JPH08500250A

JPH08500250A - ノーウォークおよび関連ウイルスを検出し、かつ特徴付けるための方法並びに試薬

Info

Publication number: JPH08500250A
Application number: JP6507522A
Authority: JP
Inventors: マトソン、デイビッド・オー; エステス、メアリー・ケー; ジアン、クザイ; グラハム、デイビッド・ワイ
Original assignee: ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン
Priority date: 1992-09-07
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 1996-01-16
Also published as: WO1994005700A3; WO1994005700A2; AU4851493A

Abstract

(57)【要約】二本鎖ｃＤＮＡは、ボランティアの便検体から精製された。ノーウォークウイルスから抽出された核酸から合成される。インビトロ転写ベクターにサブクローニングした後にＤＮＡクローンから誘導された一本鎖ＲＮＡプローブは、ノーウォークウイルスが約８ｋｂのサイズのｓｓＲＮＡゲノムを含んでいることを示すためにも使用される。ノーウォーク一特異的ｃＤＮＡの利用可能性およびゲノム配列情報は、その全ゲノムのクローニングおよび鋭敏な診断アッセイの確立を早める。かかるアッセイは、ノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスの抗原のプローブまたはプライマー、および、ｃＤＮＡから発現されたか、或は、既に知られているゲノム配列に基づいて作られたタンパク質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用した検出に基づく。ノーウオークウイルスゲノムから導き出されかつ発現システムで生成されたタンパク質を使用したアッセイは、抗体の反応を測定できる。ノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスのワクチンは、発現されたノーウォークウイルスタンパク質から作られる。

Description

【発明の詳細な説明】ノーウォークおよび関連ウイルスを検出し、かつ特徴付けるための方法並びに試薬この出願は、この出願と共に継続し、全て「ノーウォークおよび関連ウイルスを検出し、かつ特徴付けるための方法および試薬」と題する出願人の米国特許出願07/443,492号（1989年１１月８日出願）、米国特許出願07/515,993号（1992年４月２７日出願、現在は放棄されている）、米国特許出願07/573,509号（1990年８月２７日出願）、および米国特許出願07/696,454号（1991年５月６日出願）の一部継続出願である。この発明は、食品医薬品局および国立衛生研究所の認可または裁定により部分的に支持されている。米国政府は、この発明に対してある程度の権利を有している。発明の分野この発明は、概ね、ノーウォークウイルス［Norwalkvirus ］およびカリチウイルス［calicivirus ］のクローンの合成、並びにノーウォークおよび関連ウイルスに対するプローブの作製に関する。また、この発明は、ノーウォークおよび関連ウイルスの検出し、かつ特徴付ける方法に関する。発明の背景ノーウォークウイルスは最も重要なウイルス性病原体の一つであり、この病原体は米国において２番目にありふれた病気である急性胃腸炎を引き起こす（Ding le et al., Am.J．Hyg 58:16-30(1953);Kapikian and Chanock，ウイルス学， B.N.Field′s 第２版，Raven Press,New York,pp.671- 693 （1990）の “ノーウォーク群のウイルス”）。成人ウイルス性胃腸炎の４２％までは、ノーウォークまたはノーウォーク様ウイルスによって引き起こされるものと見積られている（Kaplan et al.,Ann. Internal Med.96(6):756-761 （1982））。ノーウォークウイルスが水および食物の両者を介して伝染することは書物に記録されており、特にハマグリ、トリガイ、およびカキを含む汚染された貝類を消費することで病気の大流行が発生している（Murphy et al.,Med. J .Ausl.2:329-333(1979);Gunn et ．,Am.J.Epidemiol.115:348-351 (1982);Wilso n et al.,Am.J.PublicHealth 72;72-74(1982);Gill et al.,Br.Med.J.287:1532- 1534(1983);DuPont New Engl.J.Med.314:707-708 (1986);Morse et al.,New Eng l. J.Med.314:678-681(1986);Sekine et al.,Microbiol. Immunol.33:207-217 ( 1989)）。海産食品の消費の増大に伴って、近年、魚および貝関連食品の有毒化が増大していることが注目され、これがこれらの存在に対する臨床医の認識を増すことに貢献している（Eastaugh and Shepherd,Arch. Intern.Med.149:1735-1740（1989））。ノーウォークウイルスは１９７３年に発見された。最近まで、このウイルスに関する知識は限られたものに止まっていた。これは、このウイルスを細胞培養物中で増殖させることに成功しておらず、ウイルス培養に対する適切な動物モデルが見出されていないためである。流行の発生時およびヒトボランティアの研究から得られるヒトの便のサンプルのみがこのウイルスの源である。しかしながら、便中のウイルスの濃度は、通常の電子顕微鏡を用いるウイルス検出が不可能であるほど低い（Dolin el al., Proc. Soc. Exp. Med. and Biol. 1 40:578-583(1972);Kapikian et al. J.Virol. 10:1075-1081 (1972);Thornhill et al.J, Infect.Dis.132:28-34 （１９７５）。ノーウォークウイルスの現在の検出法には、免疫電子顕微鏡法および、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や急性かつ回復期のヒト由来血清を用いるビオチン−アビジン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような他の免疫学的方法が含まれる。現在までのところ、量が不十分であること、またはウイルス性抗原の尋常ならざる特性のいずれかのために、動物由来の超免疫抗血清の調製は成功していない。ビリオンの予備的な生理学的特徴付けにより、この粒子が１つのポリペプチドを有することが示されている（Greenberget al.,J.Vlrol.37:994-999(1981)）が、ウイルスゲノムを特徴付けようとする努力は成功していない。ノーウォークウイルスに関連するウイルスには、典型的なカルチウイルス形態を示すウイルスやアストロウイルス類［astroviruses］のような小腸腸内ウイルス［small roundenteric viruses ］が含まれる。この明細書中で表１に示されるヒト小腸ウイルスの分類図は、Journal o f MedicalVirology,9:257-265 （19 82）においてCaul and Appletonによって概観が述べられている図の最新版である。この系は、Cubiit et al.,J.Infectious Diseases,156:806-814 （1987）で参照されている；新規下痢要因ウイルス［NovelDiarrhoea Viruses ] , Ciba Foundation Symposium No.128,pp.108-125(John Wiley & Sons,N.Y. (1 987)）という書籍の“小腸ウイルス：分類と食物介在感染における役割”と題するApplelonの論文の表１；およびウイルス学（B.N.Firlds, 2d ed.Raven Press( 1990)）という書籍に掲載される、Kapikian a nd Chanock による“ノーウォーク群のウイルス”と題する章の表１。表１に示されるように、ヒト小腸構造ウイルスにはカリチウイルスおよびアストロウイルスが含まれる。近年のノーウォークウイルスの配列決定により、ノーウォークウイルスはカリチウイルスであり、他のカリチウイルスと同様のゲノム構成を有していることが示されている。ヒト小腸腸内ウイルスに加え、その形態に基づいてアストロウイルス類、カリチウイルス類、および小腸構造ウイルス類に分類される非ヒト小腸ウイルスが存在する。これらのウイルスの例としては、ピグミーチンパンジーから単離される霊長類カリチウイルス（雑誌Science 221: 79-81 (1983)に掲載）、ブタ腸内カリチウイルス（Journal of Clinical Microb iology 12:105-111 (1983)に掲載）およびウシアストロウイルス（Vel Pathol.2 1:208-215(1984)に掲載）が挙げられる。カリチウイルスの個々の型は時々宿主特異性および組織走性を発現するが、群全体としては、それらは胃腸炎、肝炎、流産、皮膚病変、肺炎、心筋炎、および脳炎を引き起こす。ヒトに感染するカリチウイルス類はこの文脈に適合している。すなわち、アザラシ、魚、ブタおよびウシと同様に、ヒトにおいて、ノーウォーク様ウイルスは胃腸炎を引き起こし、Ｅ型肝炎は肝炎を引き起こし、かつサンミゲルトド５型ウイルスは皮膚小嚢を引き起こす（Textbook of PediatricInfecli ous Disease, 3d ed.,R.D.Feigin and J.D.Cherry,eds., W.B.Sanders, Philade lphia, (in press)のD.0.Matson “Calicivirus Infections”）。発明の要約したがって、この発明の目的は、ｃＤＮＡライブラリーの合成およびクローニングによりノーウォーク並びにその関連ウイルスを検出し、かつ特徴付けることにある。ノーウォーク並びに関連ウイルスのｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列を推測することも、この発明に関連する目的である。ノーウォークウイルスとノーウォーク関連ウイルスとの遺伝的な相関を確認するためのプローブまたはプライマーを開発することはこの発明の他の目的である。ノーウォークおよびその関連ウイルスに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する方法を開発することは、この発明のさらなる目的である。ノーウォークおよびその関連ウイルスを検出するためのプローブを作製する方法を開発することは、この発明のさらにまた別の目的である。ウイルスの存在が疑われるサンプルにおいてノーウォークおよびその関連ウイルスを検出するために、アッセイにおいて前記ｃＤＮＡまたはそれらの断片またはそれらの誘導体を用いることは、この発明のさらなる目的である。タンバク質を発現させて抗体応答を測定することも、この発明のさらなる目的である。前記目的を達成するための、ノーウォークウイルスｃＤＮＡクローンのゲノムセンス鎖のヌクレオチド配列には、表２に示されるヌクレオチド配列が含まれる。ノーウォークヌクレオチド配列には蛋白質をコードする領域が存在する。ノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド配列、その断片および誘導体は、診断用製品、ワクチン並びに抗ウイルス剤の作製に用いられる。この発明の他のさらなる目的、特徴および利点は、以下に示すこの発明の現時点での好ましい態様の記述から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１．ノーウォークおよびその関連ウイルスのＥＭ写真。ノーウォークウイルス（Ａ）、ヒトカリチウイルス（Ｂ）、小腸構造ウイルス（Ｃ）、およびヒトアストロウイルス。バーは０．１μｍである。図２ａ．陽性ノーウォークｃＤＮＡクローンのスクリーニングのための、便サンプルと３２ｐ−標識プラスミドＤＮＡとのハイブリダイゼーション。２人のボランティアからの１対の便［ノーウォークウイルスに感染する前（ｂ）と後（ａ）］からの核酸をゼ-タバインド［Zetabind］フィルター上に点在させた。複製ストリップを作製し、５０℃および６５℃で、テストクローン（ｐＵＣ−27，ｐＵＣ−593，ｐＵＣ−13およびｐＵＣＮＶ-953）の各々とハイブリダイズさせた。ノーウォーク感染の（前ではなく）後の便サンプルと唯一反応するクローンの１種（ｐＵＣＮＶ-953）は潜在的な陽性クローンであると考えられ、さらなる特徴付けのために選択された。図２ｂ．クローン³²ｐ−標識ｐＵＣＮＶ−953と、３名のボランティアから感染後の異なる時期に集めた別の３組の便サンプル（Ｂ＝病気の急性期前；Ａ＝病気の急性期；Ｐ＝病気の後急性期）とのドットブロットハイブリダイゼーション。核酸は直接点在させるか、もしくはＲＮＡｓｅまたはＤＮＡｓｅで処理した後に点在させた。二本鎖相同ｃＤＮＡ（ｐＵＣＮＶ−953）を便サンプルと同様の処理の後点在させた。図３．ＣｓＣｌグラジエント中のノーウォークウイルスをｐＧＥＭＮＶ−953 から作製したｓｓＲＮＡプローブとのドットブロットハイブリダイゼーション。ＣｓＣｌグラジエントの各画分からのアリコート５０μｌをゼータマインドフィルター上に点在させた。このフィルターの複製を作製し、その各々を２種のｓｓＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。その後、この２種の鎖をｃＲＮＡ（ウイルス核酸とのハイブリダイゼーションが陽性）およびｖＲＮＡ（ウイルス核酸とはハイブリダイズしない、データは示さず）と称した。グラフは、ドットブロットハイブリダイゼーションと同じＣｓＣｌグラジエントの各画分におけるノーウォークウイルスのＥＭカウントを示す。各グリッド当り５つの方形についてカウントし、方形当りのウイルス粒子の平均数を算出した。図４．第１のノーウォークウイルスｃＤＮＡクローンのゲノムセンス鎖のヌクレオチド配列。このｃＤＮＡ中の長オープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列も示す。図５．ノーウォークｃＤＮＡクローンの模式図。ｐＵＣＮＶ−９５３は最初の同定されたクローンである。制限酵素分析およびクローンの部分配列決定により重複クローンを決定した。ＡＡＡはウイルスゲノムの３’末端のポリ（ａ）を示す。図６．ノーウォークウイルスはＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ［RNA-direct ed RNA polymerase ］の配列モチーフをコードする。ノーウォークウイルスｐＵＣＮＶ−4095 （ＮＶ）の一部の推定アミノ酸配列を、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、ポリオウイルス（polio ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、シンドビス［Sindbis］ウイルス（ＳＮＢＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）、スズメノチャヒキモザイクウイルス（ＢＭＶ）、およびササゲモザイクウイルス（ＣｐＭＶ）の推定ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼをコードすると考えられている合意アミノ酸残基と比較した。ＮＶ以外のウイルスの配列は、Reyes et a l.,Science 247:1335-1339 (1990)からのものである。図７．ノーウォークウイルスゲノムの増幅に用いられる３対の初期プライマー。ＲＮＡをＣＴＡＢ法により便サンプル（サンプル543-11）から抽出し、ＲＴ− ＰＣＲにより増幅した。レーン１および５はベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ［Bethesda Research Laboratories］より入手したｌｋｂマーカー（１．６、１．０および０．５ｋｂとして移動するマーカーを標識した）；レーン２はノーウォークウイルスプライマ-８および９を用いるＰＣＲ：レーン３はノーウォークウイルスプライマー１６および１７を用いるＰＣＲ；レーン４はノーウォークウイルスプライマー１および４を用いるＰＣＲ。増幅生成物はアガロースゲル上で分離し、エチジュウムブロマイドで染色した後ＵＶで可視化した。レーン３に見られる小生成物は、実験の度に量が変化した。この研究に用いられる３つのプライマー対の位置は、オートラジオグラフの上に与えられている。マップの下の数字はＲＴ−ＰＣＲ産物の（塩基対での）サイズを示している。図８．これは、表２に示されるノーウォークゲノムの構成を模式的に示す。ここに示される特徴は、ノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド配列およびこのゲノムにおいてコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列の分析に基づいている。このゲノムは、３’末端の111個のＡを含む7753個のヌクレオチドを有している。この配列を翻訳することにより、このゲノムが（第２ラインの白抜きのボックスによって示される）３つのオープンリーディングフレームをコードすることが予測される。第１のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド146 の開始コドンから始り、（終始コドンを除いて）ヌクレオチド5359まで伸びるものと予想される。第２のオープンリーディングフレームはヌクレオチド５３４６から始まってヌクレオチド６９３５まで伸び、第３のオープンリーディングフレームはヌクレオチド6938と7573との間に存在する。これらの推定タンパク質とタンパク質データバンクの他のタンバク質との比較に基づくと、第１のオープンリーディングフレームは最後には開裂して少なくとも３つのタンパク質を生成する。これらの３つのタンパク質には、ピコルナウイルス２Ｃ様タンパク質、３Ｃ様プロテアーゼおよび３Ｄ様ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。第２のオープンリーディングフレームは、ピコルナウイルスＶＰ３タンパク質との配列相同性を有するカプシドタンパクをコードする。図９．ヒトカリチウイルスサッポロ［Sapporo ］ｃＤＮＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。ヒトカリチウイルスサッポロ（ＨｕＣＶサッポロ）の551 ヌクレオチドの公知配列の全てが示されている。ヌクレオチド配列の下は、ＨｕＣＶサッポロのアミノ酸配列である。ＨｕＣＶサッポロヌクレオチド配列の上は、ヒューストン・デイ・ケア・センター大発生（デイ・ケア）に由来するｃＤＮＡの配列である。デイ・ケア配列において、″．″はその部位でＨｕＣＶサッポロヌクレオチドと同じヌクレオチドを示している。デイ・ケア配列の何処にヌクレオチドの相違が生じているかは、新しい文字がその位置を示している。″Ｎ″ はその部位のヌクレオチドが不確実であることを示している。ＨｕＣＶサッポロのアミノ酸配列の下は、ｃＤＮＡの２３ｓ２ｍ３１およびc-29*4-gel （これらは共に551ヌクレオチドの公知配列に寄与している）並びに新規３６プライマー（表６参照）の範囲を示す矢印である。図１０．カリチウイルスｃＤＮＡと公知の配列を有するカリチウイルス株とのヌクレオチド相同性。全ての比較は、ヒトカリチウイルスサッポロの配列を参照した。ベースラインの長さは公知の配列領域を示す。ボックスは，ＨｕＣＶサッポロと示された株とのヌクレオチド配列相同の領域を示している。ボックスの長さは、示された株の相同性が存在する部分を示し、ボックスの高さは相同性の強さを示す。ＳＤは標準偏差である。ＳＤが３以上は重要である。ノーウォーク相同ボックスの下の数字は、ノーウォークウイルスの相同性が観察された領域を示している。図１１．ノーウォークウイルス配列からのプライマーを用いてノーウォーク関連ウイルスＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のヌクレオチド配列を得るために用いられる戦略。この図は、ノーウォークウイルスゲノムの部分的な模式図、並びに３Ｄ様ポリメラーゼ領域の位置を示す、予想されるＯＲＦＩ、ＶＰ３様ドメインの位置を示す第２のＯＲＦおよびＯＲＦ３の開始位置を示す。最下部において、実線は、ノーウォークウイルスゲノムの配列から選択されたプライマーセット（３６および３５のような数字を参照）を用いたことに基づいて配列決定されたＫＹ８９の領域を示す。図１２．ノーウォークウイルスヌクレオチド配列とノーウォークウイルス関連ウイルスＳＲＳＶ／ＫＹ／８９ヌクレオチド配列との比較。ノーウォーク関連ウイルスＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のヌクレオチド配列の一部は、ノーウォークウイルス（ＮＶ）ゲノム由来のプライマーを用いて決定した。このノーウォーク関連ウイルスの配列を得るために用いられるＮＶゲノム由来のプライマーは表６に示されている。これらのプライマーの幾つかは、ＳＲＳＶ／ＫＹ／８９から得られた開始ヌクレオチド配列に基づいて、ＳＲＳＶ／ＫＹ／８９の配列の残りを得るために修飾されている。ここに示されるプライマーおよび表６に示されるプライマーは、例としてのみ用いられる：他のＮＶプライマーを用いることもできる。図１３ノーウォークウイルスおよびノーウォーク関連ウイルスＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のタンパク質の推定アミノ酸配列の比較。ＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のタンパク配列は、図１２に示されるヌクレオチド配列から推測した。図１３ａは、ＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のＯＲＦ２（カプシド）の推定アミノ酸配列とノーウォークウイルスゲノムにおいてコードされる同じ領域との比較を示す。図１３ｂは、ＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のポリメラーゼタンパクの部分の推定アミノ酸配列とノーウォークウイルスのそれとの比較を示す。他のノーウォーク関連ウイルス由来の類似配列の比較は、抗原性領域を含む保全並びに発散領域の発見を可能にする。この情報により、全てのノーウォーク関連ウイルスを検出するための広範に反応するプライマーおよび個々のノーウォーク関連ウイルスを検出するための特異的なプライマーセットの選択が直ちに可能となる。同様に、診断、ワクチンおよび抗ウイルス剤の開発のために、共通のアミノ酸配列又は特定のアミノ酸配列を有する断片およびペプチドを選択することができる。図１４．ノーウォークウイルスおよびＮＶゲノム由来のプライマーを用いて得られたノーウォーク関連ウイルスの部分ヌクレオチド配列の比較。ＳＲＳＶ／ＣＤＣ６／９１，ＳＲＳＶ／ＵＴ／８８、ＳＭＡ／７８；ＳＲＳＶ／ケンブリッジ、ＵＫ／９２、ＳＲＳＶ／ＣＤＣ３２、ノーウォークウイルス／６８、ＳＲＳＶ−３／８８、ＳＲＳＶ／ＫＹ８９／８９。図１４ａおよび１４ｂはこのゲノムの２つの異なる領域を示す。図１５．ノーウォークウイルスカプシドタンパクの発現。ノーウォークウイルスＤＮＡのサブゲノム断片（ヌクレオチド5337ないし7753）を有するバキュロウイルス組換体を選別し、１０ＰＦＵ／細胞の感染多重度での昆虫（ Spodopterafug iperda ）細胞の感染に用いた。２７℃で４日間インキュべートしたポスト感染細胞を回収し、１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりタンパク質を分析した。クーマシーブルーで染色した後、タンパク質は可視化された。ノーウォーク発現タンパク質（矢の頭で強調されている）は組換体感染細胞にのみ見られ、野生型バキュロウイルス（ｗｔ）または偽感染（ｍ）昆虫細胞には見られなかった。図１６．ノーウォークウイルスが発現するタンパク質は、ノーウォークウイルスに感染したボランティアの血清との免疫反応性を示す。図１１に示される発現タンパク質を９６穴ＥＬＩＳＡプレートの壁面に吸収させ、ノーウォークウイルスに感染する前（プレ）および感染３週間後（ポスト）のボランティアから採取した血清サンプルの希釈液を用いてその反応性をテストした。３７℃で２時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ血清を添加し、続いて、基質を添加した後に414ｎｍでの光学密度を読み取ることにより反応性を測定した。このデータは、感染後血清が１：１００および１：１０００の血清希釈率で発現抗原と強く反応し、幾つかの血清は１：１０，０００の希釈率でも特異的に反応することを示している。図１７．ノーウォークゲノムの３’末端を有するバキュロウイルス組換体は、昆虫細胞中でウイルス様粒子を生成する。バキュロウイルス組換体Ｃ−８（図１１参照）に感染した昆虫細胞の溶解質を電子顕微鏡で分析し、多数のウイルス様粒子を有することが示された。これらの粒子は、ノーウォークウイルスに感染したボランティアの便から得られたウイルス粒子と同じサイズである。バー＝５０ｎｍ。図１８．ノーウォークウイルス様粒子をＣｓＣｌグラジエント中で精製することができる。バキュロウイルス組換体Ｃ−８に感染した昆虫細胞の上清をジェネトロン［ genetron ］を用いる抽出およびＰＥＧ沈殿により処理し、これらのＰＥＧペレットから溶出されるウイルスをＳＷ５０．１ローターにおいてＣｓＣｌ中で４℃で２４時間遠心した。このグラジエントを分画し、各画分中の物質をＥＬＩＳＡプレートの２つのウェルに吸着させた。次いで、複製ウェルを、プレもしくはポスト感染血清のいずれか、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト血清および基質で処理し、ＯＤ414ｎｍを読み取ることにより反応を監視した。グラジエント中１．３１ｇ／ｃｍ３の密度でピークが観察され、電子顕微鏡によりこのピークにウイルス様粒子が含まれることが示された。このピークはまた、同じバキュロウイルス組換体に由来する昆虫細胞において発現されるタンパク質と一緒に移動する、分子量約58,500の主要タンパク質を含む。図１９．ノーウォークウイルスに感染したボランティアからのプレおよびポスト血清サンプルの反応性の測定に発現したウイルス様粒子を用いることにより、ほとんどのボランティアが免疫応答を有することが示されている。免疫応答を示さなかったボランティア６も、ウイルスが投与された後でも病気になることはなかった。図２０．霊長類パン・パニスカス［ Pan paniscus ］ｃＤＮＡ atprcvw２の部分配列。発明の詳細な説明当該分野の熟練者には、この発明の範囲および精神から離れることなくここに開示される発明に種々の置換えや変更を加え得ることは容易に理解される。ここで用いられる“断片”という用語は、ペプチドを産生し、またはコードするために発現することが求められるノーウォークウイルスゲノムまたはノーウォークウイルスのサブゲノムクローンのあらゆる部分であると定義される。上記ペプチドは、次に、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を誘発することができる。わずかアミノ酸５個のペプチドが抗原性を有することもあるが、通常は、アミノ酸１５個以上のペプチドが必要とされる。これはペプチドの特性に依存し、予め予測することは不可能である。ここで用いられる゛誘導体”という用語は、ノーウォークウイルスゲノムを表わし、かつ本来のｃＤＮＡを直接または連続的に用いることにより検出されるＤＮＡまたはさらなるｃＤＮＡの大切片、あるいはそれらの推定アミノ酸配列と定義される。したがって、クローンｐＵＣＮＶ−1011は、本来のクローンとは重複もしておらず、配列を共有もしていないが、誘導体である。また、ＤＮＡ断片のＲＮＡ相対物、並びに１つ以上の塩基が置換され、あるいは標識および末端構造が読み取りもしくは発現に影響することなく加えられているＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片も誘導体の定義の範囲に含まれる。ここで用いられるノーウォーク“関連ウイルス”および゛ノーウォーク様ウイルス”という用語は、ヒトおよび非ヒトカリチウイルス、アストロウイルスおよび小腸構造ウイルス（ＳＲＳＶ）と定義される。これらのウイルスのほとんどのゲノム配列は知られていないので、この分類は、Journalof Medlial Virology,9 ;257-265(1982)においてCauland Appletonにより；新規下痢要因ウイルス［Nove lDiarrhoea Viruses ], Ciba FｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍＮｏ．１２８,pp.108-125(Iohn Wiley &Sons,N.Y. (1987)）という書籍における“小腸ウイルス：分類と食物介在感染における役割”と題する論文においてAppleton により；並びに，ウイルス学（ B.N.Field' s 第２版， Raven Press, (1990) ）という書籍の “ノーウォーク群のウイルス”と題する章においてKapikian a nd Chanockにより記述される形態学に基づいている。ウイルスのゲノム配列が知られてくるに従って、当該分野の熟練者は、ヌクレオチド相同性に基づいて、ノーウォーク関連ウイルスおよびノーウォーク様ウイルスを決定することができるであろう。ここでＳＲＳＶもしくはノーウォーク群と呼ばれるウイルスのサブグループがノーウォーク関連ウイルスの範囲に入る。ノーウォーク群には、スノー・マウンテン因子（ＳＭＡ）、ハワイ因子、タウントン［ Taunton ］因子、アマルリー、オトフケ、およびモントゴメリー・カウンティー因子［ Amulree, Otofuke, and Montgomery County Agent ］が含まれる。ノーウォーク群は、無定型表面もしくは不揃いの概観を有する、小さく、丸い構造ウイルスである。分子クロ−ニングのためのノーウォークウイルスの製造ノーウォークウイルスは、成人ボランティアに、安全にテストされたノーウォークウイルス（ 8FIIa ）を投与することにより製造した。ボランティアでの研究に用いられたウイルス接種物は、Alberti Kapikian博士（アレルギーおよび感染疾患研究所、国立衛生研究所、ベテスダ，ＭＤ）の好意によるものである。このウイルスは、オハイオ州ノーウォークにおける急性胃腸炎の大発生に起源を持つ（Dolin et al.,1971 ）。8FIIac7）１ないし１００倍ＴＢＳ液希釈２ｍｌをミリＱ水［ milli-Q water ］（ Millipore,Bedford.MA01739）８０ｍｌと共に各個人に経口投与した。ウイルス投与の２分前および５分後に各個人に重炭酸ナトリウムを摂取させた。ボランティアでの研究は、ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン、メソジスト・ホスピタルおよびジェネラル・クリニカル・リサーチ・センターでインスティチュート・レビュー・ボード・フォー・ヒューマン・リサーチの承認を受けた。ボランティアには、ジェネラル・クリニカル・リサーチ・センターにおいてウイルスを投与した。ボランティアはここに人院し、４日間広範な診療を受けた。全ての便を集め、後の使用のために−７０℃で保存した。便サンプルからのノーウォークウイルスの精製便サンプルの１０％ＴＢＳ溶液を、3000ｒｐｍで１５分間の低速遠心により清澄化した。次いで、得られた上清を、ジェネトロンを用いて、０．５％ツビッターゲント 3-14 ［ Zwittergent 3-14 ］清浄剤（ Calbiochem Corp., La Joll a. CA ）の存在下で２ないし３回抽出した。５０．２Ｔｉローター（ Beck man Instruments. Inc.,Palo Alio,CA 94304 ）において、４０％ショ糖クッションを通して36,000 ｒｐｍで９０分間ペレット化することにより、水相中のウイルスを濃縮した。このぺれっとをＴＢＳ中に懸濁させ、ＣｓＣｌ溶液（屈折率 1.368）と混合して、ＳＷ５０．１ローター（Beckman ）において約35,000 ｒｐｍで約２４時間遠心した。底部穿孔によりこのＣｓＣｌを分画し、ＥＭ試験により各画分をウイルスについて監視した。ノーウォークウイルスを含有するピーク画分をプールし、サンプル中のＣｓＣｌをＴＢＳで希釈して、約35,000 ｒｐｍで１時間ウイルスをペレット化することにより除去した。精製したウイルスは、約７０℃で保存した。精製ウイルスからの核酸の抽出抽出の１つの方法には、ＣｓＣｌグラジエントからの精製ノーウォークウイルスを、プロテイナーゼＫ緩衝液（０．１Ｍ Tris-Cl pH 7.5、12.5mM EDTAN 0.15MＮａＣｌ、１％ｗ／ｖＳＤＳ）中において約３７℃で約３０分間プロテイナーゼＫ（400μｇ／ｍｌ）で処理することが含まれる。次いで、このサンプルを、フェノールークロロホルムで１度、およびクロロホルムで１度抽出した。水相中の核酸を０．２ＭＮａＯＡｃの存在下で２．５容積のエタノールを用いて沈殿させることにより濃縮し、次いで１５分間微小遠心することによりペレット化した。ｃＤＮＡ合成および増幅したｃＤＮＡのクローニング合成およびクローニングの方法の１つには、精製ノーウォークウイルスから抽出した核酸を１０ｍＭＣＨ₃ ＨｇＯＨで変性することが含まれる。次いで、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー（Amersham,Arlington Heights,IL 6000 5）が補われたｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを合成した。第２の鎖が合成された後、反応混合物をフェノールークロロホルムを用いて１度、クロロホルムを用いて１度抽出し、次いでエタノール沈殿を行なった。ＤＮＡ標識用のランダムプライマーキット（Promega Corp., Madison,WI 53711-5305）を用いてＤＮＡの増幅を行なった。クレノーフラグメント（Promega Corp. ）を添加した後、変性（ 100℃、２分間）、リアニーリング（室温までの２分問の冷却）および伸長（室温、３０分間）のサイクルを８回行なった。ＤＮＡライブラリーを、ＳｍａＩ部位への鈍端ライゲーションを用いてｐＵＣ−１３に構築した。陽性クローンについてのライブラリーのスクリーニングスクリーニングの１方法として、形質転換されたＤＨ５アルファ・バクテリア細胞（ＢＲＬ）から白色コロニーを取り出し、各コロニーについてプラスミドＤＮＡのマスタープレートおよびミニプレップ［minipreps ］両者を調製した。アガロースゲル中でのこのプラスミドＤＮＡの電気泳動の後、インサートを有するクローンを同定した。アガロースゲル中のインサートＤＮＡを切り出し、PRIME- A-GENE （登録商標）ラベリング・システム（Promega Corp. ）におけるように、ランダムプライマーおよびクレノ−ＤＮＡポリメラーゼを３２ｐで標識した。酵素のような他の同位体もしくは生化学標識、蛍光、化学発光または生物発光（ bioluminescent ）基質を用いることもできる。２名のボランティア（543および544）からの一対の便サンプル（ノーウォーク感染の前後）から抽出された核酸を、ゼータバインドフィルター（AMF,Cuno,Meriden. CT ）上に点在させた。複製フィルターストリップを作製し、６５℃でホルムアミドなしで、各々の標識プラスミドプローブと個別にハイブリダイズさせた。潜在的な−性クローンは、それらのプレーおよびポスト−感染便との異なる反応によって判定した。ボランティアのポスト感染便と反応する（しかしプレーとは反応しない）クローンは陽性であると考えられ、マスタープレート上のこれらのクローンをさらに特徴付けた。ひとたびノーウォーククローンの１つが同定されると、それを用いてｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングし、さらに重複するクローンを同定した。これらの付加的なクローンを用いてｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングすることにより、最終的に、ノーウォークウイルスゲノムの全てを表わすクローンを同定することが可能となる。ノーウォークウイルスに関連するウイルスからのｃＤＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション生成ノーウォークウイルスゲノム配列の知識を用いる、ノーウォークウイルスに関連するウイルスのｃＤＮＡクローンを生成する１つの方法は、逆転写酵素−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法である。この方法において、関連ウイルスを含む検体300μＬからＲＮＡを抽出した。相補的ＤＮＡを、ノーウォークウイルスの配列から誘導されるプライマー対（例えば、表６に示されるプライマー３６および３５）を用いる逆転写酵素−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）により調製した。得られた生成物をプラスミドベクターにライゲートし、E.coli に形質導入した。次いで、菌からプラスミドを部分的に精製し、ジデオキシ鎖終結法によりプラスミドに挿入されたＰＣＲ生成物の配列を決定して、ヌクレオチドおよび予想されたタンパク相同性についてノーウォークウイルスとの相関を調べた。以下の例は説明として提示されるものであり、この発明をいかなる形でも制限することを意図するものではない。例１電子顕微鏡での確認より良い診断並びにノーウォークウイルスおよび関連ウイルスの分子特徴付けを可能にするために、便サンプルから精製したビリオンより核酸を抽出し、この核酸からノーウォークのｃＤＮＡライブラリーを誘導した。従来、便サンプルからのＡ型肝炎およびロータウイルスの精製に用いられる方法に幾つかの変更を加えて、ノーウォークウイルスを精製した。まず、ノーウォークウイルスを投与したボランティアから得られた便サンプルをジェネトロンで処理して脂質および水不溶性物質を除去した。次いで、水相中のウイルスを４０％ショ糖クッションを通してペレット化した。得られたペレットを再懸濁して超音波処理し、ＣｓＣｌグラジエント中に仕込んで等密度遠心を行なった。図１は、上記方法により単離された精製ノーウォークウイルスおよびＲＴ−ＰＣＲを用いるｃＤＮＡの生成に用いられるノーウォーク関連ウイルスの電子顕微鏡像を示す。例２最初のｃＤＮＡ合成、クローニングおよびスクリーニングこれらの精製ウイルスから、サンプルをプロテイナーゼＫ処理し、続いてフェノールークロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なう（ Jiang et al., 198 6: 1987 ）ことにより抽出した核酸からｃＤＮＡライブラリーを作製した。ウイルスゲノムの性質が未知であったため、ｃＤＮＡ合成の前に、抽出した核酸を水酸化メチル水銀（II）で変性させた。ガブラー・ホフマン［ Gubler-Hoffman ］法（ｃＤＮＡ合成システム・プラス、Amersham）を用いてランダム・プライムドｃＤＮＡ［random primed cDNA ］を合成し、少量のｃＤＮＡを得た。この少量のｃＤＮＡの直接クー−ニングは不成功であった。したがって、クローニングの前に、ランダムプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いてＤＮＡのより多くのコピーを合成することにより、ＤＮＡの増幅工程を行なった。この手法には、変性、ランダムプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントの添加、リアニーリングおよび伸長のサイクルが含まれる。この手法では、合成のサイクル数が増加するに従って、生成物への標識核酸の線形組込みが観察された。過剰のより小さい断片の合成を避けるために、実施サイクル数は制限された（<10）。ノーウォークｃＤＮＡの場合、増幅を８サイクル行ない、約２．５μｇのＤＮＡが得られた。これは、出発テンプレートＤＮＡの少なくとも 100倍の増幅であった。この増幅ｃＤＮＡを、鈍端ライゲーションによりｐＵＣ−１３にクロ−ニングし、陽性クローン（ｐＵＣＮＶ−953）を単離した。陽性ノーウォークウイルスクローンを得るために、潜在的なインサートを有するプラスミドＤＮＡのミニプリパレーションをアガロースゲル電気泳動によってスクリーニングした。ゲル中のより大きなクローンのインサートを切り出し、ゲル中でPRIME-A-GENE （登録商標）標識システム（ PromegaCorp.）を用いてＤＮＡでプローブを作製した。これらのプローブを２名のボランティアからの一対の便サンプル（ノーウォーク感染の前後）と個別にハイブリダイズさせた（図２ａ）。１つのクローン（ｐＵＣＮＶ−953 ）が両ボランティアからのポスト感染便サンプルと反応したが、プレ感染便サンプルとは反応しなかった。例３クローンｐＵＣＮＶ−953のウイルス起源の確認さらにクローンｐＵＣＮＶ−953のウイルス起源を確認するために、さらに６対の便サンプルをテストし、同じ結果を得た。図２ｂは、このクローンと、病気の感染後の異なる時期に採取した便サンプルとのドット・ブロット・ハイブリダイゼーションを示す。急性期に採取された便を用いた場合にのみ強い信号が観測され、病気の前後には見られなかった。この結果は、ノーウォーク下痢を呈するボランティアからの回復期血清を用いる従来のウイルス抗原検出のためのＲＩＡアッセイ並びにウイルス粒子試験のためのサンプルの免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）研究と一致した。この結果はまた、病気の過程における便中のウイルス放出のパターンと一致する（ Thornhillet al.,1975 ）。ｐＵＣＮＶ−953クローンが、ノーウォークウイルス精製スキームからのＣｓＣｌグラジエントの画分とハイブリダイズする場合には、ハイブリダイゼーションとＥＭウイルス粒子計測数との間に素晴らしい相関が見られた（図３）。ハイブリダイゼーション信号およびウイルス粒子計測数の両者のピークは、１．３８ｇ／ｃｍ³の密度を有する画分にあり、これは従来のノーウォークウイルスの生理学的特性の報告と一致した。最後に、このクローンを、アガロースゲル上で電気泳動して高度に精製したノーウォークウイルスとハイブリダイズさせることによりテストした。ノーウォークウイルスとでは単一のハイブリダイゼーションバンドが観察されたが、ＨＡＶおよびロータウイルスとでは観察されなかった。ｐＵＣＮＶ−953 ｃＤＮＡの配列決定分析により、このクローンが511ｂｐであることが示された（図４）。この部分ゲノムｃＤＮＡは、潜在的なオープン・リーディング・フレームをコードしており、それに対するアミノ酸配列が推測されている（図４）。ジーンバンク（ Molecular Biology Inf ormation Resource, Eugene Software,Baylor College of Medicine ）における他の配列との比較では、重要なヌクレオチドまたは推定アミノ酸配列相同性は見出されなかった。例４ウイルスゲノムの特徴付けへのノーウォークウイルスｃＤＮＡの使用ｐＵＣＮＶ−953 ｃＤＮＡを転写ベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）にサブクロ−ニングし、増殖させた。次いで、ＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼ（Bethes da Research Laboratory）を用いて、イン・ビトロ転写によりｓｓＲＮＡプローブを生成させた。２つの対向するセンスｓｓＲＮＡプローブがウイルス核酸と別々にハイブリダイズする場合には、１本の鎖のみがウイルスと反応し、これはウイルスゲノムが一本鎖であることを示している。図２ｂに示されるように、ウイルス核酸をフィルター上に仕込む前に（ＤＮＡｓｅではなく）ＲＮＡｓｅで処理することによりハイブリダイゼーション信号が除去された。これはウイルスゲノムがｓｓＲＮＡを含むことを示している。ｐＵＣＮＶ−９５３の配列をコンピューター解析することにより、挿入されたＤＮＡの２本の鎖の１本に長大なオープン・リーディング・フレームが見出された。このコーディング鎖と同じ配列を有するｓｓＲＮΛプローブはウイルス核酸とは反応せず、その相補的ｓｓＲＮＡプローブもハイブリダイゼーション・テストでは反応しない。したがって、ノーウォークウイルスは、正センス［ positive sense ］一本鎖ＲＮＡゲノムを有している。ノーウォークウイルスのゲノムのサイズは、精製ウイルスＲＮＡと分子量マーカーとのアガロースゲル中における移動速度の比較に基づいて、約８ｋｂであると見積もられている。ｐＵＣＮＶ−953 ｃＤＮＡを、以下のとおりに作製された第２のｃＤＮＡライブラリーの再スクリーニングに用いた。精製ノーウォークウイルスから核酸を単離することによりノーウォークもしくは関連ウイルスのクローンを合成した；ｃＤＮＡを逆転写酵素およびランダムプライマーを用いて合成した；ＤＮＡの第２鎖をｃＤＮＡから合成した；および少なくとも１つのＤＮＡのコピーをプラスミドまたはクローニングおよび発現ベクターに挿入した；並びに元のｐＵＣＮＶ −953を用いてこのライブラリーをスクリーニングし、ノーウォークまたは関連ゲノムの断片（もしくは全体）を有するクローンを同定した。その代わりに、少なくとも１つのＤＮＡのコピーをラムダＺＡＰＩＩ（登録商標、Stratagene Inc . ）のようなクローニングおよび発現ベクターに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてノーウォークまたは関連ゲノムの断片もしくはその全体を有する組換えファージを同定した。この方法を用いて、さらなるｃＤＮＡを作製し、見出した。これらのさらなるｃＤＮＡをライブラリーの再スクリーニングに用いた結果、新たなクローンが検出された（図５）。したがって、当該分野における熟練者は、完全なノーウォークウイルスｃＤＮＡ配列、またはそれらの断片もしくは誘導体を、ノーウォークおよび他の関連ウイルスのゲノムを検出するアッセイに用い得ることを認識するであろう。検出アッセイには、ノーウォークウイルスゲノムを直接検出するための標識ｃＤＮＡまたはｓｓＲＮＡプローブ、およびプローブ結合の量を測定することが含まれる。代わりに、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドプローブ（１０ヌクレオチド以上）およびポリメラーゼ・チェイン・リアクション増幅がノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスゲノムの検出に用いられる。ｃＤＮＡ中のオープン・リーディング・フレームの発現は、診断用製品、ワクチンおよび抗ウイルス剤において用いられる超免疫もしくはモノクローナル抗体の作製に利用される。上記方法論を用いることにより、表２のヌクレオチド配列が同定された。このヌクレオチド配列内に、幾つかのタンパク質のコーディング領域が同定されている。この配列において、第１のタンパク質はヌクレオチド146ないし5339によってコードされ、そのアミノ酸配列が表３に示されている。この第１のタンパク質は最終的に開裂して、ピコルナウイルス２Ｃ様タンパク質、３Ｃ様プロテアーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む少なくとも３つのタンパク質を作製する。このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、表３に示されるノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド4543ないし4924から推測される。ゲノムのこの部分がＲＮＡポリメラーゼを含むという事実は、他の正センスＲＮＡウイルスにおけるＲＮＡポリメラーゼとの比較により確認されている（図６配列番号３８ないし５０）。また、表２に示される配列において、２つの他のタンパクコーディング領域も見出された。それらは、ヌクレオチド5336ないし6935およびヌクレオチド6938ないし7573によりコードされる。これらの２つのタンパク質のアミノ酸配列を表４および５にそれぞれ示す。例５ノーウォークウイルスゲノムの配列の検出に基づく診断アッセイ臨床において、または汚染された水および食物検体に存在するウイルスは少量であるので、ノーウォークウイルスを検出するために選択されるアッセイはハイブリダイゼーションアッセイである。従来、ノーウォークウイルスのゲノムは知られておらず、配列情報を利用することができなかったため、ノーウォーク及び関連核酸を検出することは不可能であった。ノーウォークウイルスｃＤＮＡから作製されたプローブまたはノーウォークウイルスゲノム配列から作製されたプライマーは、確立しようとする診断製品のためのゲノムを増幅する方法を可能にする。ノーウォークウイルスのみを同定するためのプローブおよび他のノーウォーク関連ウイルスを同定するためのプローブにより、ノーウォークの特異的アッセイまたは多くの、もしくは全てのノーウォーク関連因子に共通の配列を検出するための一般的なアッセイのいずれかを開発することが可能となる。過去、便サンプル中のウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにおいて遭遇した主要な困難性の１つは、逆転写酵素およびＴａｑポリメラーゼ両者の酵素活性を阻害する特徴付けされていない因子（複数）が便中に存在することである（Wild etal. ,J.Clin.Microbiol.28:1300-1307,1990 ）。これらの因子は、通常の核酸抽出法では除去することが困難である。阻害囚子（複数）からウイルスＲＮＡを特異的に分離するための技術が、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）およびオリゴｄ（Ｔ）セルロースを用いて開発された。これらの技術は、酸不溶性多糖を上清中に残しながら核酸を選択的に沈殿させるＣＴＡＢ独特の特性に基づいていていた。得られた核酸はオリゴｄ（Ｔ）に吸着させ、溶出することによりさらに精製した。この工程はポリ（Ａ）テイルを欠く無関係の核酸を除去する。この技術を用いることにより、ＰＣＲによって、極少量（１０％懸濁液400 μｌ）の便サンプル中のノーウォークウイルスが容易に検出された。例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびランダムプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの増幅工程の後に、少量の便中に低濃度で存在するＲＮＡウイルスのゲノムをクローニングすることが今や可能であることは、当該分野の熟練者には認識されるであろう。ある場合には、オリゴｄ（Ｔ）を用いることなく、ＣＴＡＢを用いてＲＴ−ＰＣＲ活性核酸が抽出される。加えて、便から阻害物質（複数）を除去することができるので、便中に存在する他のウイルス（ＤＮΛウイルス、非ポリ（Ａ）テイルＲＮＡウイルス）の核酸を検出し、クローニングすることも可能である。ＣＴＡＢおよびオリゴｄ（Ｔ）セルロースの抽出技術並びに続くＲＴ−ＰＣＲを用いるウイルスＲＮＡの検出は便サンプルに対して用いられ、かつ水および食物サンプルに対して用いることができた。便サンプルを蒸留水に懸濁させ（約１０％wl/vol ）、ジェネトロンで１度抽出した。上清中のウイルスを、最終濃度約８％のポリエチレングリコールを用いて沈殿させた。このウイルスペレットをＳＤＳの存在下において約３７℃で約３０分間プロテイナーゼＫ（約400μｇ／ｍｌ）で処理し、続いてフェノールクロロホルムで１度、クロロホルムで１度抽出した。約５％ＣＴＡＢおよび約０．４ＭＮａＣｌの溶液を、サンプル：ＣＴＡＢ＝約５：２の割合で添加した。ほぼ室温で約１５分間および約４５℃で約５分間インキュベートした後、微小遠心で約３０分間遠心することにより（ウイルスＲＮＡを含む）核酸を集めた。得られたペレットを約ＩＭＮａＣｌに懸濁し、クロロホルムで２回抽出した。水相中のウイルスＲＮＡを直接ＲＴ−ＰＣＲ反応に用い、あるいはオリゴｄ（Ｔ）セルロースに対して吸着／溶出させることによりさらに精製した。オリゴｄ（Ｔ）に対する吸着／溶出のバッチ法は、ポリ（Ａ）テイルドＲＮＡの精製に用いられた。この方法において、上述のとおり部分的に精製された核酸または（ＣＴＡＢ処理を用いずに）フェノールクロロホルムで直接抽出されたＲＮＡを、結合緩衝液［ binding buf fer ］（約０．５ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＴｒｌｓ，ｐＨ７．５）中においてオリゴｄ（Ｔ）セルロース（約２−４ｍｇ／サンプル）と混合した。この混合液を約４℃で約１時間穏やかに振とうしながらインキュベートし、微小遠心で約２分間遠心した。このオリゴｄ（Ｔ）セルロースペレットを結合緩衝液で３−４回洗浄した後、ＩＸＴＥ緩衝液（約１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）でポリ（Ａ）テイルドＲＮＡを溶出した。遠心により上清を集めてオリゴｄ（Ｔ）セルロースを除去し、上清中のウイルスＲＮＡをエタノールで沈殿させた。この段階で得られたＲＮＡは基本的には阻害物質を含有せず、ＲＴ− ＰＣＲに用いることが可能であった。予備実験において、ＣＴＡＢ技術を用いて、０．０５ｇ未満の便サンプル中にノーウォークウイルスＲＮＡが検出された。ＣＴＡＢもしくはオリゴｄ（Ｔ）単独のいずれかを用いて抽出されたＲＮＡで阻害活性の痕跡が観察された。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲの前に抽出された核酸を希釈する（１：２）ことによりこれは容易に除かれた。ＣＴＡＢおよびオリゴｄ（Ｔ）技術を組み合わせることにより、結果として、ＲＴ−ＰＣＲ検出およびウイルスゲノムのクローニングに直接用いることが可能な、高品質の阻害物質非含有ＲＮＡが得られる。少量の便からクローニングするためのこの方法の開発に伴い、当該技術における熟練者は、彼らが、ゲノムの５’末端を発現するものを含むゲノムの残りのｃＤＮＡを得ることができることを知るであろう。ＰＣＲを用いる検出のために、化学的な方法によりゲノムの上記ヌクレオチド配列を作製した。これらのプライマーには、プライマ−１：ヌクレオチド7448ないし7465に位置するCACGCGGAGGCTCTCAAT ；プライマー４：ヌクレオチド7010ないし7027に位置するGGTGGCGAAGCGGCCCTC ；プライマ−８：ヌクレオチド1409ないし1426に位置するTCAGCAGTTATAGATATG：プライマー９：ヌクレオチド612 ないし629 に位置するATGCTATATACATAGGTC：プライマー１６：ヌクレオチド4010 ないし4027に位置するCAACAGGTACTACGTGACおよびプライマー１７：ヌクレオチド4654ないし4671に位置するTGTGGCCCAAGATTTGCT （それぞれ配列番号５１ないし５６）が含まれる。これらのプライマーは、逆転写酵素およびポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いるウイルスの検出に有用であることが示されている。図７はこれらのプライマーを用いたデータを示す。プライマーセット１および４、８および９、並びに１６および１７において、プライマー１、８および１７について上に与えられた配列の逆相補物［ reverse compliments ］を用いた。新規の、付加的なプライマーセット（表６および配列番号１５ないし３７）を、ノーウォーク関連ウイルスを検出するためのプローブとして用いた。表７は、新たに選択されたプライマーセット３６−３５、６９−３９、７８−８０の、多くのノーウォーク関連ウイルスを検出する能力が示されている。これらの結果は、元のノーウォークウイルス配列由来のプライマーセットを、ノーウォーク関連ウイルスの検出に用いるさらなる例である。これらのウイルスの多くのヌクレオチド配列データは、これらの異なるウイルスのプライマーセット３６−３５または６９−３９によって記述されるＲＮＡ領域内に、これらの異なる因子をノーウォークウイルスゲノム配列に由来するプライマーを用いて検出することができるにもかかわらず、遺伝的相関する連続が存在する（８７％ないし０％）ことを示している。別の小腸構成ウイルスの2516ヌクレオチドの配列（ＳＲＳＶ／ＫＹ／８９配列番号１２）もまた、元のノーウォークウイルス配列由来の合計で８つのプライマーセット（プライマー５６および２３、４２および５５、５８および５９、６０およびを６１、７２および６３、７６および７７、６４および７５、並びに７４および３；表６）を用いることにより得られた。例６ノーウォークウイルスタンパク質に対するポリクローナ抗体およびモノクローナル抗体の調製ｃＤＮＡ断片またはそれらの誘導体にコードされているタンパク質（複数）は原核性もしくは真核性発現系において産生され、診断アッセイのために動物を免疫してポリクローナル抗体を産生せしめるために用いられる。原核性ホストには、グラム陽性菌の他に、E.coli、S.tymphimurium、 Serratiamarcescens ＮおよびBacillus subtilis のようなグラム陰性菌を含んでもよい。真核性ホストには酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞が含まれ得る。免疫動物には、モルモット、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギもしくはウマのような哺乳動物、またはニワトリのような非哺乳動物もしくはネズミではない種が含まれ得る。これらの動物を、免疫応答の刺激を増強するためのフロイントのアジュバントのようなアジュバントと混合した発現タンパク質で繰り返し免疫することにより、このタンパク室に対する抗体が産製する。代わりに、部分ｃＤＮＡ配列から（あるいは元のもしくは他のクローンを用いて検出される付加的なｃＤＮＡの配列決定を行なうことにより決定される他の配列から）推定されるアミノ酸配列と一致するように作製された、アミノ酸１５個よりも大きい合成ペプチドを、ウシ血清アルブミン、リソザイムのような担体タンパク質に結合し、またはグルタルアルデドを用いる処理で架橋し、動物の免疫に用いて診断テストのためのポリクローナル抗体を産生させる。発現タンパク質もしくは合成ペプチドのいずれかで免疫された動物の血清を、ノーウォーク及び関連ウイルスに対する抗体が生成していることを示すために、免疫電子顕微鏡法、ウェスタンブロット（イムノブロット）およびブロッキングＥＬＩＳＡのような免疫学的アッセイで試験する。発現タンパク質もしくは合成ペプチドとの反応性は、ポリクローナル血清の特異性を示している。ノーウォーク群の他のウイルス（スノーマウンテン因子、ハワイ因子、タウントン因子等）との反応性は、交差反応エピトープを認識する試薬の生成を示している。上述の免疫原を注入され、かつ生成したポリクローナル抗体を有することが示されたＢａｌｂ＼ｃマウスを、免疫原で追加免疫した後殺す。牌臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを生成するためにそれらの脾臓を取り出す。この融合により得られたハイブリドーマを、発現タンパク質、ペプチドおよびウイルス粒子との反応性についてスクリーニングし、ノーウォークウイルスに対するモノクローナル抗体を産生する細胞を選択する。ノーウォーク関連ウイルスを用いたハイブリドーマのスクリーニングにより、それらのウイルスに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを同定することもまた可能になる。診断アッセイの開発ノーウォークウイルスゲノムの推定アミノ酸配列の解析により、ノーウォークウイルスが図８に示される遺伝構成を有していることが示されている。非細胞含有翻訳系およびバキュロウイルス発現系におけるこのゲノムの領域の発現により、ゲノムの５’末端が非構造タンパク質をコードし、かつゲノムの３’末端が少なくとも１つの構造タンパク質をコードすることが示されている。この情報に基づいて、完全なゲノムもしくはこのゲノムのサブゲノム領域を発現させて、ウイルス性抗原もしくはゲノムの特定領域に対する免疫応答を検出する診断アッセイを創出することが可能である。この情報は、ノーウォークウイルス、抗原またはノーウォークウイルスに対する免疫応答の検出に用いることができる。この情報はまた、現時点では特徴付けされておらず、胃腸炎を引き起こし、もしくは他の疾患を引き起こす可能性のある他の類似ウイルスの検出に用いることもできる。これらのウイルスの幾つかはカリチウイルスまたはピコルナウイルス・スーパーファミリーに属する。これらのウイルスの全ては、それらのＤＮＡ配列中に一致する、もしくは類似のゲノム領域を有する。ノーウォークウイルスに関連するウイルスに由来するｃＤＮＡの有用性は、これらの関連ウイルスに対する診断アッセイのための新規抗体および抗血清の製造を可能にする。例えば、培養することができないカリチウイルス由来のｃＤＮＡの有用性は、これらのクローンのタンパク生成物の発現を可能にする。このタンバク生成物は、新規抗体および抗血清の開発に用いられる。加えて、ノーウォークウイルスに関連するウイルスに由来するｃＤＮＡをノーウォークウイルスに由来するｃＤＮＡと合体させ、生成したタンパク質の一部がノーウォークウイルスゲノム配列から誘導され、かつタンパク質の他の部分がノーウォークウイルスに関連するウイルスのゲノム配列から誘導されたものであるようなキメラタンパク質を製造することに遺伝子工学が用いられている。これらのキメラタンパク質は、その後、診断用試薬、ワクチンおよび抗ウイルス剤の製造に用いられる。診断アッセイの例は、後述の特定の例および図に示される。例７ノーウォークウイルスゲノムの理解に基づいてウイルスゲノムの特定領域を検出することによりノーウォークウイルスまたはノーウォーク関連ウイルスの核酸を検出する診断アッセイの開発ノーウォークウイルスゲノムの遺伝構成は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを開発してノーウォークウイルス配列および他の関連もしくは類似ウイルスの共通配列を検出することが可能な領域としての遺伝配列の特定領域を推測することを可能にする。これらの共通ゲノム配列の幾つかは、カリチウイルスもしくはピコルナウイルス・スーパーファミリーに属するウイルスに見出されている。この検出は、標準ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションまたは他の遺伝子増幅法により行なうことができる。３５（ CTT GTT GGT TTG AGG CCA ＴＡＴＮノーウォークウイルスゲノムのn t4944-4924に相補的、配列番号１５）および３６（ ATA AAA GTT GGC ATG A AC A,ノーウォークウイルスゲノムの nt 4475-4493、配列番号１６）と呼ばれる２つのプライマーを、ノーウォークウイルスＲＮＡポリメラーゼをコードしているらしい領域から選択した。次いで、これらのプライマーを、1982年発生時のヒトカリチウイルスサッポロ株（ＨｕＣＶサッポロ）（図９、配列番号５）のヌクレオチド配列からの逆転写酵素−ＰＣＲによるｃＤＮＡクローンの調製に用いた。得られた配列を、ノーウォークウイルスおよびジーンバンクから入手したネコおよびウサギカリチウイルスの配列と比較した。“c-29*4-ゲル”と呼ばれ、カリチウイルス配列を含むことが決定されているサッポロ株からの第１のｃＤＮＡは488ヌクレオチドの長さであり、そのうちの４０ヌクレオチドはプライマー３６および３５が寄与するものであり、かつ残りの448ヌクレオチドはヒトカリチウイルス・サッポロに独特のものである。クローンc-29*4-ゲルのプライマ−３６および３５の間の配列もまた、図９および配列番号８に示されている。ＨｕＣＶサッポロｃＤＮＡクローンが正しいことは、５つの事実により立証されている。第１に、この配列はノーウォークウイルス、ネコカリチウイルス、およびウサギカリチウイルスとヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで高い相同性を示す（図１０並びに表７および８を参照）。第２に、この配列は正鎖上の領域をコードする連続タンパク質を含む。ノーウォーク、ネコおよびウサギカリチウイルスにおいて、連続タンパク質コーディング領域もまた相同領域に見出される。第３に、この配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するＲＮＡウイルスタンパク質のマーカーであるアミノ酸モチーフＹＧＤＤを有している。c-29 *4-ゲルにおいて、ＹＧＤＤモチーフは配列の末端から予想される距離に存在する。第４に、同じｃＤＮＡ生成物が６つの異なる便検体から得られた。第５に、ジーンバンクにおける他の配列に対しては重要な相同性は見出されなかった。 c-29*4-ゲルのヌクレオチド配列は、内部プライマー［internal primer ］の合成に用いられる。この内部プライマーは、ヒトカリチウイルス・サッポロＲＮＡからの第２のＲＴ−ＰＣＲ生成物のセットの作製に用いられる。多くのｃＤＮＡクローンが得られた。その１つである“at23s2m31”と名付けられたクローンは、ウイルスゲノム上でc-29*4-ゲルに含まれる配列から５’末端側に位置する重複配列を有する。配列ａt23s2m31 は、146ヌクレオチドの長さであり、４６ヌクレオチドでc-29*4-ゲルと重複している。at23s2m31配列およびc-29*4-ゲルとの重複領域については図９を参照。得られたc-29*4-ゲルおよびat23s2m31 の結合配列情報は、プライマ−３５が寄与するc-29*4-ゲルを除いて551ヌクレオチドの長さである。ヒトカリチウイルス・サッポロの配列がノーウォークウイルス配列の知見から派生したとしても、前者は同じ領域において区別することができる（表８または図９参照）。ヒトカリチウイルス・サッポロの公知の配列は、このウイルスがノーウォークウイルスよりも動物カリチウイルスにより密接に関連していることを示している。 1987年５月、ヒューストンにおいて１人の子供がウイルスに感染し、その形態に基づいてこのウイルスはカリチウイルスであると同定された。この子供から採取されたウイルス粒子を含有するサンプルは、ノーウォークウイルスおよびヒトカリチウイルス・サッポロを検出するために開発された血清学的アッセイに反応しなかった。この株のウイルスゲノムからのＲＴ−ＰＣＲを用いるｃＤＮＡの調製にプライマー３６および３５が用いられた。得られたｃＤＮＡ生成物は4847コンプリートと呼ばれ、プライマーを除いて434ヌクレオチドの長さであり、ノーウォークウイルスおよびヒトカリチウイルス・サッポロのそれとは区別することができる（図１０の相同性比較における”ヒューストン”；表１０および配列番号１０参照）。このヒューストンｃＤＮＡが正しいことを示す証拠は、ノーウォークウイルスおよびヒトカリチウイルス・サッポロとの相同性が統計的に有意ではないことを除いて、上にc-29*4-ゲルについて列挙したものと同じである。ヒトカリチウイルス・サッポロおよび関連因子に対する増幅プライマーの作製へのヒトカリチウイルス・サッポロ株由来の配列の使用ヒトカリチウイルス・サッポロの公知配列は、ｃＤＮＡクローンc-29*4-ゲルの最初の増幅に用いられる２つのプライマーのうちの１つ、すなわちプライマ− ３６（表６参照）と呼ばれるプライマーと重複する。その領域における公知カリチウイルス配列（表８、配列番号５７ないし６２）の相同性の試験により、新規の３６プライマーを合成することが可能であり、かつノーウォークウイルスよりもヒトカリチウイルス・サッポロにより密接に関連するカリチウイルスの増幅に用い得ることが示された。新規プライマーが合成され、プライマー“新３６”と称された（表６、最終行、配列番号３７を参照）。 1986年１１月にヒューストン・デイ・ケア・センター（“デイ・ケア”）において下痢の大発生を引き起こしたカリチウイルスからのｃＤＮＡクローンの生成に、プライマ−３５と共に新３６プライマーを用いた。デイ・ケア大発生を引き起こしたこのカリチウイルス株は、ＥＩＡによると、抗原性の上ではヒトカリチウイルス・サッポロに関連を有するもののノーウォークウイルスとは別個のものであった。プライマー新３６および３５を用いてＲＴ−ＰＣＲにより得られたデイ・ケアｃＤＮＡ生成物は、プライマーを除いて445ヌクレオチドの長さであり（図９および配列番号９を参照）、かつ図１０に示されるように、ヒトカリチウイルス・サッポロに近い相同性を有し、ノーウォークウイルスとはより隔たってはいるものの依然として重要な相同性を有している。このデイ・ケアｃＤＮＡが正しいことを示す証拠は、上にc-29*4-ゲルについて列挙したものと同じである。動物カリチウイルスからのｃＤＮＡの誘導へのノーウォークウイルス配列由来のプライマ−３５および３６の使用ピグミーチンパンジー、パン・パニスカスの口からカリチウイルスを単離した。このカリチウイルスは、ＥＩＡによってヒトカリチウイルス・サッポロ株から抗原的に区別される。ＲＴ−ＰＣＲおよびプライマー３６および３５を用いて、霊長類カリチウイルス（ＰｒＣＶ）ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。このｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列は未だ利用することはできない。atprcvw2 と呼ばれるｃＤＮＡは、予想されたサイズであり、かつ公知配列の領域においてヒトカリチウイルス・サッポロ、ネコカリチウイルス（複数）およびウサギカリチウイルスと重大なヌクレオチド相同性を有している。公知配列の領域ではノーウォークウイルスとの重大な相同性は観察されていない。公知のアミノ酸配列には、正鎖上のプライマ−３５から予期された距離にＹＧＤＤモチーフが含まれる。胃腸炎の大発生に関連付けられる別の小腸内ウイルスであるＫＹ８９の検出および特徴付けへのノーウォークウイルスゲノム配列由来の多数のプライマーの使用ノーウォークウイルスの公知配列は、1989年の日本における胃腸炎の大発生時の便から採取された因子であるＳＲＳＶ／ＫＹ／８９のような他のウイルスの配列を得るために用いられている。元来、ｃＤＮＡ生成物および配列情報はプライマーセット３６−３５を用いて得られたものである。別の８セットのプライマー（表６および配列番号２１ないし３６に示される、プライマー５６および２３、４２および５５、５８および５９、６０および６１、７２および６３、７６および７７、６４および７５、並びに７４および３）を用いる継続された研究により、2516ヌクレオチドのＳＲＳＶ／ＫＹ／８９配列が決定された（図１１および１２、配列番号１２を参照）。この配列には、ゲノムのポリメラーゼ領域およびカプシド領域の一部が含まれる。図１４および６（配列番号３８ないし５０および６３ないし７５）は他のノーウォーク関連ウイルス由来の配列を示す。他のノーウォーク関連ウイルスを用いてこのアプローチを連続的に適用する（例えば、表７に示すように）ことにより、多数のノーウォーク関連ウイルスの完全な配列を発見することが可能になる。当該分野の熟練者は、そのような配列情報並びにノーウォーク関連ウイルスの断片および誘導体の発現を利用することにより、ノーウォークウイルス断片および誘導体が用いられているのと同じ方法で、抗体、抗原、ウイルス性遺伝物質または抗ウイルス物質を検出する診断アッセイの開発並びに特定のノーウォーク関連ウイルスに対するワクチンを開発することが可能になることを理解するであろう。例８発現したノーウォークウイルスタンパク質を用いる、ノーウォークウイルスに対する免疫応答を検出する診断アッセイの開発ノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体においてコードされる蛋白質は、原核性又は真核性発現系において産生され、ウイルス感染による免疫応答を検出する診断アッセイにおいて抗原として用いられる。原核性ホストには、グラム陽性菌の他に、Escherichia coli、Salmonella tymphimurium 、 Serratia marcescens 、Bacillus subtilis, Staphylococcus aureusおよびS treptococus sanguinisのようなグラム陰性菌も含まれる。真核性ホストには酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞が含まれる。診断アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット又は他のアッセイのような多くの形態が含まれる。図１５は、ノーウォークウイルスゲノムの３’末端によりコードされたカプシドタンパク質のデータを示す。これは、表２および図８に示されるＤＮＡ配列のヌクレオチド5337ないし7753により発現される。このタンパク質は約58,500の分子量を有しており、以下58,500 ｍｗｔタンパク質と称する。これは、バキュロウイルス組換体（Ｃ−６およびＣ−８）に感染した昆虫細胞において産生された。Ｃ−６およびＣ−８感染細胞おける58,500 ｍｗｔタンパク質を表わすバンド（図１５の矢印を参照）は、野生型（ＷＴ）バキュロウイルスに感染した昆虫細胞または偽感染細胞では見られない。ノーウォークウイルスｃＤＮＡもしくは断片もしくは誘導体によってコードされる他のタンパク質は、バキュロウイルス組換体および他の発現系を用いることにより同様に発現される。図１６は、バキュロウイルス発現系を用いて産生される 58,500 ｍｗｔタンパク質を利用して、ノーウォークウイルス接種によるボランティアの感染前後の免疫応答を検出したデータを示す。抗原をＥＬＩＳＡプレート上におき、プレーおよびポスト-感染ヒト血清を添加した。このデータは個人がいつ感染したのかを示すものであり、ポスト-血清は抗原に強く反応する。ノーウォークウイルスｃＤＮＡまたはそれらの断片もしくは誘導体においてコードされる他のタンパク質は、ノーウォークウイルス感染に続く免疫応答の検出に、同様に用いられる。幾つかのタンバク質は、粒子を形成し得る内因性の特性を有している。上述の 58,500 ｍｗｔタンパク質もその特性を有している。タンパク質から形成される粒子はいかなる発現系においても現われ、抗体応答もしくは免疫応答の検出に基づく診断アッセイの構築に用いられる。図１７は、バキュロウイルス発現系を用いて、ノーウォークゲノムの３’末端を有する組換体から産生された粒子の電子顕微鏡像を示す。これらの粒子は、本来のウイルス粒子と似たサイズを有している。それらは、抗原性であり、免疫反応性であり、かつ免疫原性である。それらは、発現した粒子の多くが核酸を欠いているという点で、自然の状態で感染した結果得られるウイルス粒子のほとんどとは異なる。ｒＮＶ粒子は、マウス、ウサギおよびモルモットに非経口的に与えるとき、あるいはマウスに経口的に与えるときに高い免疫原性を示す。図１８は、ＣｓＣｌグラジエント中で遠心した後のｒＮＶ粒子の特性についてのデータを示す。粒子の密度（黒塗りの四角で記号化されている）は１．３１ｇ／ｃｃであり、これはボランティアに投与された元の感染性ノーウォーク接種物から精製された粒子の密度１．３８ｇ／ｃｃとは異なる。このグラジエントを分画した。各画分をＥＬＩＳＡプレート上におき、次いでヒト血清を導入した。白抜きの四角は、プレー感染血清にはＥＬＩＳＡ活性がないことを示している。黒塗りの菱形は、ポスト-感染血清に反応性があることを示している。ノーウォークウイルスｃＤＮＡまたはそれらの断片もしくは誘導体においてコードされる他のタンパク質から作製される他の粒子も、ノーウォークウイルス感染の後の免疫応答の検出に同様に用いられる。図１９は、58,500ｍｗｔタンパク質によって形成された精製粒子を用いて、ノーウォークウイルスに感染した９名のボランティアの（接種前ではなく）接種後の血清サンプル中の免疫応答を検出したデータを示す。これらのボランティアの１人である６番は、臨床的な症状の監視または免疫応答の測定に基づいても、ノーウォークウイルス感染の兆候を示さなかった。精製された発現粒子をＥＬＩＳＡプレート上にのせ、各ボランティアから採取した１つの感染前血清サンプルおよび１つの感染後血清サンプルを粒子に添加した。感染前および感染後の各々のサンプルにおいて粒子に結合した抗体の量を測定した。図１９に示すデータは、発現タンパク質が免疫反応性で、かつ抗原性の粒子を形成することを示している。ノーウォークウイルスｃＤＮＡまたはそれらの断片もしくは誘導体においてコードされる他のタンパク質も、免疫反応性および抗原活性の検出に同様に用いられる。ノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスを検出する診断アッセイのさらなる開発も追求された。第１に、新しいＥＬＩＳＡアッセイがノーウォークカプシドタンパク質を利用することに基づいて創出された。このタンパク質は、ノーウォークウイルスｃＤＮＡ配列から推測された後バキュロウイルス発現系を用いて生成されたｃＤＮＡ断片から合成されるように加工されている。この発現したノーウォークウイルスカプシドタンパク質は、自己集合して組換えノーウォークウイルス粒子（ｒＮＶ）となった。このｒＮＶ抗原を用いて２つの新しいＥＬＩＳＡアッセイが確立された。１方のアッセイは抗ウイルス抗体を検出し、他方はウイルス抗原を検出する。両ＥＬＩＳＡ法は、そのような因子の検出に利用可能な（ヒトボランティア由来の試薬に基づく）従来のアッセイと比較して、非常に鋭敏である。抗体ＥＬＩＳＡのさらなる特徴付は、このアッセイがノーウォークウイルスによるヒトへの感染、あるいはスノーマウンテンおよびハワイ因子のようなノーウォーク群に属するウイルスによるヒトへの感染のサブセット、に続く免疫応答を検出することを示している。対照的に、抗原ＥＬＩＳＡは、バキュロウイルス発現組換えノーウォークウイルス粒子（ｒＮＶ）に作製した超免疫血清を用いることを基礎としている。この抗原ＥＬＩＳＡは非常に特異的であることが見出されており、始原型ノーウォークウイルス（ 8FIIa）および密接に関連する因子のサブセットは認識するが、スノーマウンテン因子およびハワイ因子のようなノーウォーク群に属する他の全てのウイルスは認識しない（表１および７を参照）。抗原ＥＬＩＳＡは小腸構成ウイルスやカリチウイルスのようなノーウォーク群に属する他のウイルスを検出はしないが、これらおよび他のノーウォーク関連ウイルスはノーウォークウイルスのヌクレオチド配列から選択されたプライマーを用いて検出することが可能である（表７を参照）。より広範に反応する診断アッセイを開発するために、ノーウォークウイルスゲノムの他の断片を利用することを基礎とするＥＬＩＳＡを開発した。この新しい診断アッセイは、抗体応答、またはカプシド領域以外のノーウォークウイルスゲノムの断片から推測される抗原の検出に基いている。このアプローチの例およびデータは以下の通りである。特定のノーウォークウイルス非構造タンパク質がノーウォークウイルスゲノムの第１ＯＲＦにおいてコードされることが予想される。このＯＲＦはウイルスゲノムの５′末端に位置し、190,000（190Ｋ）の予想分子量を有している。このＯＲＦ１が診断アッセイにおいて有用かどうかを、まず全ウイルスＲＮＡにおいてコードされるタンパク質を発現させ、次いで、細胞非含有系を用いて、コードされたタンパク質の合成とその免疫活性の試験を行なった。これは、ノーウォークウイルスゲノムｃＤＮＡの全ｃＤＮＡ（ｐＧＮＶ−Ｆ）のイン・ビトロ転写により行なった。この全ｃＤＮＡは、図５の物理マップに示される元のノーウォークウイルスｃＤＮＡのサブゲノム誘導体をライゲートすることにより構築した。次に、合成されたＮＶｍＲＮＡを、ノーウォークウイルス特異的タンパク質の合成に向かうそれらの能力について、放射標識タンパク質を生成するための³⁵ｓメチオニンの存在下において、網状赤血球溶解物中における細胞非含有翻訳により試験した。発現したタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。ウイルスＲＮＡを含有するサンプルにおいては分子量約130,00 0の明瞭なバンドが観察されたが、陰性対照（ウイルスＲＮＡなし）においては見出されなかった。このタンパク質の免疫反応性を、ノーウォークウイルスを投与したボランティアから採取した感染前および感染後の血清との反応性により試験した。この130Ｋタンパク質は、ノーウォークウイルスに感染したボランティアの回復期血清によって沈殿したが、感染前に採取された血清によっては沈殿しなかった。これは、このタンパク質がウイルス特異的であることを示している。これは、130Ｋタンパク質がいくらかの免疫反応性エピトープを有していることを示した。この翻訳系において作製されるタンパク質のサイズが明らかに小さいことは、このタンパク質のゲル上での移動が異常であるか、あるいは内部開始コドンが翻訳の開始に用いられているか、もしくはタンパク質が翻訳された後にある種の翻訳後修飾が起こっているかのいずれかであることを示唆している。診断アッセイに有用なノーウォークウイルスｃＤＮＡの免疫反応性誘導体をさらに特徴付けるために、バキュロウイルス発現系を用いて、ノーウォークウイルスゲノムの２Ｃ領域（図８を参照）を発現させた。この領域は、それが非構造タンパク質の５−末端に位置し、かつ予想されるノーウォークウイルスタンパク質の配列と関連カリチウイルスおよびピコルナウイルスについて公表された新規配列との間で高レベルの保全が見出されたため、最初の発現のために選択された。ウイルスゲノムの５′末端ｃＤＮＡをバキュロウイスル転移ベクターｐＶＬ１３９３にサブクローニングした。昆虫Ｓｆ９細胞に、野生型バキュロウイルスＤＮＡと一緒に共形質導入［co-transfection ］した後、ノーウォークウイルス遺伝子を有する組換え体を同定し、選別した。プラーク生成を３回繰り返した後、組換え−感染昆虫細胞の放射標識溶解物を調製し、ＰＡＧＥにより放射標識タンパク質を分析した。その結果、組換え−感染細胞においては見掛けの分子量が57,0 00（５７Ｋ）のタンパク質が生成したが、非感染細胞では生成していないことが示された。このタンパク質のサイズからは、ヌクレオチド953に位置する内部ＡＵＧ開始コドンがこのタンパク質の生成に用いられたことが示唆される。この５７Ｋタンパク質もまた、ノーウォークウイルスに感染したボランティアに由来する回復期血清により沈殿する（が、感染前血清では沈殿しない）。このタンパク質は、主に細胞に関連して残った。当該分野における熟練者は、この２Ｃ非構造タンパク質の収量および純度の改善が可能であり、それがノーウォークおよび関連ウイルス感染を検出するためのより迅速なＥＬＩＳＡをもたらすであろうことを容易に理解するであろう。当該分野の熟練者はまた、ノーウォークウイルスゲノムの別の領域（例えば、３Ｃ様、３Ｄ様および３ｄ０ＲＦ）からタンパク質を発現することにより、２Ｃ非構造およびｒＮＶ構造タンパク質を用いて構築したＥＬＩＳＡと同様に、ノーウォークおよび関連ウイルスの診断アッセイが構築されることも理解するであろう。これらの新規アッセイは、ノーウォーク関連ウイルスの検出のスペクトルを広げるに違いない。ノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスを検出するための鋭敏な方法が初期に欠如していたことが、多くのノーウォーク関連ウイルスの明確な記述を困難なものとしていた。しかしながら、表７に示されるように、ここに提供される方法およびデータは、ノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド配列の発見が、いかにしてノーウォークウイルスおよび他の関連因子を検出するための試験を開発する能力にまで達するかを示している。これらのデータおよび方法はまた、ノーウォークウイルスゲノムの断片および誘導体を、ノーウォークおよび関連ウイルスの証拠およびこれに対する免疫性を得るために用いることができることを示している。例９発現したノーウォークウイルスおよびノーウォーク関連ウイルスを用いる、ウイルス性抗原を検出するための診断アッセイの開発原核性もしくは真核性発現系における１以上のノーウォークウイルス遺伝子の発現により形成される個々のタンパク質、粒子またはタンパク質凝集体を免疫原として用い、あるいは動物に接種して、ウイルス性抗原を検出する診断アッセイのためのポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造する。バキュロウイルス発現系を用いて生成した組換えノーウォークウイルス粒子（ｒＮＶ）は、非経口免疫に従って、マウス、モルモットおよびウサギにおけるポリクローナル抗体の製造に用いられている（表９を参照）。ｒＮＶを経口投与されたマウスはまた、血清抗体を発現している。また、ｒＮＶで免疫されたマウス由来のハイブリドーマも、ミエローマ細胞との融合により得られている。これらの抗体を捕獲ＥＬＩＳＡにおいて用いることにより、ＮＶ抗体を検出できることが示されている。ｒＮＶ粒子に対して作製された抗血清に基づくこの抗原ＥＬＩＳＡは、非常に特異的であり、ノーウォーク関連ウイルスのサブセットのみを検出する（表７を参照）。したがって、カプシド抗原に対するより広範な反応性を有するＥＬＩＳＡを構築するために、（スノーマウンテン、ハワイ等の）他のノーウォーク関連ウイルス由来のさらなるカプシド抗原を発現させなければならない。ＥＬＩＳＡは、ウイルス性抗原の検出に用いることができる唯一の形式である。他の形式には、免疫蛍光法もしくはイムノサイトケミストリー、または免疫電子顕微鏡法が含まれ得る。ノーウォークウイルスとノーウォーク関連ウイルスとを比較することにより、カプシドタンパクの保全領域を同定し、そのような配列の断片を動物の免疫に用い、その結果ノーウォークウイルスに対してより広範な反応性を有する抗血清を製造することが可能となる。その代わりに、ノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスの発現タンパク質で動物を連続的に免疫することにより、所望の広範な反応性を有する抗血清が得られるであろう。数種のノーウォークおよびノーウォーク関連ウイルスの１種に特異的な抗原検出アッセイ、並びにより広範な反応性を有するさらなるアッセイは、いずれも用いられるであろう。ゲノムの他の領域にコードされているタンパク質の断片の発現は、ウイルス性抗原を検出するためのＥＬＩＳＡにおいて用いられる、他のタンパク質に対する抗血清の製造に利用することができる。ゲノムの５′末端にコードされるポリプロテインを代表する第１ＯＲＦおよびポリプロテインの断片２Ｃの発現は、これらの非構造タンパク質の各々およびこれらに対して作製された抗血清がこれらのウイルスタンパク質を検出する診断アッセイの開発に利用可能であることを示している。これらのアッセイは、配列保全の故に、広範に反応し、多くの別のノーウォーク関連ウイルスを検出することができる。当該分野の熟練者は、ノーウォークウイルスのゲノム構成の知識によって、ウイルス性抗原を検出する診断アッセイに用いるために、他のノーウォーク関連ウイルスのゲノムの同じ領域を同様に発現させることが可能であることを理解するであろう。例１０ノーウォークウイルス発現抗原を用いるワクチンの開発発現したノーウォークウイルスタンパク質から、ノーウォークウイルス、ノーウォーク群のウイルスまたは他の小腸内ウイルスに対するワクチンを作製する。発現タンパク質は、単独で、もしくは１種以上の他のノーウォークウイルスタンパク質との組み合わせで発現したノーウォークウイルスカプシドタンパク質であっても、自己形成粒子であってもよい。例えば、図１７に示される粒子は、バキュロウイルス発現系を用いて作製された。これらは、単独で、もしくは１種以上の他のノーウォークウイルスタンパク質との組み合わせで発現する場合にはワクチンとして用いられる。同様に、ノーウォークウイルスｃＤＮＡまたはそれらの断片もしくは誘導体においてコードされる他のタンパク質は、単独で、もしくは１種以上のノーウォークウイルスタンパク質との組み合わせで発現する場合にはワクチンとして用いられる。個人には、経口、非経口または両方法の組み合わせによりワクチン投与する。非経口ワクチン投与では、発現タンパク質をアジュバントと混合し、最大免疫応答および保護免疫が得られる量および間隔で１以上の投与量を投与する。経口ワクチン投与はノーウォークウイルス接種物による自然感染と同意義である。すなわち、個人は、脱塩素水または緩衝液と共にワクチンを摂取する。経口ワクチン投与では、続いて、胃の活性を中和するために重炭酸ナトリウム処理することもできる。例えば、各人は、ワクチン投与の２分前および５分後に重炭酸ナトリウム溶液を摂取する。例１１発現したノーウォークウイルスカプシドを他の抗原もしくは他の抗原の一部の発現のための担体として用いることによる、他の因子に対するワクチンの製造発現した後に粒子を形成するノーウォークウイルスカプシドタンパクをコードするゲノムの領域（すなわち、領域5346ないし6935および5337ないし7753）を同定することにより、カプシドタンパクをコードするｃＤＮＡに抗原性エピトープをコードするｃＤＮＡの１以上の非相同片を組み込む遺伝子加工が可能となる。そのような組換え遺伝子が発現することにより、抗原性の組換えカプシドが生成し、抗体が誘導されて、ノーウォークウイルスおよびその抗原に対して、並びに非相同エピトープもしくは抗原に対して保護される。代わりに、ノーウォークウイルスカプシドタンパク担体を、１以上の非相同タンパク抗原または非相同エビトープを有する合成ペプチドと混合し、あるいは共有結合的に結合させる。この混合物は抗原性であり、抗体を誘導し、ノーウォークウイルスおよびその抗原に対して、並びに非相同エピトープもしくは抗原に対して保護する。個人には、例１０に記載される経口もしくは非経口法を用いてワクチン投与する。例１２キットノーウォークウイルスに対する免疫応答を検出するためのキットは、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体から推測されるタンパク質を容器内に供給することにより調製される。ノーウォーク関連ウイルスに対する免疫応答を検出するために、同様のタンパク質をノーウォーク関連ウイルスから調製する。例えば、そのようなキットには、ノーウォークウイルスヌクレオチド１ないし7753によりコードされるタンパク質、ノーウォークウイルスヌクレオチド146ないし5359によりコードされるタンパク質、ノーウォークウイルスヌクレオチド5337ないし7573 によりコードされるタンパク質、ノーウォークウイルスヌクレオチド5346ないし 6935によりコードされるタンパク質、ノーウォークウイルスヌクレオチド6938ないし7573によりコードされるタンパク質およびそれらの組み合わせを用いることができる。また、このキットには、偽陽性および偽陰性対照、試薬およびサンプル収集装置を含めることもできる。このキットは、１つのサンプルを検出するために、もしくは多数のサンプルを検出するために備えることができる。例１３キットノーウォークウイルスおよびノーウォーク関連ウイルスを検出するためのキットは、表３、４、または５に示されるノーウォークウイルスゲノムの推定アミノ酸配列、またはこの推定アミノ酸配列の断片もしくは誘導体から発現されるタンパク質から作製された少なくとも１つの抗血清を容器内に供給することにより調製される。同様の抗血清を、ノーウォーク関連ウイルスゲノムによってコードされるタンパク質から調製する。例えば、ノーウォークウイルスヌクレオチド１ないし7753によりコードされるタンパク質に対して作製された抗血清、ノーウォークウイルスヌクレオチド146ないし5359によりコードされるタンパク質に対して作製された抗血清、ノーウォークウイルスヌクレオチド5337ないし7573によりコードされるタンパク質に対して作製された抗血清、ノーウォークウイルスヌクレオチド5346ないし69 35によりコードされるタンパク質に対して作製された抗血清、ノーウォークウイルスヌクレオチド6938ないし7573によりコードされるタンパク質に対して作製された抗血清およびそれらの組み合わせを用いることができる。また、このキットには、偽陽性および偽陰性対照、試薬およびサンプル収集装置を含めることもできる。このキットは、１つのサンプルを検出するために、もしくは多数のサンプルを検出するために備えることができる。結論として、ここに記載される発明および態様は、目的を遂行、言及される目的および効果並びにその他本願に固有の事項の達成に適している。この発明の新規の特徴は添付の請求の範囲に示されている。開示を目的としてこの発明の現時点で好ましい態様が記述されているが、ここに記述される合成および使用の詳細における多くの変更は当該分野における熟練者には明らかであろう。しかしながら、この発明を開示された特定の形態に限定する意図はなく、逆に、この発明の精神および範囲内にある、全ての変更、合成および使用の代替手段並びに均等物を含めることを意図するものであることは理解されるべきである。配列表 (1)一般情報： (i)出願人：マトソン，デビットオウエステス，マリーケイジアン，キシィグラハム，デビットワイ (ii)発明の名称：ノーウォークおよび関連ウイルスを検出しかつ特徴付けるための方法ならびに試薬 (iii)配列の数：７５ (iv)住所： (Ａ) 番地：フルブライトアンドヤオルスキーパテントデパートメント (Ｂ) 通り：１３１０マッキニー，スイート (Ｃ) 市：ヒューストン (Ｄ) 州：テキサス (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：７７０１０−３０９５ (v) コンピュータ読取形式： (Ａ) 媒体形式：フロッピーディスク (Ｂ) コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパチブル (Ｃ) オペレーションシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０，バージョン＃１．２５ (vi) 本出願の記録： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分類： (viii) 弁護士／代理人の情報： (Ａ) 氏名：ロウナー，チャーレンエイ (Ｂ) 登録番号：３３，０３５ (Ｃ) 参照／明細番号：Ｄ−５５２６ (ix) 遠距離通信情報： (Ａ) 電話：７１３−６５１−３６３４ (Ｂ) ファックス：７１３−６５１−５２４６ (Ｃ) テレックス：ウエスタンユニオン７６２８２９ (２) 配列番号１の情報 (i) 配列の特徴： (Ａ）配列の長さ：７７５３塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：不明 (ii) 配列の種類：ｃＤＮＡ (vi) 起源： (Ａ) 生物名：ノーウォークウイルス (Ｂ) 株名：８ＦＩＩａ (vii) 直接の起源： (Ｂ) クローン：ｐＵＣＮＶ−９５３およびその誘導体 (ix) 配列の特徴 (Ａ) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (Ｂ) 存在位置：１４６．．５３５９ (Ｄ) 他の特徴：／記＝１４６〜５３５９のヌクレオチドによりコード化されたタンパク質は結局は開裂して、少なくとも、ピコルナウイルス２Ｃ様タンパク質、３Ｃ様プロテアーゼおよびＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼになる。 (ix) 配列の特徴 (Ａ) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (Ｂ) 存在位置：５３４６．．６９３５ (Ｄ) 他の情報：／記＝５３４６〜６９３５のヌクレオチドは２つの異なるアミノ酸配列をコードするのに使用される。一つは、１４６〜５３５９のヌクレオチドによりコードされるアミノ酸であり、もう一つは、５３４６〜６９５３のヌクレオチドによりコードされるアミノ酸である。 (ix) 配列の特徴 (Ａ) 特徴を表す記号：ＣＤＳ (Ｂ) 存在位置：６９３８〜７５７３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ (72)発明者ジアン、クザイアメリカ合衆国、テキサス州 77025、ヒューストン、カプリ 9211 (72)発明者グラハム、デイビッド・ワイアメリカ合衆国、テキサス州 77054、ヒューストン、ミスチャイアー 4051

Claims

【特許請求の範囲】１．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスゲノムに結合するに十分なサイズを有する、表２に示される式のｃＤＮＡ配列並びにそれらの断片および誘導体。２．表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体のヌクレオチド１ないし7753を含むヌクレオチドによってコードされるタンパク質。３．前記タンパク質が原核性発現系または真核性発現系において産生される請求の範囲第２項記載のタンパク質。４．前記タンパク質が化学的方法により製造される請求の範囲第２項記載のタンパク質。５．表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体のヌクレオチド146ないし5359によってコードされるタンパク質。６．前記タンパク質が原核性発現系または真核性発現系において産生される請求の範囲第５項記載のタンパク質。７．前記タンパク質が化学的方法により製造される請求の範囲第５項記載のタンパク質。８．表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたは断片のヌクレオチド45 43ないし4924によってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。９．前記ＲＮＡポリメラーゼが原核性発現系または真核性発現系において産生される請求の範囲第８項記載のＲＮＡポリメラーゼ。１０．前記ＲＮＡポリメラーゼが化学的方法により製造される請求の範囲第８項記載のＲＮＡポリメラーゼ。１１．表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体のヌクレオチド5337ないし7573によってコードされるタンパク質。１２．前記タンパク質が原核性発現系または真核性発現系において産生される請求の範囲第１１項記載のタンパク質。１３．前記タンパク質が化学的方法により製造される請求の範囲第１１項記載のタンパク質。１４．表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体のヌクレオチド5346ないし6935によってコードされるタンパク質。１５．前記タンパク質が原核性発現系または真核性発現系において産生される請求の範囲第１４項記載のタンパク質。１６．前記タンパク質が化学的方法により製造される請求の範囲第１４項記載のタンパク質。１７．表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体のヌクレオチド6938ないし7573によってコードされるタンパク質。１８．前記タンパク質が原核性発現系または真核性発現系において産生される請求の範囲第１７項記載のタンパク質。１９．前記タンパク質が化学的方法により製造される請求の範囲第１７項記載のタンパク質。２０．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを検出するためのＲＮＡプローブを製造する方法であって、ノーウォークウイルスｃＤＮＡクローンを転写ベクターにサブクローニングする工程；該ｃＤＮＡ含有転写ベクターを増殖させる工程；ＲＮＡポリメラーゼを添加して、イン・ビトロ転写により一本鎖ＲＮＡを生成させる工程；および該一本鎖ＲＮＡを単離する工程を包含する方法。２１．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを含有することが疑われるサンプルにおいてノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを同定する方法であって、ノーウォークウイルスまたはノーウォーク関連ウイルスに特異的なｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、該ｃＤＡＮまたはＲＮＡプローブがノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスゲノムに結合する条件下において、試験しようとする前記サンプルに添加する工程；および前記ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブの結合量を測定する工程を包含する方法。２２．前記サンプルが、食物、水および便からなる群より選ばれる請求の範囲第２１項記載の方法。２３．前記ｃＤＮＡが、ｐＵＣＮＶ−953、ｐＵＣＮＶ−4145、ｐＵＣＮＶ−4 095、ｐＵＣＮＶ−5030およびｐＵＣＮＶ−5101からなる群より選ばれるか、あるいはそれらの断片もしくは誘導体である請求の範囲第２１項に記載の方法。２４．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを含有することが疑われるサンプルにおいてノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを同定する方法であって、各々約１０ヌクレオチド以上の、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを、該ヌクレオチドがノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスゲノムに結合する条件下において、前記サンプルに添加する工程；前記結合オリゴヌクレオチドの間のヌクレオチド配列を増幅する工程；および増幅した配列の量を測定する工程を包含する方法。２５．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを含有することが疑われるサンプルにおいてノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを同定する方法であって、ＣＴＡＢ法を用いて核酸を単離する工程；核酸を増幅する工程；および増幅生成物を測定する工程を包含する方法。２６．前記ＣＴＡＢ法が、前記サンプルをジェネトロンで抽出する工程；前記ジェネトロン抽出サンプルの上清を除去する工程；前記上清中のウイルスをポリエチレングリコールで沈殿させる工程；前記沈殿物をＳＤＳの存在下においてプロテイナーゼＫで３０゜分処理する工程；前記処理沈殿物をフェノールークロロホルム、次いでクロロホルムで連続的に抽出する工程；前記連続的に抽出したサンプルの上清に、約５％ＣＴＡＢおよび約０．４ＭＮａＣｌの溶液を、サンプル：ＣＴＡＢを約5:2の割合で添加することにより混合液を形成する工程：前記溶液をインキュベートする工程；前記溶液を遠心して核酸を集める工程：前記核酸をＩＭＮａＣｌに懸濁し、その後クロロホルムで抽出する工程を包含する請求の範囲第２５項に記載の方法。２７．前記核酸に対して逆転写を行なう工程；プライマーを用いて核酸を増幅する工程；およびアガロースゲル電気泳動を用いて増幅した核酸を検出する工程をさらに包含する請求の範囲第２５項に記載の方法。２８．食物、生物学的および環境的サンプルからのノーウォークまたは病原因子をクローニングする方法であって、ＣＴＡＢ法を用いて核酸を単離する工程；核酸を増幅する工程；および前記増幅された核酸をベクターに組み込む工程を包含する方法。２９．式CTT GTT GGT TTG AGG CCA TATで表わされるプライマー配列。３０．式ATA AAA GTT GGC ATG AAC Aで表わされるプライマー配列。３１．式GTT GAC ACA ATC TCA TCA TCで表わされるプライマー配列。３２．式GGC CTG CCA TCT GGA TTG CCで表わされるプライマー配列。３３．式GGG CCC CCT GGT ATA GGT AAで表わされるプライマー配列。３４．式TGG TGA TGA CTA TAG CAT CAG ACA CAA Aで表わされるプライマー配列。３５．式ACT CAC CCA AAT CCT CCAで表わされるプライマー配列。３６．式GTT CTG ACC ACC TAA CCTで表わされるプライマー配列。３７．式AGT TTG GGT CCC CAT CTT AAT CCT TTで表わされるプライマー配列。３８．式TGA ACC AAA ACC AGG GGGで表わされるプライマー配列。３９．式AGC AAA GTC ATA CAT GAA ATで表わされるプライマー配列。４０．式CCA TTA TAC ATT TGT AGで表わされるプライマー配列。４１．式ATT ATA GTT TCT TGC ATAで表わされるプライマー配列。４２．式CAC ACT CTG GAC ATT GTC TGで表わされるプライマー配列。４３．式CAT TGG GTT TCC AGA CCT Aで表わされるプライマー配列。４４．式ATA ATT GGG GAT CTT CCA AAで表わされるプライマー配列。４５．式TAG TGG CAT GGG TAT TTCで表わされるプライマー配列。４６．式TAT GCC AAT CAC AGC CACで表わされるプライマー配列。４７．式GTC TGG CTC CCA AGT TGA CCで表わされるプライマー配列。４８．式CGG TAT CAG GGT CAA CATで表わされるプライマー配列。４９．式TGA GGC TGC CCT GCT CCAで表わされるプライマー配列。５０．式CCA CCG CTG TCC GGG AGGで表わされるプライマー配列。５１．式GTT GCT GTT GGC ATT AAC Aで表わされるプライマー配列。．５２．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを検出するためのプローブの製造方法であって、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体から、１以上の短もしくは長ヌクレオチドを合成する工程を包含する方法。５３．請求の範囲第５２項に記載の方法により製造されたプローブ。５４．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスを検出するためのプローブの製造方法であって、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体のサブゲノム領域から、１以上の短もしくは長ヌクレオチドを合成する工程を包含する方法。５５．請求の範囲第５４項に記載の方法により製造されたプローブ。５６．前記サブゲノム領域が式CTT GTT GGT TTG AGG CCA TATの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。５７．前記サブゲノム領域が式ATA AAA GTT GGC ATG AAC Aの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。５８．前記サブゲノム領域が式GTT GAC ACA ATC TCA TCA TCの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。５９．前記サブゲノム領域が式GGC CTG CCA TCT GGA TTG CCの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６０．前記サブゲノム領域が式GGG CCC CCT GGT ATA GGT AAの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６１．前記サブゲノム領域が式TGG TGA TGA CTA TAG CAT CAG ACA CAA Aの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６２．前記サブゲノム領域が式GTT CTG ACC ACC TAA CCTの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６３．前記サブゲノム領域が式AGT TTG GGT CCC CAT CTT AAT CCT TTの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６４．前記サブゲノム領域が式TGA ACC AAA ACC AGG GGGの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６５．前記サブゲノム領域が式AGC AAA GTC ATA CAT GAA A Tの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６６．前記サブゲノム領域が式CCA TTA TAC ATT TGT AGの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６７．前記サブゲノム領域が式CAC ACT CTG GAC ATT GTC TGの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６８．前記サブゲノム領域が式CAT TGG GTT TCC AGA CCT Aの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。６９．前記サブゲノム領域が式ATA ATT GGG GAT CTT CCA AAの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。７０．前記サブゲノム領域が式TAT GCC AAT CAC AGC CACの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。７１．前記サブゲノム領域が式GTC TGG CTC CCA AGT TGA CCの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。７２．前記サブゲノム領域が式CGG TAT CAG GGT CAA CATの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。７３．前記サブゲノム領域が式TGA GGC TGC CCT GCT CCAの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。７４．前記サブゲノム領域が式CCA CCG CTG TCC GGG AGGの配列を含む請求の範囲第５５項記載のプローブ。７５．前記サブゲノム領域がノーウォークゲノムの第１オープン・リーディング・フレームを含む請求の範囲第５４項記載の方法。７６．請求の範囲第７５項に記載の方法により製造されるプローブ。７７．前記サブゲノム領域がヌクレオチド146ないし5359を含む請求の範囲第５４項記載の方法。７８．請求の範囲第７７項に記載の方法により製造されるプローブ。７９．前記ヌクレオチドが、ピコルナウイルス２Ｃ様タンパク質、３Ｃ様プロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはそれらの組み合わせをコードする請求の範囲第５４項記載の方法。８０．請求の範囲第７９項に記載の方法により製造されるプローブ。８１．前記ヌクレオチドがカプシドタンパクをコードする請求の範囲第５４項記載の方法。８２．請求の範囲第８１項に記載の方法により製造されるプローブ。８３．前記サブゲノム領域がヌクレオチド5337ないし7573を含む請求の範囲第５４項記載の方法。８４．請求の範囲第８３項に記載の方法により製造されるプローブ。８５．前記サブゲノム領域がヌクレオチド5346ないし6935を含む請求の範囲第５４項記載の方法。８６．請求の範囲第８５項に記載の方法により製造されるプローブ。８７．前記サブゲノム領域がヌクレオチド6938ないし7573を含む請求の範囲第５４項記載の方法。８８．請求の範囲第８７項に記載の方法により製造されるプローブ。８９．ノーウォーク関連ウイルスを検出するためのプローブの製造方法であって、 GTTGCTGTTGGCATTAACA 、 TAGTGGCATGGGTATTTCNATTATAGTTTCTTGCATA、 AGCAAA GTCATACATGAAATNおよびACTCACCCAAATCCTCCAよりなる群から１以上のヌクレオチド配列を選択する工程；該ヌクレオチド配列を化学的方法または発現系において生成させる工程を包含する方法。９０．請求の範囲第８９項に記載の方法により製造されるプローブ。９１．ノーウォークウイルスに対する免疫応答を検出するためのキットであって、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体によってコードされるタンパク質を収容する容器を具備するキット。９２．前記タンパク質が、ヌクレオチド１ないし7753によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド146ないし5359によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5337ないし75７３によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5346 ないし6935によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド6938ないし7573によってコードされるタンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求の範囲第９１項記載のキット。９３．ノーウォーク関連ウイルスに対する免疫応答を検出するためのキットであって、該ノーウォーク関連ウイルスのゲノムによってコードされるタンパク質を収容する容器を具備するキット。９４．ノーウォークウイルスに対する免疫応答を検出する方法であって、ノーウォークウイルスに晒されていることが疑われる個体から血清サンプルを収集する工程；表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体によってコードされるタンパク質を選択する工程；前記選択されたタンパク質と前記血清とが反応し得る条件下にある診断アッセイにおいて、前記血清に前記選択されたタンパク質を添加する工程；および前記血清と前記選択されたタンパク質との反応量を測定する工程を包含する方法。９５．前記診断アッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイおよびイムノブロットからなる群より選ばれる請求の範囲第９４項記載の方法。９６．前記選択されたタンパク質がカプシドタンパクである請求の範囲第９４項記載の方法。９７．前記選択されたタンパク質が、粒子を形成することが可能である本質的な特性を有する請求の範囲第９４項記載の方法。９８．前記選択されたタンパク質が、ヌクレオチド１ないし7753によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド146ないし5359によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド５３37ないし7573によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5346ないし6935によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド6938ないし７５７３によってコードされるタンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求の範囲第９４項記載の方法。９９．ノーウォークウイルスに対する免疫応答を検出する診断アッセイであって、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体においてコードされるタンパク質を選択する工程；該タンパク質を抗原として用いる工程；ノーウォーク感染個体からの感染後血清を、該血清と前記抗体とが反応し得る条件下で添加する工程；および前記血清と前記抗体との反応量を測定する工程を包含するアッセイ。１００．前記タンパク質がカプシドタンパクである請求の範囲第９９項記載の方法。１０１．前記選択されたタンパク質が、粒子を形成することが可能である本質的な特性を有する請求の範囲第９９項記載の方法。１０２．前記選択されたタンパク質が、ヌクレオチド１ないし7753によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド146ないし5359によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5337ないし７５７３によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5346ないし6935によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド6938ないし7573によってコードされるタンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求の範囲第９９項記載の方法。１０３．ノーウォークウイルスおよびノーウォーク関連ウイルスを検出するためのキットであって、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムによってコードされるタンパク質または該ゲノムの断片もしくは誘導体から作製される少なくとも１つの抗血清を含む容器を具備するキット。１０４．前記タンパク質が、ヌクレオチド１ないし7753によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド146ないし5359によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5337ないし7573によってコードされるタンバク質、ヌクレオチド5346 ないし6935によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド69３８ないし7573によってコードされるタンパク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求の範囲第１０２項記載のキット。１０５．ノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスに対する抗体を製造する方法であって、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムまたはそれらの断片もしくは誘導体によってコードされるタンパク質で動物を免疫することを包含する方法。１０６．前記タンパク質が、ヌクレオチド１ないし7753によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド146ないし5359によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5337ないし7573によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド5346 ないし6935によってコードされるタンパク質、ヌクレオチド6938ないし7573によってコードされるタンバク質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求の範囲第１０５項記載の方法。１０７．表２に示されるノーウォークウイルスのｃＤＮＡ配列またはそれらの断片もしくは誘導体によってコードされるノーウォークウイルス抗原を包含する、ノーウォークウイルスに対するワクチン。１０８．前記抗原が、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド146ないし5359またはそれらの誘導体を用いて製造される請求の範囲第１０７項記載のワクチン。１０９．前記抗原が、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド5337ないし7573またはそれらの誘導体を用いて製造される請求の範囲第１０７項記載のワクチン。１１０．前記抗原が、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド5346ないし6935またはそれらの誘導体を用いて製造される請求の範囲第１０７項記載のワクチン。１１１．前記抗原が、表２に示されるノーウォークウイルスゲノムのヌクレオチド6938ないし7573またはそれらの誘導体を用いて製造される請求の範囲第１０７項記載のワクチン。１１２．前記抗原が、粒子を形成することが可能である本質的な特性を有する請求の範囲第１０７項記載のワクチン。１１３．ノーウォークウイルスに対して個体を免疫する方法であって、請求の範囲第１０７項記載のワクチンの免疫学的に有効な投与量を経口もしくは非経口的に投与する工程を包含する方法。１１４．ノーウォークウイルスに対して個体を免疫する方法であって、請求の範囲第１０７項記載のワクチンの免疫学的に有効な投与量を経口および非経口的に投与する工程を包含する方法。１１５．図９に示されるヒトカリチウイルスゲノムのｃＤＮＡ配列並びにそれらの断片および誘導体であって、該断片および誘導体はノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスゲノムに結合するに十分なサイズおよびヌクレオチド相同性を有するｃＤＮＡ配列。１１６．図９に示されるヒトカリチウイルス・サッポロ・ゲノムのヌクレオチド１ないし551またはそれらの断片もしくは誘導体を含むヌクレオチドによってコードされるタンパク質。１１７．ヌクレオチド１ないし149並びにそれらの断片および誘導体を含むヒトカリチウイルス・サッポロ・ゲノムのｃＤＮＡサブクローンであって、該断片および誘導体がノーウォークまたはノーウォーク関連ウイルスゲノムに結合するに十分なサイズおよびヌクレオチド相同性を有するｃＤＮＡサブクローン。１１８．ヒト・カリチウイルス・サッポロゲノムのｃＤＮＡサブクローンであって、ヌクレオチド113 〜551 ならびにそのフラグメントおよび誘導体を具備し、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するｃＤＮＡサブクローン。１１９．図９にデイケアカリチウイルスのｃＤＮＡ配列ならびにそのフラグメントおよび誘導体であって、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するもの。１２０．図１２に示すSRSV/KY/89のｃＤＮＡ配列ならびにそのフラグメントおよび誘導体であって、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するもの。１２１．表１０に示すヒト・カリチウイルスのｃＤＮＡ配列ならびにそのフラグメントおよび誘導体であって、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するもの。１２２．霊長類カリチウイルスのｃＤＮＡサブクローンであって、配列 TGGACGGACC TGCTGTTGAA GATCTCTTCA AANGGCTCGAACGACCAAAG CACGATCG GT ATTGTGTTGA CTACGCAAAG TGGGACTCAACCCANCCACCA AAAGTAACAT CCAATCAATN GAC ATCおよびそのフラグメントおよび誘導体を具備し、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するｃＤＮＡサブクローン。１２３．霊長類カリチウイルスのｃＤＮＡサブクローンであって、配列 GTGA NATGNN ACATCTTCGA CTCGATGGAC CTATTCACATATGGTGATGA CGGTGTCTAC ATCGTCCCAC CACTATATCA TCTGTCATGCCCAAGTCTTC ACCAACCTGA AACおよびそのフラグメントおよび誘導体を具備し、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するｃＤＮＡサブクローン。１２４．ノーウオークウイルスまたはノーウオーク関連ウイルスに対する免疫反応を検出する方法であって、ノーウオークウイルスに晒されたことが疑われる個体から血清サンプルを採取する工程と、ノーウオーク関連ウイルスのゲノム配列またはそのフラグメント若しくは誘導体（このフラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有する）によってコードされるタンパクを選別する工程と、キメラタンパクおよび前記血清の反応を可能とする条件下での診断試験において、前記選別されたタンパクを前記血清に添加する工程と、前記血清および前記選別されたタンパクの反応量を測定する工程とを具備する方法。１２５．請求項124に記載の方法であって、前記診断試験が、酵素結合免疫吸着試験、ラジオイムノアッセイ及びイムノブロットからなる群から選ばれる方法。１２６．請求項124に記載の方法であって、前記ゲノム配列が請求項117のｃＤＮＡである方法。１２７．請求項124に記載の方法であって、前記ゲノム配列が請求項119のｃＤＮＡである方法。１２８．請求項124に記載の方法であって、前記ゲノム配列が請求項120のｃＤＮＡである方法。１２９．請求項124に記載の方法であって、前記ゲノム配列が請求項121のｃＤＮＡである方法。１３０．請求項124に記載の方法であって、前記ゲノム配列が請求項122のｃＤＮＡである方法。１３１．請求項124に記載の方法であって、前記ゲノム配列が請求項123のｃＤＮＡである方法。１３２．ノーウオークウイルスまたはノーウオーク関連ウイルスを検出するためのキットであって、ノーウオーク関連ウイルスのゲノム配列によってコードされるタンパク、または前記ゲノム配列のフラグメント若しくは誘導体から作成された少なくとも一つの抗血清を含む容器を具備し、前記フラグメントおよび誘導体はノーウオークウイルスゲノムまたはノーウオーク関連ウイルスゲノムに結合するために十分な大きさおよびヌクレオチド相同性を有するキット。１３３．請求項132に記載のキットであって、前記ゲノム配列が請求項117のｃＤＮＡであるキット。１３４．請求項132に記載のキットであって、前記ゲノム配列が請求項119のｃＤＮＡであるキット。１３５．請求項132に記載のキットであって、前記ゲノム配列が請求項120のｃＤＮＡであるキット。１３６．請求項132に記載のキットであって、前記ゲノム配列が請求項121のc ＤＮＡであるキット。１３７．請求項132に記載のキットであって、前記ゲノム配列が請求項122のｃＤＮＡであるキット。１３８．請求項132に記載のキットであって、前記ゲノム配列が請求項123のｃＤＮＡであるキット。１３９．ノーウオーク関連ウイルスのゲノムによってコードされるタンパクと組合わされたノーウオークウイルスゲノムにコードされるタンパクを含むキメラタンパク。１４０．ノーウオークウイルスに対する免疫反応を検出する方法であって、ノーウオークウイルスに晒されたことが疑われる個体から血清サンプルを採取する工程と、キメラタンパクおよび前記血清の反応を可能とする条件下での診断試験において、請求項139の前記キメラタンパクを前記血清に添加する工程と、前記血清および前記キメラタンパクの反応量を測定する工程とを具備する方法。１４１．ノーウオークウイルスまたはノーウオーク関連ウイルスのためのワクチンであって、抗原として用いられる請求項139のキメラタンパクを含有するワクチン。１４２．ノーウオークウイルスまたはノーウオーク関連ウイルスを検出するためのキットであって、請求項139のキメラタンパクから作成された少なくとも一つの抗血清を含む容器を具備したキット。