KR0178399B1 - 장을 통해 전염되는 비a비b형 간염 바이러스 병원체 및 그것의 특유한 에피토프 - Google Patents
장을 통해 전염되는 비a비b형 간염 바이러스 병원체 및 그것의 특유한 에피토프 Download PDFInfo
- Publication number
- KR0178399B1 KR0178399B1 KR1019910701774A KR910701774A KR0178399B1 KR 0178399 B1 KR0178399 B1 KR 0178399B1 KR 1019910701774 A KR1019910701774 A KR 1019910701774A KR 910701774 A KR910701774 A KR 910701774A KR 0178399 B1 KR0178399 B1 KR 0178399B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- derived
- intestine
- nanb
- Prior art date
Links
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 136
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 59
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 58
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 claims abstract description 18
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 77
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 47
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 45
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 claims description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 claims 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 241000156302 Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus Species 0.000 abstract description 33
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 abstract description 14
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 abstract 1
- 241000590988 Danainae Species 0.000 abstract 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 73
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 36
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 4
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 4
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 4
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 4
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 4
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 4
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 4
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 4
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 4
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 4
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 4
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 4
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 4
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 4
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 4
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 4
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 4
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 4
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 4
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 4
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 4
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 4
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 4
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 4
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 4
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 4
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 4
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 4
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 4
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 4
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 4
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 4
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 3
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 3
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 3
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 3
- 241000724832 Non-A, non-B hepatitis virus Species 0.000 description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 101000623262 Trypanosoma brucei brucei Uncharacterized 22 kDa protein in aldolase locus Proteins 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 101000962067 Gallus gallus Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000037319 Hepatitis infectious Diseases 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 208000001297 phlebitis Diseases 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- RYVMUASDIZQXAA-UHFFFAOYSA-N pyranoside Natural products O1C2(OCC(C)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C2)C(C)C(C2(CCC3C4(C)CC5O)C)C1CC2C3CC=C4CC5OC(C(C1O)O)OC(CO)C1OC(C1OC2C(C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OCC(O)C(O)C1O RYVMUASDIZQXAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000007919 viral pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 장을 통해 전염되는 비A/비B형 바이러스간염 병원체(HEV)로부터 유도되는 바이러스 단백질에 관한 것이다. 한 구체예에서, 단백질은 바이러스 간염 병원체로 감염된 개체에 존재하는 항체와 명역학적으로 반응한다. 이 단백질은 장을 통해 전염된 병원체에 의한 감염의 검출을 위한 진단 방법에 유용된다. 상이한 군주의 HEV 로 감염된 개체의 혈청과 반응하는 특이한 에피토프가 확인되었다. 또한 본 발명은 바이러스 병원체의 클론된 서열로부터 유도된 DNA 프로브에 관한 것이다. 이들 프로브는 바이러스-유도 DNA 단편의 프로브-특이적 증폭을 이용하여, 전체 바이러스 병원체의 확인 및 서열화에 유용하고, 감염된 샘플에서 바이러스 병원체의 존재에 대한 측정에 유용하다.
Description
[발명의 명칭]
장을 통해 전염되는 비 A 비 B 형 간염 바이러스 병원체 및 그것의 특유한 에피토프
[관련출원과의 상호관계]
본 출원은 1990년 4월 5일 출원된 미합중국 출원 일련번호 07/505,888 호의 계속 일부 출원이고, 이것은 1989년 10월 13일 출원된 미합중국 출원 일련번호 420,921호의 계속 일부출원이며, 이것은 1989년 6월 16일 출원된 미합중국 출원 일련번호 367,486호의 계속 일부 출원이고, 이것은 1989년 4월 11일 출원된 미합중국 출원 일련번호 336,672호의 계속 일부출원이며, 이것은 1988년 6월 17일 출원된 미합중국 출원 일련번호 208,997 호의 계속 일부 출원이다. 상기 출원은 모두 본원에 참고로서 인용된다.
[발명의 분야]
본 발명은 재조합 단백질, 유전자 및 유전자 프로브에 관한 것이고, 보다 구체적으로 본 발명은 장을 통해 전염된 비 A 비 B 형 간염 바이러스 병원체로부터 유도된 단백질 및 프로브, 이 단백질 및 프로브를 사용하는 진단방법 및 백신적용, 및 특히 진단 및 예방에 유용한 특이한 에피토프( 및 그러한 에피토프를 포함하도록 인공 제조된 단백질)를 코드화하는 유전자 절편에 관한 것이다.
[배경]
장을 통해 전염되는 비 A 비 B 형 간염 바이러스 병원체(ET-NANB; 본원에서는 HEV 로서 언급하기로 한다)는 아시아, 아프리카, 유럽, 멕시코 및 인도아대륙의 여러 가지 유행성 및 산발성 병에서 나타나는 간염의 보고된 병인이다. 감염은 보통 분변으로 오염된 물에 의해 진행되며, 밀접한 육체적 접촉에 의해서도 바이러스는 확산될 수 있다. 이 바이러스는 만성 감염을 유발하는 것 같지는 않다. ET-NANB 의 바이러스 병인학은 수집한 분변 분리물로 건강한 지원자를 감염시킴에 의해 입증되었다; 면역 전자 현미경(IEM) 연구로 감염된 개인들로부터 취한 변에서 27-34㎚ 직경의 바이러스 입자들을 볼 수 있었다.
바이러스 입자들은 지역적으로 먼 곳에 있는 감염된 개인들로부터 얻은 혈청중의 항체와 반응하였는데, 이것은 단일한 바이러스 병원체 또는 부류가 전세계적으로 볼 수 있는 ET-NANB 간염의 주원인임을 시사한다. 비경구적으로 전염되는 NANB 바이러스(간염 C 형 바이러스 또는 HCV 로서도 알려져 있음)로 간염된 개인의 혈청에서는 항체 반응을 찾아볼 수 없었는데, 이것은 2가지 NANB 타입 사이에 상이한 특이성이 있음을 나타낸다.
혈청학적 차이 외에도, 2가지 타입의 NANB 감염은 뚜렷한 임상학적 차이를 나타낸다. ET-NANB는 때로 열과 관절통, 및 문정맥 염증과 관련되고, 간 생검시편에서 담즙 울혈과도 관련되는 급성 간염을 특징으로 한다.(Arankalle). 이런 증상은 대체로 6주 이내에 소멸된다. 비경구적으로 전염되는 NANB 는 대조적으로, 약 50% 의 경우 만성 감염을 초래한다. 열과 관절통은 드물게 나타나며 염증은 실질조직(parenchyma)에 우선적으로 분포된다(khuroo, 1980).
ET-NANB 의 경로는 일반적으로 건강한 성인에게서는 거의 두드러지지 않으며, 그런 감염된 사람들의 대부분이 HCV에서 찾아볼 수 있는 만성 후유증 없이 회복된다. 그러나, 이 질병의 특유한 역학적 특징은 임산부에게서 찾아볼수 있는 현저히 높은 사망률이다 ; 이러한 사실은 수많은 연구에서 10내지 20% 정도로 보고된다. 이러한 발견은 많은 역학 연구에서 찾아볼 수 있지만 현재 설명되지 않은 채로 남아있다. 이것이 바이러스 병원성을 반영하는 것인가에 대해서는 상관없이, 바이러스와 면역 억제된(임신) 숙주의 상호반응의 치명적 결과, 또는 민감한 영양불량 상태의 집단의 쇠약해진 출산전 건강의 영향은 밝혀져야 할 것으로 남아있다.
2가지 바이러스 병원체는 또한 영장류 숙주 민감성을 토대로 하여 구별될 수 있다. 비 경구적으로 전염되는 병원체가 아닌 ET-NANB는 게잡이 원숭이 (cynomolgu s monkeys) 에 전염될 수 있다. 비경구 전염되는 병원체는 ET-NANB 보다 더 용이하게 침팬지에 전염될 수 있다 (Bradley, 1987).
전세계적으로 ET-NANB 간염과 관련된 바이러스 게놈서열을 확인하고 클론하기 위해 많은 노력이 행해져 왔다. 바이러스-특이적 게놈 서열을 필요로 하는 그러한 노력의 한가지 목표는, 바이러스 및 그것의 단백질 생성물의 성질을 확인 및 특성 확인하는 것이다. 다른 목표는 항체-기저 진단과정 및 백신에 사용될 수 있는 재조합 바이러스 단백질을 제조하는 것이다. 이러한 노력에도 불구하고, ET-NANB 간염과 관련된 바이러스 서열은 지금까지 성공적으로 확인되거나 클론 되지 않았고, 또한 바이러스-특이적 단백질도 확인되거나 제조되지 않았다.
[발명의 개요]
본 발명에 신규한 조성물, 그것의 제조방법 및 용도가 제공되는데, 상기 조성물은 ET-NANB 에 대한 바이러스 병원체로부터 유도된 바이러스 단백질과 그것의 단편을 포함한다. 진단 및 백신 제조에 특히 유용한 바이러스 단백질( 및 해당하는 유전서열)의 많은 특이적 단편이 또한 기재된다. ET-NANB 바이러스 단백질의 제조방법은, ET-NANB 게놈 서열을 분리한 후 숙주 세포에서의 클로닝 및 발현을 포함한다. 그 결과의 재조합 바이러스 단백질은 진단제제 및 백신으로서 사용된다. 게놈 서열 및 그것의 단편은 ET-NANB 바이러스 단백질의 제조에서 및 바이러스 검출용 프로브로서 사용된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 클론된 ET-NANB 단편을 얻는 과정 및 서열화 과정에서 사용된 벡터 제조 및 조작을 도시한다.
제2도는 방사성 표지된 ET-NANB 프로브가, 감염된 (I) 및 비감염된(N) 담즙 공급원(2A)로부터, 및 감염된(I) 및 비 감염된(N) 변-샘플 공급원(2B)로부터 분리된 RNA 로부터 제조된 증폭된 cDNA 단편과 혼성화되는 것을 보여주는 서던 블롯을 도시한다.
[특정 구체예의 설명]
본 발명에는 ET-NANB 에 대한 바이러스 병원체로부터 유도된 유전 서열 및 그것의 단편으로 이루어지는 신규한 조성물이 제공되며, 또한 게놈 서열을 사용하여 제조된 재조합 바이러스 단백질과 조성물의 사용방법이 제공된다.
바이러스 단백질상의 에피토프들은 특히 진단 및 백신제조에 유용한 것으로 확인되었다. 에피토프들을 함유하는 작은 펩티드는 ET-NANB 로 감염된 환자의 다중 혈청에 의하여 인지된다.
HEV 의 분자 클로닝은 2가지의 매우 상이한 접근법에 의하여 이루어졌다. 분자 클론을 성공적으로 확인하는 첫번째 방법은, 감염된 및 비감염된 원숭이 담즙으로부터 취한 이종 cDNA에 대한, 잠정적인 HEV cDNA 클론의 상이한 혼성화를 토대로 한 것이었다. 두가지 공급원으로 부터의 cDNA를32P를 사용하여 고특이적 활성으로 표지하여 감염된 공급원 프로브에 특이적으로 혼성화되는 클론을 확이하였다. HEV 의 버어마(Burma) 분리물로 감염된 게잡이 원숭이를 이러한 첫번째 실험에 이용하였다. 이 과정의 민감성은 전체 백그라운드(overall background)에 대하여 비교적 특이적 서열이 많다는 것에 직접적으로 관련된다. 대조실험에서, 표적 서열의 특이적 확인은 1000백그라운드 서열당 1 정도록 작은 특이적 부분으로도 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다. 많은 클론이, 감염된(버어마 분리물) 및 대조를 위해 비감염된 원숭이 담즙으로부터 제조된 라이브러리 및 프로브를 사용하여 상기 과정에 의해 확인되었다. 이 프로토콜에 의해 정제된 16플라크 중에서 가장 먼저 배타적으로 특성 확인된 클론을 ET1.1로 표시하였다.
ET1.1은 감염된 공급원 cDNA 로부터 유도되고 그것에 대해 독특한 것으로 특성확인되었다. 이종 cDNA 는 감염 및 비감염 공급원으로부터, 서열과 독립적인 단일한 최초의 증폭기법을 사용하여 증폭되었다(SISPA). 이 기법은 공동 계류중인 출원 일련번호 208,512(1988년 6월 17일 출원됨)호에 기재되어 있다. 버어마 분리물로 감염된 원숭이 담즙으로부터 제조된 cDNA 의 제한된 푸울은 계속해서, 프로브로서 잠재적인 HEV 클론을 사용하는 클로닝 또는 혼성화전에 효소적으로 증폭될 수 있다. ET1.1 은 감염공급원으로 부터의 원래의 담즙 cDNA 에 특이적으로 혼성화된다. 이 클론이 HEV 의 게놈으로부터 유도되었다는 추가의 정당성은, ET1.1 서열과, 소말리아, 타슈켄트, 보르네오, 멕시코 및 파기스탄을 포함한 상이한 지역에서의 ET-NANBH 유행병으로부터 수집된 다섯 종류의 상이한 사람 변 샘플로부터 제조된 SISP A cDNA에 존재하는 서열과의 유사성에 의하여 입증되었다. 이들 분자역학 연구로, 전세계적인 ET-NANBH의 주된 원인으로 나타난 바이러스로부터 유도된 바와같은, 분리 서열이 수립되었다.
ET1.1의 바이러스 특이성은, 이 클론이 감염된 원숭이 간으로부터 추출된 RNA 에 특이적으로 혼성화되었다는 발견에 의하여 추가로 수집되었다. 폴리아 데닐화된 RNA 의 혼성화 분석으로 비감염 간에는 존재하지 않는 독특한 7.5kb 의 폴리아데닐화된 전사체의 존재가 증명되었다. 이 전사체의 크기는 그것이 전 길이의 바이러스 게놈을 나타낸다는 것을 시사한다. 스트란드 특이적 올리고 누클레오티드는 또한, 사람 변으로부터 준비된 반-정제 비리온으로부터 직접 추출된 바이러스 게놈 RNA를 프로브하기 위해 사용되었다. 스트란드 특이성은 ET1.1에서 확인된 RNA-특정 RNA 중합효소(RDRP) 오픈 리딩 프레임(ORF)을 토대로 하였다(하기 설명참조). 센스 스트란드를 검출하는 프로브만이 핵산에 혼성화되었다. 이들 연구는 HEV를 플러스 센스, 단일 스트란드 게놈으로 특성 확인하였다. 간으로부터 추출된 RNA에 대한 스트란드 특이적 혼성화는 또한, 대부분의 세포내 전사체가 포지티브 센스임을 확립시켰다. 바이러스 발현에 대한 모든 신규한 메커니즘을 제외하고는, 네가티브 스트란드는 그것이 비록 검출될 수 없다 하더라도, 센스스트란드와 비교하여 1:100 보다 작은 비율로 존재할 것이다.
ET1.1 은 비감염 사람, 감염 및 비감염 원숭이로부터 유도된 게놈 DNA, 및 대장균 및 다양한 박테리오파지 공급원으로 부터의 게놈 DNA를 사용하는 서던 블롯 혼성화 및 PCR 에 의해 시험될 때 외인성인 것으로 증명되었다.
후자는 cDNA 제조 및 증폭증에 수행된 많은 효소적 조작 동안 도입된 외인성 서열로 인한 사소한 오염을 배제하기 위해 시험되었다. ET1.1 클론의 뉴클레오티드 서열은 유전자은행 데이터베이스에 있는 어떠한 엔트리와도 유사하지 않은 것으로 밝혀졌다. 그러나 ET1.1 클론의 변역된 오픈 리딩 프레임은 RNA-특정 RNA 중합효소와 일치하는 조화 아미노산 잔기와 제한된 동종성을 갖는 것이 입증되었다. 이 조화 아미노산 모티프는 모든 포지티브 스트란드 RNA 바이러스 중에서 공유되는 부분이며, 상기 주지된 바와같이, HCV 게놈의 3' 끝에 존재한다. 그러므로, 1.3kb 클론은 적어도 부분적으로는 바이러스 게놈의 비구조적 부분으로부터 유도될 것으로 추측되었다.
본 발명에 의해 입증된, ET-NANB 의 상이한 균주들의 상호관계 때문에 ET-NANB 바이러스 병원체의 게놈은 본 명세서에서, 대장균 주 BB4에서 운반되고 ATCC 기탁번호 67717 호를 가지는 플라스미드 pTZKF 1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 함유하는 것으로서 규정된다. 양방향으로의 전체 서열은 현재 아래에서 기재되는 바와같이 확인되었다. 두 스트란드가 모두 단백질을 코드화할 수 있으므로, 두 스트란드의 서열을 모두 제시한다. 그러나,공지 단백질에 대한 통계적 유사성 때문에, 그리고 전방 서열이 지배적으로 단백질을 코드화하는 것으로 알려져 있기 때문에 한 방향으로의 서열을 전방 서열로서 표시하였다. 이 서열은 아래에서 3개의 가능한 번역 서열과 함께 기재한다. 서열중에는 이소로이신을 가지는 누클레오티드 145에서 출발하여 서열의 끝까지 연장되는 긴 오픈 리딩 프레임이 하나있다. 2개의 다른 리딩프레임은 많은 종결 코돈을 가지고 있다. 누클레오티드 및 아미노산에 대한 표준 약어를 아래의 서열에서 및 본 명세서의 모든 곳에서 사용한다.
하기 주어진 유전자 서열은 실질적으로 모출원에 제시한 것과 동일하다. 본 서열은 5' 끝에서 처음 37개의 누클레오티드와 3' 끝에서 마지막 13개의 누클레오티드가 없다는 것이 다른데, 이것들은 바이러스 보다는 클로닝에 사용된 링커로부터 유도된다. 또한, 본 출원에 주어진 서열에서는 위치 227에 G가 생략되었다.
다음의 유전자 서열은 SEQ ID NO. 1을 갖는다 ; 누클레오티드 1로 시작하는 리딩 프레임의 첫 번째 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2를 갖는다; 누크레오티드 2로 시작하는 리딩 프레임의 두 번째 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 3을 갖는다; 그리고 누클레오티드 3으로 시작하는 리딩 프레임의 3번째 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 4를 갖는다.
본원에서 역서열 로서 언급되는 상보 스트란드를, 상술한 전방 서열과 동일한 방식으로 아래에 나타낸다. 전방 서열에서 발견되는 긴 오픈 리딩 프레임 보다는 짧은 여러 가지 오픈 리딩 프레임들을 이 역서열에서 찾아볼 수 있다. 역방향에서 오픈리딩 프레임의 상대적인 간결함 때문에, 오픈 리딩 프레임들은 아마도 발현되지 않는다.
다음의 유전자 서열은 SEQ ID NO. 5를 갖는다.
이 서열과 병인학적 병원체의 서열과의 동일성은, 해당 서열을 버어마에서 분리된 바이러스 균주에 위치시켜 봄으로써 입증되었다. 이 분리물은 하기 누클레오티드 서열(한 스트란드와 오픈 리딩 프레임을 도시함)을 갖는다.
하기 유전자 서열은 SEQ ID NO.6을 가지며; ORF1에 해당하는 단백질 서열은 SEQ ID NO. 7을 갖고; ORF2 에 해당하는 단백질 서열은 SEQ ID NO. 8을 가지며; ORF3 에 해당하는 단백질 서열은 SEQ ID NO.9를 가진다.
이 서열의 표시된 총 염기번호는 7195이다. 클론된 서열에 존재하는 폴리-A 꼬리는 생략하였다.
다른 NANB 간염 균주로 부터 유전물질을 분리하고 확인할 수 있는 본 발명 방법의 능력은, 멕시코에서 얻어진 분리물로 부터의 유전물질을 확인함으로써 입증되었다. 이 분리물의 서열은 상기 SEQ ID NO.1 에서 나타낸 ET1.1 서열과 약 75%가 동일하였다. 서열은 아래의 단원 II.B 에서 설명되는 조건을 사용하는 혼성화에 의해 확인되었다.
바이러스를 분리하기 위한 이 상이한 접근법에서, cDNA 라이브러리는 텔릭스타크(Telixtac)의 ET-NANB 의 급격한 증가로 부터 수집된 반-정제된 사람 변 시편으로 부터 직접 제조되었다. cDNA 의 회수 및 대표적인 라이브러리의 제조는 서열에 관계없는 단일한 최초 증폭의 적용에 의해 보장되었다(SISPA). 그렇게 증폭된 cDNA 군집으로 부터 람다 gt11 에서 제조된 cDNA 라이브러리는, 감염된 원숭이로 부터 취한 간 부분에 대한 직접 면역 형광법에 대해 측정되는 바 고 역가의 항-HEV 항체를 가지는 것으로 여겨지는 혈청으로 스크린 되었다. 총 60,000개의 스크린된 클론으로 부터, 406.3-2 와 406.4-2로 표시된 2개의 cDNA 클론을 이 방법에 의하여 확인하였다. 이들 클론의 서열은 계속해서, 원래의 ET1.1 클론으로 라이브러리를 혼성화 스크린함으로써 분리된 클론으로 부터 얻어진 HEV(버어마) 서열과의 동종성 비교에 의해 바이러스 게놈의 3'쪽 반쪽에 집종 위치되었다.
감염된 원숭이 간으로 부터 추출된 RNA 의 노던 블롯에 대해 혼성화프로브로서 사용될때 상기 분리된 cDNA 에피토프들은, ET1.1 프로브를 이용하여 얻은 노던 블롯과 비교할때 다소 상이한 결과를 유발한다. ET1.1 프로브를 사용하는 것으로 보이는 단일 7.5kb 전사체에 부가하여, 3.7과 2.0kb 의 추가의 2개의 전사체가, 혼성화 프로브로서 상기 에피토프중 어느 하나를 사용하여 확인되었다. 이들 폴리아데닐화된 전사체들은 프로브로서 3'극단 에피토프 클론(406.3-2)를 사용하는 것으로 확인되었고, 그러므로 이들 전사체는 게놈 3'끝과 말단이 같은 것으로 정립되었다(아래 참조). 에피토프 클론 중 하나(406.4-2)는 계속해서 5가지 상이한 지역적(소말리아, 버어마, 멕시코, 타슈켄트 및 파키스탄) 유행병으로 부터 수집된 항혈청과 특이한 방식으로 반응하는 것으로 나타났다. 406.3-2 클론은 이들 5가지 유행병 중에서 4가지 유행병으로 부터의 혈청과 반응하였다(Yarbough et al., 1990). 두가지 클론은 감염된 원숭이로 부터 취한 과거의 접종물 항혈청과만 반응하였다. 후자의 실험으로 실험적으로 감염된 원숭이에서의 혈청 변환이 분리된 외인성 클론 서열과 관련 되었음이 확인되었다.
혼성 cDNA 서울(멕시코 균주의 여러 클론으로 부터 얻음)을 아래에 나타낸다.
혼성 멕시코 균주서열(SEQ ID NO.10):
상기 서열은 폴리아데닐화된 클론으로 부터 얻었다. 명확한 구분을 위하여 3 폴리 A 꼬리는 생략하였다.
상기 서열은 본 시리즈의 전 출원에서 이미 확인된 1661개의 누클레오티드로 이루어지는 부분 cDNA 서열을 포함한다. 앞서 확인된 부분 서열은 몇군데 정정하면서 아래에 나타낸다.(SEQ ID NO.11). 정정은 클로닝 가공물인 앞서 보고된 서열중 처음 80 염기의 결실; 구 위치 174 다음의 G, 2770 다음의 C, 몇 279 다음의 GGCG 의 삽입 ; 구 위치 709 에서 C 의 T 로의 변화, 722-723에서 GC 의 CG 로의 변화, 1238-1239에서 CC 의 TT 로의 변화, 및 1606에서 C 의 G 로의 변화 ; 구위치 765에서 T 의 결실 ; 및 구 서열의 마지막 11염기의 결실을 포함하며, 이것들은 바이러스 기원이 아니라 링커서열의 일부분이다.
비 A 비 B T: 멕시코 균주 ; SEQ ID NO.11
버어마 균주와 멕시코 균주를 비교할때, 멕시코 균주의 누클레오티드 1과 버어마 균주의 누클레오티드 25에서 시작하여 중복되는 7189개의 누클레오티드에서 75.7% 의 동일성을 찾을 수 있다.
동일한 방식으로, HEV 의 상이한 균주가 소비에트연방 공화국의 타슈켄트에서 얻은 분리물에서 확인되었다. 타슈켄트 서열을 아래에 제시한다(SEQ ID NO.12):
다음의 비교서열에서 알 수 있는 바와같이, 타슈켄트(Tash.)서열이 멕시코 서열 보다 버어마 서열에 더 가깝게 닮아있으며, 이것은 보다 가깝게 관련된 지역으로 부터 2균주에 대해 기대된 바와같다. 비교에서 사용된 넘버링 시스템은 버어마 서열을 기초로 한 것이다. 앞서 나타낸 바와같이, 버어마 서열은 SEQ ID NO.6을 가지며, 멕시코 서열은 SEQ ID NO.10 을 가지며, 타슈켄트 서열은 SEQ ID NO.12 를 갖는다. 서열들 사이의 라인에 있는 문자들은 보존된 누클레오티드를 나타낸다.
가능한 코딩 영역들인 많은 오픈 리딩 프레임이 상기 나타낸 DNA 서열내에서 발견되었다. 이미 주지된 바와같이, RNA-특정 RNA중합효소(RDRP)에 대해 일치하는 잔기들은 HEV(버어마) 균주 클론 ET1.1 에서 확인되었다. 일단 클론들의 인접하고 있는 중첩 세트가 축적되면, RDRP 와, 헬리카제 도메인에 대해 일치하는 잔기로서 확인되는 것들을 포함하는 비구조적 엘레먼트가 첫번째 큰 오픈리딩 프레임(ORFI)에 위치하고 있다는 것은 더욱 명백해진다. ORFI 은 게놈의 5' 쪽 반을 차지하며, 명백한 비코딩 영역의 27번째 염기쌍 다음에 잇는 첫번째 코드화된 met 에서 시작되고, 종결코돈에 도달하기 전까지 5079bp 연장된다. 플러스 1프레임에서 ORF1 정지 코돈으로 부터 아래쪽으로 37bp 에서 시작되는 것은 2번째로 큰 오픈리딩 프레임(ORF2)으로서, 이것은 1980bp 연장되며, 폴리 A 가 첨가되는 곳으로 부터 위쪽으로 68bp 에서 종결된다. 제3 전방 ORF(플러스 2프레임에서)는 또한 HEV 에 의해 사용된다. ORF3 은 길이가 단지 370bp 에 불과하며, 멕시코 SISPA cDNA 라이브러리로 부터 얻은 면역 반응성 cDNA 클론 406.4-2의 확인을 위해 활용되는 것이 아니라면 바이러스에 의해 활용될 것으로 예측되지는 않는다(상세한 설명 참조). 이 에피토프로, 이 ORF 가 발현되는 수단이 아직 완전히 해명되지는 않았지만, 바이러스에 의해 ORF3 가 활용되는 것이 확인되었다. 만약 첫번째 met 가 이용된다고 가정한다면, ORF3 은 그것의 5' 끝에서 1bp 만큼 ORF1 과 중첩하며, ORF2 와는 그것의 3' 끝에서 326bp 만큼 중첩한다. ORF2 는 광범위 반응성 406.3-2 에피토프를 함유하며, 그것의 5' 극단에 단일 서열을 가지고 있다. 이 ORF2 의 처음 반쪽은 또한 다은 바이러스 캡시드 단백질에서 찾아볼 수 있는 것과 유사한 높은 pI 값(10)을 갖는다. 이러한 데이타는 ORF2 가 HEV 의 지배적인 구조 유전자일 것임을 시시한다.
하위게놈 전사체의 존재는 이들 RNA 가 게놈의 5' 끝으로 부터의 스플라이싱(splicing)에 의해 제조되는 지의 여부를 결정하기 위한 실험 세트를 촉진시켰다. 5' 극단을 포함하는 게놈 전체를 통한 하위게놈 프로브들을 사용하는 분석은 스플라이스된 전사체에 대한 증거를 제공하지 못하였다. 그러나, 게놈의 일부 영역이, 아마도 그것의 하위게놈 메시지의 생성에 RNA 전사에 대한 가능한 내부 개시 부위가 사용됨에 따라 신드비스(Sindbis)에서 확인된 21bp 절편과 고도의 상동성을 나타냈다. 21개의 누클레오티드 중에서 16개의(76%)가 동일하다.
상이한 ET-NANB 발생으로 부터 수집된 혈청에 의해 인지된 HEV 의 에피토프(즉, 보편적으로 인지된 에피토프)를 코드화하는 2개의 cDNA 클론을 분리하여 특성 확인하였다. 한 클론은 상이한 감염환자로 부터 얻은 8명의 혈청과 면역반응 하였고, 다른 클론은 시험된 사람 혈청 중 7혈청과 면역반응하였다. 2개의 클론은 감염된 동물로 부터 얻는 원숭이 혈청과 특이적으로 면역반응하였고, 비감염 동물로 부터 얻은 혈청에 대해서는 면역학적 반응을 나타내지 않았다. 406.3-2와 406.4-2로 표시한 이들 재조합 파지의 cDNA 서열을 결정하였다. HEV 오픈 리딩 프레임은 HEV 로 감연된 환자로 부터 얻은 혈청에 의하여 특이적으로 인지된 에피토프를 코드화하는 것으로 나타난다. 그것들이 코드화하는 cDNA 서열 및 폴리펩티드를 아래에 나타낸다.
HEV 의 멕시코 균주로 부터 유도된 에피토프 :
406.4-2서열(누클레오티드 서열은 SEQ ID NO.13을 가지며 아미노산 서열은 SEQ ID NO.14 를 갖는다) :
406.3-2서열(누클레오티드 서열은 SEQ ID NO.15를 가지며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO.16 을 가진다) :
이들 에피토프의 보편적인 특징은 그것들을 코드화하는 DNA 에 의하여 나타난 동종성으로 볼때 명백하다. 만약 상기 나타낸 멕시코 균주로 부터의 에피토프 코딩 서열을, 예컨대 상기 나타낸 버어마 균주 같은 다른 균주로 부터 얻은 DNA 서열과 비교할 때, 다음의 비교에서 알 수 있는 바와같이 유사성이 명백히 드러난다.
406.4-2 에피토프의 비교, HEV 멕시코 및 버어마 균주 :
33개의 아미노산 중첩에서 73.5%가 동일하다
406.3-2 에피토프의 비교, HEV 멕시코 및 버어마 균주 :
42개의 아미노산 중첩에서 90.5%가 동일하다
분자 유전학 기술분야에 숙련된 사람이라면, 상기 제시한 특이한 DNA 서열 중 각각이 해당하는 상보 DNA 서열 뿐만 아니라 ,제시된 기본 서열 및 상보 DNA 서열 두가지에 해당하는 RNA 서열을 나타낸다는 것을 인정할 것이다. 또한, 펩티드를 코드화하는 오픈리딩 프레임들이 존재하며, 아미노산 서열이 ET1.1 서열 또는 상기 나타낸 기타 서열에서와 같이 명백하게 나타난 것과 같은 방식으로, 아미노산 서열을 명백히 나타내지 않고서도 누클레오티드 서열에 의해 발현 가능한 펩티드가 드러난다.
[발명의 상세한 설명]
[Ⅰ. 정의]
아래에서 규정되는 용어들은 본원에서 다음과 같은 의미를 갖는다 : 1. 장을 통해 전염되는 비 A 비 B 형 간염 바이러스 병원체, ET-NANB, 또는 HEV는 (ⅰ) 수인성 감염성 간염을 야기하고, (ⅱ) 게잡이 원숭이들에게서 전염될 수 있으며, (ⅲ) 간염 A 형 바이러스(HAV), 간염 B 형 바이러스 (HBV), 간염 C 형 바이러스(HCV), 및 간염 D 형 바이러스(HDV)와 혈청학적으로 구별되고, )ⅳ) ATCC 기탁번호 67717로 표시되고, 대장균 주 BB4에서 운반되는 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)의 1.33kb cDNA 삽입물에 일치하는 게놈영역을 포함하는 바이러스, 바이러스 타입, 또는 바이러스 부류를 의미한다.
2. 2개의 핵산단편은, 만약 이것들의 매니아티스등의 문헌(Maniatis et al., op. cit., pp.320-323)에 기재된 혼성화 조건하에서 서로 상대방에 혼성화될 수 있다면 상동이다. 그러나, 다음의 세척조건 : 2 x SCC, 0.1% SDS 로 실온에서 2회, 각각 30분; 2x SSC, 0.1% SDS 로 50℃에서 30분간 1회; 2 x SCC 로 실온에서 각각 10분씩 2회 세척한다면, 상동 서열은 최대한 약 25 내지 30% 의 염기쌍 미스매칭(mismatches)을 포함하는 것으로 확인될 수 있다. 바람직하게는 상동 핵산 스트란드는 15내지 25%; 보다 바람직하게는 5내지 15%의 염기쌍 미스매칭을 포함한다. 이러한 상동도는, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 바와같이, 유전자 라이브러리(또는 다른 유전자 물질 공급원)로부터 클론을 확인하기 위한 보다 엄격한 세척조건을 사용하여 선택될 수 있다.
3. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 누클레오티드 서열(2개의 누클레오티드 서열 사이의 상동성을 확인하기 위한 대용방법에서)은, 만약 이것들이 돌연변이 갭 매트릭스(gap matrix) 및 6이상의 갭 페널티(gap penalty)를 이용하는 프로그램 ALIGN을 사용하여 5보다 큰 (표준편차 단위로) 일렬배열 스코어 (alignment score)를 갖는다면, 상동(이 용어가 본 명세서에서 바람직하게 사용된다)으로 간주된다. (Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure (1972) Vol. 5, National Biomedical Research Foundation, pp.101-110, and Supplement 2 to this volume, pp.1-10 참조). 2개의 서열(또는 그것의 부분들, 바람직하게는 최소한 30개의 아미노산)은, 이들의 아미노산이 상기 언급한 ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 배열될 때 50% 또는 50% 이상 동일한 경우 보다 바람직하게 상동이다.
4. DNA 단편이 바이러스 병원체 게놈의 영역과 동일한 또는 실질적으로 동일한 염기쌍 서열을 가지고 있다면 ET-NANB 바이러스 병원체 로부터 유도 된 것이다.
5. 단백질은 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유도된 DNA 또는 RNA 의 오픈 리딩 프레임에 의해 코드화되는 경우 ET-NANB 바이러스 병원체 로부터 유도 된 것이다.
[Ⅱ. 클론된 ET-NANB 단편의 제조과정]
본 발명의 한 측면에 따라서, 바이러스 특이적 DNA 클론은 (a) 공지의 ET-NANB 감염 게잡이 원숭이의 담즙으로부터 RNA를 분리하고, (b) cDNA 단편을 클론하여 단편 라이브러리를 형성한 다음, (c) 감염 및 비감염 담즙 공급원으로부터 방사성 표시된 cDNA 에 차등적으로 혼성화시킴에 의해 라이브러리를 스크린함으로써 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
[A. cDNA 단편 혼합물]
게잡이 원숭이에서 ET-NANB 감염은, 27내지 34㎚ 의 ET-NANB 입자 (평균직경 : 32㎚)에 대하여 양성인 사람의 변으로부터 취한 10% W/V 현탁액을, 동물에 정맥내 접종함으로써 시작된다. 감염된 동물은 알라닌 아미노기 전이 효소의 상승수준에 대하여 모니터되며, 그것은 간염 감염의 척도가 된다. ET-NANB 감염은 공개된 방법(Gravelle)에 따라, 바이러스-유사 입자(VLPs)에 대한 혈청양성 항체들의 면역특이적 결합에 의해 확인된다. 간단히 설명하면, 감염후 3-4주후에 감염된 동물로부터 취한 변(또는 담즙) 시편을 인산-완충 식염수로 1:10 으로 희석하고, 10배 현탁액을 저속 원심분리에 의해 정화한 다음 계속해서 1.2 및 0.45 미크론 필터를 통하여 여과한다. 물질은 다시 30% 슈크로오스 쿠션을 통하여 펠릿화됨으로써 추가로 정제될 수 있다(Bradley). 그 결과의 VLPs의 제제는 공지의 ET-NANB 감염 환자로부터 얻어 희석된 혈청과 혼합된다. 밤새 인큐베이션된 다음 혼합물은 밤새 원심분리되어 면역 응집체가 펠릿화되고, 이것은 염색되어, VLPs 에 대한 항체 결합에 대하여 전자 현미경으로 조사된다.
ET-NANB 감염은 또한 VLP-양성 혈청에 대한 혈청 변환에 의하여 확인될 수 있다. 이 방법에서 감염된 동물의 혈청은 상기와 같이, 감염된 사람의 변시료에서 분리된 27-34㎚ 의 VLP 와 혼합된 후, VLP 에 대한 항체 결합에 대하여 면역 전자 현미경으로 조사된다.
담즙은 담관에 카뉼레를 삽입하여 담즙 유체를 수집함에 의해서나 또는 검시중에 담관 내용물을 꺼냄에 의해서 ET-NANB 양성동물로부터 수집할 수 있다. 총 RNA 는 실시예 1A에서 개괄적으로 설명하는 바와같이, 고온 페놀 추출에 의하여 담즙으로부터 추출된다. RNA 단편은 실시예 1A에서 언급되는 것과 같이, 무작위 프라이밍(priming)에 의해 해당하는 이중 나선 cDNA 단편을 합성하기 위해 사용된다. cDNA 단편은 겔 전기 영동에 의해서 또는 밀도구배 원심분리에 의해서 분획화되어 소망하는 크기부류, 예컨대 500-4,000 염기쌍의 단편들이 얻어질 수 있다.
또 다른 바이러스 물질을 공급원이 사용될 수 있지만, 예컨대 변 샘플로부터 얻어지는 VLP 가 cDNA 분획의 제조에 사용될 수 있지만(실시예 4에서 설명됨), 담즙공급원이 바람직하다. 본 발명의 한 측면에 따라서, ET-NANB-감염 원숭이로부터 얻은 담즙이, 면역 전자 현미경에 의해 증명되는 바, 변 샘플에서 얻어지는 물질보다 더 많은 수의 무상 바이러스 입자를 나타내는 것으로 밝혀졌다. ET-NANB 바이러스 단백질 또는 게놈 물질, 또는 무상 바이러스의 공급원으로서 사용하기 위하여, ET-NANB-감염사람 또는 게잡이 원숭이로부터 얻어지는 담즙은 본 발명의 일부를 구성한다.
[B. cDNA 라이브러리 및 클로닝]
상기에서 얻은 cDNA 단편을 적당한 클로닝 벡터에 클론하여 cDNA 라이브러리를 형성한다. 이것은 EcoRI 서열같은 적당한 끝을 가지고 있는 링커를 블런트-끝 단편에 부착시키고, 그 단편을 클로닝 벡터의 적당한 삽입 부위, 예컨대 유일한 EcoRI 부위에 삽입함으로써 이루어질 수 있다. 초기 클로닝 후에, 원한다면 라이브러리가 재클론되어 단편 삽입물을 함유하는 벡터의 백분율을 증가시킬 수 있다. 실시예 1B에 설명되는 라이브러리 제조가 대표적인 예이다. 이 실시예에서, cDNA 단편은 블런트 끝을 가지며, EcoRI 끝이 부착되어 람다 파지 벡터 gt10의 EcORI 부위에 삽입된다. 5%이하의 단편 삽입물을 나타낸 라이브러리 파지를 분리하고, 단편 삽입물을 람다 gt10 벡터안에 재클론하여 95% 이상의 삽입물-함유 파지를 생성한다.
cDNA 라이브러리는, 감염 및 비감염 공급원으로부터 유도된 cDNA 프로브에 대한 차등 혼성화에 의하여 ET-NANB에 대해 특이적인 서열에 대해 스크린된다. 감염 및 비감염 공급원 담즙 또는 변의 바이러스 분리물로 부터의 cDNA 단편은 상술한 바와같이 제조될 수 있다. 단편은 종래 방법(Maniatis, p.109)에 따라 무작위 표지화, 닉 번역 또는 끝 표지화(end labeling)에 의해 방사성 표지한다. 상기로 부터의 cDNA 라이브러리는, 실시예2에서 상세하게 설명되는 바와같이, 이중 니트로셀롤로오스 필터로의 전달, 및 감염된 공급원 및 비감염 공급원(대조표준) 방사성 표지된 프로브 둘 다를 사용한 혼성화에 의하여 스크린된다. 바람직한 상한선, 즉 25-30%의 염기쌍 미스매치로 혼성화하는 서열을 회수하기 위하여, 참고문헌(Maniatis et al., op. cit., pp.320-323)에 기재된 조건하에서, 그러나 다음의 세척조건 : 2 x SCC, 0.1% SDS 로 실온에서 2회, 각각 30분씩; 2 x SCC, 0.1% SDS 로 50℃에서 1회 30분간; 2 x SCC 로 실온에서 2회, 각각 10분의 조건을 사용하여 혼성화되는 클론이 선택 될 수 있다. 상기 조건은 프로브로서 ET1.1 서열을 사용하여 상기 논의된 멕시코 균주의 분리물의 확인을 가능하게 하였다. 감염된 공급원의 프로브에 대하여 선택적으로 혼성화되는 플라크를, 바람직하게 저플레이팅 밀도에서 재플레이팅하고 상기와 같이 스크린하여, ET-NANB 서열에 대하여 특이적인 단일 클론을 분리하였다. 실시예2 에 나타낸 바와같이, 감염된 공급원의 프로브와 특이적으로 혼성화되는 16개의 클론이 이 과정에 의해 확인되었다. 1.33 킬로염기쌍 단편 삽입물을 포함한, 16개 클론 중 하나를 람다 gt101.1 로 표시하였다.
[C. ET-NANB 서열]
B 단원으로부터 ET-NANB 단편의 클론된 영역의 염기쌍 서열은 표준 서열화 방법에 의하여 결정한다. 실시예 3 에 기재된 한 예시적인 방법에서, 선택된 클로닝 벡터로부터 단편 삽입물을 절출시키고, 겔 전기 영동으로 분리 한 후, 삽입 부위의 양 측에 대한 염기쌍 서열이 알려져 있는 클로닝 벡터에 삽입한다. 실시예 3에서 사용되는 특정 벡터는, 제1도 좌측에 도시된 pTZKF1 벡터이다. gt101.1 파지로 부터의 ET-NANB 단편을 pTZKF1 플라스미드의 유일한 EcoRI 부위에 삽입한다. 원하는 삽입물을 운반하는 재조합체는 실시예 3에서 설명되는 바와같이, 분리된 1.33 킬로염기 단편과의 혼성화에 의해 확인되었다. pTZKF1(ET1.1)으로 확인된 한 선택된 플라스미드가 EcoRI을 이용한 벡터 소화후에 예상되는 1.33kb 단편을 제공하였다. pTZKF1(ET1. 1) 플라스미드로 감염된 대장균주 BB4를 미합중국 메릴랜드 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁하였고, 이것은 ATCC 기탁번호 67717로 표시된다.
pTZKF1(ET1.1)플라스미드를 제1도의 하부에 예시한다. 단편 삽입물은 각각 A 와 C 로 표시된 5' 및 3' 끝영역을 가지며, B 로 표시된 중간영역을 갖는다. 이들 영역의 서열들은 표준 디데옥시 서열화에 의해 결정하였고, 본 출원과 연속 출원관계에 있는 선출원에서 나타냈다. 3개의 짧은 서열(A,B 및 C)는 동일한 삽입물 스트란드에서 유래한다. 실시예 3에서 알게되는 바와같이, B-영역 서열은 실제로 반대편 스트란드로부터 결정되므로, 상기 제시된 B 영역 서열은 서열화된 스트란드의 서열의 상보성을 나타낸다. 부분적인 서열의 염기번호는 근사하다.
본 발명자들은 계속해서 완전한 서열을 확인하기 위하여 작업을 계속 하였고, 그것은 상기 나타낸 것과 같다. 이 총 서열의 단편들은 제한 엔도 뉴클레아제를 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 전방서열 및 역서열의 컴퓨터 분석으로 많은 절단 부위가 확인된다.
[Ⅲ. ET-NANB 단편]
본 발명의 다른 측면으로, 본 발명은 ET-NANB 게놈 서열 또는 그것으로부터 유도된 cDNA 단편과 혼성화하는 ET-NANB-특이적 단편 프로브를 포함한다. 그 단편은 제Ⅱ단원에서 기재된 바와같은 전 길이의 cDNA 단편을 포함하거나 또는 클론된 cDNA 단편내의 보다 짧은 서열영역으로부터 유도될 수 있다. 보다 짧은 단편은 제 Ⅳ단원에서 설명되는 바와같이, 소망하는 크기의 단편을 생성하는 조건하에서 전 길이의 단편의 효소적 소화에 의해 제조될 수 있다. 또는 달리, 단편은 cDAN 단편으로부터 유도된 서열을 사용하여, 올리고누클레오티드 합성법에 의해 제조될 수도 있다. 선택된 서열의 올리고누클레오티드 단편을 제조하기 위한 방법 또는 통상의 작업들이 활용될 수 있다. 단편들은 프로브로서 사용될때는 대개 최소한 12 누클레오티드이며, 바람직하게는 최소한 14,20,30 또는 50 누클레오티드이다. 프로브는 500정도, 바람직하게는 300 또는 200 누클레오티드 보다 적은 길이일 수 있다.
주어진 ET-NANB 단편이 실제로 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 유도된 것인지를 확인하기 위해서, 단편이 감염된 공급원으로 부터의 cDNA 와 선택적으로 혼성화하는 것을 알아볼 수 있다. 예시에 의해, pTZKF1(ET1.1) 플라스미드의 1.33kb 단편이 ET-NANB 유래된 것을 확인하기 위하여, pTZKF1(ET1.1) 플라스미드로부터 단편을 절출시키고, 정제한 다음, 무작위 표지화에 의하여 방사성 표지하였다. 방사성 표지된 단편을 감염 및 비감염 공급원으로부터 분획화된 cDNA 와 혼성화시켜, 단지 감염공급원의 cDNA 와만 프로브가 반응하는 것을 확인하였다. 이 방법은 실시예4에서 예시되며, 실시예 4에서, pTZKF1(ET1.1)플라스미드로 부터의 상기 방사성 표지된 1.33kb 단편을, 감염 및 비감염 공급원으로부터 제조한 cDNA 에의 결합에 대하여 조사하였다.
감염된 공급원은(1) 공지의 ET-NANB 감염된 버어마의 환자로부터 취한 변샘플로부터 유도된 바이러스 균주로 감염된 게잡이 원숭이의 담즙, 및 (2) 멕시코에 거주하는 ET-NANB 환자의 변 샘플로부터 유도된 바이러스 병원체이다. 각 단편 혼합물의 cDNA를 먼저 실시예 4에서 설명되는 링커/프라이머 증폭방법에 의하여 증폭시켰다. 단편의 분리는 아가로오스 겔 상에서, 그리고 서던 블롯팅 및, 분획화된 cDNA 에 방사성 표지된 1.33kb 단편을 결합시키기 위한 혼성화에 의해 이루어진다. 감염된 공급원으로 부터의 cDNA를 함유하는 레인은 기대했던 바와같이, 결합된 프로브의 얼룩진 밴드를 나타냈다(링커/프라이머 증폭법에 의하여 증폭된 cDNA 는 광범위한 크기를 가지는 것으로 예상되었다). 비감염 공급원으로 부터의 증폭된 cDNA 에 대해서는 프로브가 결합하지 않는 것으로 관찰하였다. 그 결과는 1.33kb 프로브가 ET-NANB 감염과 관련된 cDNA 단편에 특이적임을 시사한다. 프로브로서 ET1.1을 사용하는 이것과 동일한 타입의 연구는 타슈켄트, 소말리아, 보르네오 및 파키스탄으로부터 수집된 ET-NANB 샘플에 대한 혼성화를 입증하고 있다. 두번째로, 프로브가 상이한 대륙(아시아, 아프리카 및 북아메리카)으로부터 유도된 ET-NANB 관련 서열에 특이적이라는 사실은, 클론된 ET-NANB 버어마 서열(ET1.1)이 전세계적인 ET-NANB 간염 감염의 원인이 되는 통상적인 ET-NANB 바이러스 또는 바이러스 부류로부터 유도된다는 것을 의미한다.
관련된 확증 연구에서, 사람 또는 게잡이 원숭이의 게놈 DNA 감염 및 비감염 두가지)로부터 제조된 분획화된 게놈 단편에 결합하는 프로브를 조사하였다. 어느쪽의 게놈 분회과도 결합하는 프로브는 관찰되지 않았는데, 이것은 ET-NANB 단편이 내인성 사람 또는 게잡이 원숭이 게놈 단편이 아니라는 것을 입증하고, 또는 HEV 가 RNA 바이러스임을 입증한다.
단편의 ET-NANB 특이적 서열에 대한 다른 확증은, 단편의 코딩 영역으로부터 ET-NANB 단백질을 발현시키는 능력, 및 보고된 ET-NANB 발생기간 동안 수집된 혈청과 상기 단백질과의 입증된 특이한 혈청-반응성이다. 아래의 제Ⅳ단원은 단편을 사용하는 단백질 발현 방법을 논의한다.
ET-NANB-특이적 단편의 한 중요한 추가의 서열 정보를 함유하는 ET-NANB-유도 cDNA를 확인하기 위한 것이다. 새롭게 확인된 cDNA 는 계속해서 새로운 단편 프로브를 생성하고, 이것은 완전한 게놈이 확인되고 서열화될 때까지 계속 반복되는 것을 가능하게 한다. 추가의 ET-NANB 라이브러리 클론을 확인하고 그것으로부터 새로운 프로브를 제조하기 위한 과정들은 일반적으로 제Ⅱ단원에 기재한 클로닝 및 선택과정을 따른다.
단편( 및 상기 주어진 서열을 토대로 제조된 올리고누클레오티드)은 또한, 환자 샘프에서 ET-NANB 바이러스 게놈 물질을 검출하는 중합효소 연쇄반응 방법에 대한 프라이머로서 유용하다. 이런 진단 방법은 아래의 제Ⅴ단원에서 설명될 것이다.
406.3-2와 406.4-2로 표시된, 멕시코 균주로부터 유도된 2개의 특이한 유전 서열은 면역원 에피토프를 코드화하는 것으로 확인되었다. 이것은 HEV 로 감염된 개체(사람) 및 실험동물로부터 얻은 혈청과 면역학적으로 특이하게 반응하는 에피토프를 코드화하는 클론을 분리함으로써 이루어진다. 분리된 서열과 유전 서열의 유전자은행 수집물중의 서열과의 비교는, 상기 바이러스 서열이 신규하다는 것을 나타낸다. 이들 서열이 독특하기 때문에, 이들 서열은 HEV 의 존재를 확인하고, HAV, HBV, 및 HCV HEV 균주를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 이들 서열은 또한 샘플중의 바이러스의 존재를 진단하기 위한 올리고누클레오티드 프로브를 고안하기 위해 유용하다. 이것은 그 자체가 면역측정에 사용되는 폴리펩티드의 합성에 사용될 수 있다. 특이한 406.3-2와 406.4-2 서열은 발현 또는 복제를 용이하게 하기 위해, 예컨데 벡터같은 다른 유전물질안에 통합될 수 있다. 또한 관련된 바이러스 균주, 예컨대 버어마 균주에 의해 코드화된 유사한 항원성 영역을 확인하기 위해서도 사용될 수 있다 (상기 입증된 바와같음.)
[Ⅳ. ET-NANB 단백질]
상기 지적한 바와같이, ET-NANB 단백질은 ET-NANB 단편의 오픈리딩 프레임 코딩 영역을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 한 바람직한 접근법에서, 단백질 발현에 사용된 ET-NANB 단편은 소망하는 크기의 단편, 및 바람직하게는 지배적으로 약 100내지 약300염기쌍의 크기를 가지는 무작위 단편을 제조하기 위해 처리되었던 클론의 cDNA 로부터 유도된다. 실시예5는 DNA 소화에 의해 그러한 단편을 제조하는 것을 설명한다. 약 30내지 약100 아미노산을 가지는 펩티드 항원을 얻는 것이 바람직하기 때문에, 소화단편은 대략 100내지 300염기쌍 크기 범위의 것들을 선택하기 위하여, 예컨대 겔 전기영동에 의하여 바람직한 크기로 분획화된다. 또는 달리, 직접 HEV-함유 공급원(예컨대 담즙 또는 변)으로부터 제조되는 cDNA 라이브러리는, 그것이 만약 적절한 발현 벡터에 클론된다면 직접 스크린될 수 있다(아래의 설명참조).
예를들어, 406.3-2 와 406.4-2 서열에 의해 발현된 ET-NANB 단백질(및 그것의 펩티드 단편)은, 이들 단백질이 다양한 상이한 사람 혈청과 면역반응하는 것으로 증명되었고, 그에따라 그 표면상에 HEV에 특이적인 하나 또는 그 이상의 에피토프의 존재를 시사하고 있기 때문에 특히 바람직하다. 이들 클론은 gt11 라이브러리의 직접 스크리닝에 의해 확인되었다.
[A. 발현 벡터]
ET-NANB 단편은 적당한 발현 벡터 안에 삽입된다. 하나의 예시적인 발현 벡터는 람다 gt11으로,이것은 베타-갈락토시다제 유전자의 번역 종결 코돈에서 위쪽으로 53 염기쌍 만큼 떨어져 있는 유일한 EcoRI 삽입부위를 함유하고 있다. 그러므로, 삽입된 서열은 베타-갈락토시다제 유전자의 N-말단부분, 이종펩티드, 및 임의로 베타-갈락토시다제 유전자의 C-말단영역(C-말단 부분은 이종 펙티드 코딩 서열이 번역 종결 코돈을 함유하지 않는 경우 발현된다)을 함유하는 베타-갈락토시다제 융합 단백질로서 발현될 것이다. 이 벡터는 또한 허용온도, 예컨대 32℃에서 바이러스의 용원(viral lysogeny)을 초래하고, 상승온도, 예컨대 37℃에서 바이러스 용해를 유도하는 온도-감지 리프레서(c1857)을 생산한다. 이 벡터의 장점은(1) 고도로 효과적인 재조합 생성, (2) 허용온도, 그러나 비허용온도는 아닌 온도에서 숙주-세포 성장을 토대로 용원된 숙주 세포를 선택하는 능력, 및(3) 재조합 융합 단백질 생성의 고수준이다. 나아가, 이종 삽입물을 함유하고 있는 파지가 비활성 베타-갈락토시다제 효소를 생성하기 때문에, 삽입물을 포함하고 있는 파지는 베타-갈락토시다제 착색-기질 반응에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
발현 벡테에 삽입하기 위해서 바이러스 소화 단편은, 필요에 따라 선택된 제한 부위 링커, 예컨대 EcoRI 링커를 함유하도록 종래 과정에 따라 변형될 수 있다. 실시예 1은 람다 gt11 안으로 소화단편을 클로닝하는 방법을 예시하고 있는데, 그 방법은 단편을 블런트-끝처리 하는 단계, EcoRI 링커와 결찰시키는 단계, 그리고 그 단편을 EcoRI-절단 람다 gt11 으로 도입시키는 단계로 이루어진다. 그 결과의 바이러스 게놈 라이브러리는 상대적으로 큰 (대표적인) 라이브러리가 생성되었는지의 여부를 확인하기 위해 체크될 수 있다. 이것은 람다 gt11 벡터인 경우에, 적당한 박테리아 숙주를 감염시키고, 그 박테리아를 플레이팅한 후, 베타-갈락토시다제 활성손실에 대하여 플라크를 조사함으로써 행해진다. 실시예 1에 기재된 과정을 사용하여, 약 50%의 플라크가 효소활성 손실을 나타냈다.
[B. 펩티드 항원발현]
상기와 같이 형성된 바이러스 게놈 라이브러리는, ET-NANB 혈청양성 환자로부터 얻은 항혈청과 면역반응하는 펩티드 항원(융합 단백질로서 발현됨)의 생성에 대하여 스크린된다. 바람직한 스크리닝 방법에서, 파지 라이브러리 벡터로 감염된 숙주 세포는 상기와 같이 플레이트되고, 그 플레이트는 니트로 셀룰로오스 필터로 블롯팅되어, 세포에 의해 생성된 재조합 단백질 항원이 필터상으로 전달된다. 그런다음 필터는 ET-NANB 항혈청과 반응시키고, 세척되어 미결합 항체가 제거된 다음, 리포터-표지된 항-사람 항체와 반응하여, 항-ET-NANB 항체를 통하여 샌드위치 양식으로 필터에 결합된다.
전형적으로, 관심의 재조합 항원의 생성에 의하여 확인되는 파지 플라크는, 상대적으로 낮은 밀도에서 항체-반응성 융합 단백질의 제조에 대해 재조사된다. 그 과정에서 면역반응성 재조합 항원을 생성한 여러개의 재조합 파지클론이 확인되었다.
선택된 발현 벡터는 재조합 단백질을 정제할 목적으로, 대규모 생산에 사용될 수 있다. 대규모 생산은(a) 대장균같은 적당한 숙주를 선택된 람다 gt11 재조합체로 용원화하고, (b) 형질전환된 세포를 이종 펙티드를 고수준으로 생성하는 조건하에서 배양하고, 그리고(c) 용해된 세포로부터 재조합 항원을 정제하기 위해 보고되어 있는 다양한 방법중 한가지를 사용하여 수행한다.
상기 람다 gt11 클로닝 벡터를 포함하는 한 바람직한 방법에서, 고생성체 대장균 숙주, BNN103을 선택된 라이브러리 파지로 감염시키고, 2개의 플레이트 상에서 이중 플레이팅한다. 플레이트중 하나는 바이러스 용원이 일어날 수 있는 온도인 32℃에서 성장시키고, 다른 하나는 42℃에서 성장시키는데, 이 온도에서 감염시키는 파지는 용해단계에 있고, 따라서 세포성장이 방해된다. 그러므로, 더 낮은 온도에서 성장하는 세포가 성공적으로 용원화될 것으로 추측된다.
그런다음 용원화된 숙주세포는 바이러스 삽입물을 함유하는 융합 단백질이 더 높은 수준으로 생성되게 하는 액체 배양 조건하에서 성장된 후, 금속 냉장에 의해 용해되어 소망하는 융합 단백질이 방출된다.
[C. 펩티드 정제]
재조합 펩티드는 표준 단백질 정제 과정에 의해 정제될 수 있는데, 그 과정은 차등적인 침전화, 분자체 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 등전점 전기영동, 겔 전기영동 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 상기 제조된 바와같은 베타-갈락토시다제 융합단백질 같은 융합단백질의 경우에, 사용될 수 있는 단백질 분리기법은 천연 단백질의 분리에 사용된 기법들로부터 응용될 수 있다. 그러므로, 가용성 베타 갈락토시다제 융합 단백질의 분리를 위해서, 단백질은 간단한 친화성 크로마토그래피에 의해서, 표면-결합 항-베타-갈락토시다제 항체를 가지고 있는 고체 지지체 위로 세포용해 물질을 통과시킴으로써 용이하게 분리될수 있다.
[D. 바이러스 단백질]
본 발명의 ET-NANB 단백질은 또한 ET-NANB 바이러스 병원체로부터 직접 유도될 수 있다. 상기와 같이 감염된 개체로부터 얻은 변 또는 간 샘플로부터 분리된 VLP 또는 단백질 바이러스 단백질 물질의 적당한 공급원이다. 변 샘플로부터 분리된 VLP 는 단백질 분리전에 추가로 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다(아래참조). 바이러스 병원체는 또한 세포 배양으로도 증가될 수 있는데, 이것은 편리하고 잠재적으로 농축된 바이러스 단백질 공급원을 제공한다. 공동 소유인 미합중국 특허출원 일련번호 846,757호(1986년 4월 1일 출원됨)는, 세포 배양액에서 NANB 감염을 지지하는 불멸화된 트리오마(trioma)간 세포에 대해서 기재하고 있다. 트리오마 셀 라인은, 사람 간 세포를 사람 염색체 안정성에 대하여 선택된 마우스/사람 융합 파트너로 융합시킴으로써 제조된다. 소망하는 NANB 바이러스 병원체를 함유하는 세포는 항-ET-NANB 항체를 사용하여 면역형광법에 의해 확인될 수 있다.
바이러스 병원체는 단백질 분리전에, 음파처리 고-또는 저-염 조건, 또는 계면활성제 사용을 포함하는 종래 방법에 의하여 파괴된다.
ET-NANB 바이러스 단백질의 정제는, 표준 방법에 따라 적당한 고체 지지체에 부착된 정체된 항-ET-NANB 항체를 사용하여, 친화성 크로마토그래피에 의하여 수행될 수 있다. 항체는 그 자체가 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는데, 그 방법에서 상술된 바와같은 면역반응성 재조합 ET-NANB 단백질은, 면역 혈청 공급원으로 부터의 항-ET-NANB 항체의 분리를 위해 고체 지지체에 부착된다. 결합된 항체는 표준방법에 의해 지지체로부터 분리된다.
또는 달리, 항-ET-NANB 항체는, 마우스 또는 다른 동물을 재조합 ET-NANB 단백질로 면역시킴으로써 제조된 단일 클론성 항체(Mab)일 수 있다. Mab 제조를 위해서는, 동물로부터 림프구가 분리되어 적당한 융합 파트너로 불멸화된 후, 재조합 단백질 면역원과 반응하는 성공적인 융합 생성물이 선택된다. 이것은 계속해서 상술된 바와같이 친화성 정제 과정에 사용되어 천연 ET-NANB 항원을 얻을 수 있다.
[Ⅴ. 활용]
ET-NANB가 그것의 사람에 미치는 영향 때문에 주관심의 대상이긴 하지만, 최근의 데이터는 이 바이러스가 또한 다른 동물, 특히 포유동물을 감염시키는 것으로 나타났다. 따라서, 활요에 관한 본 논의는 사람과 수의학적 용도, 특히 상업적인 수의학적 용도, 예컨대 돼지, 소, 양, 말 및 기타 가축의 진단 및 치료에 적용된다.
[A. 진단방법]
본 발명의 입자 및 항원과 유전물질은 진단용 측정에 사용될 수 있다. ET-NANB 간염의 존재를 검출하는 방법은 혈액샘플, 변샘플 또는 간생검 시편 같은 생물학적 샘플을, ET-NANB 간염 바이러스 관련 분석물의 존재에 대하여 분석하는 것으로 이루어진다.
분석물은 상기 제시된 서열(cDNA 서열)의 실질적으로 전체의 서열까지 일 수 있는, 최소한 약16개의, 통상적으로는 30 내지 200개의 연속 누클레오티드의 서열을 포함하는 프로브와 혼성화하는 누클레오티드 서열일 수 있다. 분석물은 RNA 또는 cDNA 일 수 있다. 분석물은 전형적으로 ET-NANB 로 추정되는 바이러스 입자이거나, 또는 그것에 대한 분류가 규정에 어긋나는 입자이다. 바이러스 입자는, 상기 제시된 전방 및 역 서열의 최소한 12개의 연속 누클레오티드로 이루어진 서열과 최소한 약 70% 통상적으로는 서열내의 최소한 약 60개의 연속되는 누클레오티드와 최소한 약 80% 상동성을 가지는 서열로 이루어지며, 전 길이 서열에 실질적으로 상동인 서열로 이루어질 수 있는 RNA 바이러스 게놈을 가지는 것으로서 추가로 특성확인된다. 분석물이 프로브에 혼성화하는 경우에 분석물을 검출하기 위해서, 프로브는 검출가능 표지를 포함 할 수 있다. 프로브로서 사용하기에 특히 바람직한 것은 본원에 기재된 406.3-2 와 406.4-2 클론으로부터 유도된 연속 누클레오티드의 서열인데, 왜냐하면, 이 클론들이 HEV 의 진단에 특히 유용하기 때문이다.
분석물은 또한 항원, 예컨대 ET-NANB 바이러스 입자상의 세포표면 항원을 인지하는 항체로 이루어질 수 있다. 분석물은 또한 ET-NANB 바이러스 항원일 수 있다. 분석물이 항체 또는 항원인 경우, 표지된 항원 또는 항체 중 어느 하나는, 각각, 분석물에 결합하여 면역학적 복합체를 형성할 수 있고, 이것은 다시 표지에 의해 검출될 수 있다.
전형적으로, 표면 항원 및/또는 전체 입자와 같은 분석물을 검출하기 위한 방법은 면역측정을 기초로 한다. 면역측정은 ET-NANB 간염 바이러스에 의한 감염으로부터 발생된 숙주내 항체의 존재를 측정하기 위하여, 그리고 바이러스 입자 또는 항원의 존재를 직접 측정하는 측정에 의하여 수행될 수 있다. 그러한 기법은 잘 알려져 있으므로 본원에서 상세하게 기재할 필요는 없다. 실시예는 이종 및 동종 면역측정 기법 두가지를 모두 포함한다. 2가지의 기법은 바이러스 입자 또는 그것의 항원과 해당하는 특이한 항체 사이의 면역학적 복합체 형성을 기초로 한다. 바이러스 항원에 대한 이종 측정법은 전형적으로 고체 표면에 결합된 특이한 단일 클론성 또는 다중클론성 항체를 사용한다. 샌드위치 측정법은 점점 증가추세에 있다. 고체상의 필요없이 용액중에서 수행되는 동종 측정법도 또한, 예컨대 자유 항체를 효소-항원 포합체에 결합시킴으로써 결과되는 효소활성의 차이를 측정함으로써 사용될 수 있다. 많은 적당한 측정법이 미합중국 특허 제 3,817,837호, 제4,006,360호, 제3,996.345호에 개시되어 있다.
ET-NANB 바이러스에 의해 유도된 항체의 존재에 대하여 측정하는 경우, 본 발명의 바이러스 및 항원은 IgG 또는 IgM 항체를 검출하기 위한 특이한 결합제로서 사용될 수 있다. IgG 합성이 아직 개시되지 않았을 때 IgM 항체가 전형적으로 감염과정 중에 나타나는 제 1항체이기 때문에, 숙주의 혈류에 존재하는 IgM 과 IgG 항체의 구체적인 구별은 의사 또는 다른 연구자로 하여금 그 감염이 최근의 것인지 또는 회복기의 것인지 결정하는 것을 가능하게 한다.
본원에 기재된 406.3-2와 406.4-2 클론에 의해 발현된 단백질과 그것의 펩티드 단편은, 그것들이 많은 상이한 사람 HEV 혈청과 반응하게 될 것으로 입증되었기 때문에 특히 항체 검출을 위하여 특이적인 결합제로서 사용하기에 바람직하다. 나아가, 그것들은 급성 및 회복기 혈청과 반응한다.
한 진단방법에서, 시험 혈청은 표면-결합된 ET-NANB 단백질 항원을 가지고 있는 고상시약과 반응한다. 항-ET-NANB 항체가 시약에 결합하고, 세척에 의해 미결합 혈청 성분이 제거된 후, 시약은 리포터로 표지된 항-사람 항체와 반응하여, 고상 지지체 상에 결합된 항-ET-NANB 항체의 양에 비례하여 시약에 대한 리포터(reporter)에 결합된다. 시약은 다시 세척되어 미결합 표지 항체가 제거되고, 시약과 결합된 리포터의 양이 측정된다. 전형적으로, 리포터는 적당한 형광측정 또는 비색측정 기질의 존재하에 고상을 인큐베이션 함으로써 검출되는 효소이다.
상기 측정에서 고체표면 시약은 단백질 물질을 고체 지지체 물질, 예컨대 중합체 비이드, 딥스틱, 또는 필터 물질에 부착시키기 위한 공지기법에 의해 제조된다. 상기 부착 방법은 일반적으로 단백질의 지지체에 대한 비특이적 흡착, 또는 고체 지지체상에 있는 예컨대 활성 카르복실, 히드록실, 또는 알데하이드 그룹같은 화학적으로 반응성 그룹에, 전형적으로 자유 아민기를 통한 단백질의 공유부착을 포함한다.
동종 측정법으로서 알려져 있는 제2진단 방법에서, 고체 지지체에 대한 항체 결합은 배지에서 직접 검출될 수 있는 반응 배지의 약간의 변화를 발생 시킨다. 지금까지 제안되었던 공지의 일반 유형의 동종 측정법은, (a) 항원에 대한 항체 결합이 기록된 운동성의 변화에 의해 검출되는 스핀-표지된 리포터(스핀 스플리팅 피이크의 광역화), (b) 결합이 형광 효력의 변화에 검출 되는 형광 리포터, (c) 항체 결합이 효소/기질 상호반응에 영향을 미치는 효소 리포터, 및 (d) 결합이 리포좀용해와 캡슐화된 리포터의 방출을 유도하는 리포좀-결합 리포터를 포함한다. 이들 방법을 본 발명의 단백질 항원에 응용시키는 경우 동종 측정 시약을 제조하기 위한 종래 방법을 따른다.
상술한 측정법의 각각에서, 측정방법은 시험 개체로부터 얻은 혈청을 단백질 항원과 반응시키고,결합된 항체의 존재에 대하여 항원을 조사하는 것을 포함한다. 조사는 첫 번째 방법에서와 같이, 표지된 항-사람 항체를 조사되는 항체, IgM(급성 단계) 또는 IgG(회복단계) 에 부착시키고, 고체 지지체에 결합된 리포터의 양을 측정하는 것을 포함하거나, 또는 두 번째 방법에서와 같이, 동종 측정 시약에 미치는 항체의 영향을 관찰하는 것을 포함할 수 있다.
또한 바로 위에서 설명한 측정방법을 수행하기 위한 측정 시스템 또는 키트도 본 발명의 일부를 형성한다. 키트에는 일반적으로, (a)장을 통해 전염된 비 A 비 B 형 바이러스 병원체로 감염된 개체에 존재하는 항체와 반응하고, (b) 대장균주 BB4에서 운반되고 ATCC 기탁번호 67717을 가지는 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물과 상동인 영역을 함유하는 게놈을 가지고 있는 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 재조합 단백질 항원이 표면에 결합되는 지지체가 포함된다. 키트의 리포터-표지된 항-사람 항체는 표면-결합 항-ET-NANB 항체를 검출하기 위해 사용된다.
[B. 바이러스 게놈 진단 적용]
본 발명의 유전물질은 그 자체로서, 많은 측정법에서, 자연 발생 감염에 존재하는 유전물질에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화 측정법에 의하여 후기 분석을 하기 위해 표적 핵산을 증폭하기 위한 한가지 방법은 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR 기법으로서 알려져 있다. PCR 기법은 서로 일정거리 만큼 떨어져 있고 상기 나타낸 유전 서열을 토대로 하는 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여, 병에 걸린것으로 추측되는 병리학적 샘플에서 본 발명의 바이러스 입자를 검출하는데 적용될 수 있다. 프라이머들은 이중 스트란드 DNA 분자의 반대편 스트란드에 상보하고, 전형적으로 약 50내지 450nt 또는 그 이상(통상 2000nt를 넘지 않는다) 만큼 떨어져 있다. 이 방법에는 특이한 올리고누클레오티드 프라이머를 준비한 후 표적 DNA 의 변성, 프라이머 결합, 및 프라이머 공간 배치를 토대로 하여 예상되는 길이의 DNA 단편을 얻기 위한 DNA 중합 효소를 이용한 연장으로 이루어지는 사이클을 반복하는 것이 수반된다. 한 프라이머로부터 생성된 연장 생성물은 다른 프라이머에 대한 추가의 표적 서열로서 작용한다. 표적 서열의 증폭도는 수행되는, 사이클 횟수에 의해 제어되고, 간단한 식 2n(n은 사이클 횟수이다)에 의해 이론적으로 계산된다. 사이클당 평균 효율은 약56내지 85%로 주어지고, 25사이클이 30만 내지 480만개의 표적 서열의 복사물을 생성한다. PCR 방법은 많은 간행물, 예를들어 Saiki et al., Science(1985) 230:1350-1354 ; Saiki et al., Nature(1986) 324:163-166; 및 Scharf et al., Science(1986) 233:1076-1078에 기재되어 있다. 또한 미합중국 특허 제 4,683,194호; 4,683,195호 및 4,683,202호를 참조할 수 있다.
본 발명은 ET-NANB 단편의 선택적인 증폭을 토대로 하여 ET-NANB 바이러스 병원체를 측정하기 위한 특이한 진단방법을 포함한다. 이 방법은 DNA 이중나선 단편의 반대편 스트란드의 비-상동 영역으로부터 유도된 한쌍의 단일 스트란드 프라이머를 사용한다. 이것은 계속해서 대장균 주 BB4에서 운반되고 ATCC 기탁번호 67717을 가지는 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 함유하는 게놈을 가지고 있는 장을 통해 전염되는 바이러스 간염 병원체로부터 유도된다. 본 발명의 한 측면을 구성하는 상기 프라이머 단편 은 상기 제Ⅲ단원에서 설명된 바와같은 ET-NANB 단편으로부터 제조된다. 진단 방법은 상기 논의된 바와같이, 미합중국 특허 제4,683,202호에 개시된 바와같은 선택된 핵산 서열을 증폭하기 위한 방법을 따른다.
[C. 펩티드 백신]
본 발명의 항원중 어느 것이라도 백신제조에 사용될 수 있다. 백신을 제조하기 위한 바람직한 출발물질은 담즙으로부터 분리된 입자 항원이다.
항원은 상술된 바와같이 무상 입자로서 초기에 회수되는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 공급원으로부터 분리된 입자 또는 비-입자 재조합 항원으로부터 적당한 백신을 제조하는 것이 가능하다. 비-입자 항원이 사용되는 경우(전형적으로 가용성 항원), 바이러스 엔벨로프 또는 바이러스 캡시드로부터 유도된 단백질이 백신제조에 사용하기에 바람직하다. 상기 단백질들은 또한 상술된 바와같이 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
만약 정제된 단백질이 그 자체로서 면역원이 아니라면, 그것은 담체에 결합함으로써 단백질은 면역원성이 될 수 있다. 담체는 우혈청 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌 등일 수 있다. 필수적인 것은 아니지만, 항원을 정제하여 실질적으로 사람 단백질이 없도록 만드는 것이 바람직하다. 그러나, 항원은 단백질, 바이러스, 및 영양배지, 셀라인, 조직, 또는 그것으로부터 바이러스가 배양되거나 그것으로부터 바이러스가 얻어지는 병리학적 유체에 의하여, 또는 그것들로 오염됨으로 인하여 도입될 수 있는 사람으로부터 유래된 것이 아닌 다른 물질을 포함하지 않는 것이 보다 중요하다.
백신 접종은 종래 방식으로 수행될 수 있다. 예를들어, 그것이 바이러스 입자이거나 단백질이거나 관계없이, 항원은 물, 식염수, 완충식염수, 완전 또는 불완전 보조액 등과 같은 적당한 희석제에 담겨져 사용될 수 있다. 면역원은 항체 유도를 위한 표준 기법을 사용하여, 예컨대, 비활성화된 또는 감퇴된 바이러스 입자 또는 항원을 함유하는, 생리적으로 적합하고 멸균된 용액을 피하주사함에 의하여 투여된다. 전형적으로, 면역 반응을 일으킬 정도의 양, 전형적으로 1㎖ 또는 그 이하의 양의 바이러스 입자가 매 백신접종 주사시에 투여된다.
백신조성물의 특정 실례는, 약제학적으로 허용가능한 보조제에, 그것의 게놈의 대장균주 BB4에서 운반되고 ATCC 기탁번호 67717을 가지는 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 함유하는, 장을 통해 전염되는 비 A 비 B 바이러스 간염 병원체로부터 유도된 재조합 단백질 또는 혼합물을 포함한다. 백신은 항-ET-NANB 항체의 상당한 역가가 혈청에서 검출될 때까지 일정주기 간격으로 투여된다. 백신은 ET-NANB 감염에 반하여 보호목적으로 의도된다.
특히 바람직한 것은 발현된 단백질의 단편을 포함하여, 본 발명에 기재된 406.3-2 와 406.4-2에 의해 발현된 단백질 및 그것의 동등물을 사용하여 제조된 백신이다. 이러한 클론들이 이미 다양한 사람 HEV-양성 혈청과 반응하는 것으로 입증되었기 때문에, 그것들의 다양한 HEV 균주에 대한 보호에 활용되는 것이 드러난다.
[D. 예방 및 치료 항체 및 항혈청]
백신으로서의 사용에 부가하여, 조성물은 ET-NANB 바이러스 입자에 대한 항체를 제조하는데에 사용될 수 있다. 항체는 직접 항바이러스제로서도 사용된다. 항체를 제조하기 위해서, 숙주 동물이 바이러스 입자, 또는 필요에 따라, 백신에 대해 상술된 바와같이 담체에 결합된 바이러스 입자에 고유한 비-입자 항원으로 면역처리된다. 숙주 혈청 또는 혈장은 적절한 시간 간격에 따라 수집되어 바이러스 입자와 반응하는 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 감마 글로불린 분획 또는 IgG 항체는 예를들어, 포화 황산 암모늄 또는 DEAE 세파덱스의 사용에 의하여, 또는 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지되어 있는 기타 다른 기법에 의하여 얻을 수 있다. 항체는 약품같은 다른 항-바이러스제와 관련될 수 있는 많은 유해한 부작용이 실질적으로 없다.
항체 조성물은 잠재적인(가능한) 불리한 면역 시스템 반응을 최소화함으로써 숙주 시스템에 보다 적합하게 만들어질 수 있다. 이것은 외래종항체의 FC 부분의 전부 또는 일부를 제거함으로써, 또는 숙주 동물과 동일한 종의 항체를 사용함으로써, 예컨대 사람/사람 하이브리도마로부터 얻은 항체를 사용함으로써 이루어진다.
항체는 또한, 항체-바이러스 복합체가 마크로 파지에 의해 인지되기 때문에, 면역반응을 증강시키기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 항체는 항체의 다른 치료를 위한 투여에 사용된 양과 유사한 양으로 투여될 수 있다. 예를들어, 푸울된 감마 글로불린은, 바이러스가 세포안으로 들어가는 것을 방해하기 위하여, 광견병, 홍역 및 B형 간염같은 다른 바이러스성 질병의 초기 잠복기 동안에 체중 1 파운드당 0.02 내지 0.1㎖의 양으로 투여된다. 그러므로, ET-NANB 바이러스 입자와 반응하는 항체는 단독으로, 또는 다른 항-바이러스제와 결합상태로, ET-NANB 바이러스로 감염된 숙주에 수동 투여 되어 면역 반응 및/또는 항바이러스 약물의 효력을 증강시킨다.
또는 달리, 항-ET-NANB-바이러스 항체는, 면역원으로서 항-이디오타입(idiotype) 항체를 투여함으로써 유도될 수 있다. 편리하게도, 상술된 바와같이 제조되는 정제된 항-ET-NANB 바이러스 항체 제제는 항-이디오타임 항체를 숙주 동물에게서 유도하기 위해 사용된다. 적당한 희석제에 담긴 조성물이 숙주동물에 투여된다. 투여후, 보통은 반복된 투여후에, 숙주는 항-이디오타입 항체를 생성한다. Fc 영역에 대한 면역원성 반응을 제거하기 위하여, 숙주동물로서 동종에 의해 생성된 항체가 사용될 수 있거나, 또는 투여된 항체의 Fc 영역이 제거될 수도 있다. 숙주동물에서 항-이디오타입 항체가 유도된 후에 혈청 또는 혈장이 회수되어 항체 조성물이 제공된다. 조성물은 항-ET-NANB 바이러스 항체에 대해 상술된 바와같이 정제되거나, 또는 친화성 매트릭스에 결합된 항-ET-NANB 바이러스 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다. 생성된 항-이디오타입 항체는 실제 ET-NANB 항원과 구조가 거의 동일하며, ET-NANB 입자 항원을 사용할때보다 더 빈번하게 ET-NANB 백신제조에 사용될 수 있다.
환자에서 항-ET-NANB 바이러스 항체를 유도하는 수단으로서 사용되는 경우, 항체를 주사하는 방식은 백신접종 목적에 대한 주사방식과 동일하다. 즉, 근육내, 피하, 복강내등으로 보조제를 포함하거나 하지않은 생리적으로 적당한 희석제중의 효과적인 농도로 주사된다. 1회 또는 그 이상의 추가 주사가 바람직한 경우도 있다. 항-ET-NANB 바이러스 항체를 유도하기 위해 사용된 항-이디오타입 방법은, 항-ET-NANB 바이러스 항체의 수동 투여에 의해 유발될 수 있는 문제점들, 예컨대 불리한 면역반응, 및 정제된 혈액 성분이 투여와 관련된 문제점들, 예컨대 아직 발견되지 않은 바이러스로 인한 감염을 완화시킨다.
본 발명의 ET-NANB-유도 단백질은 또한, 노출전 또는 노출후 예방에 대해 고안된 항혈청 제조에 사용하기 위해 의도된다. 여기에서 ET-NANB 단백질, 또는 그것들의 혼합물은 사람 항혈청을 제조하기 위한 공지방법에 따라, 적당한 보조제와 함께 제형되어, 건강한 성인 자원자에 주사에 의해 투여된다. 주사된 단백질에 대한 항체 반응은 제 ⅡA 단원에 기재된 바와같이, 항-ET-NANB 혈청 항체의 존재를 검출하기 위한 주기적인 혈청 샘프링에 의해, 면역처리 후 여러주의 기간동안 모니터된다.
면역된 개체로부터 얻어지는 항혈청은 감염될 가능성이 있는 개체에 대한 노출전 예방조처로서 투여될 수 있다. 항혈청은 또한, 노출후 예방에 대한 간염 B형 바이러스에 대하여 고역가의 항혈청을 사용하는 것과 유사하게, 개체의 노출후 치료에 유용하다.
[E. 단일클론성 항체]
ET-NANB 바이러스 입자 및 단백질에 대한 항체와 항-이디오타입 항체의 생체내 사용과 진단용 사용에 대해, 단일클론성 항체를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 단일클론성 항-바이러스 입자 항체 또는 항-이디오타입 항체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 면역된 동물로부터 비장 또는 림프구를 취하여, 당해기술 분야에 숙련된 사람들에게 공지된 방법에 의하여 하이브리도마를 제조하기 위하여 불멸화하거나 또는 사용한다. 사람-사람 하이브리도마를 제조하기 위하여 사람 림프구 증여자를 선택한다. ET-NANB 바이러스로 감염된 것으로 알려진 증여자 (감염은 예컨대 혈액중의 항-바이러스 항체의 존재에 의하여 또는 바이러스 배양에 의하여 밝혀지는 경우임)는 적당한 림프구 증여자로서 기여한다. 만약 증여자의 비장이 절개된다면, 림프구는 말초혈 샘플로부터 또는 비장 세포로부터 분리되어 사용될 수 있다. 엡스타인-바르 바이러스(EBV)가 사람 림프구를 불멸화하기 위해 사용될 수 있고, 또는 사람 융합 파트너가 사람-사람 하이브리도마를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 펩티드를 사용한 1차 시험관내 면역화는 또한 사람 단일클론성 항체의 생성에 사용될 수 있다.
불멸화된 세포로부터 분비된 항체는, 소망하는 특이성을 가지는 항체를 분비하는 클론을 결정하기 위해 스크린된다. 단일클론성 항-바이러스 입자 항체의 경우, 항체는 ET-NANB 바이러스 입자에 결합하여야 한다. 단일클론성 항-이디오타입 항체의 경우, 항체는 항-바이러스 입자 항체에 결합하여야 한다. 소망하는 특이성을 가지는 항체를 생성하는 세포가 선택된다.
다음의 실시예는 다양한 본 발명의 측면을 예시하며, 어느 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하기 위해 의도된 것은 아니다.
[재료]
실시예에 사용된 재료는 다음과 같다; 효소 : DNAse I 과 알칼리 포스파타제는 베링거 만하임 바이오케미 칼스사(BMB, 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재)로부터 구매하였고; EcoRI, EcoRI 메틸리아제, DNA 리가아제, 및 DNA 중합요소 I 은 뉴 잉글랜드 바이오랩스사(NEB, 미국 메릴랜드주 비벌리 소재)로부터 구매하였으며; RNase A 는 시그마사(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)에서 구입하였다.
기타 시약 : EcoRI 링커는 NEB 로부터 구입하였고; 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), S-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP), S-브로모-4-클로로-3-인돌릴-B-D-갈락토피라노시드(Xgal) 및 이소프로필 B-D-티오갈락토 피라노시드(IPTG)는 시그마사에서 구입하였다.
cDNA 합성키트와 무작위 프라이밍 표지화 키트는 베링거 만하임 바이오 케미칼사(BMB, 미국 인디아나주 인디아폴리스 소재)에서 구입하였다.
[실시예 1]
[cDNA 라이브러리의 제조]
[A. ET-NANB 바이러스의 공급원]
2마리의 게잡이 원숭이를, 공지의 ET-NANB 환자로부터 얻은 면역 혈청에 대한 변내의 27내지 34㎚ 바이러스-유사 입자(VLP)의 결합에 의해 증명되는 바, 그것의 변이 ET-NANB 에 대하여 양성반응을 보이는 버어마 케이스로부터 분리한 ET-NANB 바이러스 균주로 감염된 제2-계대된 원숭이(cyno #37)로부터 얻은 변 푸울의 10% 현탁액으로 정맥내 주사하였다. 동물은 접종후 24 내지 36일 사이에 상승된 수준의 알라닌 아미노기 전이효소(ALT)를 나타냈으며, 한 원숭이는 감염의 급성 전단계에서 담즙으로 27 내지 34 ㎚ 의 VLP를 분비하였다.
각각의 감염된 동물의 담관에 카뉼레를 연결하여 매일 1내지 3cc 정도의 담즘을 수집하였다. RNA 는 한 담즙시료(cyno #121)로부터, 표준 RNA 분리과정을 사용하여 고온 페놀 추출법에 의하여 추출하였다. 2중 스트란드 cDNA 는 분리된 RNA 로부터, 베링거 만하임사에서 구입한 cDNA 합성 키트를 사용하여, 제1 스트란드 생성에 대한 랜덤 프라이머에 의하여 제조하였다.
[B. 2중나선 단편의 클로닝]
2중 나선 cDNA 단편의 끝을 표준조건하에서 T4 DNA 합성효소로 블런트로 처리한후 (Maniatis, p. 118), 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 브런트-끝 물질을 EcoRI 링커를 사용하여 표준조건하에서 결찰시킨후(Maintis,pp. 396-397), EcoRI 으로 소화시켜서 과잉의 링커 끝을 제거하였다. 결찰되지 않은 링커들은 계속되는 이소프로판을 침전화에 의하여 제거하였다.
람다 gt10 파지 벡터(Huynh)를 프로메가 바이오텍크사(미국 와이오밍주 메디슨 소재)에서 구입하였다. 이 클로닝 벡터는 파지 CI 리프레서 유전자내에 유일한 EcoRI 클로닝 부위를 가지고 있다. 상기에서 얻은 cDNA 단편들을 0.5 내지 1.0㎕ 의 EcoRI-절단 gt 10, 0.5 내지 3㎕ 의 상기 이중나선 단편, 0.5㎕ 의 10X 결찰완충액, 0.5㎕ 의 리가아제 (200 유니트) 및 총량을 5㎕ 로 조정하는 증류수와 혼합함으로써 EcoRI 부위에 도입시켰다. 혼합물을 14℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 표준 방법(Maniatis, pp. 256-168)에 따라 시험관내 팩키징 하였다.
균주 HG415 같은 대장균 hfl 균주를 감염시키기 위해 팩키지된 파지를 사용하였다. 또는 달리, 프로메가 바이오텍크사에서 구입할 수 있는 대장균주 C600 hfl을 사용할 수도 있다. EcoRI-끝 단편을 삽입시킴으로써 얻어진 재조합 플라크의 백분율은, 20개의 무작위 플라크중, 분석결과 5% 이하였다.
그 결과의 cDNA 라이브러리를 플레이팅하고, 용출 완충액을 첨가함으로써 선택 플레이트로부터 파지를 용출시켰다. 파지로부터 DNA를 추출한후, EcoRI 으로 DNA를 소화시켜 이종 삽입물을 유리시킨 다음, DNA 단편을 아가로오스 상에서 분획화하여 파지 단편을 제거하였다. 500내지 4,000 염기쌍의 삽입물이 분리되었으며 상기와 같이 람다 gt10 에 재클론시켰고, 대장균주 HG415를 감염 시키기 위해 팩키지된 파지를 사용하였다. 파지 라이브러리는 총 8개의 플레이트에, 플레이트당 약 5,000개의 플라크로 대장균주 HG415 상에 플레이팅 하였다.
[실시예 2]
[ET-NANB 클론된 단편의 선택]
[A. cDNA 프로브]
실시예1에서와 같이, 비감염 및 ETNANB-감염 게잡이 원숭이로부터 이중 나선 cDNA 단편을 제조하였다. cDNA 단편은 베링거만하임사에서 입수한 무작위-프라이밍 표지화 키트를 사용하여, 무작위 프라이밍에 의하여 방사성 표지화하였다.
실시예1에서 플레이트된 cDNA 라이브러리를 2개의 니트로셀롤로오스 필터 각각에 전달시킨후, 표준방법(Maniatis, pp. 320∼323)에 따라, 베이킹에 의해 필터상에 파지 DNA를 고정시켰다. 2벌의 필터를 상기의 감염-공급원 또는 대조 cDNA 프로브의 각각과 혼성화시켰다. 필터의 자동방사선 사진을 촬영하여, 단지 감염공급원으로부터의 방사성 표지된 cDNA 프로브와 혼성화한, 즉, 비감염 공급원으로부터의 cDNA 프로브와는 혼성화하지 않은 라이브러리 클론을 확인 하였다. 총 약 40,00개의 클론을 조사하였고, 그중에서 16개의 클론을 상기의 삭제선택법에 의하여 확인하였다.
각각의 16개의 클론을 취하여 아가 플레이트상에 저농도로 재플레이팅 하였다. 각 플레이트상의 클론을 2개의 니트로셀롤로오스 ag 2중 리프트에 옮기고, 상기와 같이 감염 및 비감염 공급원으로부터 얻은 방사성 표지된 cDNA 프로브와의 혼성화에 대하여 조사하였다. 감염공급원 프로브에 선택적으로 결합하는(즉, 실질적으로 비감염된 공급원 프로브와는 결합하지 않으면서, 감염공급원 프로브와 결합하는) 클론을 선택하였다. 선택적으로 감염공급원으로부터의 프로브에 결합하는 클론중 하나를 분리하여 계속되는 연구에 사용하였다. 이 선택된 벡터를 람다 gt10-1.1 로 표시하고, 제1도에 도시한다.
[실시예 3]
[ET-NANB 서열]
실시예1에서 얻은 클론, 람다 gt10-1.1을 EcoRI 으로 소화하여 이종 삽입물을 분리시켰다. 이종 삽입물은 겔 전기영동에 의하여 벡터 단편으로부터 분리되었다. 단편의 전기영동 이동성은 1.33kb 단편의 이동성과 일치하였다. EcoRI 끝을 함유하고 있는 이 단편을 pTZKFI 벡터의 EcoRI 부위에 삽입하였다. 상기 벡터는 1987년 11월 25일 출원되고 일련번호 125,650 호인, 본 출원인의 공동출원인 희귀 클론 확인을 위한 클로닝 벡터 시스템 및 방법에 구조와 성질이 발표되었다. 간단히 말하면, 제1도에 예시된 바와같이, 상기 플라스미드는 T7 중합효소 프로모터 부위에 인접하고 있는 유일한 EcoRI 부위를 가지고 있고, 플라스미드 및 파지 복제기원을 가지고 있다. EcoRI 부위 양측에 바로 인접한 서열은 알려져 있다. 스트라타진(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라욜라 소재)으로부터 입수한 대장균 BB4 박테리아를 이 플라스미드로 형질 전환시켰다.
방사성 표지된 ET-NANB 프로브를, 실시예2에서 얻은 람다 gt1.0-1.1 파지로부터 1.33kb 삽입물을 절출시키고, 겔 전기영동에 의해 단편을 분리한 후, 상기와 같이 무작위로 표지시킴으로써 제조하였다. 상기 pTZKFI 으로 형질 전환되고 소망하는 ET-NANB 삽입물을 내포하고 있는 박테리아를 복제 리프트에 의해 선택하고, 실시예2에서 대략 설명한 방법을 따라 방사성 표지된 ET-NANB 프로브로 혼성화시켰다.
성공적인 재조합체를 포함하는 한 박테리아 콜리니를 사용하여 1.33kb 삽입물의 일부를 서열화하였다. pTZKFI (ET1.1)로 표시된 이 분리물을 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁하였고, ATCC 기탁번호 67717 로 표시한다. 표준 디데옥시 서열화 과정, 및 양측에 EcoRI 부위가 있는 서열에 대한 프라이머를 사용하여, 삽입물의 5`-끝영역과 3`-끝영역으로부터 약 200-250 염기쌍의 서열을 얻었다. 이 서열은 상기 제Ⅱ단원에서 제시하였다. 동일한 기법으로 계속 서열화하여 양방향으로 전체 서열을 얻었으며, 이것 역시 상기에 제시하였다.
[실시예 4]
[ET-NANB 서열의 검출]
비감염 및 ET-NANB-감염 게잡이 원숭이의 담즙으로부터 cDNA 단편 혼합물을 상기와 같이 제조하였다. 사람 변 샘플로부터 얻어지는 cDNA 단편을 다음과 같이 제조하였다.
ET-NANB 발생의 결과로서 ET-NANB 로 감염된 것으로 진단된 멕시코인으로부터 얻어진 30㎖ 의 10% 변 현탁액과, 건강한 비감염 멕시코인으로부터 유사한 부피의 변을, 30% 슈크로오스 밀도 구배 쿠션위에 놓고, 25,000 x g에서 6시간, SW27 로터로, 15℃에서 원심분리하엿다. 감염된 공급원 변으로부터 펠릿화된 물질이, 감염된 변 샘플에서 ET-NANB 감염의 특징인 27 내지 34㎚ 의 VLP 입자를 포함하고 있었다. 두가지 감염 및 비감염 샘플 모두의 슈크로오스-구배 펠릿으로부터 RNA를 분리하였고, 분리한 RNA를 실시예1에서 설명한 바와같이 cDNA 단편을 제조하기 위해 사용하였다.
감염 및 비감염 담즙 공급원으로부터 및 감염 및 비감염 사람 - 변 공급원으로부터의 cDNA 단편 혼합물을, 1988년 6월 17일에 출원된 공동소유의 특허출원 일련번호 07/208,512(DNA 증폭 및 삭제 기법)에 설명되어 있는 신규한 링커/프라이머 복제 방법에 의하여 각각 증폭시켰다. 간단히 설명하면, 각 샘플의 단편을 DNA Pol I 으로 블런트끝으로 처리한 후, 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다. 블런트-끝처리된 물질을 다음의 서열(위의 또는 5' 서열은 SEQ ID NO. 21을 가지고, 아래의 또는 3' 서열은 SEQ ID NO. 22를 갖는다) :
5 ' -GGAATTCGCGGCCGCTCG-3 '
3 ' -TTCCTTAAGCGCCGGCGAGC-5 ' 을 가지는 링커와 결찰시켰다.
2중나선 단편을 NruI 으로 소화하여 링커 이합체를 제거하고, 서열 5` - GGAATTCGCGGCCGCTCG-3' 을 가지는 프라이머와 혼합한 다음, 변성시키고, 실온에서 냉각시켜 단일 스트란드 DNA/프라이머 복합체를 만들었다. 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq) 중합효소와 4가지의 모든 데옥시누클 레오티드를 첨가함으로써 복합체를 복제하여 2중나선을 제조하였다. 연속적인 스트란드 변성, 스트란드/프라이머 복합체의 형성, 및 복제를 포함하는 복제 과정을 25회 반복하였다.
증폭된 cDNA 서열을, 아가로오스 겔 전기영동에 의하여, 2% 아가로오스 매트릭스를 사용하여 분획화하였다. DNA 단편을 아가로오스 겔로부터 니트로 셀룰로오스 페이퍼로 옮긴후, 필터를 (i) 상기의 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)을 EcoRI 으로 처리하고, (ii) 방출된 1.33kb 의 ET-NANB 단편을 분리한 후, (iii) 분리된 단편을 무작위 표지화 함으로써 제조한 무작위-표지32P프로브에 혼성화시켰다. 프로브 혼성화는 종래의 서던 블롯팅 방법(Maniatis, pp. 382-389)에 의해 수행하였다. 제2도는 감염(I) 및 비감염(N) 담즙공급원(2A)으로부터, 및 감염(I) 및 비감염(N) 사람 변 공급원(2B)로부터의 cDNA 로 얻어지는 혼성화 패턴을 보여준다. 도면에서 알 수 있는 바와같이, ET-NANB 프로브는 2가지 감염 공급원으로부터 얻은 단편과 혼성화되었지만, 2가지의 비감염 공급원 으로부터 얻은 서열에는 비상동이었고, 그러므로 이것으로 유도된 서열의 특이성을 확인하였다.
방사성 표지된 1.33kb 단편과 사람 및 게잡이 원숭이 DNA 로부터 얻은 게놈 DNA 단편과의 서던 블롯을 또한 준비하였다. 2가지의 게놈 단편 혼합물중 어느 것과도 프로브는 혼성화하지 않는 것으로 관찰되었고, 이것은 ET-NANB서열이 사람 또는 게잡이 원숭이 게놈중 어느 하나에 대하여 외인성임을 확인시켜 준다.
[실시예 5]
[ET-NANB 단백질의 발현]
[A. ET-NANB 클로닝 서열의 제조]
실시예 2에서 얻은 pTZKF1(ET1.1) 플라스미드를 EcoRI 으로 소화하여 1.33kb ET-NANB 삽입물을 방출시켰고, 이것을 겔 전기영동에 의하여 선형화된 플라스미드로부터 정제하엿다. 정제된 단편을 표준 소화 완충액(0.5M Tris HCL, pH 7.5; 1 mg/㎖ BSA; 10 mM MnCl2)에 ㎖당 약 1㎎의 농도로 현탁시킨 후, DNAse I 로 실온에서 약 5분간 소화시켰다. 이 반응조건은 선행 보정 연구에서 결정되었는데, 그때에 배타적으로 100내지 300 염기쌍의 단편을 생성하는데 필요한 인큐베이션 시간을 결정하였다. 물질을 페놀/클로로포름으로 추출한후, 에탄올로 침전시켰다.
소화 혼합물중의 단편을 블런트 끝을 가지도록 처리하고, 실시예 1 에서와 같이 EcoRI 링커와 결찰시켰다. 그 결과의 단편을 , phi X 174/HaeIII 및 람다/HindIII 사이즈 마아커를 사용하여, 1.2% 아가로오스 겔 상에서 전기영동(5-10 V/㎝)에 의하여 분석하였다. 100내지 300bp 분획을 NA 45 스트립(Schleicher and Schuell)상에 용출한 후, 용출용액(1M NaCl, 50㎎ 의 아르기닌, pH 9.0)을 포함하고 있는 1.5㎖ 의 마이크로튜브에 넣고, 67℃에서 30내지 60분간 인큐베이션하였다. 용출된 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출한후, 2배 부피의 에탄올로 침전시켰다. 형성된 펠릿을 20㎕ 의 TE (0.01 M Tris HCl, pH 7.5, 0.001 M EDTA) 에 재현탁하였다.
[B. 발현 벡터에의 클로닝]
람다 gt11 파지 벡터(Huynh)를 프로메가 바이오텍크사 (미국 와이오밍주 메디슨 소재)에서 구입하엿다. 이 클로닝 벡터는 베타-갈락토시다제 번역 종결 코돈으로부터 윗쪽으로 53 염기쌍 떨어진 곳에 유일한 EcoRI 클로닝 부위를 가지고 있다. 코딩 서열(실시예5)로부터 직접 제공된 상기의 게놈 단편 또는 cDNA 의 증폭후 (실시예 4)의 상기의 게놈 단편을, 0.5 내지 1.0㎍ 의 EcoRI-절단 gt11, 0.3 내지 3㎕ 의 상기 크기 조정된 단편들, 0.5㎕ 의 10X 경찰 완충액(상기 참조), 0.5㎕ 의 리가이제(200 유니트), 및 총 5㎕ 가 되게 조정하는 증류수와 혼합함으로써, EcoRI 부위에 삽입하였다. 혼합물을 14℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 표준방법(Maniatis, pp. 256-268)에 따라 시험관내 팩키징하였다.
미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 DNAX 의 케빈무어 박사로부터 얻은 대장균주 KM392를 감겸시키기 위해 팩키지된 파지를 사용하였다. 또는 달리, 아메리칸 타입컬춰콜렉션으로부터 입수할 수 있는 대장균주 Y1090 (ATCC #37197)을 사용할 수도 있다. 감염된 박테리아를 플레이팅하고 그 결과의 콜로니들을, X-gal 의 존재하에 표준 X-gal 기질 플라크 측정법(Maniatis)을 사용하여, 베타-갈락토시다제 활성의 손실(투명한 플라크)에 대하여 조사하였다. 약 50%의 파지 플라크가 베타-갈락토시다제 효소 활성의 손실을 나타냈다(재조합체).
[C. ET-NANB 재조합 단백질에 대한 스크리닝]
ET-NANB 회복기의 항혈청을, 멕시코, 보르네오, 파키스탄, 소말리아, 및 버어마에서 보고된 ET-NANB 발명 기간동안 감염된 환자들로부터 얻었다. 혈청들은 ET-NANB 감염에 걸린 여러명의 다른 환자들로부터 취한 변 샘플에서 얻은 VLP 와 면역학적으로 반응하였다.
상기로부터 약 104 pfu 의 파지 스톡으로 감염된 대장균 KM392 세포 군집을 150㎚ 플레이트상에서 준비하여 인큐베이션한후, 37℃에서 5내지 8시간 플레이트를 뒤집어 놓았다. 군집은 니트롤셀롤로오스 쉬트와 겹쳐져서 발현된 ETNANB 재조합 단백질이 플라크로부터 페이퍼로 전달되었다. 플레이트와 필터를 해당하는 플레이트와 필터 위치를 매치시키는데 지표로 삼았다.
필터를 TBST 완충액(10 mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% 트윈 20)으로 2회 세척하고, AIB (1% 젤라틴을 포함하는 TBST 완충액)으로 차단한 뒤 다시 TBST 로 세척하고, 항혈청을 첨가한후 밤새 인큐베이션하였다(조건 : AIB 로 1;50 으로 희석하고, 플레이트당 12내지 15㎖ 씩). 쉬트를 TBST 로 2회 세척한후, 효소로 표지된 항-사람 항체와 접촉시켜 항혈청에 의해 인지되는 항원을 함유하고 있는 필터 부위에 표지된 항체를 부착시켰다. 최종 세척후, 5㎖ 의 알칼리 포스파타제 완충액(100 mM Tris, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2)중에 16㎕ 의 BCIP(50㎎/㎖ 의 스톡용액, 4℃에서 유지)와 혼합된 33㎕ 의 NBT(50㎎/㎖ 의 스톡용액, 4℃에서 유지)를 함유하고 있는 기질 배지에서 필터를 전개시켰다. 항혈청에 의해 인지되는 바, 항원 생성지점에 자주색이 나타났다.
[D. 스크리닝 플레이팅]
전단계에서 결정한 항원 생성 구역을, 약 100 내지 200 pfu 로 82㎜ 플레이트상에 재플레이팅하였다. NBT-BCIP 전개를 통하여 5 내지 8시간 인큐베이션으로부터 출발하는 상기 단계)를 반복하여, ET-NANB 항체와 반응할 수 있는 항원을 분비하는 파지를 플라크 정제하였다. 확인된 플라크를 취하여 파지 완충액으로 용출시켰다(Maniatis, p. 443).
[E. 에피토프 확인]
실시예 2의 원래의pTZKF1 (ET1.1) 플라스미드로부터 유도된 하위 클론시리즈를, 상술한 것과 동일한 기법을 사용하여 분리하였다. 5개의 하위 클론 각각은 C 에 나타낸 항-ET 항혈청의 푸울과 면역학적으로 반응하였다. 하위클론들은 앞서 제시한 역 서열의 짧은 서열을 함유하였다. 하위클론에서 시작하고 끝나는 점의 서열을(완전한 역 서열과 관련하여) 아래의 표에 나타낸다.
상기 표에 나타낸 모든 유전자 서열이 에피토프에 대한 코딩서열을 함유해야 하기 때문에, 에피토프에 대한 코딩서열은 누클레오티드 594 (5'-끝)과 643(3'-끝) 사이의 영역에 있는 것으로 나타난다. 그러므로 이 상대적으로 짧은 서열에 동등한 및 상보하는 유전서열은, 이 코딩영역을 사용하여 생성된 펩티드와 같이 본 발명에 특히 바람직한 측면이다.
전적으로 상이한 에피토프를 확인하는 제 2 시리즈의 클론은 단지 멕시코 유래 혈청을 이용하여 분리하였다.
이 에피토프에 대한 코딩시스템은 누클레오티드 2(5'-끝)와 101(3'-끝) 사이에 있다. 그러므로 이 짧은 서열과 관련된 유전서열이, 이 코딩영역을 사용하여 생성된 펩티드가 그러한 것 처럼, 또한 바람직하다.
HEV 에 특이한 에피토프를 함유하는 폴리펩티드 제조에 사용하기 위한 2개의 특히 바람직한 하위클론들은 406.3-2 와 406.4-2 로, 이것들의 서열은 상기에서 나타냈다. 이들 서열은 멕시코인 변으로부터 유도된 증폭 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 이 단원에서 설명한 기법을 사용하여, 이들 클론에 의해 발현된 폴리펩티드를, 전세계적인 공급원으로부터 얻은 수 많은 상이한 사람 HEV-양성 혈청에 대하여 면역반응성에 대해 시험하였다. 아래의 표3에 나타낸 바와같이, 8개의 혈청이 406.4-2 에 의해 발현된 폴리펩티드와 면역학적으로 반응하였고, 6개의 혈청이 406.3-2 에 의해 발현된 폴리펩티드와 면역학적으로 반응하였다.
비교를 위해서, 다양한 사람 혈청과 표1에 나타낸 Y2 클론과의 반응성을 아래의 표에 나타낸다. 단지 하나의 혈청만이 Y2 클론에 의해 발현된 폴립펩티드와 반응하였다. gt11 벡터의 정상적인 발현 생성물에 대한 면역 반응성은 볼 수 없었다.
본 발명을 이상과 같이 특정 구체예, 방법, 제조 및 용도에 관해 설명하였고, 한편, 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양한 수정 및 변형이 이루어질수 잇다는 것이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 명백하다.
Claims (24)
- 대장균주 BB4내에 들어있고 ATCC 기탁번호가 67717인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물의 코딩 영역과 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스성 간염 병원체로부터 유도된 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 1.33kb EcoRI 삽입물내의 완전한 코딩 영역에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 하기의 제1 서열 (SEQ ID NO. 1), 제2 서열 (SEQ ID NO. 5), 제3 서열 (SEQ ID NO. 6), 제4 서열(SEQ ID NO. 10), 또는 제5 서열(SEQ ID NO. 12), 또는 그것들에 대한 상보 서열을 가지는 DNA 분자의 코딩영역과 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 재조합 단백질 :
- (a) 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염에 감염된 개체에 존재하는 항체와 면역학적으로 반응하고, (b) 대장균주 BB4내에 들어있고, ATCC 기탁번호가 67717인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1) 에 존재하는 1.33kb 의 DNA EcoRI 삽입물과 상동인 영역을 함유하는 게놈을 가진 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 단백질.
- 제4항에 있어서, 상기 1.33kb EcoRI 삽입물내의 코딩영역에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- (a) 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염에 감염된 개체에 존재하는 항체와 면역학적으로 반응하고, (b) 유전서열 406.3-2 또는 406.4-2 또는 그것의 단편에 의해 코드화되는 단백질.
- 시험개체에서 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염 바이러스 병원체에 의한 감염을 검출하는 방버으로서, (a)장을 통해 전염되는 비A비B형 간염으로 감염된 개체에 존재하는 항체와 면역학적으로 반응하고, (b) 대장균주 BB4에서 운반되고 ATCC 기탁번호가 67717인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1) 에 존재하는 1.33kb의 DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 펩티드 항원을 제조하는 단계. 상기 항원과 시험개체로부터 얻은 혈청을 반응시키는 단계, 그리고 결합된 항체의 존재에 대하여 항원을 조사하는 단계로 이루어지는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 반응단계에서는 IgM 또는 IgG 항체, 또는 그것들이 혼합물을 포함하는 상기 혈청항체를 제공된 항원이 부착된 지지체와 접촉시키고, 상기 조사단계에서는 상기 지지체 및 결합된 상기 혈청항체를 리포터-표지된 항-사람 항체와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염의 감염을 진단할 수 있는 혈청항체의 존재를 확인하기 위한 키트로서, (a) 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 간염 병원체에 감염된 개체에 존재하는 항체와 면역학적으로 반응하고, (b) 대장균주 BB4내에 들어있고 ATCC 기탁번호가 67717 인 플라스미드 pTZKF1 (ET1.1)에 존재하는 1.33kb 의 DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는 바이러스 간염 병원체로부터 유도된 재조합 펩티드 항원이 표면에 결합된 지지체, 및 리포터-표지된 항-사람 항체로 이루어지는 키트.
- 대장균주 BB4에 들어있고 운반되고 ATCC 기탁번호가 67717인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.3kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 DNA 단편.
- 제10항에 있어서, 상기 1.33kb EcoRI 단편으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 단편.
- 유전서열 406.3-2 또는 406.4-2 또는 그것의 단편을 포함하며, 상기 단편은 12개의 이상의 연속적 누클레오티드를 포함하는 DNA 분자.
- 하기의 제1서열(SEQ ID NO. 1), 제2서열(SEQ ID NO. 5), 제3서열(SEQ ID NO. 6), 제4서열(SEQ ID NO. 10), 또는 제5서열(SEQ ID NO. 12), 또는 그것들에 대한 상보 서열내의 DNA 단편에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 DNA 단편 :
- 대장균주 BB4에 들어있고 운반되고 ATCC 기탁번호가 67717인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 바이러스 간염 병원체로부터 유도된 DNA 이중나선 단편의 반대쪽 스트란드의 비상동 영역으로부터 유도되는, 한쌍의 단일 스트란드 프라이머를 용기 또는 분리용기내에 포함하고 있는 키트.
- 제14항에 있어서, 상기 플라스미드내의 EcoRI 이중나선 삽입물의 반대쪽 스트란드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 생물학적 샘플에서 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염 바이러스 병원체의 존재를 검출하기 위한 방법으로서, 샘플로부터 유도된 이중나선 DNA 단편의 혼합물을 제조하는 단계, 이중나선 단편을 변성시키는 단계, 대장균주 BB4에 들어있고 ATCC 기탁번호가 67717인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 바이러스 간염 병원체로부터 유도된 DNA 이중나선 단편의 반대쪽 스트란드의 비상동 영역으로부터 유도되는, 한쌍의 단일 스트란드 프라이머를 변성된 DNA 단편에 첨가하는 단계, 상기 프라이머를, 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염 병원체로부터 유도된 이중나선 DNA 단편의 반대쪽 스트란드의 상동 서열영역에 혼성화시키는 단계, 프라이머가 혼성화된 단편 스트란드들을 DNA 누클레오티드 존재하에 DNA 중합효소와 반응시켜서 프라이머 서열을 포함하는 새로운 DNA 이중나선을 형성하는 단계, 그리고 서열의 원하는 증폭도가 이루어질 때까지 상기 변성, 첨가, 혼성화 및 반응 단계들을 반복하는 단계로 이루어지는 방법.
- 제16항에 있어서, 프라이머가 상기 플라스미드내의 EcoRI 이중 나선 삽입물의 반대쪽 스트란드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 병원체로 감염된 배양세포 샘플에서 바이러스 병원체의 존재를 검출하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 대장균주 BB4에 들어있고 ATCC 기탁번호가 67717 인 플라스미드 pTZKF1(ET1.1)에 존재하는 1.33kb DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈이 함유하고 있는, 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 재조합 단백질을 약제학적으로 허용되는 보조제내에 포함하고 있는, 장을 통해 전염되는 비A비B형간염 바이러스 병원체에 대해 개체를 면역시키기 위한 백신.
- 제19항에 있어서, 단백질이 상기 플라스미드내의 EcoRI 삽입물로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 백신.
- 유전서열 406.3-2 또는 406.4-2 또는 그것의 단편에 의해 코드화된 단백질을 약제학적으로 허용되는 보조제내에 포함하고 있는, HEV에 대해 개체를 면역시키기 위한 백신.
- 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 병원체 또는 병원체에 의해 생성된 핵산단편을 분리하는 방법로서, 상기 병원체의 공급원으로서 장을 통해 전염되는 비A비B형 간염으로 감염된 사람 또는 게잡이 원숭이로부터 얻어지는 담즙을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 담즙이 감염된 게잡이 원숭이로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 대중균주 BB4에 들어있고 ATCC 기탁번호가 67717 인 플라스미드 pZTKF( ET1.1)에 존재하는 1.33kb의 DNA EcoRI 삽입물에 상동하는 영역을 자체의 게놈의 함유하는, 장을 통해 전염되는 비A비B형 바이러스 간염 병원체로부터 유도되는 단백질에 면역된 사람으로부터 얻어지는 사람 다중클론성 항혈청.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50588890A | 1990-04-05 | 1990-04-05 | |
| US505,888 | 1990-04-05 | ||
| PCT/US1991/002368 WO1991015603A1 (en) | 1990-04-05 | 1991-04-05 | Enterically transmitted non-a/non-b hepatitis viral agent and characteristic epitopes thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR920701481A KR920701481A (ko) | 1992-08-11 |
| KR0178399B1 true KR0178399B1 (ko) | 1999-04-01 |
Family
ID=24012303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019910701774A KR0178399B1 (ko) | 1990-04-05 | 1991-04-05 | 장을 통해 전염되는 비a비b형 간염 바이러스 병원체 및 그것의 특유한 에피토프 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0476130B1 (ko) |
| JP (2) | JPH04506608A (ko) |
| KR (1) | KR0178399B1 (ko) |
| CN (1) | CN1075112C (ko) |
| AT (1) | ATE400658T1 (ko) |
| AU (1) | AU644878B2 (ko) |
| CA (1) | CA2057052C (ko) |
| DE (1) | DE69133599D1 (ko) |
| TW (1) | TW210355B (ko) |
| WO (1) | WO1991015603A1 (ko) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5686239A (en) * | 1988-06-17 | 1997-11-11 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis E virus peptides and methods |
| US5741490A (en) * | 1988-06-17 | 1998-04-21 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis E virus vaccine and method |
| US6455492B1 (en) * | 1988-06-17 | 2002-09-24 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis E virus vaccine and method |
| US5885768A (en) * | 1988-06-17 | 1999-03-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Hepatitis E virus peptide antigen and antibodies |
| US6214970B1 (en) | 1988-06-17 | 2001-04-10 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis E virus antigens and uses therefor |
| US6291641B1 (en) | 1988-06-17 | 2001-09-18 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis E virus antigens and uses therefor |
| EP0510952A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-28 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotide primers and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus |
| US5859230A (en) * | 1992-07-30 | 1999-01-12 | Genelabs Technologies, Inc. | Non-A/non-B/non-C/non-D/non-E hepatitis agents and molecular cloning thereof |
| US6207416B1 (en) | 1992-09-18 | 2001-03-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant proteins of a Pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
| US6787145B1 (en) | 1992-09-18 | 2004-09-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
| WO1994006913A2 (en) | 1992-09-18 | 1994-03-31 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Healthand Human Services | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis e and their use in diagnostic methods and vaccines |
| CN1059928C (zh) * | 1992-09-29 | 2000-12-27 | 天津普生生物科技有限公司 | 利用大肠杆菌制备可用来检验c型肝炎之抗原蛋白的方法 |
| US5736315A (en) * | 1992-10-21 | 1998-04-07 | National Institute Of Health | Methods and compositions for detecting anti-hepatitis E virus activity |
| US5874563A (en) * | 1994-05-20 | 1999-02-23 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis G virus and molecular cloning thereof |
| US5824507A (en) * | 1994-05-20 | 1998-10-20 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis G virus and molecular cloning thereof |
| US6054567A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
| US6458562B1 (en) | 1998-04-09 | 2002-10-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Recombinant proteins of a Pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
| JP4080995B2 (ja) * | 2001-06-25 | 2008-04-23 | 株式会社東芝 | 日本人からのｅ型肝炎ウイルスに由来するポリヌクレオチドプローブおよびプライマー、それらを有するチップ、それらを有するキット、並びにそれらによるｅ型肝炎ウイルスを検出する方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4659678A (en) * | 1982-09-29 | 1987-04-21 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
| WO1985001517A1 (en) * | 1983-09-30 | 1985-04-11 | Massachusetts Institute Of Technology | PRODUCTION OF cDNA REPRESENTING HEPATITIS A VIRAL SEQUENCES |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| FR2597606B1 (fr) * | 1986-04-16 | 1989-10-06 | Pasteur Institut | Nouveau reactif pour la detection d'hepatites virales non a non b et procede de diagnostic de telles hepatites par voie immunoenzymatique |
| WO1989012641A1 (en) * | 1988-06-17 | 1989-12-28 | Genelabs Incorporated | Enterically transmitted non-a/non-b hepatitis viral agent |
-
1991
- 1991-04-05 KR KR1019910701774A patent/KR0178399B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-04-05 DE DE69133599T patent/DE69133599D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-05 JP JP3508331A patent/JPH04506608A/ja not_active Withdrawn
- 1991-04-05 WO PCT/US1991/002368 patent/WO1991015603A1/en active Application Filing
- 1991-04-05 EP EP91908163A patent/EP0476130B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-05 AT AT91908163T patent/ATE400658T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-05 CA CA002057052A patent/CA2057052C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-05 AU AU77651/91A patent/AU644878B2/en not_active Expired
- 1991-04-05 CN CN91103058A patent/CN1075112C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-23 TW TW080105712A patent/TW210355B/zh not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-07-04 JP JP2003192394A patent/JP2004043470A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1063507A (zh) | 1992-08-12 |
| JP2004043470A (ja) | 2004-02-12 |
| EP0476130B1 (en) | 2008-07-09 |
| ATE400658T1 (de) | 2008-07-15 |
| KR920701481A (ko) | 1992-08-11 |
| EP0476130A4 (en) | 1993-05-19 |
| EP0476130A1 (en) | 1992-03-25 |
| JPH04506608A (ja) | 1992-11-19 |
| WO1991015603A1 (en) | 1991-10-17 |
| TW210355B (ko) | 1993-08-01 |
| AU7765191A (en) | 1991-10-30 |
| CN1075112C (zh) | 2001-11-21 |
| DE69133599D1 (de) | 2008-08-21 |
| CA2057052C (en) | 2009-06-30 |
| AU644878B2 (en) | 1993-12-23 |
| CA2057052A1 (en) | 1991-10-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0178399B1 (ko) | 장을 통해 전염되는 비a비b형 간염 바이러스 병원체 및 그것의 특유한 에피토프 | |
| JP2007031440A (ja) | 腸管伝播性非ａ非ｂ肝炎ウイルス因子 | |
| CA2065287C (en) | New hcv isolates | |
| CA2032381C (en) | Viral agent | |
| JP3746291B2 (ja) | Ｅ型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法 | |
| KR100217483B1 (ko) | C형 간염 바이러스 에피토프 | |
| EP0423239A1 (en) | Post-transfusion, non-a, non-b hepatitis virus and antigens | |
| US5885768A (en) | Hepatitis E virus peptide antigen and antibodies | |
| JPH07101986A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドおよびイムノアッセイ | |
| US5218099A (en) | Post-transfusion, non-A, non-B hepatitis virus polynucleotides | |
| US5741490A (en) | Hepatitis E virus vaccine and method | |
| US5789559A (en) | DNA sequences of enterically transmitted non-A/non-B hepatitis viral agent | |
| US5824649A (en) | DNA sequences of enterically transmitted non-A/non-B hepatitis viral agent and characteristic epitopes thereof | |
| JP4390293B2 (ja) | Ｅ型肝炎のパキスタン株組換えタンパク質および診断法およびワクチンにおけるそれらの使用 | |
| CN1048523C (zh) | 制备由肝炎病毒因子产生的蛋白质的方法 | |
| EP0585381A1 (en) | THE ASTROVIRUS HUMAN GASTROENTERITIS AGENTS AND MOLECULAR CLONING OF CORRESPONDING cDNAs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20091012 Year of fee payment: 12 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |