecciones con virus recombinante periódicamente. Después de la resolución mediante SDS-PAGE, se detectó la proteína mediante tinción con azul de Coomassie, y por medio del peso molecular esperado, se confirmó la validez de la proteína expresada. Adicionalmente, después de resolver la proteína mediante SDS-PAGE, se transfirió la proteína sobre una membrana de nitrocelulosa, y por medio de la técnica de transferencia Western, se identificó después la proteína expresada con suero de convaleciente de SRSV.
(3) Purificación y recuperación de las partículas de tipo virus
Las semillas de baculovirus recombinante se infectaron a una M.O.I. de 1 a 10. Después de la adsorción durante aproximadamente 60 minutos, se añadió "Ex-cell 400", seguido de incubación a 26,5°C durante 3 días. Después se añadió un inhibidor de proteasa, por ejemplo, pepstatina A o una leupeptina, al cultivo a una concentración final 1 mM, seguido de incubación adicional durante 2 a 3 días.
Después de la incubación, el cultivo se centrifugó a 2.500 rpm durante 10 minutos a 4°C para recoger el sobrenadante de cultivo. El cultivo recogido se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 minutos para eliminar el baculovirus recombinante. El sobrenadante se centrifugó a 25.000 rpm durante 4 horas en un "Beckmann SW28 Rotor" para que las partículas de tipo virus precipiten. A continuación, el tubo de centrífuga del cual se había descartado el sobrenadante se mantuvo boca abajo para eliminar por completo el sobrenadante. Después de eso, se añadió tampón Grace o PBS(-) (0,5 mL) con el inhibidor de proteasa incorporado al tubo de centrífuga, y se dejó que la centrífuga reposara durante la noche a 4°C.
Después del reposo, las partículas de tipo virus se suspendieron en el tampón Grace que contenía el inhibidor de proteasa que se había añadido, y se recuperaron. A las partículas de tipo virus recuperadas, se le añadió el tampón Grace que contenía inhibidor de proteasa o PBS(-) con CsCl (3,8 g) añadido para dar 13 mL. La mezcla resultante se ultracentrifugó a 16°C y 35.000 rpm durante 24 a 48 horas. Después de la ultracentrifugación, se recogió una banda de color pálido en la que se acumulaban las partículas de tipo virus. Tras una dilución 1/5 con tampón Grace que contenía inhibidor de proteasa, la suspensión resultante se ultracentrifugó a 45.000 rpm durante 3 horas en un "Beckmann TL100.3 Rotor" para que precipitaran las partículas de tipo virus.
Las partículas de tipo virus precipitadas se solubilizaron con tampón Grace o PBS(-) al cual se había añadido inhibidor de proteasa. Se prepararon soluciones de tampón Grace que contenía inhibidor de proteasa que contenían sacarosa del 10% al 50% en un tubo 4PA, al cual se había añadido en la parte superior la solución solubilizada de las partículas de tipo virus, seguido de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa a 35.000 rpm durante 4 horas a 4°C. Después de la centrifugación, se recogió una banda de color pálido de partículas de tipo virus como partículas de tipo virus SRSV purificadas en una jeringa de 1 mL con una aguja 26G.
Las partículas de tipo virus SRSV purificadas se diluyeron con tampón Grace según se necesitara, y se midió la cantidad de proteína mediante el método Bradford.
Las partículas de tipo virus SRSV purificadas se sometieron a tinción negativa con acetato de uranilo, y a continuación se examinaron con el microscopio electrónico para averiguar si se habían formado o no partículas de tipo virus (FIGS. 2 a 12).
Ejemplo 5 Preparación Anticuerpos Inmunes y Anticuerpos Marcados mediante el Uso de Partículas de Tipo Virus
(1) Preparación de anticuerpos inmunes contra partículas de tipo virus
Se mezclaron un tampón de fosfato (pH 7,2, 1 mL) – que contenía partículas de tipo virus SRSV purificadas (500 Ig) obtenidas de una de la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP, la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP, la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP, la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP, y la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP -y el coadyuvante incompleto de Freund (1 mL), y a continuación se inmunizó un conejo blanco New Zealand (3 kg) de una manera conocida per se en la técnica. Tres semanas más tarde, el conejo se inmunizó adicionalmente con una mezcla de tampón de fosfato (pH 7,2, 1 mL), que contenía las partículas de tipo virus SRSV (0,25 Ig), y el coadyuvante incompleto de Freund (1 mL) (dosis de refuerzo). Tres semanas más tarde, se llevó a cabo la inmunización como en la dosis de refuerzo, y aproximadamente 7 a 10 días después de la dosis de refuerzo, se llevó a cabo la exanguinación, y se separó el componente del suero.
Después de someter el suero separado y purificado a fraccionamiento con sulfato de amonio, se sometió a diálisis la fracción relevante durante la noche a 4°C frente a Tris-HCl 50 mM (pH 7,6). El producto dializado interno se sometió después a cromatografía en DEAE Sefarosa que había sido equilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 7,6). Bajo supervisión a una longitud de onda UV de 280 nm, se recogió un pico D.O. para obtener un anticuerpo IgG purificado en DEAE (anticuerpo anti-SRSV) contra las partículas de tipo virus.
(2) Preparación de anticuerpos marcados
Se marcó cada uno de los anticuerpo anti-SRSV con POD mediante una técnica mejorada con ácido peryódico ["Koso Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immunoassay)", 2, 91, 1982]. Descrito de manera específica, se disolvió POD a 4 mg/mL en agua destilada y se añadió peryodato de sodio 0,1 M (0,2 mL), seguido de reacción a la temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. La mezcla de reacción se sometió a diálisis después durante la noche frente a tampón de acetato de sodio 1 mM (pH 4,0). Después de la diálisis, se añadió tampón de carbonato de sodio 0,2 M (pH 9,5, 0,02 mL) para ajustar el pH a 9,5, y al mismo tiempo, se añadió anticuerpo anti-SRSV (8 mg).
Después de dejar que reaccionaran a la temperatura ambiente durante 2 horas, se añadió borohidróxido de sodio de 4 mg/mL (0,1 mL), seguido de reacción a 4°C durante aproximadamente 2 horas. Después de la reacción, se llevó a cabo la filtración en gel con "Sephacryl S-200" mientras se utilizaba tampón de fosfato 10 mM. Bajo supervisión a una longitud de onda UV de 280 nm, se recogió una fracción de anticuerpo anti-SRSV marcado con POD.
(3) Preparación de una microplaca de anticuerpo anti-SRSV en fase sólida
Los anticuerpos anti-SRSV se diluyeron por separado con un tampón de carbonato (pH 9,5) a una concentración de 0,5 a 10 Ig/mL y después se vertieron a 100 IL/pocillos en una microplaca de fondo plano de poliestireno (fabricada por Nunc). Después se permitió que la microplaca reposara durante la noche a 4°C. Después de reposar durante 18 horas o más, la microplaca se lavó de 3 a 4 veces a 200 IL/pocillos con PBS que contenía "Tween 20" a una concentración final de 0,05%. A continuación se añadió PBS 10 mM (pH 7,2) – que contenía albúmina de suero bovino (BSA) y "Tween 20" a concentraciones finales de 0,5% y 0,05%, respectivamente – a 200 IL/pocillo. Se dejó reposar la microplaca durante la noche a 4°C para obtener una microplaca con anticuerpo anti-SRSV en fase sólida.
Ejemplo 6 Reactividad Cruzada
(1) ELISA de Detección de Antígeno
Las partículas de tipo virus SRSV purificadas de cada grupo se diluyeron entre 4 ng/mL y 0,04 ng/mL con una solución que contenía albúmina de suero bovino (BSA) y "Tween 20" a concentraciones finales de 0,2% y 0,05%, respectivamente, en un tampón (PBS 10 mM, pH 7,2).
A continuación, se añadieron cada una de las emulsiones diluidas de las partículas de tipo virus (VLP) a 100 IL/pocillo a los pocillos de la correspondiente microplaca de anticuerpo anti-SRSV en fase sólida, seguido de una reacción a la temperatura ambiente durante 60 minutos. Tras la reacción, las mezclas de reacción de los pocillos se eliminaron mediante succión. Se añadió a los pocillos PBS 10 mM (pH 7,2) que contenía "Tween 20" a una concentración final de 0,05% a 200 IL/pocillo, y después se eliminó mediante succión del mismo modo. Este procedimiento se repitió al menos tres veces. Después de lavar, se añadió el anticuerpo anti-SRSV marcado con POD del correspondiente serotipo, que se había diluido 1/20000 con un tampón, a 100 IL/pocillo, seguido de reacción a la temperatura ambiente durante 60 minutos. Después del lavado, se añadió una solución de TMB con peróxido de hidrógeno a 100 IL/pocillo, seguido de reacción a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras la reacción, se añadió ácido sulfúrico 0,6 N a 100 IL/pocillo, y se midió la absorbancia (450 nm/630 nm) de cada pocillo por medio de un lector automático de ELISA. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 Reactividad cruzada entre Serotipos
- VLP Purificadas
- Concentración VLP (ng/mL) Placa de anticuerpo en fase sólida x POD (superior: nombre de la cepa, inferior: dilución de anticuerpo marcado con POD)
- 124 20000
- 258 20000 407 20000 645 20000 104 20000 809 20000 754 20000 1876 20000 47 20000 7k 20000 10-25 20000
- 124
- 4 1,430 0,018 0,013 0,016 0,013 0,007 0,007 0,008 0,010 0,019 0,009
- 0,4
- 0,192 0,011 0,010 0,011 0,014 0,007 0,007 0,008 0,011 0,018 0,009
- 0,04
- 0,030 0,011 0,011 0,011 0,013 0,007 0,007 0,009 0,012 0,018 0,009
- 258
- 4 0,042 1,831 0,114 0,020 0,015 0,009 0,007 0,010 0,012 0,019 0,010
- 0,4
- 0,013 0,270 0,022 0,013 0,016 0,009 0,007 0,009 0,013 0,019 0,011
- 0,04
- 0,008 0,043 0,012 0,011 0,017 0,008 0,007 0,009 0,012 0,018 0,010
- 407
- 4 0,084 0,045 0,974 0,010 0,015 0,007 0,007 0,009 0,011 0,018 0,009
- 0,4
- 0,016 0,012 0,134 0,010 0,013 0,007 0,008 0,009 0,011 0,018 0,009
- 0,04
- 0,009 0,010 0,025 0,011 0,014 0,007 0,007 0,008 0,011 0,019 0,009
- 645
- 4 0,149 0,034 0,023 0,320 0,016 0,008 0,008 0,009 0,011 0,020 0,010
- 0,4
- 0,024 0,013 0,012 0,045 0,017 0,009 0,008 0,009 0,012 0,019 0,011
- 0,04
- 0,010 0,010 0,011 0,014 0,015 0,009 0,008 0,008 0,012 0,021 0,011
- 104
- 4 0,007 0,009 0,009 0,010 0,708 0,007 0,015 0,025 0,017 0,031 0,009
- 0,4
- 0,010 0,009 0,009 0,010 0,094 0,008 0,008 0,011 0,013 0,020 0,009
- 0,04
- 0,009 0,009 0,010 0,011 0,024 0,008 0,007 0,009 0,012 0,020 0,009
- 809
- 4 0,013 0,012 0,012 0,011 0,114 0,877 0,047 0,143 0,046 0,080 0,017
- 0,4
- 0,010 0,010 0,011 0,011 0,030 0,134 0,013 0,033 0,018 0,028 0,013
- 0,04
- 0,009 0,010 0,010 0,010 0,017 0,022 0,008 0,011 0,014 0,020 0,011
- 754
- 4 0,008 0,011 0,009 0,010 0,038 0,008 0,286 0,068 0,025 0,027 0,013
- 0,4
- 0,008 0,009 0,010 0,011 0,017 0,008 0,038 0,015 0,013 0,020 0,010
- 0,04
- 0,009 0,009 0,011 0,011 0,016 0,008 0,011 0,010 0,012 0,020 0,009
- 1876
- 4 0,010 0,012 0,011 0,011 0,026 0,009 0,013 0,728 0,023 0,025 0,012
- 0,4
- 0,009 0,014 0,010 0,011 0,017 0,009 0,008 0,089 0,015 0,021 0,013
- 0,04
- 0,011 0,010 0,010 0,012 0,016 0,010 0,007 0,017 0,014 0,019 0,011
- 47
- 4 0,008 0,009 0,009 0,010 0,017 0,007 0,008 0,011 0,324 0,021 0,014
- 0,4
- 0,008 0,009 0,009 0,011 0,015 0,008 0,008 0,009 0,048 0,020 0,013
- 0,04
- 0,008 0,009 0,009 0,011 0,014 0,008 0,008 0,008 0,017 0,022 0,011
- 7k
- 4 0,009 0,010 0,010 0,011 0,019 0,009 0,010 0,011 0,015 0,160 0,014
- 0,4
- 0,009 0,011 0,010 0,011 0,016 0,008 0,008 0,008 0,015 0,035 0,016
- 0,04
- 0,011 0,010 0,010 0,011 0,017 0,009 0,008 0,009 0,014 0,022 0,015
- 10-25
- 4 0,009 0,010 0,010 0,011 0,098 0,010 0,022 0,069 0,033 0,058 1,050
- 0,4
- 0,007 0,009 0,010 0,011 0,026 0,009 0,009 0,020 0,018 0,026 0,163
- 0,04
- 0,009 0,009 0,009 0,012 0,016 0,009 0,007 0,011 0,015 0,023 0,029
- Blanco
- 0,009 0,011 0,010 0,011 0,016 0,009 0,008 0,009 0,017 0,022 0,016
En la tabla, "645" indica la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP, "124" la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP, "258" la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP, "407" la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP, "104" la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP, "809" la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP, "754" la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP, "1876" la cepa Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP, "47" la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP, "7k" la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP, y "10-25" la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP.
Como resultado, no se observó reactividad cruzada entre los virus del mismo genogrupo, por no hablar de la reactividad cruzada entre virus de los diferentes Genogrupos I y II. Se confirmó, por lo tanto, que los serotipos de los 11 tipos de cepas de virus utilizados eran diferentes entre sí.
Ensayo 1 Discriminación de los SRSV del Genogrupo
Los anticuerpos anti-SRSV contra los SRSV pertenecientes al Genogrupo I (la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP, la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP, la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP, y la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP) se diluyeron con un tampón de carbonato (pH 9,5) a una concentración de 0,5 a 10 Ig/mL y después se mezclaron. La mezcla así obtenida se vertió a 100 IL/pocillo en una microplaca de fondo plano de poliestireno (fabricada por Nunc). La microplaca se dejó reposar durante la noche a 4°C. Tras dejar reposar durante 18 horas o más, la microplaca se lavó de 3 a 4 veces a 200 IL/pocillo con PBS que contenía "Tween 20" a una concentración final de 0,05%. Después se añadieron PBS 10 mM (pH 7,2) – que contenía albúmina de suero bovino (BSA) y "Tween 20" a concentraciones finales de 0,5% y 0,05%, respectivamente – a 200 IL/pocillo. Se dejó reposar la microplaca durante la noche a 4°C para obtener una microplaca con los anticuerpos IgG anti-SRSV contra los respectivos serotipos del Genogrupo I portados en una forma en fase sólida mixta (placa de Tipo I).
A continuación, se formaron de un modo similar los anticuerpos anti-SRSV contra los SRSV pertenecientes al Genogrupo II (la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP, y la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP) en una fase sólida para obtener una placa de Tipo II.
A las heces (0,5 a 1,0 g) de cada paciente con SRSV, se le añadieron PBS (9 mL) y "Daiflon" (1 mL), seguido de homogeneización. La suspensión preparada de este modo se centrifugó a 19.000 g durante 20 minutos, y el sobrenadante se recogió y se formó en una emulsión fecal al 10%. La emulsión fecal al 10% se diluyó 1:1 en volumen con un tampón. La emulsión diluida se añadió a 100 IL/pocillo a pocillos de placas de Tipo I y Tipo II, y se dejó reaccionar a la temperatura ambiente durante 60 minutos. Tras la reacción, las mezclas de reacción se eliminaron por succión. Se añadió PBS 10 mM (pH 7,2) – que contenía "Tween 20" a una concentración final de 0,05% - a 200 IL/pocillo a los pocillos, y después se eliminó por succión. Este procedimiento se realizó al menos tres veces. Después de lavar los anticuerpos anti-SRSV marcados con POD de los respectivos serotipos, dichos anticuerpos que habían sido diluidos 1/20.000 con un tampón, se añadieron a 100 IL/pocillo, y después se hicieron reaccionar a la temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de lavar, se añadió una solución de TMB con peróxido de hidrógeno a 100 IL/pocillo, y a continuación se hicieron reaccionar a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la reacción, se añadió ácido sulfúrico 0,6 N a 100 IL/pocillo, y se midió la absorbancia (450 nm/630 nm) de cada pocillo por medio de un lector automático de ELISA.
Como resultado, se encontró que entre los 15 especímenes fecales de pacientes infectados con SRSV del Genogrupo 1, 14 especímenes fecales reaccionaron solamente con la placa de Tipo I y no reaccionaron con la placa de Tipo II. Con respecto a los 7 especímenes fecales de pacientes infectados con SRSV del Genogrupo II, por otra parte, 6 especímenes fecales no reaccionaron con la placa de Tipo I sino que reaccionaron solamente con la placa Tipo II. Se ha confirmado, por lo tanto, que la discriminación en el genogrupo es realmente factible.
Test 2 Discriminación de los SRSV en el Serotipo
Se diluyeron cada uno de los anticuerpos anti-SRSV contra los SRSV (la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP, la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP, la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP, la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP, y la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP) independientemente con un tampón de carbonato (pH 9,5) a una concentración de 0,5 a 10 Ig/mL. Las diluciones así obtenidas se vertieron a 100 IL/pocillo en una microplaca de fondo plano de poliestireno (fabricada por Nunc). La microplaca se dejó reposar durante la noche a 4°C. Después de haber dejado reposar durante 18 horas o más, la microplaca se lavó de 3 a 4 veces a 200 IL/pocillo con PBS que contenía "Tween 20" a una concentración final de 0,05%. Después se añadió PBS 10 mM (pH 7,2) – que contenía albúmina de suero bovino (BSA) y "Tween 20" a concentraciones finales de 0,5% y 0,05%, respectivamente - a 200 IL/pocillo. La microplaca se dejó reposar durante la noche a 4°C para obtener una microplaca de anticuerpo anti-SRSV en fase sólida (placa de discriminación de serotipo).
Con respecto a los especímenes fecales de pacientes con SRSV, se llevó a cabo un ELISA de una manera similar a la del Ensayo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3 Ensayo Clínico
- Número total de especímenes: 41
- Serotipo discriminado por el kit de la invención
- Número de especímenes detectados
- HU/NLV/Kashiwa 645/1999/JP
- 1
- Hu/NLV/Seto 124/1989/JP
- 7
- Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP
- 4
- Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP
- 1
- HU/NLV/Narita 104/1997/JP
- 4
- Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP
- 12
- Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP
- 2
- Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP
- 3
- Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP
- 1
- Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP
- 1
- Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP
- 2
- Número total de especímenes detectados
- 38 (93%)
Como resultado, se ha encontrado que de acuerdo con el método de detección de SRSV de la presente invención, los SRSV se pueden detectar con una probabilidad tal elevada como el 93% y sus serotipos también se pueden 5 discriminar.
Adicionalmente, los serotipos discriminados por el kit de la presente invención fueron coincidentes con los averiguados mediante PCR y un análisis de sus secuencias de bases (Tabla 4).
10 Tabla 4 Comprobación de los Serotipos
- Número total de especímenes: 38
- Serotipo discriminado por el kit de la invención
- Número de especímenes discriminados en serotipo por PCR y análisis de las secuencias de bases
- HU/NLV/Kashiwa 645/1999/JP
- 1 Especímenes 1
- Hu/NLV/Seto 124/1989/JP
- 7 Especímenes 7
- Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP
- 4 Especímenes 4
- Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP
- 1 Espécimen 1
- HU/NLV/Narita 104/1997/JP
- 4 Especímenes 4
- Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP
- 12 Especímenes 12
- Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP
- 2 Especímenes 2
- Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP
- 3 Especímenes 3
- Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP
- 1 Espécimen 1
- Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP
- 1 Espécimen 1
- Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP
- 2 Especímenes 2
Los anticuerpos anti-SRSV contra los SRSV (la cepa Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP, la cepa Hu/NLV/Seto 124/1989/JP, la cepa Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP, la cepa Hu/NLV/Narita 104/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP, la cepa Hu/NLV/Chitta 5 1876/1996/JP, la cepa Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP, la cepa Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP, y la cepa Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP) fueron diluidos cada uno independientemente con un tampón de carbonato (pH 9,5) a una concentración de 0,5 a 10 Ig/mL. Todas las diluciones así obtenidas se mezclaron. Como alternativa, los anticuerpos anti-SRSV pueden ser diluidos después de mezclarlos entre sí. Utilizando la mezcla diluida de este modo de los anticuerpos anti-SRSV, se produjo del mismo modo una microplaca de anticuerpo anti-SRSV en fase
10 sólida. Con respecto a los 22 especímenes fecales de pacientes infectados con SRSV, se llevó a cabo un ELISA de una manera similar a la del Ensayo 1. Fue posible detectar SRSV en 20 especímenes.
Aplicabilidad Industrial
15 De acuerdo con el kit de detección de SRSV de la presente invención, es posible detectar la mayor parte de los virus relacionados con SRSV descubiertos hasta la fecha y también discriminar sus serotipos y genogrupos. Cuando se produce un envenenamiento alimentario relacionado con SRSV, el kit de detección de SRSV de la presente invención es, por lo tanto útil para especificar una ruta de infección, evitar que la infección se propague, y realizar una investigación epidemiológica.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> DENKA SEIKEN CO., LTD Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
<120> Kit de Detección para SRSV
5 <130> DK0001
<150> JP P1999-175928
<151> 1999-06-22
<160> 34
<170> PatentIn Ver. 2.1 10 <210> 1
<211> 545
<212> PRT
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<400> 34 atgaagatgg cgtcgaatga cg 22
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Un kit de detección de SRSV que consiste esencialmente en:
- (a)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 1, y
- (b)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 2, y
- (c)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 3, y
- (d)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 4, y
- (e)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 5 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 5, y
- (f)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 6 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 6, y
- (g)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 7 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 7, y
- (h)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 8, y
- (i)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 9, y
- (j)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 10, y
- (k)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 11.
-
- 2.
- Un kit de detección de SRSV de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos anticuerpos han sido preparados mediante la inmunización con partículas de tipo virus.
-
- 3.
- Un kit de detección de SRSV de acuerdo con la reivindicación 1, para distinguir los serotipos de los SRSV.
-
- 4.
- Un kit de detección de SRSV para discriminar el genogrupo de los SRSV, consistiendo esencialmente el kit en
- (a)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 1, y
- (b)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 2, y
- (c)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 3 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 3, y
- (d)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 4.
- 5. Un kit de detección de SRSV para la discriminación del genogrupo de los SRSV, consistiendo esencialmente el kit en
- (e)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 5 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 5, y
- (f)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 6 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 6, y
- (g)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 7 o un
anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 7, y- (h)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 8 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 8, y
- (i)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 9, y
- (j)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 10, y
- (k)
- un anticuerpo contra un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11 o un anticuerpo contra un péptido parcial del mismo que tiene una antigenicidad equivalente al péptido del SEQ ID NO: 11.
-
- 6.
- Un kit de detección de SRSV de acuerdo con las reivindicaciones1 a 5, en donde los anticuerpos se inmovilizan sobre portadores de anticuerpos en fase sólida adecuados para capturar los SRSV.
-
- 7.
- Un gen de Hu/NLV/Chiba/407/1987/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 15; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4.
- 8. Un gen de Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 20; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 9.
- 9. Un gen de Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 21; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 10.
- 10. Un gen de Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP que tiene
- (a)
- una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 22; o
- (b)
- una secuencia de bases que codifica un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 11.
- 11. Un anticuerpo anti-SRSV específico para partículas de tipo virus que consisten en el péptido del SEQ ID NO: 4, el SEQ ID NO: 9, el SEQ ID NO: 10 o el SEQ ID NO: 11.
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