JP4390293B2 - E型肝炎のパキスタン株組換えタンパク質および診断法およびワクチンにおけるそれらの使用 - Google Patents
E型肝炎のパキスタン株組換えタンパク質および診断法およびワクチンにおけるそれらの使用 Download PDFInfo
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Description
本発明は肝炎ウイルス学の分野である。特に、本発明はパキスタンからのE型肝炎の腸伝染株、SAR-55、に由来する組換えタンパク質およびこれらのタンパク質を用いる診断法およびワクチン応用に関している。
発明の背景
腸伝染非A/非B型肝炎であるE型肝炎の流行はアジア、アフリカおよび中央アメリカで報告されている(Balayan,M.S.(1987),SovietMedical Reviews,Section E,Virology Reviews,Zhdanov,0-V.M.(ed),Chur,Switzerland:Harwood Academic Publishers,vol.2,235-261;Purcell,R.G.,et al.(1988),Zuckerman,A.J.(ed),”Viral Hepatitis and Liver Disease”,New York:Alan R.Liss,131-137;Bradley,D.W.(1990),British Medical Bulletin,46:442-461;Ticehurst,J.R.(1991),Hollinger,F.B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.(eds):”Viral Hepatitis and Liver Disease”,Williams and Wilkins,Baltimore,501-513)。E型肝炎ウイルス(HEV)が風土病である国で報告されている肝炎の90%までが散発性肝炎(E型肝炎と推定されている)の患者だとみなされている。感染した患者の血清中抗HEV抗体を検出するための血清学的試験開発の必要性が本分野で広く認識されているが、感染したヒトまたは動物から排出されるHEVは非常に低濃度であるため、血清学的試験の抗原としてのそのようなHEVの使用を不可能にしており、細胞培養においてのHEV繁殖で限られた成功が報告されているだけであり(Huang,R.T.et al.(1992),J.Gen.Virol.,73:1143-1148)、細胞培養は現在の所、血清学的試験に必要とされる量の抗原を産生するにはあまりにも不十分である。
最近、E型肝炎に関連するウイルスゲノム配列を同定する世界的な努力の結果、HEV株のいくつかの数のゲノムがクローニングされた(Tam,A.W.et al.(1991),Virology,185:120-131;Tsarev,S.A.et al.(1992),Proc,Natl.Acad,Sci.USA,89:559-563;Fry,K.E.et al.(1992),Virus Genes,6:173-185)。DNA配列の分析により、HEVゲノムは三つの読み取り枠(ORF)で組織化されることが仮定され、および三つのORFが完全HEVタンパク質をコードしていることが仮定された。
ビルマ(ミャンマー)からのHEV株ゲノムの部分DNA配列がReyes et al.,1990,Science,247:1335-1339に記載されている。Tam et al.,1991およびReyes et al.,PCT特許出願WO91/15603(1991年10月17日に公開)はHEVのビルマ株の完全ヌクレオチド配列および演繹されたアミノ酸配列を開示している。これらの筆者はこの株の配列内に三つの前部読み取り枠(ORF)が含まれていることを仮定した。
Ichikawa et al.,1991,Microbiol.Immunol.,35:535-543はHEV感染カニクイザルからの血清によるλgt11発現ライブラリーのスクリーニングにより240-320ヌクレオチド長の一連のクローンの単離を記載している。一つのクローンにより発現された組換えタンパク質が大腸菌で発現された。この融合タンパク質はHEVミャンマー株のORF-2の3’領域によりコードされている。
HEVメキシコ株およびHEVビルマ株のORF-2の3’領域内にコードされている別のタンパク質の発現がYarbough et al.,1991 J.Virology,65:5790-5797に記載されている。この論文はHEVに由来する二つのcDNAクローンの単離を記載している。これらのクローンは融合タンパク質として大腸菌で発現された。
Purdy et al.,9921,Archives of Virology,123:335-349およびFavorov et al.,1992,J.of Medical Virology,36:246-250は大腸菌におけるより大きなORF-2タンパク質断片の発現を記載している。これらの参照文献ならびに前に議論した文献は、細菌発現系を使用したORF-2遺伝子の一部の発現のみを記載している。本発明まで、完全長ORF-2の発現は成功していない。
HEVのゲノム組織化および形態学的構造はカリチウイルスに最も密接に相関している。興味あることに、カリチウイルスの構造タンパク質はこれらのゲノムの3’部分にコードされており(Neil,J.d.et al.(1991)J.Virol.,65:5440-5447;およびCarter,M.J.et al.(1992),J.Arch.Virol.,122:223-235)、HEVゲノムの3’末端部分もまた構造タンパク質をコードしているという直接的証拠は存在しないが、細菌細胞における3’ゲノム領域ある小さな部分の発現はELISAおよびウェスタンブロットにおいて抗HEV血清と反応性を持つタンパク質産生の結果を与えた(Yarborough,et al.,(1991);Ichikawa et al.(1991);Favorov et al.(1992)およびDawson,G.J.et al.(1992)J.Virol Meth;38:175-186)。しかしながら、構造タンパク質としてのORF-2タンパク質の機能は本発明までは証明されていなかった。
ORF-2遺伝子の一部でコードされている小さなタンパク質は動物血清のHEVに対する抗体を検出するイムノアッセイに使用されてきた。血清学的イムノアッセイにおいて、抗原として細菌で発現された小さなタンパク質の使用はいくつかの潜在的欠点を持っている。第一に、細菌細胞においてのこれらの小さなタンパク質の発現は溶解性の問題、およびイムノアッセイに抗原として粗大腸菌溶解物が使用された場合は患者の血清と大腸菌タンパク質の非特異的交差反応性を生じる(Purdy et al.(1992))。第二に、常用疫学における抗HEV抗体のための最初の血清学的試験としてのウェスタンブロットの使用は時間および費用の点で実際的ではない。HEVゲノムの3’末端部分に由来する小さなペプチドを使用するELISAは既知のHEV感染患者を41%の陽性でしか検出しなかった。第三に、ピコルナウイルスを含む多くのウイルスで、重要な抗原性および免疫原性エピトープは高度な高次構造を持っていることが示されている(Lemon,S.M.et al.(1991),Hollinger,F.B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.(eds):”Viral Hepatitis and Liver disease”,Williams and Wilkins,Baltimore,20-24)。この理由のため、完全なHEV遺伝子をコードしている完全ORFの真核生物系での発現は、HEVウイルス様粒子を形成できるタンパク質の生成を生じるであろうと信じられている。そのような完全ORFタンパク質は、HEVの構造タンパク質の一部のみで代表される上記の小さなタンパク質よりも天然のカプシドタンパク質により近い免疫学的構造を持っているであろう。従って、これらの完全ORFタンパク質は現在使用されているより小さなタンパク質と比較してより代表的抗原およびより有効な免疫原として働くであろう。
発明の要約
本発明はヒトE型肝炎ウイルス株SAR-55の単離されたおよび実質的に純粋な調製試料に関している。
本発明はまた、ヒトE型肝炎ウイルス株SAR-55のゲノムRNAの単離されたおよび実質的に純粋な調製試料に関している。
本発明はまた、ヒトE型肝炎ウイルス株SAR-55のcDNAに関している。
組換えHEVタンパク質ならびに等価な天然核酸配列の産生を指示できる合成核酸配列を提供するのが本発明の目的である。そのような天然核酸配列はcDNAまたはゲノムライブラリーから単離されるであろうし、それからHEVタンパク質の合成を指示できる遺伝子が同定および単離されるであろう。この出願の目的には、核酸配列とはタンパク質をコードしているRNA、DNA、cDNAまたはそれらの合成変異体を意味している。
本発明はさらにSAR-55 cDNAに由来のプライマーを利用したE型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいた生物学的試料中のE型肝炎ウイルス検出法にも関している。
本発明はまたE型肝炎遺伝子発現を阻害するためのSAR-55 cDNAに由来する一本鎖アンチセンスポリ−またはオリゴヌクレオチドの使用にも関している。
本発明はまた、SAR-55のHEVゲノムによりコードされている、または合成核酸配列によりコードされている、単離されたおよび実質的に純粋なHEVタンパク質および特に、HEVの読み取り枠2配列によりコードされている組換えタンパク質にも関している。
本発明はまた、核酸をクローニングし、cDNAを発現ベクター内へ挿入して宿主中で組換えタンパク質を発現することによるHEVゲノム配列に由来する組換えHEVタンパク質を調製する方法にも関している。
本発明はまた、得られた組換えHEVタンパク質の診断剤およびワクチンとしての使用にも関している。
本発明はまた、生物学的試料中のE型肝炎ウイルスに特異的な抗体を検出する方法も包含している。そのような方法はHEVにより起こされる感染および疾患の診断、およびそのような疾患伝搬のモニタリングに有用である。そのような方法はまた、哺乳類におけるHEV感染および疾患の処置過程における治療剤の効力のモニタリングにも有用である。
本発明はまた、哺乳類におけるE型肝炎の防止または処置で使用するための医薬組成物にも関している。
図の簡単な説明
図1はHEV株SAR-55ゲノムの完全ORF-2タンパク質の発現に使用された組換えベクターを示している。
図2Aおよび2Bはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)であり、野生型バキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルス(ORF-2コード遺伝子を含んでいる)を感染させた昆虫細胞の細胞溶解物はクーマシーブルー(A)で染色されているかまたはHEV感染チンパンジーの血清でウェスタンブロッティングされている。図2Aおよび2Bの両方とも、レーン1は非感染SF-9細胞の全細胞溶解物を含んでおり;レーン2は野生型バキュロウイルスを感染させた細胞の溶解物を含んでおり;レーン3は組換えバキュロウイルスを感染させた細胞の溶解物を含んでおり;およびレーン4は分子量マーカーを含んでいる。
図3Aおよび3Bは組換え的に感染させた昆虫細胞におけるORF-2発現の結果形成された、各々30および20nmウイルス様粒子の免疫電子顕微鏡像を示している。
図4は抗原として完全ORF-2をコードしている遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組換えORF-2を使用したELISAの結果を示している。血清抗HEVレベルは、カニクイザルにHEVのメキシコ(Cyno-80A82、Cyno-9A97およびCyno83)またはパキスタン(Cyno−374)株を接種した後の種々の時間で決定された。
図5A−Dは抗原として完全ORF-2をコードしている遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組換えORF-2を使用したELISAの結果を示している。血清IgGまたはIgM抗HEVレベルは二匹のチンパンジーにHEVを接種した後の時間に決定された。
図6A−Jは抗原としてSAR-55から誘導された組換え完全ORF-2タンパク質および抗原としてHEVのビルマ株から誘導された組換え部分ORF-2タンパク質(Genelabs)を使用して得られたELISAデータの比較を示している。
図7A−JはSAR-55 HEVの10%糞懸濁液の一連の10倍希釈液(各々の表の上の括弧内に示されている)を接種したカニクイザルに対する抗HEV IgG ELISAおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の値を示している。ELISAで使用された組換え抗原は:グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST);3-2(M)、3-2エピトープ[Yarbrough et al.,(1991)J.Virol,65:5790-5797]およびGST融合物;SG3(B)、ORF-2の327C末端アミノ酸およびGST融合物[Yarbrough et al.,(1993):E型肝炎のための診断試験のアッセイ開発、”ウイルス肝炎および肝疾患についての国際シンポジウム、科学プログラムおよび抄録巻”Tokyo:VHFL p.87];および昆虫細胞で直接発現された55kDa ORF-2生成物である。
図8A−EはSAR-55 HEVの10%糞懸濁液の一連の10倍希釈液(各々の表の上の括弧内に示されている)を接種した陽性カニクイザルの抗HEV IgG ELISAおよびALTの値を示している。ELISAで使用された組換え抗原は:グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST);3-2(M)、3-2エピトープ[Yarbrough et al.,(1991)]およびGST融合物;SG3(B)、ORF-2の327C末端アミノ酸およびGST融合物[Yarbrough et al.,(1993)];および昆虫細胞で直接発現された55kDa ORF-2生成物である。
図9はSAR-55 HEVの10%糞懸濁液の一連の10倍希釈液(ゲルの各々のレーンの上に示されている)の抽出物から生成されたPCR生成物が分離された2%アガロースゲルのエチジウムブロミド染色を示している。PCR生成物の予想された長さは約640塩基対であり、(M)と記されているカラムはDNAサイズマーカーを含んでいる。
図10は酵母において完全ORF-2タンパク質またはより低い分子量の断片を発現させるために使用されたpPIC9ベクターを示している。
図11は、E型肝炎ウイルス(HEV)ゲノムおよび完全長(bHEV ORF2 fl)および端が切断されたHEV ORF2(bHEV ORF2 5’trおよびbHEV ORF2 5’-3’tr)カプシド遺伝子の模式的構成を示している。
図12Aおよび12BはHEV ORF2完全長遺伝子をコードしている組換えバキュロウイルスの一時的タンパク質発現を示している。Sf-9昆虫細胞をbHEV ORF2 flウイルスにより感染多重度(MOI)=5で感染させた。感染細胞および培地上清は4日間感染にわたって毎日採取した。細胞溶解液および培地上清は8-16%タンパク質勾配ゲル上のSDS-PAGEにより分画し、コロイドクーマシーブルー色素で染色した(図12A)。二重のタンパク質ゲルからのタンパク質はエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移し、HEVタンパク質はHEVに対する一次チンパンジー抗血清(1:500)続いて二次ヤギ抗血清ヒトIgG2-アルカリ性ホスファターゼ(1:5000)への抗体結合により染色体遺伝子的に検出された(図12B)。レーン1、シーブルー分子量マーカー;レーン2、模擬感染細胞;レーン3、感染後(p.i.)1日目の細胞;レーン4、p.i.2日目の細胞;レーン5、p.i.3日目の細胞;レーン5、p.i.3日目の細胞;レーン6、シーブルータンパク質MWマーカー;レーン7、模擬感染上清;レーン8、p.i.1日目の上清;レーン9、p.i.2日目の上清;3日目の上清;レーン10、p.i.4日目の上清。レーンの帰属はパネルAおよびBで同じである。
図13A−13CはbHEV ORF2 flウイルス感染昆虫細胞からの細胞溶解物のタンパク質クロマトグラフィー溶出プロフィールを示している。図13AはQローディング緩衝液中の0-300mM直線NaCl濃度勾配を使用したQセファロースファーストフロー強アニオン交換カラムによるアニオン交換クロマトグラフィーからのタンパク質溶出プロフィールを示している。図13BはQローディング緩衝液中の0-300mM直線NaCl濃度勾配を使用したSQURCE 15Q高速強アニオン交換カラムのピークQ分画からのHEV 55kDタンパク質のタンパク質溶出プロフィールを示している。図13Cは55kDタンパク質を含むSQURCE 15Qクロマトグラフィーでプールされ、セファクリルS200カラムでのゲル濾過にかけられた溶出プロフィールを示している。
図14はセファクリルS200カラムでのゲル濾過分画に含まれているHEV 55kDタンパク質のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットの結果を示している。細胞溶解物のSQURCE 15Qクロマトグラフィーでの55kDタンパク質を含んでいるプール分画はセファクリルS200カラムでのゲル濾過にかけられた。選択されたカラム分画の一部がSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析(下のパネル)またはクーマシーブルー染色8-20%NOVEX勾配ゲル(上のパネル)にかけられた。HEVタンパク質はHEV感染チンパンジーからの回復期抗血清によるウェスタンブロットにより検出された。レーン1、シーブルータンパク質分子量マーカー;レーン2、プールされたQ分画;レーン3-12、ゲル濾過分画。
図15はbHEV ORF2 flウイルス感染Sf-9昆虫細胞からの細胞溶解物から精製された組換えHEV ORF2 kDタンパク質のLys Cペプチドプロフィールを示している。
図16はbHEV ORF2 flウイルス感染Sf-9昆虫細胞からの細胞溶解物から精製された組換えHEV ORF2 55kDタンパク質のカルボキシル末端アミノ酸分析の結果を示している。
図17はbHEV ORF2 flウイルス感染Sf-9昆虫細胞からの細胞溶解物から精製された組換えHEV ORF2 55kDタンパク質のエレクトロスプレー質量分析プロフィールを示している。
図18Aおよび18BはHEV ORF2遺伝子をコードしている組換えバキュロウイルスの一時的タンパク質発現を示している。SF-9昆虫細胞はbHEV ORF2 5’trまたは5’-3’trウイルスで接種後4日間MOI=5で感染させた。感染細胞および培地上清は4日感染の間毎日採取され、図12の説明に記載したように分析された。図18AおよびBは各々bHEV ORF2 5’tr(図18A)および5’-3’tr(図18B)ウイルス感染による細胞付随タンパク質のSDS−PAGE(レーン1−5)およびウェスタンブロット(レーン6-10)の結果を示している。図18CおよびDは各々bHEV ORF2 5’tr(図18C)および5’-3’tr(図18D)ウイルス感染により分泌されたタンパク質のSDS-PAGE(レーン1−5)およびウェスタンブロット(レーン6-10)の結果を示している。レーン1および6、模擬感染細胞;レーン2および7、p.i.1日目の細胞;レーン3および8、p.i.2日目の細胞;レーン4および9、p.i.3日目の細胞;およびレーン5および10、p.i.4日目の細胞;
シーブルータンパク質MWマーカーが示されたタンパク質の分子量を決定するために使用された。生きているHEVを感染させたチンパンジーからの抗HEV抗体がHEVタンパク質を検出するためにウェスタンブロットにおいて使用された。
発明の詳細な説明
本発明はパキスタンからのE型肝炎ウイルス(HEV)の単離および実質的に精製された株、SAR-55に関している。本発明はまた、HEVのタンパク質をコードしているウイルス遺伝子のクローニング、および発現系を用いる組換えタンパク質の発現にも関している。特に、本発明はSAR-55に由来するHEVの読み取り枠(ORF)のクローニングおよび発現に関している。
本発明は単離されたHEVタンパク質に関している。好適には、本発明のHEVタンパク質は天然のHEVタンパク質に実質的に相同的であり、および最も好適には生物学的に等価である。本明細書および請求の範囲で使用される”生物学的に等価”とは、本組成物が抗原性および/または免疫原性であることを意味している。本発明のHEVタンパク質は哺乳類への注射により保護的抗体の産生も刺激し、野生型HEVの攻撃から哺乳類を保護するために働くであろう。以下の明細書および請求の範囲で使用される”実質的に相同的”とは天然HEVタンパク質へのアミノ酸配列の相同性の程度を意味している。好適には相同性の程度は70%を超え、好適には90%を超え、特に好適なタンパク質の群は二つのタンパク質間の領域を比較して天然のHEVタンパク質と99%以上が相同的である。
好適なHEVタンパク質はORF遺伝子によりコードされているタンパク質である。特に興味を持たれるのは、HEVのORF-2遺伝子によりコードされているタンパク質であり、最も特別にはHEVのSAR-55株のORF-2遺伝子によりコードされているタンパク質である。ORF−1、ORF-2およびORF−3タンパク質のアミノ酸配列は各々SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3として以下に示されている:
3文字略号は、天然に存在する20アミノ酸の通常のアミノ酸簡略表記法に従っている。
好適な組換えHEVタンパク質は少なくとも一つのORFタンパク質から成っている。一つ以上の同一または異なったORFタンパク質から作られた他の組換えタンパク質はタンパク質の生物学的特性を変えるために作製された。個別的アミノ酸またはアミノ酸の個別的配列の付加、置換または欠失がHEVタンパク質の生物学的活性を促進するであろうことが企図された。
本発明はまた上述したHEVタンパク質またはそのHEVタンパク質に実質的に相同的なタンパク質の産生を指示できる核酸配列にも関している。SAR-55と名付けられたこの核酸配列は以下にSEQ ID NO:4として示されており、1992年9月17日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託されている(ATCC受入れ番号75302)。
ヌクレオチドに使用された略号は本分野で標準的に使用されているものである。
一方向の配列は、それがRNAウイルスのタンパク質コード鎖であるので”プラス”配列と慣行で称されており、前記SEQ ID NO:4で示されている配列である。
SAR-55読み取り枠の演繹されたアミノ酸配列はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3を持っている。ORF−1はSEQ ID NO:4のヌクレオチド28から始まり5078ヌクレオチド長であり;ORF-2はSEQ ID NO:4のヌクレオチド5147から始まり1971ヌクレオチド長であり;およびORF−3はSEQ ID NO:4のヌクレオチド5106から始まり368ヌクレオチド長である。
ORF-2タンパク質類似体の産生を指示できるDNA配列を生じるであろうDNA配列の変形が企図された。本明細書および請求の範囲を通して使用されている”ORF-2タンパク質の類似体”とは本明細書に特に示された配列と実質的に同一のアミノ酸配列を持っており、生じるタンパク質(即ち、類似体)が抗原的および/または免疫原的であるように本明細書に示された配列中の一つまたはそれ以上の残基が生物学的に等価な残基で置換されているタンパク質を意味している。上に示されたDNA配列は本発明の好適な実施態様を代表していることに注意すべきである。遺伝子コードの縮重のため、本ORFタンパク質またはそれらの類似体の産生を指示できるDNA配列を導くであろう多数のヌクレオチド選択がなされることを理解するべきである。そのため、上に示した配列と機能的に等価である、または上に示したアミノ酸配列に従って産生されるORFタンパク質の類似体の産生を指示するであろう配列と機能的に等価であるDNA配列は本発明に包含されることが意図されている。
本発明はE型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいた、生物学的試料中のE型肝炎ウイルスを検出する方法に関している。好適には、本方法はそのゲノムがSEQ ID NO:4に示されたSAR-55配列と相同的である領域を含んでいるE型肝炎ウイルスから誘導されるDNA二重鎖断片の相対する鎖の非相同的領域から誘導される一本鎖プライマー対を利用している。これらのプライマーは米国特許第4,683,202号に定義されているような選択された核酸配列を増幅するための過程に従った方法で使用できる。
本発明はまた、E型肝炎遺伝子の発現を阻害するための、SAR-55 cDNAに相補的配列から誘導される一本鎖アンチセンスポリ−またはオリゴヌクレオチドの使用にも関している。これらのアンチセンスポリ−またはオリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAであろう。標的化配列は典型的にはメッセンジャーRNA、およびより好適にはRNAのプロセッシングまたは翻訳に必要とされる一つの配列である。アンチセンスポリ−またはオリゴヌクレオチドは、Lemaitre et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-652に記載されているようにポリリジンのようなポリカチオンへ結合でき;この結合体はメッセンジャーRNAにハイブリダイズしてその機能を阻害するのに十分な量で哺乳類へ投与できる。
本発明はHEV、好適には少なくとも一つのORFタンパク質から成るタンパク質、最も好適には少なくとも一つのORF-2タンパク質製造のための組換えDNA法を含んでいる。組換えORFタンパク質は一つのORFタンパク質または同一のまたは異なったORFタンパク質の組み合わせから成っているであろう。天然のまたは合成核酸配列がHEVタンパク質の産生を指令するために使用されるであろう。本発明の一つの実施態様において、本方法は以下の工程から成っている:
(a)HEVタンパク質を産生するように宿主生物体を指示できる核酸配列を調製し;
(b)核酸配列を宿主細胞内へ導入できおよびそこで複製できるベクター内へクローニングし(そのようなベクターは核酸配列のための作動要素を含んでいる);
(c)核酸および作動要素を含んでいるベクターを、タンパク質を発現できる宿主生物体内へ導入し;
(d)ベクターの増幅およびタンパク質の発現に適した条件下で宿主細胞を培養し;
(e)タンパク質を採取する。
本発明の別の実施態様において、HEVの核酸、好適には少なくとも一つのHEVのORFまたは同一のまたは異なったORFタンパク質の組み合わせをコードしている、最も好適には少なくとも一つのORF-2アミノ酸配列をコードしている核酸配列によりコードされているタンパク質の組換えDNA合成のための方法は以下の工程から成っている:
(a)タンパク質が産生される条件下、タンパク質を産生するために宿主生物体を指示できる核酸配列を含んでいる形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主を培養する、ここで該タンパク質はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3またはそれらの組み合わせに従ったアミノ酸配列を持っているHEVから単離された天然のHEVタンパク質と実質的な相同性を示している(二つのタンパク質間の比較領域にわたって)。
一つの実施態様において、HEV株SAR-55のウイルスゲノムのRNA配列は以下のように単離され、cDNAへクローン化された。ウイルスRNAはSAR-55で感染されたカニクイザルから集められた生物学的試料から抽出され、ウイルスRNAは次に逆転写され、ビルマからのHEV株のゲノム(Tam et al.(1991))またはSAR-55ゲノムのプラスまたはマイナス鎖に相補的であるプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。PCR断片はpBR322またはpGEM-32内へサブクローン化され、二本鎖PCR断片が配列決定された。
本発明での使用が企図されたベクターには、前記のような核酸配列が挿入できならびに任意の好適なまたは必要とされる作動要素を持ち、そのベクターは宿主生物体内へ続いて導入できおよびそのような宿主中で複製できる任意のベクターが含まれる。好適なベクターはその制限部位に関する情報がよく供給されており、および核酸配列の転写に好適なまたは必要とされる作動要素を含んでいるものである。
本明細書で議論されるように、”作動要素”はベクター核酸の適当な転写および続いての翻訳に必要なまたは好適な、少なくとも一つのプロモーター、少なくとも一つの終止コドンおよび他のDNA配列を含んでいる。特に、そのようなベクターは宿主生物体により認識される少なくとも一つの複製開始点、ならびに少なくとも一つの選択可能マーカー、および少なくとも一つの核酸配列の転写を開始できるプロモーター配列を含むように企図されている。
本発明のクローニングベクターの構築において、核酸配列の多数のコピーおよびその付随する作動要素が各々のベクター内へ挿入されるであろうことにさらに注意すべきである。そのような態様において、宿主生物体はベクター当たりより多い量の所望のHEVタンパク質を生成するであろう。ベクター内へ挿入されるであろうDNA配列(一つの配列または二つの異なった配列にせよ)の多コピーの数は、適した宿主微生物内へ導入され、複製されおよび転写されるべきそのサイズに従い、結果として生じるベクターの能力によってのみ制限されている。
別の実施態様において、HEVタンパク質のコード配列を含んでいる制限切断断片は原核生物または真核生物細胞中で機能する適した発現ベクター内へ挿入できる。適したとは、ベクターがHEVタンパク質、好適には少なくとも一つのORFタンパク質をコードしている完全核酸配列を運搬および発現できることを意味している。好適な発現ベクターは真核生物細胞で機能するものである。そのようなベクターには酵母での発現に有用なベクター(例えば、pPIC19ベクター−Invitrogen)、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス、好適にはバキュロウイルス導入ベクターが含まれるが、これらに制限されるわけではない。好適なベクターは完全ORF-2遺伝子を含んでいるp32-2、および完全ORF-3およびORF-2遺伝子を含んでいるp59-4である。これらのベクターは1992年9月10日にAmerican Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 USAに寄託されており、受入れ番号75299(p63-2)および75300(p59-4)を持っている。より好適なベクターはORF-2のアミノ酸112-660をコードしているbHEV ORF2 5’tr、ORF-2のアミノ酸112-607をコードしている5’-3’trおよびHEV ORF2のアミノ酸112-578をコードしているバキュロウイルスベクターである。実施例1はORF-2遺伝子をpBlueBac内へクローニングしたp63-2の作製を示している。この方法はHEV株SAR-55ゲノムの制限酵素NruIおよびBglIIによる切断、BlnIおよびBglII部位を含んでいるポリリンカーのベクター特異的NheI部位内への挿入、アダプターを使用したNruI-BglII ORF-2断片のBlnI-BglII pBlueBacへの挿入を含んでいる。
さらに別の実施態様において、組換えタンパク質を発現させる目的のため、選択された組換え発現ベクターは続いて適した真核生物細胞系内へトランスフェクトされる。そのような真核生物細胞系には酵母、およびヒーラー、MRC-5、CV-1、HuH7またはHepG2のような細胞株が含まれるが、これらに制限されるわけではない。一つの好適な真核生物細胞系はSf9昆虫細胞である。一つの好適な方法には、昆虫細胞株Sf-9の場合のバキュロウイルス発現ベクターの使用が含まれている。
発現された組換えタンパク質は、実施例2に示されているようなクーマシーブルー染色および抗HEV抗体を含んでいる血清を使用するウェスタンブロッティングを含む本分野で既知の方法により検出される。他の方法は実施例3に示したような免疫電子顕微鏡法によるウイルス様粒子の検出である。
別の実施態様において、SF9細胞により発現された組換えタンパク質は粗溶解物として得ることができ、それは分別沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーなどを含む本分野で既知の標準タンパク質精製法により精製できる。免疫アフィニティークロマトグラフィーの場合、組換え体タンパク質は、ORFタンパク質に特異的な抗体が結合されている樹脂を含むカラムを通すことにより精製される。清澄化したバキュロウイルス感染細胞溶解物および培地上清からの組換え的に発現されたHEV ORF2タンパク質精製のプロトコール例は実施例16に記載されている。
別の態様において、本発明の発現された組換えタンパク質は、ヒト、チンパンジー、旧世界ザル、新世界ザル、他の霊長類などを含む哺乳類(これらに制限されるわけではない)においてのE型肝炎を診断または予測するためのイムノアッセイに使用できる。好適な態様において、イムノアッセイはヒトにおけるE型肝炎感染の診断に有用である。HEVタンパク質、特にORFタンパク質、およびより特別にはORF2タンパク質を使用するイムノアッセイは、部分ORFタンパク質を利用するイムノアッセイに比べて非常に特異的、高感度および再現可能なHEV感染の診断法を提供する。
本発明のイムノアッセイとはラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイなどであろう。ELISAに関して本分野で知られている標準技術はMethods in Immunodiagnosis、第2版、RoseおよびBigazzi編、John Wiley and Sons、1980およびCampbell et al.,Methods of Immunology,W.A.Benjamin,Inc.,1964(両方とも本明細書において援用される)に記載されている。そのようなアッセイは本分野で説明されているように直接、間接、競合的または非競合的イムノアッセイであろう。(Oellerich,M.1984.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895-904)。そのような検出アッセイに適した生物学的試料には組織生検試料抽出物、全血、血漿、血清、脳脊髄液、胸膜液、尿などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
一つの態様において、抗原としての表面結合組換えHEVタンパク質、好適にはORFタンパク質またはORF-2およびORF-3、ORF-1およびORF-3などのような異なったORFタンパク質との組み合わせ、を持つ固相試薬と試験血清を反応させる。最も好適には、HEVタンパク質は本質的にHEV ORF2のアミノ酸112-607から成るタンパク質である。固体表面試薬は固体支持物質にタンパク質を結合するための既知の技術により製造できる。これらの結合法には支持体へのタンパク質の非特異的吸着または支持体上の反応性基へのタンパク質の共有結合的結合が含まれる。抗原と抗HEV抗体との反応後、非結合血清成分は洗浄により除去され、抗原抗体複合体は標識ヒト抗体のような第二抗体と反応させる。標識は、適当な蛍光分析用または比色用試薬存在下で固体支持体をインキュベートすることにより検出される酵素であってもよい。放射性標識またはコロイド金などのような他の検出可能標識を使用してもよい。
好適な態様において、HEV ORF2のアミノ酸112-607をコードするSAR-55のORF-2配列を含んでいる組換えバキュロウイルスベクターにより発現されたタンパク質は、抗HEV抗体、好適にはIgGまたはIgM抗体を検出するための特異的結合剤として使用される。実施例10は固相試薬が表面抗原としてアミノ酸112-607から成る組換え55キロダルトンタンパク質を持つELISAの結果を示している。このタンパク質はHEVの異なった型の株に応答して生成される抗体を検出できるが、A、B、CまたはD型肝炎に応答して生成される抗体は検出しない。
HEVタンパク質および類似体はイムノアッセイで使用するため、キット、単独でまたは第二抗体のような他の試薬との組み合わせの形で製造される。
組換えHEVタンパク質、好適にはORFタンパク質またはORFタンパク質類の組み合わせ、より好適にはORF-2タンパク質および実質的に相同的なタンパク質および本発明の類似体はE型肝炎の攻撃に対して哺乳類を保護するためのワクチンとして使用できる。免疫原として働くワクチンは細胞、組換え発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物または発現されたタンパク質を含んでいる培養上清であろう。もしくは、免疫原は部分的または実質的に精製された組換えタンパク質である。免疫原は純粋なまたは実質的に純粋な形で投与することは可能であるが、現在の所、医薬組成物、処方または製剤としてが好適である。
本発明の製剤は(獣医学的またはヒトへの両方とも)、前記のような免疫原と一緒に一つまたはそれ以上の医薬として受容可能な担体および随意に他の治療成分から成っている。担体は処方の他の成分と両立できるおよび受容者に有害ではないという意味において”受容可能”でなければならない。製剤は都合よくは単一剤形で提供され、医薬分野ではよく知られた方法により製造されるであろう。
すべての方法は活性成分を一つまたはそれ以上の補助的な成分から成る担体と会合させる工程を含んでいる。一般に、製剤は活性成分と液体担体または細かく粉砕した固体担体と均一におよび密接に会合させることにより調製され、必要に応じ、続いて所望の製剤へ生成物を成形する。
静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与に適した製剤は、好適には受容個体の血液と等張である溶液による活性成分の滅菌水溶液から成っている。そのような製剤は固体活性成分を、塩化ナトリウム(例えば、0.1-2.0M)、グリシンなどのような生理的に調和する物質を含み、生理的条件と一致するように緩衝化されたpHを持っている水に溶解して水性溶液を作製し、該溶液を滅菌することにより都合よく調製される。これらは単一または多服用量容器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアルで提供されるであろう。
本発明の製剤は安定化剤を合体させてもよい。安定化剤の例はポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸および有機酸であり、それらは単独でまたは混合して使用されるであろう。これらの安定化剤は好適には免疫原の重量1部当たり0.11-10,000部の量で合体させる。もし二つまたはそれ以上の安定化剤が使用されるべき場合は、それらの総計は好適には上に特定した範囲内である。これらの安定化剤は水溶液中で適当な濃度およびpHで使用される。そのような水溶液の特異的浸透圧は一般的に0.1-3.0オスモルの範囲、好適には0.8-1.2の範囲である。水溶液のpHは5.0-9.0の範囲、好適には6-8の範囲内に調節されている。本発明の免疫原の処方において、抗吸着剤を使用してもよい。
作用の持続を調節するために別の薬学的方法を用いてもよい。調節放出製剤はタンパク質またはそれらの誘導体を複合または吸着させるポリマーの使用により達成される。調節送達は適した巨大分子(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはプロタミン硫酸)および巨大分子の濃度ならびに調節放出させるための取り込みの方法を選択することにより果たされるであろう。調節放出製剤による作用の持続を調節するための別の可能な方法はポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビニル酢酸コポリマーの粒子内へタンパク質、タンパク質類似体またはそれらの機能性誘導体を取り込ませることである。もしくは、ポリマー粒子内へのこれらの取り込みの代わりに、これらの物質を、例えば、コアセルベーション技術によりまたは界面重合により(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル)調製されたマイクロカプセル内へ、またはコロイド状薬剤送達系、例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセルへ、またはマクロエマルジョンへ捕捉することが可能である。
経口製剤が望まれる場合、ラクトース、スクロース、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶性セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビアゴムのような典型的担体と合併させる。
本発明のタンパク質はキットの形で、単独でまたは前記のような医薬組成物の形で供給される。
ワクチン接種は常法により実施できる。例えば、免疫原は食塩水または水のような適した希釈剤で、または完全または不完全アジュバントで使用できる。さらに、免疫原はタンパク質を免疫原性にするために担体に結合させてもさせなくてもよい。そのような担体分子の例には、ウシ血清アルブミン(BSA)、スカシガイのヘモシアニン(KLH)、破傷風毒素などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。免疫原は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下などのような抗体産生に適した経路により投与できる。免疫原は一度にまたは著しい力価の抗HEV抗体が産生されるまで定期的な間隔で投与される。抗体はイムノアッセイを用いて血清中に検出されるであろう。
さらに別の態様において、免疫原はHEV ORFタンパク質の宿主生物体合成を指示できる核酸配列である。そのような核酸配列は当業者には既知の方法により適した発現ベクター内へ挿入される。インビボでの高効率遺伝子導入に適した発現ベクターにはレトロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスベクターが含まれるが、それらに制限されるわけではない。それらの発現ベクターの作動要素は本明細書ですでに説明されており、当業者には既知である。そのような発現ベクターは静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口で投与できる。
別の態様において、直接遺伝子導入が、例えば、HEV ORFタンパク質の宿主生物体合成を指示できる核酸配列を含むプラスミドに基づいた真核生物発現ベクターの筋肉内注射により達成される。そのような方法はインビボでのB型肝炎表面抗原の産生に以前に利用されており、表面抗原に応答した抗体が生じている(Davis,H.L.et al.(1993)Human Molecular Genetics,2:1847-1851;またDavis et al.(1993)Human Gene Therapy,4:151-159および733-740)およびDavis,H.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:7213-7218もまた参照されたい)。
免疫原が部分的または実質的に精製された組換えHEV ORFタンパク質である場合、HEVに対して保護的抗体応答を惹起するのに有効な用量は約0.1μgから約100μgの範囲である。より好適な範囲は約0.5μgから約70μgであり、最も好適には約10μgから約50μgである。
HEVに対して保護的抗体応答を惹起するのに有効なHEV−ORFタンパク質−コード核酸配列の用量は約1から約5000μgの範囲であり;より好適な範囲は約300から約2000μgである。
HEV ORFタンパク質の宿主生物体合成を指示できる核酸配列を含む発現ベクターはキットの形で、単独でまたは前記のような医薬組成物の形で供給される。
本発明の免疫原の投与は予防的かまたは治療的目的であろう。予防的に提供される場合、免疫原はHEVへの暴露に先立って、またはHEV感染による徴候に先立って提供される。免疫原の予防的投与は、哺乳類におけるその後のHEV感染を防止または軽減するために働く。治療的に提供された場合、免疫原は感染の発見時(または短時間後)またはHEVによって起こされる感染または疾患の徴候の発現時に提供される。免疫原の治療的投与は感染または疾患の軽減に働く。
好適な態様はHEV株SAR-55のORF-2配列により発現される組換えORF-2タンパク質およびその等価物を用いて製造されたワクチンである。組換えORF-2タンパク質は異種または同種HEV株による攻撃に対する保護を提供することが示されており、種々のHEV株に対する保護におけるそれらの有用性が示される。
ワクチンとしての使用に加えて、組成物はHEVウイルス様粒子に対する抗体を製造するために使用できる。抗体は抗ウイルス剤として直接的に使用できる。抗体を製造するため、宿主動物はワクチンにおいて説明したように担体に結合されたウイルス粒子または、適切な場合、ウイルス粒子固有の非粒子抗原を使用して免疫された。宿主血清または血漿が適当な時間間隔後に集められウイルス粒子に反応性を持つ抗体を含む組成物が得られる。ガンマグロブリン分画またはIgG抗体が、例えば、飽和硫酸アンモニウムまたはDEAEセファデックス、または当業者には既知の他の技術を使用して得ることができる。抗体は、薬剤のような他の抗ウイルス剤に付随するであろう多くの不利な副作用を実質的に持っていない。
抗体組成物は不利な免疫系応答の可能性を最小にすることにより宿主系により合致するように作製できる。このことは異なる種のFc部分のすべてまたは一部を除去することにより、または宿主動物と同一の種の抗体を使用することにより(例えば、ヒト/ヒトハイブリドーマからの抗体の使用)達成することができる。ヒト化抗体(即ち、ヒトにおいて非免疫原性)が、例えば、抗体の免疫原性部分を対応する非免疫原性部分(即ち、キメラ抗体)に置き換えることにより製造されるであろう。そのようなキメラ抗体は一つの種からの反応性または抗原結合部分および異なった種からの抗体のFc部分(非免疫原性)を含んでいるであろう。キメラ抗体の例には、非ヒト哺乳類−ヒトキメラ、齧歯類−ヒトキメラ、マウス−ヒトおよびラット−ヒトキメラ(Robinson et al.,国際特許出願184,187;Taniguchi M.,欧州特許出願171,496;Morrison et al.,欧州特許出願173,494;Neuberger et al.,PCT出願WO86/01533;Cabilly et al.,1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439;Nishimura et al.,1987 Canc.Res.47:999;Wood et al.,1985 Nature 314:446;Shaw et al.,1988 J.Natl.Cancer Inst.80:15553、すべて本明細書において援用される)が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
”ヒト化”キメラ抗体の一般的総説はMorrison S.,1985 Science 229:1202およびOi et al.,1986 BioTechniques 4:214に記載されている。
適した”ヒト化”抗体はもしくはCDRまたはCEA置換によっても製造できる(Jones et al.,1986 Nature 321:552;Verhoeyan et al.,1988 Science 239:1534;Biedleret et al.,1988 J.Immunol.141:4053、すべて本明細書において援用される)。
抗体または抗原結合断片はまた遺伝子工学によっても製造される。大腸菌における重鎖および軽鎖遺伝子発現のために技術がPCT特許出願;公開番号WO901443、WO901443およびWO9014424およびHuse et al.,1989 Science 246:1275-1281の主題である。
抗体はまた免疫応答を促進する手段としても使用できる。本抗体は他の抗体の治療的投与で使用された量と同様の量で投与できる。例えば、プールしたガンマグロブリンは、細胞内へのウイルス侵入を妨害するために、狂犬病、麻疹およびB型肝炎のような他のウイルス疾患の初期潜伏期の間に0.02-0.1ml/lb体重で投与される。従って、HEVウイルス粒子に反応性の抗体は単独でまたは抗ウイルス剤の有効性を促進させるためにHEVに感染した宿主に別の抗ウイルス剤と併せて受身的に投与できる。
もしくは、抗HEV抗体は免疫原として抗イディオタイプ抗体を投与することにより誘導できる。都合よく、前記のように製造された精製抗HEV抗体調製試料が宿主動物において抗イディオタイプ抗体を誘導するために使用される。組成物は適した希釈で宿主動物に投与される。投与後(通常は反復投与)、宿主は抗イディオタイプ抗体を産生する。Fc領域への免疫原性応答を除くため、宿主動物と同一の種により産生された抗体が使用でき、または投与される抗体のFc領域を除くことができる。宿主動物で抗イディオタイプ抗体の誘導後、抗体組成物を得るために血清または血漿を集める。組成物は抗HEV抗体のために前に説明したように、またはアフィニティーマトリックスへ結合された抗HEVを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。産生された抗イディオタイプ抗体は基準HEV抗原と同様のコンホメーションであり、HEV粒子抗原を使用するよりもむしろこの抗体がHEVワクチンの製造に使用されるであろう。
動物において抗ウイルス抗体を誘導する手段として使用される場合、抗体を投与する様式はワクチン接種と同一である(即ち、アジュバントとまたは無しで、生理学的に適した希釈剤中の有効な濃度で筋肉内、腹腔内、皮下などに)。1回またはそれ以上のブースター注射が望ましいであろう。
本発明のHEV由来タンパク質はまた、前または後暴露予防と称される抗血清の産生での使用も意図されている。ここでHEVタンパク質またはタンパク質の混合物は適したアジュバントに処方され、ヒト抗血清を産生するための既知の方法に従ってヒトボランティアへ注射により投与された。注射されたタンパク質に応答した抗体は、免疫化後数週間の間、本明細書に記載したイムノアッセイを使用し、抗HEV血清抗体の存在を検出するために定期的に血清を採ることによりモニターされた。
免疫化個体からの血清は、前暴露予防手段として感染の危険性がある個体に投与されるであろう。抗血清はまた、後暴露予防のためのB型肝炎ウイルスに対する高力価抗血清の使用と同じように、個体の後暴露の処置にも有用である。もちろん、当業者は標準技術を用いて免疫化した個体の抗血清から精製された免疫グロブリン(HEV免疫グロブリン)は前暴露予防手段としてまたは個体の後暴露の処置に使用されることを容易に理解するであろう。
HEVウイルス様粒子およびタンパク質および抗イディオタイプ抗体に対する抗体のインビボ使用および診断的使用の両方に対し、モノクローナル抗体を使用するのが好適である。モノクローナル抗ウイルス粒子抗体または抗イディオタイプ抗体は以下のように製造できる。免疫化動物から脾細胞またはリンパ球を取り出し、当業者には既知の方法により不死化するかまたはハイブリドーマを作るために使用する(Goding,J.W.1983 Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Pladermic Press,Inc.,NY,NY,pp.56-97)。ヒト−ヒトハイブリドーマを製造するためにヒトリンパ球ドナーが選択される。HEVで感染していることが知られているドナー(感染は例えば、血液中の抗ウイルス抗体の存在またはウイルス培養により示されている)は適したリンパ球ドナーとして役に立つであろう。リンパ球は末梢血試料から単離できるか、またはもしドナーが脾摘されたなら脾臓細胞が使用されるであろう。エプスタイン−バールウイルス(EBV)がヒトリンパ球を不死化するのに使用でき、またはヒト融合パートナーがヒト−ヒトハイブリドーマを製造するために使用できる。ペプチドによる一次インビトロ免疫化もまたヒトモノクローナル抗体の発生に使用できる。
不死化細胞により分泌された抗体は所望の特異性の抗体を分泌しているクローンを決定するためにスクリーニングされる。モノクローナル抗ウイルス粒子抗体については、抗体はHEVウイルス粒子へ結合しなければならない。モノクローナル抗イディオタイプ抗体については、抗体は抗ウイルス粒子抗体へ結合しなければならない。所望の特異性の抗体を産生している細胞が選択される。
別の態様において、モノクローナル抗体は、問題とする抗原で免疫されたヒトまたはチンパンジーからのB細胞のV遺伝子をコードしているメッセンジャーRNAを採取することにより誘導される。免疫グロビンの重鎖および軽鎖をコードしているメッセンジャーRNAは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、無作為に合体され、表示のために線状ファージ内へクローン化する。ファージは次に、固相に結合されている選択された抗原上の”パニング”により問題とする抗体を運んでいることで選択される。抗原に相同的な抗体の結合部位を示している回収されたファージは増幅され、それらが運んでいる抗体遺伝子は完全抗体分子をコードするように組み立てられる。問題とする抗原に特異的なそのような抗体は大腸菌で発現され、精製され、前記のようにヒトモノクローナルに利用された。組み合わせ的ライブラリーからのヒトモノクローナル抗体の発生は、例えば、Hoogenboom,H.R.およびWinter,G.,(1992)Journal of Molecular Biology,227巻,381-388ページ、およびChanock,R.M,et al.,(1993)Infectious Agents and Disease,2巻,118-131ページに記載されている。
前記の抗体およびそれらの抗原結合断片はキットの形、単独で、またはインビボ使用のための医薬組成物として供給されるであろう。抗体は治療的使用に、イムノアッセイにおいての診断的使用に、または前記のようなORFタンパク質を精製するための免疫アフィニティー試薬として使用されるであろう。
材料
実施例で使用された材料は以下のものである:
霊長類。チンパンジー(Chimp)(パン トログロディテス)。旧世界ザル:カニクイザル(Cyno)(マカカ ファスシクラリス)、アカゲザル(Rhesus)(M.ムラッタ)、ベンパツザル(PT)(M.ネメストリーナ)およびアフリカミドリザル(AGM)(セルコピテカス エチオプス)。新世界ザル:クチヒゲタマリン(Tam)(サギナス ミスタックス)、リスザル(SQM)(サイミリ スシウレウス)およびフクロウザル(OWL)(オータス トリビガタス)。霊長類は単にバイオハザード封じ込め条件下で飼われた。動物のケージ、維持および世話は霊長類学のすべての要求にあうまたは超えるものである。
ほとんどの動物は、Tsarev,S.A.et al.,(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563;およびTsarev,S.A.et al.,(1993),J.Infect.Dis.167:1302-1306に記載されているようにウシ胎児血清で希釈した0.5mlの糞懸濁液に含まているHEV、株SAR-55が静脈内へ接種された。Chimp-1313および1310は7人のパキスタンE型肝炎患者から集められた糞のプールが接種された。
血清試料は接種前および後に約1週間に2度集められた。肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、イソクエン酸脱水素酵素(ICD)およびガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)の血清レベルは市販品として入手可能な試験によりアッセイされた(Medpath Inc.,Rockville,MD)。血清学的試験は前記のように実施された。
実施例1
HEV株SAR-55のゲノムのDNA配列の同定
PCRのためのウィルスRNAテンプレートの調製。HEVに感染したカニクイザルの胆汁(10μl)、20%(wt/vol)SDS(最終濃度1%に)、プロテイナーゼK(10mg/ml、最終濃度1mg/mlに)、1μlのtRNA(10mg/ml)、および3μlの0.5M EDTAを混合して最終容量を250μlとし、55℃で30分間インキュベートした。総核酸の胆汁からの抽出を、フェノール/クロロホルム(1:1(vol/vol))を使用して65℃で2回、そしてクロロホルムで1回行った後、エタノールで沈殿させ、95%エタノールで洗浄し、RT-PCRに使用した。糞便および特に血清由来のHEV RNAのRT-PCR増幅は、RNAがより広範に精製される場合に、より効果的であった。血清(100μl)または10%糞便懸濁液(200μl)を上記のようにプロテイナーゼKで処理した。30分間のインキュベートの後、300μlのCHAOS緩衝液(4.2Mグアニジンチオシアネート/0.5N-ラウロイルサルコシン/0.025Mトリス-HCl、pH8.0)を添加した。核酸を、フェノール/クロロホルムを使用して65℃で2回抽出し、次いでクロロホルムを使用して室温で抽出した。その後、7.5M酢酸アンモニウム(225μl)を上層に添加し、核酸を0.68mlの2-プロパノールで沈殿させた。ペレットを300μlのCHAOS緩衝液に溶解し、100μlのH2Oを添加した。クロロホルム抽出および2-プロパノール沈殿を繰り返した。核酸を水に溶解し、エタノールで沈殿させ、95%エタノールで洗浄してRT-PCRに使用した。
プライマー。21〜40ヌクレオチド(nt)長で、Burma(BUR-121)由来のHEV株のゲノム(Tam,A.W.ら(1991),Virology,185:120-131)またはSAR-55ゲノムのプラスまたはマイナス鎖に相補的な94個のプライマーを、Applied Biosystemsモデル391DNA合成装置を使用して合成した。
これら94個のプライマーの配列のSEQ.ID NO.5からSEQ.ID NO.98までを以下に示す:
HEVプライマーのリスト
配列の左側の略号は以下を表す:RおよびDは、それぞれ逆向きおよび順向きプライマーを表す;BおよびSは、それぞれE型肝炎のBurma-121株およびE型肝炎のSAR-55株由来の配列を表す;5’NCおよび3’NCは、それぞれHEVゲノムの5’および3’非コード領域を表す;そして、1、2、または3は、それぞれオープンリーディングフレーム1、2、または3由来の配列を表す。いくつかの配列の右側に示す()記号は、それらの配列への合成の制限部位の挿入を表す。
PCRフラグメントのクローニングのために、3〜7ntが前に配置したEcoRI、BamHI、またはBglII制限部位をプライマーの5’末端に付加した。
RT-PCR。通常の100μlのRT-PCR混合液には、テンプレート、10mMトリス-HCl(pH8.4)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、4種全てのdNTP(それぞれ0.2mM)、50pmolの順向きプライマー、50pmolの逆向きプライマー、40ユニットのRNAsin(Promega)、16ユニットの鳥類の骨髄芽球症ウィルスの逆転写酵素(Promega)、4ユニットのAmpliTaq(Cetus)、100μl未満の軽鉱油を含有させた。混合液を42℃で1時間インキュベートした後、35サイクルのPCRで増幅した;94℃で1分間、45℃で1分間、そして72℃で1分間。PCR産物を1%アガロースゲルで分析した。
PCRフラグメントのクローニング。末端に制限部位を有するPCRフラグメントをEcoRIおよびBamHIまたはEcoRIおよびBglII制限酵素で消化し、EcoRI/BamHIで消化したpBR322またはpGEM-3Z(Promega)にクローニングした。あるいはまた、PCRフラグメントをTAクローニングキット(Invitrogen)を使用してPCR1000(Invitrogen)にクローニングした。
PCRフラグメントおよびプラスミドのシーケンシング。PCRフラグメントを1%アガロースゲルから切り出し、ジーンクリーン(Geneclean,Bio 101,La Jolla,CA)で精製した。二本鎖PCRフラグメントを、シーケナーゼ(Sequenase,United States Biochemical)を使用してWinship,P.R.(1984),Nucleic Acids Rev.17:1266に記載されるようにシーケンスした。CsCl勾配で精製した二本鎖プラスミドをシーケナーゼキット(United States Biochemical)でシーケンスした。
配列のコンピューター分析。HEV株のヌクレオチド配列をGenetics Computer Group(Madison,WI)のソフトウェア・パッケージを使用して比較した(Devereaux,J.ら(1984),Nucleic Acids Rev.,12:387-395,VAX8650コンピューターのバージョン7.5(国立癌研究所(National Cancer Institute),Frederick,MD))。
実施例2
組換え発現ベクター、P63-2の構築
HEV株SAR-55のゲノムの完全なORF-2を含有するプラスミド(Tsarev,S.A.ら(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563)を使用して制限フラグメントNruI-BglIIを得た。NruIにより、HEVのcDNAのORF-2のATG開始コドンの5ヌクレオチド上流を切断した。合成BglII部位をHEVゲノムの3’末端のポリA配列の直前に前もって配しておいた(Tsarev,S.A.ら(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563)。このフラグメントをpBlueBacトランスファーベクター(Invitrogen)に挿入するために、合成ポリリンカーをベクターの独自のNheI部位に導入した。このポリリンカーはBlnIおよびBglII部位を含有したが、これらはHEVのcDNAおよびpBlueBac配列のいずれにも存在しない。NruI-BglII ORF-2フラグメントを、図−1に示すようなアダプターを使用してBlnI-BglII pBlueBacに挿入した。
実施例3
SF9昆虫細胞におけるP63-2の発現
P63-2およびAcMNPVバキュロウィルスDNA(Invitrogen)を、Invitrogenのプロトコールに従ってCa沈殿法でSF9細胞(Invitrogen)に共トランスフェクトした。このプロトコールに従うことにより;AcMNPVバキュロウィルスDNAから生存する無傷のバキュロウィルスが生成され、これにP63-2を入れて組換えバキュロウィルスを生成できる。この組換えバキュロウィルスについてプラーク精製を4回行った。得られた組換えバキュロウィルス63-2-IV-2を使用してSF9細胞を感染させた。
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット。昆虫細胞を泳動緩衝液(50mMトリス-HCl、pH6.8、100mM DTT、2% SDS、0.1% ブロムフェノールブルー、および10%グリセロール)に再懸濁し、Laemmli,U.K.(1970),Nature,227:680に記載されるようにSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。ゲルをクマシーブルーで染色するか、またはタンパク質をBA−85ニトロセルロースフィルター(Schleicher&Schuell)上に電気ブロットした。転写後、ニトロセルロース膜を、10%ウシ胎児血清および0.5%ゼラチンを含有するPBSでブロッキングした。一次抗体として、チンパンジー-1313の高度免疫血清を1:1000に希釈したものを使用した。二次抗体として、ホスファターゼでラベルし、アフィニティー精製したヤギ抗ヒトIgG抗体(Kirkegaard&Perry Laboratories社)を1:2000に希釈したものを使用した。アルカリホスファターゼのためのウェスタンブルーで安定化した基質(Promega)中でフィルターを展開した。全てのインキュベーションはブロッキング溶液中で行い、洗浄は0.05%Tween-20(Sigma)を含有したPBSで行った。
HEV ORF-2の発現。組換えバキュロウィルス63-2-IV-2に感染させたSF9細胞で合成された主要なタンパク質は、見かけの分子量が74KDのタンパク質であった(図−2A、3列目)。このサイズは完全なORF-2(71KD)に予想されたものよりやや大きい。サイズの差異はタンパク質のグリコシル化によるものと考えられ、これはグリコシル化しうる部位(Asn-Leu-Ser)がN-末端部分に少なくとも1個存在するためである。このタンパク質は、非感染細胞(図−2A、1列目)、または野生型非組換えバキュロウィルスに感染した細胞(図−2A、2列目)では検出されなかった。後者の場合、検出された主要なタンパク質は多面体タンパク質であった。同じ溶解産物をチンパンジー-1313の血清(HEVでの高度免疫された)を使用してウェスタンブロットで分析した場合(図−2B)、組換え細胞溶解産物のタンパク質のみが反応し(3列目)、主要なバンドはこの場合も74KDのタンパク質として表現された(図−2B)。クマシー染色したゲルに現れた約25、29、35、40〜45、および55〜70kDaのマイナーなバンド(図−2A、3列目)もウェスタンブロットで血清と反応した(図−2B、3列目)。74KDより大きい分子量のバンドの中には、異なる程度のグリコシル化によって生じるものがあり、一方、より低い分子量のバンドはプロセシングおよび/または分解を表す。HEVの接種の前にチンパンジー-1313から得た血清は、ウェスタンブロットでいずれのタンパク質とも反応しなかった。
実施例4
組換え感染SF9細胞の免疫電子顕微鏡
5x106の組換え感染SF9細胞を、10mMトリス-HCl、pH7.4、0.3%サルコシルを含有するCsCl(1.30g/ml)中で音波処理し、40,000rpmで68時間遠心分離した(SW60Ti)。ELISAの反応性が最も高く、浮遊密度が1.30g/mlであった画分50μlを1mlのPBSで希釈し、5μlのチンパンジー-1313高度免疫血清を添加した。高度免疫血清は、前もってE型肝炎の第二の株(メキシカンHEV)に感染させておいたチンパンジーを再刺激して調製した。サンプルを室温で1時間インキュベートした後4℃で一晩放置した。免疫複合体を、SW60Tiローターを使用して30,000rpm、4℃で2時間沈殿させた。ペレットを蒸留水に再懸濁し、3%PTAでネガティブ染色し、カーボングリッドに配置して、電子顕微鏡EM-10(Carl Zeiss、Oberkochen、ドイツ)で、40,000倍の倍率で観察した。
VLPの検出。野生型または組換えバキュロウィルス63-2-IV-2に感染した昆虫細胞からの細胞溶解物をCsCl密度遠心で分画した。組換え感染昆虫細胞からのCsCl勾配の画分をチンパンジー-1313高度免疫血清と共にインキュベートし、抗体で覆われた2種類のウィルス様粒子(VLP)が、浮遊密度1.30g/mlの画分に観察された:第一(図−3A)、HEVを思わせるサイズ(30nm)および形態学的構造を有する、抗体で被覆された個々の粒子、第二(図−3B)、HEVより小型(約20nm)であるが他はHEVに類似している粒子の、抗体に被覆された集合体。直接EMは、種々の異種の個体群の存在を示し、それらには、それぞれ直径30および20nmで、ウィルス粒子のように見えるが、結合する抗体が存在せず、HEVと確認されないものがあった。多くのIEM試験は、HEVゲノムのORF-2領域から合成されたタンパク質の少なくともいくつかは粒子構造を成すことを示唆していた。感染後期の昆虫細胞では、より小型のタンパク質の割合がより高い場合、それに一致してELISAでの結果がより良好になった。従って、感染後期の組換え昆虫細胞の分画していない溶解産物を、後続の試験においてELISAの抗原として使用した。
実施例5
抗HEVの完全なORF-2を発現した後HEVの異なる株で感染させる、昆虫細胞由来の抗原を使用するELISAによる検出
63-2-IV-2ウィルスに感染したSF9細胞5x106を1mlの10mMトリス-HCl、pH7.5、0.15MNaClに再懸濁し、次いで凍結および解凍を3回行った。10μlのこの懸濁液を10mlの炭酸緩衝液(pH9.6)に溶解し、フレキシブルマイクロリットルアッセイプレート(Falcon)の被覆に使用した。血清サンプルを1:20、1:400、および1:8000、または、1:100、1:1000、および1:1000に希釈した。ウェスタンブロットについて記載したのと同様のブロッキングおよび洗浄溶液をELISAに使用した。二次抗体として、ヒトIgGに対するペルオキシダーゼ結合ヤギIgG画分、またはホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗旧世界ザルもしくは抗新世界ザル免疫グロブリンを使用した。結果は405nmで光学密度(O.D.)を測定して得た。
HEVのパキスタン株を表現する昆虫細胞由来の抗原でHEVのメキシコ株に感染したカニクイザルにおいて抗HEV抗体を検出できるかどうかを確認するために、3検体のサルを試験した(図−4)。2検体のサル、カニクイ-80A82およびカニクイ-9A97はメキシコ’86HEV株を含有する糞便で感染させ(Ticehurst,J.ら(1992),J.Infect.Dis.,165:835-845)、第三のサル、カニクイ-83は同じ株の第二継代で感染させた。コントロールとして、カニクイ-374由来の血清サンプルをパキスタンHEV株SAR-55で感染させ、同様の試験を行った。メキシコ株で感染させた3検体のサルは全て、抗HEVに血清変換した。第一継代由来の動物は15週目までに血清変換し、第二継代のものは5週目までに変換した。興味深いことに、4検体の動物のうちで抗HEV力価の最も高かったのは、メキシコ株の第二継代を接種したカニクイ-83であった。メキシコ株の第一継代を接種したカニクイザルは力価が最も低く、パキスタン株の第一継代を接種したものは中間の力価であった。
実施例6
完全なORF-2を発現する昆虫細胞由来の抗原を使用する抗HEV ELISAの特異性
ここに記載するELISAが、他の型の肝炎に関連する抗体を除外して抗HEVを特異的に検出するかどうかを評価するために、チンパンジーの血清サンプルを、他の既知の肝炎ウィルスに感染させた4組で分析した(Garci,P.ら(1992),J.Infect.Dis.,165:1006-1011;Farci,P.ら(1992),Science(出版中);Ponzetto,A.ら(1987),J.Infect.Dis.,155:72-77;Rizzetto,m.ら(1981)Hepatology 1:567-574;チンパンジー-1413、1373、1442、1551(HAV)のための参考文献;そしてチンパンジー-982、1442、1420、1410(HBV)にはPurcellらの未公表データを参考とした)(表−1)。接種前のサンプル、および接種後5週目と15週目の血清を、1:100、1:1000、および1:10000に希釈した血清でHEV ELISA分析した。HAV、HBV、HCV、およびHDVに感染させた動物由来の血清はいずれもHEV抗体のELISAで反応しなかったが、HEVを接種した4検体のチンパンジーはいずれも、抗HEVのIgMおよびIgGクラスを生成した。
実施例7
非ヒト霊長類におけるHEVのSAR-55株の宿主域の決定
種々の霊長類にHEVの標準的な糞便懸濁液を静脈内接種し、一連の血清サンプルを採取して感染をモニタリングした。肝炎を示すものとして血清ALT濃度を測定し、抗HEVの上昇をもって血清変換とみなした。結果を、カニクイザルおよびチンパンジーで得られたものと比較した。
HEVに感染させたアカゲザルは共に(表−2)、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の非常に顕著なピークおよび強い抗HEV応答を示した。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性のピークはどちらの動物でも35日目に観察され、21日目に血清変換した。抗HEVの力価は29日目に最大に達した。この研究に使用したアフリカミドリザル(表−2)は共に、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性および抗HEVの上昇を示した。アフリカミドリザル230は接種後7週間で死亡したが、感染の確認はその前に行った。サル74のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性のピークは接種前の血清の平均値を約3倍上回っており、サル230では約5倍であった。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性および抗HEVのピークは、サル74および230においてそれぞれ28および21日目に同時に生じた。
ブタオザル99は、接種前の血清の平均値より>3SD高いアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の上昇を示し、ブタオザル98は示さなかった。しかしながら、どちらのサルも21日目に血清変換し、抗HEV力価はチンパンジーおよび旧世界ザルのものと同等であった。ブタオザルではアラニンアミノトランスフェラーゼ活性のピークが低かったため、HEVでの感染ではなく免疫化されている可能性を完全に無視することはできない。しかしながら、いくつかの理由により免疫化ではないと考えられる。第一に、2検体のシシザルは、ブタオザルのわずか1/4の大きさであるが同量の接種物を接種したが、いずれにも免疫化は観察されなかった。第二に、糞便中に排出されるHEVの量は通常、極少量であることが知られており、この研究で使用した糞便の10%懸濁液0.5mLは、特に静脈内接種の場合、動物を免疫するのに十分な量の抗原を含有するとは考えられない。
この研究で接種したシシザルは、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の顕著な上昇、または抗HEVの産生をいずれも起こさなかった(表−2)。従って、これらの動物は感染しなかったと考えられる。リスザルは抗HEVを産生したが、チンパンジーまたは旧世界ザルより有意に低いレベルであった(表−2)。更に、血清変換は他の動物より遅くに起こった。リスザル868は41日目に血清変換し、869は35日目であった。抗HEV力価はモニタリングの>3カ月の間のいずれの時点でも>1:20ではなく、どちらの動物でも、47〜54日目にピーク値に達した後、明らかに減衰した。しかしながら、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性はどちらの動物でもやや顕著であり、時間的に血清変換の時期と関係していた。
ヨザルは旧世界ザル種とほぼ同程度にHEV感染に応答した(表−2)。どちらのヨザルも21日目に血清変換し、28日目までに抗HEV力価は1:8000に達した。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性は、ヨザル924では35日目にピークとなったが、サル925では49日目までならなかった。
実施例8
チンパンジーにおけるIgMおよびIgG抗HEVの検出
どちらのチンパンジーでも、血清ALT濃度は接種後約4週間で上昇した(表−2、図−5)。どちらのチンパンジーもALT酵素の上昇時、またはそれより早期に血清変換した(図−5A、5C)。IgM抗HEVの濃度もチンパンジーについて測定した。チンパンジー-1374では、IgM抗HEVの力価(図−5B)はIgGの力価(図−5A)ほど高くなく、2週間にわたって減衰した。IgGおよびIgM抗体はいずれも、この動物では20日目に最初に検出されたが、IgM抗HEVの力価はその日が最も高く、一方IgGの力価はその日が最も低かったが、その後上昇して3カ月間以上にわたってほぼ同レベルを維持した。チンパンジー-1375では、IgM抗HEVのみが20日目に検出された(図−5D)。力価はチンパンジー-1374より高く、IgM抗HEVはモニタリングの全期間で検出された。IgG抗HEVは、この動物では27日目に最初に観察され(図−5C)、実験期間中、ほぼ同レベルを維持した。
実施例9
昆虫細胞で発現した完全なORF-2タンパク質を使用するELISAとE.coliで発現した構造タンパク質のフラグメントを使用するものとの比較
真核細胞におけるHEVゲノムの完全なORF-2領域の発現が、E.coliにおける構造タンパク質のフラグメントの発現より有利であるかどうかを評価するために、出願人は先の抗原をELISAに使用して、既に分析されているカニクイザルの血清(Tsarev,S.A.ら(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:559-563;およびTsarev,S.A.ら(1993),J.Infect.Dis.(167:1302-1306))を、細菌で発現した抗原フラグメントを使用して再試験した(表−3)。
ELISAで測定した6検体のサルのうち3検体で、昆虫細胞で発現した抗原はE.coliで発現した抗原より早期に血清変換を検出した。昆虫細胞由来の抗原を使用して、試験した中で最も高い希釈液(1:8000)で、全ての6検体のサル由来の血清中に抗HEV抗体を検出できた。E.coli細胞由来の抗原(Burma株)では抗HEV力価に関する情報は得られなかったが、これは全ての血清を1:100の希釈でしか試験しなかったからである(Tsarev,SAら(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA;89:559-563;Tsarevら(1993)J.Infect.Dis.(167:1302-1306))。
別の研究では、E型肝炎ウィルス、SAR-55株を1/10ずつ連続的に希釈し、10-1から10-5までの希釈液をいくつかのペアのカニクイザルに接種してto titer the virus。血清中のALT濃度を測定して肝炎を確認し、血清中のHEVに対する抗体を本発明のELISA法(図中のデータ)、またはGenelabのELISA(3つのELISA。それぞれ、Yarbroughら(J.Virol.(1991)65:5790-5797)に4-2、3-2、および612と示されている抗原の一つを使用)で測定した(図−6 a〜gの下部に陽性(+)または陰性(−)試験として示されているデータ)。全てのサンプルはunder codeで試験した。
本発明のELISA法は接種した全てのカニクイザル、およびウィルスの全ての希釈液でIgG抗HEVの血清変換を検出した。
これに対して、Genelabの結果は以下に概説するように、著しく変化していた。
カニクイ-385(10-5)はGenelabおよび本発明のいずれのELISAでも陽性だったので、10-4(10倍のウィルスを接種)および10-3(100倍のウィルスを接種)も陽性であると予測された。それらは本発明では陽性であったが、それに対してGenelabのELISA試験では、カニクイ-383および393のALT濃度が活性肝炎を示唆しているにも関わらず、10-3では2検体とも、10-4では1検体が陽性とならなかった。従って、データは本発明のELISA法がHEVに対する抗体を検出する従来の方法より有利であることを示している。
実施例10
HEVのパキスタンSAR-55株の完全なORF-2領域から発現した55kDaのタンパク質、または細菌内で融合タンパク質として発現したORF-2のより短い領域のいずれかからなる組換えORF-2抗原を使用するELISAの比較
実施例3の記載および図−2Aと2Bに示すように、種々の分子量の多くのタンパク質が、完全なORF-2を含有する組換えバキュロウィルスに感染した昆虫細胞で発現する。以下のように、接種後7日目に回収した5x108のSF-9細胞から約55kDaの分子量のタンパク質を部分的に精製した:感染細胞を遠心分離し、40μg/mlのフェニルメチルスルホニルフルオライド(Sigma,St.Louis,Missouri)を含有する10mlの10mM トリス-HCl(pH8.0)、50mM NaClに再懸濁し、音波処理をして細胞を破壊し、溶解産物を90,000xgで4℃で30分間遠心分離した。上清を10mMトリス-HCl(pH8.0)、50mM NaClで平衡化したDEAE-セファロースCL-6B(Pharmacia,Uppsala,Sweden)カラムで泳動した。カラムを泳動緩衝液で洗浄し、10mM トリス-HCl(pH8.0)、250mM NaClで55kDaのタンパク質を溶出した。55kDaのタンパク質を含有する画分を合一し、3gの(NH4)2SO4を10mlのタンパク質溶液に添加してタンパク質を沈殿させた。タンパク質ペレットを10mM トリス-HCl(pH8.0)、50mM NaClに溶解した。次いで55kDaのタンパク質を昆虫細胞で発現したHEV抗原としてELISAに使用して、細菌で発現した2つのHEV抗原(3-2(メキシコ)(Goldsmithら,(1992)Lancet,339:328-331)またはSG3(Burma)(“ウィルス性肝炎および肝臓疾患に関する国際シンポジウム。科学プログラムおよび要約の巻(International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease.Scientific program and abstract volume)”Tokyo:VHFL,p87,687巻のYarboughら,(1993)E型肝炎の診断試験のアッセイ開発(Assay development of diagnostics tests for hepatitis E)))のいずれか1つを使用したELISAに対する比較試験を行った。。これらの細菌抗原は、26kDaのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)と、ORF-2のC末端の6アミノ酸上流にある42個のアミノ酸の配列からなる抗原配列3-2(M)(Yarboughら,(1991)J.Virol.,65:5790-5797)、あるいはORF-2の327個のC末端アミノ酸(Yarboughら,(1993))のいずれかとの融合タンパク質であった。ELISAを以下のように実施した。
ウェル当たり60ngの55kDaのタンパク質またはウェル当たり200ngの融合抗原を炭酸緩衝液(pH9.6)に混合し、ポリスチレンマイクロタイターアッセイプレート(Dynateck,S.Windham,ME)のウェルに入れ、37℃で2時間インキュベートした。プレートを、10%ウシ胎児血清および0.5%ゼラチンを含有するPBSでブロッキングした。表−5および図−7A〜7Jと8A〜8Dに示すように、HEVのSAR-55株を含有する糞便の10-1から10-8の範囲の希釈液を静脈内接種(注:カニクイ-387および392は経口接種)したカニクイザル由来の血清サンプルを、ブロッキング溶液で1:100に希釈した。ペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ヒトIgM(Zymed,San Francisco,CA)を1:1000もしくは1:2000に希釈したもの、またはペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒト免疫グロブリンを1:1000に希釈したものを検出抗体として使用した。
2検体の経口接種したサル(カニクイ-387およびカニクイ-392)以外の全てのELISA試験で、55kDaおよび融合抗原を同一の実験室で同時に試験し、使用した抗原だけが異なるようにした。55kDa抗原を使用する抗HEV ELISAで陽性反応が起きたという基準は、光学密度が≧0.2であり、同一の動物の接種前の血清サンプルの2倍より大きいものとした。更に、細菌で発現した抗原はいずれもGSTとの融合タンパク質なので、これらの抗原で試験したサンプルの光学密度は、陽性と判断するには非融合GSTで得られる光学密度より3倍高くなければならない(Goldsmithら,(1992))。
結果
標準HEV糞便懸濁液の10-1希釈液を接種したカニクイザル(377、378)ではいずれも、接種後4〜5週間でALT活性が著しく上昇し、肝炎を示した(表−5、図−7Aおよび7B)。
試験した3抗原のいずれも、接種後3週間のカニクイ−377から採取したサンプル中にIgM抗HEVを検出した(表−5、図−8A)が、IgM抗HEVは第二の動物(カニクイ-378)由来のサンプルには検出されなかった。IgG抗HEVは55kDaを使用したELISAではどちらの動物にも検出されたが、融合抗原を使用したELISAではカニクイ-377にしか検出されなかった。IgG抗HEVのOD値はIgM抗HEVのものより有意に高かった。55kDaの抗原で得られたELISA値はまた、2つの融合抗原のいずれで得られたものより有意に高かった(図−7Aおよび7B)。ELISAにおいて2つのソース由来の抗原で観察されたOD値のパターンは著しく異なっていた。融合抗原を使用したELISAの場合、陽性シグナルは血清変換後すぐに最大に達し、その後、実験の15週間の間に減衰した。55kDa抗原を使用するELISAでは、陽性シグナルは血清変換後すぐに最大に達し、実験期間(15週間)を通じてほぼ同程度に高いレベルを維持した。
標準HEV糞便懸濁液の10-2希釈液を接種した両方のサル(394および395)におけるALT活性の上昇は、肝炎が予期された時点で、10倍高い投与量を接種した動物より有意に著しくなかった(表−5、図−7Cおよび7D)。カニクイ-395は実際に、接種前にも接種後15週間の時点と同様の高いALT活性を有した。後者はおそらくHEV感染に関係がないと考えられる。わずかに陽性のIgM抗HEVがカニクイ-394においてのみ(図−8B)、そして55kDaの抗原を使用したELISAでのみ検出された。しかしながら、どちらの動物でもIgG抗HEVの血清変換が検出されたため、両動物は感染していた。カニクイ-394では、抗HEV IgGは55kDa抗原では3週間目に最初に検出され、その1週間後に3-2(M)抗原で検出された。SG3(B)抗原はカニクイ-395において血清変換を検出せず、抗HEV IgGは55kDa抗原でのみ検出された。抗HEVは、この動物において時間と共に力価が減少する傾向があった。
カニクイ-380およびカニクイ-383に標準HEV糞便懸濁液の10-3希釈液を接種した(表−5、図−7E、7F、8C)。カニクイ-380のALT活性は接種の前後で変動した;従って、ALT濃度はこの動物においてE型肝炎の証明には使用できなかった。カニクイ-383では、ALT活性のわずかな上昇が観察されたが(図−7F)、これは血清変換と同時に起こり、従って軽度のE型肝炎によるものであるかもしれない。IgM抗HEVは3つの抗原のいずれでもカニクイ-380由来の血清中に検出されなかった。カニクイ-380は、SG3(B)を使用したELISAで試験した際にはIgG抗HEVについて血清変換が観察されたが、3-2(M)抗原を使用した場合はされなかった。この動物は、55kDa抗原で試験した際はIgG抗HEVが既に存在していたが、5週目からIgG抗HEVが非常に増加し始めた(図−7E)。既存の抗体の同定は、別のカニクイザル由来の血清で既に報告されている(Ticehurstら,(1992)J.Infect Dis.,165:835-845;Tsarevら,(1993)J.Infect Dis.,168:369-378)。血清変換は予期した時期に起きたが、カニクイ-383由来のサンプル中のIgG抗HEV濃度は低いままであり、55kDa抗原でしか検出できなかった。
カニクイ-389およびカニクイ-393に標準HEV糞便懸濁液の10-4希釈液を接種した(図−7G、7H、8D、表−5)。いずれの動物でもALT活性の有意な上昇は見られなかったが、5週目にカニクイ-393の血清に認められた小さいが明確なALTのピークのタイミングは肝炎の境界を示唆していた。SG3(B)または3-2(M)抗原を使用したELISAでは、どちらの動物もHEV感染に関して陰性であった。これに対して55kDa抗原では、カニクイ-389の血清中に接種後6〜8週目にIgM抗HEVが(図−8D)、そして6週目から15週目の間にIgG抗HEVが、どちらの動物でも検出された。
標準糞便懸濁液の10-5希釈液を接種した動物はいずれも顕著なALT活性の上昇を示さなかったが(図−7I、7J、表−5)、カニクイ-386ではIgMおよびIgG抗HEVがそれぞれ8〜13週目および8〜15週目に55kDa抗原で検出された(図−7J、8E)。カニクイ-385抗HEV IgGは55kDaおよび3-2(M)抗原では検出されたが、SG3(B)抗原ではされなかった。前のパターンとは対照的に、IgG抗HEVは融合抗原では、55kDa抗原より4週間早く、そしてより高い濃度で検出された。
標準HEV糞便懸濁液の10-6〜10-8の範囲の希釈液を接種した動物はいずれも、3つのHEV抗原のいずれでも抗体を産生しなかった。ALT活性の上昇はこれらの動物では観察されず、カニクイ-400で9週目にALT活性のやや顕著なピークが見られただけであった(表−5)。しかしながら、この動物において血清変換が見られなかったことは、このピークがおそらくはHEV感染に関係しないことを示している。
10%糞便懸濁液の10-1希釈液を経口接種した2検体のカニクイザル(387および392)については、いずれのザルも感染しておらず、これは、ALT濃度が上昇せず、3-2(M)および55kDa抗原で行ったELISAでHEVの血清変換が検出されなかったためである(表−5)。
最後に、HEV感染の血清学的形跡は、糞便懸濁液を10-5まで1/10ずつ希釈した溶液を接種した動物全てに観察された;これより高い希釈液を接種した動物ではこのような形跡は見られなかった。ALTの上昇で定義される顕著な肝炎は、10-1希釈液で感染させた2検体のサルにしか観察されなかった。ALT活性の有意に低い上昇が糞便懸濁液の更に高い希釈液を接種した動物の一部で観察されたが、それ以外の動物では観察されなかった。これだけを考慮すると、これらの低いALT上昇は肝炎の症状ではない。しかしながら、血清変換およびこれらのALTピークの出現が同時に起こることは、これらの動物における軽度の肝炎の存在を示唆している。抗HEV IgGの血清変換は糞便懸濁液の10-1〜10-5の範囲の希釈液を接種した動物全てに検出された。より低い濃度のIgG抗HEVおよび血清変換の遅延の傾向が、株のこれより高い希釈液を接種した動物で観察された。
要約すると、55kDaパキスタンORF-2抗原は、HEVのパキスタン株に感染させたカニクイザルにおけるIgMおよびIgG抗HEVの検出に関して、3-2(M)またはSG3(B)抗原のいずれよりも効率的であった。例えば、カニクイ-385以外の全ての動物の血清では、ELISAによるIgGまたはIgM抗HEVの検出は、55kDa抗原を使用した場合は3-2(M)またはSG3抗原のいずれの場合よりも効率的であった。55kDa抗原を使用するELISAでは、本質的に矛盾がなく、再現性のある結果が得られ、10-5以下の糞便希釈液を接種した10検体の動物全てでIgG抗HEVを検出した。また、ELISAのシグナルの大きさも接種液が希釈されるに従って減少した。融合抗原では、ペアの動物間で一貫した結果が得られなかった。これらの抗原では、10-1、10-2、10-3、または10-5の希釈液を接種したそれぞれのペアの動物のうち1検体だけがIgG抗HEVの血清変換を示し、またIgM抗HEVだけの血清変換が検出された。最初の接種溶液の10-4希釈液を接種した動物はいずれも、2つの融合抗原のいずれでも血清変換しなかったが、それにも関わらず、1検体の動物(カニクイ-393)由来の血清は、55kDa抗原でアッセイした場合には高濃度の抗HEV IgGを維持していた。上記のように、IgM抗HEVのELISAはカニクイザルIgG抗HEVのELISAより感度が有意に低いが、55kDa抗原は、3-2(M)またはSG3(B)抗原より多くの動物で抗HEV IgMを検出できた。要約すると、この研究に使用したパキスタンウィルス接種溶液の感染力価についての最終的な結論は、3-2(M)およびSG3(B)を使用するELISAから得られるデータを合わせても下すことができず、55kDaパキスタンのELISAで得られるデータのみから結論を下すことができた。
カニクイ-385に関しては、2つの試験結果間の抗HEV IgG検出が異なるのは4週間であった。これらのデータは、3-2(M)抗原中にこの動物によって認識される別のエピトープが存在し、これはより大きな55kDaおよびSG3(B)抗原には存在しないことを示唆している。完全なORF-2(75kDa)および55kDaタンパク質の両方を含有する昆虫細胞の総溶解産物を抗原として使用してこれらのサンプルを再試験した場合、結果は55kDaを単独で使用した場合と同様であった。この発見は、55kDaタンパク質が3-2エピトープのアミノ酸を含有しないのではなく、3−2エピトープ配列のコンフォメーションが、この研究に使用した3つの抗原全ての間で異なっていることを示唆している。最後に、抗原SG3(B)はORF-2のより長い部分を含有し、エピトープ3-2の完全な配列を含むという事実に関わらず、3-2(M)抗原より多くの陽性血清を検出しなかったという点は興味深い。
実施例11
RT-PCRによるHEV SAR-55ウィルス株の感染力価の測定
接種材料の感染力価についての知見は動物モデルの実験的感染で得られる多くのデータを解釈するために重要である。しかしながら、これまでHEVウィルス株の感染力価は報告されていない。HEVのSAR-55株を含有する糞便懸濁液の10倍希釈液を抽出し、RT-PCR増幅を以下のように実施してHEVゲノムを検出できる一番高い希釈液を決定した。200μlの糞便懸濁液を0.4mlの1.5M NaClおよび15% ポリエチレングリコール(PEG)8000と混合し、4℃で一晩放置した。ペレットを回収するために小型遠心機(Beckman,Palo Alto,CA)を使用して16,000gで3分間、遠心分離し、4.2Mグアニジンチオシアネート、0.5% N-ラウロイルサルコシン、0.25M トリス-HCl(pH8.0)、0.15M ジチオスレイトール(DTT)、および1.0μgのtRNAを含有する溶液475μlに溶解した。次いで、50マイクロリットルの1M トリス-HCl(pH8.0)、100mM EDTA,および10% SDSを添加した。RNAをフェノール−クロロホルム(1:1)を用いて65℃で2回抽出し、その後クロロホルム抽出を室温で行った。上層に250μLの7.5M 酢酸アンモニウムを添加し、核酸を0.6mLの2-プロパノールで沈殿させ、75% エタノールで洗浄し、100% エタノールで洗浄し、逆転写(RT)PCRに使用した。
HEVゲノムを検出するために、2組のネスティッド・プライマー(nested primer)を使用したが、これらはSAR-55ゲノムの3’領域(ORF-2)から表現された配列である。逆転写および第一のPCRのプライマーは、それぞれSEQ ID NO:99:GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC、およびSEQ ID NO:100:TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGGと示される。第二のPCRのプライマーは、それぞれSEQ ID NO:101:GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC、およびSEQ ID NO:102:TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAGと示される。RNAペレットを20μLの0.05M トリス-HCl(pH7.6)、0.06M KCl、0.01M MgCl2、0.001M DTT、40ユニットのRNAsin(Promega Biotec,Madison,WI)、16ユニットの鳥類骨髄芽球症ウィルスの逆転写酵素(Promega Biotec)、および10pmolの逆向きプライマーに溶解し、42℃で1時間インキュベートした。20μLの逆転写酵素混合液に100μLの0.01M トリス-HCl(pH8.4)、0.05M KCl、0.0025M MgCl2、0.0002Mの各dNTP、50pmolの順向きプライマー、50pmolの逆向きプライマー、および4ユニットのAmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT)を添加し、100μLの軽鉱油を積層した。HEVのcDNAを35サイクルのPCRで増幅した:94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間。PCR産物を1%アガロースゲルで分析した。その後、この混合液の5μLを使用して、伸長時間を3分に延長した以外は同一条件下で、第二の増幅を行った。
標準HEV糞便の10-1〜10-5の範囲の全ての希釈液から得られたRT-PCR産物(図−9)を2%アガロースゲルで分離し、ゲルを臭化エチジウム染色して検出した。より高い希釈液で特異的なPCR産物の量の減少が観察され、HEVゲノムが検出された10%糞便懸濁液の最も高い希釈液は10-5であった。従って、希釈比を考慮すると、HEVゲノムの力価は糞便1グラム当たり約106.7であった。
更に、RT-PCRでHEVゲノムを含有することが示された希釈液のみがカニクイザルに対して感染性を有した。従って、標準糞便懸濁液の感染力価とRT-PCRで検出されたそのゲノムの力価はほぼ同一であった。RT-PCRと感染力価間の同様の相関関係が、C型肝炎ウィルスのある株で観察された(Cristianoら,(1991)Hepatology,14:51-55;Farciら,(1991)N.Engl.J.Med.,25:98-104;Bukhら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:187-191)。
実施例12
ORF-2タンパク質をワクチンとして用いた能動免疫法および抗HEV陽性回復期血漿を用いた受動免疫法
55kDa ORF-2タンパク質に基づくELISAにおいてHEV抗体陰性(<1:10)であるカニクイザル(Cynomolgus monkey)(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis))をBL-2バイオハザード封じ込め下で個別に収容し、そして10,000または1,000CID50を含むよう希釈されたパキスタンHEV株SAR-55を含む糞便懸濁物(ウシ胎児血清中)を動物の静脈内接種に用いた。
能動免疫研究には、バキュロウイルス(baculovirus)組換え体が発現した55kDa ORF-2タンパク質を、実施例10に記載されるように、接種7日後に採取した5x108のSF-9細胞より精製した。精製55kDaタンパク質3mgをミョウバン沈澱させ、そしてミョウバン沈澱させた55kDa ORF-2タンパク質を50μg含むワクチン0.5mlを筋内注射することにより、8頭のカニクイザルを免疫した。4頭のサルは単回投与を受け、そして4頭のサルは4週間あけて2回投与を受けた。最後の免疫の4週間後、霊長類はHEVの1,000から10,000CID50で静脈内攻撃を受けた。
能動免疫研究において、4頭のカニクイザルをコントロールとして使用した。cyno-412および413はプラセボ(リン酸緩衝生理食塩水0.5ml)の単回投与を受け、そしてcyno-397および849はプラセボを2回投与された。コントロール動物はHEVの1,000から10,000CID50で攻撃を受けた。
受動免疫研究には、cyno-384を2つの中国HEV単離体KSl-1987およびKS2-1987を含む、10%の集めた糞便懸濁物0.5mlで感染させ、そして回復期中、動物から血漿を繰り返し集めた(Yinら.(1993)J.Med.Virol.,41:230-241)。cyno-396およびcyno-399の血液のおよそ1%およびcyno-401およびcyno-402の血液の10%を1:10,000のHEV抗体力価を有するcyno-384の回復期血漿で置き換えた。該血漿の注入2日後、動物をHEVの1,000CID50で攻撃した。コントロールとして、cyno-405の血液の10%を、HEV感染前にcyno-384から得た抗HEV陰性血漿で置き換えた。その後、cyno-405をHEVの1,000CID50で攻撃した。
受動および能動免疫研究両方に関し、肝臓の経皮針生検および血清および糞便試料を、接種前および接種後15週間にわたり毎週収集した。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレベルに関し、商業的に入手可能な試験(Metpath Inc.,メリーランド州ロックビル)を用いて血清を解析し、そしてALTにおいて、肝炎の生化学的徴候が2倍またはそれ以上増加していると明示された。肝臓生検は暗号化して調べ、そして利用された抗HEV ELISAは実施例10に記載された。RNA抽出およびRT-PCRは、血清100μlまたは10%糞便懸濁物100μlのRNAを製造者のプロトコルにしたがいTRIzol試薬(Gibco BRL,メリーランド州ゲイザースバーグ)で抽出した以外は、実施例11のように行った。定量化には、各動物のPCR陽性連続血清または糞便を混合し、そしてウシ血清で連続的に10倍増加希釈した。各希釈物の100μlを、本実施例中に先に記載したようにRNA抽出およびRT-PCRに用いた。本研究に用いたPCRプロトコルでは、血清1ml当たりわずか10CID50が、そして糞便1グラム当たりわずか100CID50が検出可能であった。
接種前5週間および接種後15週間の毎週の血清試料のピークALT値を、各動物に関し、比(後/前)で表した。コントロール動物群の比の相乗平均を、サイムズ試験(Simes,R.J.(1986)Biometrika,73:751-754)を用い、受動または能動免疫された動物のものと比較した。
コントロール動物群のウイルス血症の期間およびウイルスを糞便中に排出する期間およびHEVゲノム力価を、ウィルコクソン試験(Noether,G.(1967)Elements of nonparametric statistics(John Wiley & Sons Inc.,New York)中,pp.31-36.)を用いて、受動または能動免疫された動物のものと比較した。同じ試験を用いて受動および能動免疫された動物間の上記のパラメーターを比較した。
統計解析には、血清1ml中10未満のHEVゲノムを有する血清試料を1:1の力価と定め、そして糞便1g中100未満のHEVゲノムを有する糞便試料を1:10の力価と定めた。
結果
非免疫化動物におけるE型肝炎感染の経過
HEVで攻撃された5頭の非免疫化動物のうち3頭において、血清ALT値が少なくとも2倍増加することにより、肝炎の生化学的徴候が立証された。2頭の動物では、ALT活性の有意な増加は見られなかった。しかし、表6に示すように、5頭の動物すべてで、組織病理学的データにより肝炎が立証された。
壊死炎症性変化は1+から4+の段階で1+および2+の間の範囲であり、そしてALT活性上昇を示した動物において、こうした上昇と一時的に相関していた。
コントロール動物はすべて、攻撃の3から5週間後にHEVに対し血清変換(seroconvert)しており、そして1:1,000から1:32,000の範囲の最大HEV抗体力価を示した。感染、肝炎の重症度、および抗HEV反応レベルの間には高い相関関係があった。肝炎に関し最も高い累積スコアを持つcyno-405はまた、ウイルス血症およびウイルス排泄の期間が最も長く、そして抗HEVレベルが最も高かった(表6)。ウイルスを糞便に排出する期間は、ウイルス血症の期間と同じか、またはそれより長かった。コントロール動物すべてに関し、血清中のHEVゲノム力価(10-3から10-4.7)は、糞便中の力価(10-5.7から10-7)より低かった。これらの動物5頭すべてにおいて、ウイルス血症および糞便中へのウイルス排出は4から11週間にわたり検出され、そして血清変換後平均4.2週間(2から9週間の範囲)検出された。
受動免疫。血液のおよそ1%を抗HEV陽性回復期血漿で置き換えられたcyno-396および399は、輸血2日後(攻撃時)に測定したところ、1:40のHEV抗体力価を有した(表6)。どちらの動物でも、輸血1週間後にHEV抗体力価の2倍の減少が見られ、そして輸血2週間後までには検出可能レベル以下(1:10未満)に減少した。抗HEVは再び、cyno-396において攻撃5週間後に、そしてcyno-399において攻撃4週間後に検出され、HEV感染が起こっていたことを示した。攻撃の9から10週間後、最大HEV抗体力価(1:8,000)に到達した。どちらのカニクイザルも、攻撃後、ALT活性の有意な上昇を示さなかった。しかし、cyno-396において肝炎の組織学的徴候が検出され、そしてどちらの動物でも、血清および糞便において、HEVゲノムが検出された(表6)。
cyno-401および402は、血液のおよそ10%を回復期血漿と置き換えられた。輸血2日後、攻撃時、どちらのカニクイザルでも、HEV抗体力価は1:200だった(表7)。
どちらの動物でも、攻撃後15週間の間、抗HEVが連続して検出され、そしてcyno-401では最大力価は1:4,000に達したが、cyno-402では1:80でしかなかった。生化学および組織学的解析では、どちらの動物でも肝炎は明らかにされなかった。しかし、どちらの動物でも、HEVウイルス血症およびウイルスの糞便への排出が見られ、感染が起こっていたことを示した(表6)。したがって、抗体のより高い力価を達成した受動免疫予防は、HEV攻撃後、カニクイザルを肝炎に対し保護した。
能動免疫。55kDaタンパク質の50μg単回投与により免疫化した4頭の霊長類は、1:100から1:10,000の力価範囲で、組換えタンパク質に対する抗体を発現した(表7)。1頭(cyno-013)は、攻撃9週間後、麻酔事故で死亡し、そして解析に含まれている(表6)。抗原の2回投与を受けた4頭の動物は、力価1:10,000のHEV抗体を発現した。4頭のサルのうち2頭は、HEVの静脈内攻撃後、死亡した。これもまた、麻酔事故の結果であった可能性があるが、正確な病因は決定不可能だった。これら2頭のサルはさらなる解析からは除いた。残る6頭の動物のどれも、攻撃後、異常なALTレベルまたは肝炎の組織学的徴候を示さなかった(表6)。55kDaタンパク質の1回または2回投与で免疫されたカニクイザルはどちらも、ウイルス血症を示さなかった。しかし、免疫原を1回投与された4頭の動物のうち3頭は、糞便中にウイルスを排泄した。対照的に、ワクチンを2回投与された、攻撃された動物2頭のどちらでも、ウイルス排出は観察されなかった。
能動免疫された動物のほとんどで、受動免疫された動物より高いHEV抗体力価が示された。しかし、抗HEV血漿で受動免疫された2頭の動物で1:200の力価であったのに比べ、cyno-013は攻撃時に1:100のHEV抗体力価を有した。しかし、cyno-013はHEV感染に対し、受動免疫された動物より高い防御を示した。攻撃時HEV抗体力価が1:1,000であったcyno-009は、肝炎およびHEV感染に対し完全に防御された(表6)。対照的に、攻撃時HEV抗体力価が1:10,000であったにも関わらず、cyno-003は感染し、そして糞便中にHEVを排出した。しかし、この動物または免疫原の単回投与を受け、そして1:10,000またはそれ以上のHEV抗体力価を有した他のカニクイザルでは、肝炎もウイルス血症もどちらも検出されなかった。
コントロールおよび免疫された動物におけるHEV感染経過の比較
組織病理学により判定されるように、受動免疫されたサルの1頭を除き、すべての免疫された動物は、HEVの静脈内攻撃後、肝炎に対し防御された。コントロール群および受動および能動免疫された動物間の、肝炎の重症度およびウイルス複製レベルの平均値を比較することにより、一般的に、感染重症度は、攻撃時のHEV抗体力価と逆に相関しており、そして非免疫化>受動免疫化(1%)>受動免疫化(10%)>能動免疫化(1回投与)>能動免疫化(2回投与)の順に減少していることが示された(表6、8)。しかし、受動および能動免疫された動物の2つの各サブグループにおける動物の数は、統計解析を許すに十分でなかった。したがって、統計解析は、受動免疫された群を合わせたものおよび能動免疫された群を合わせたものに関し、それぞれ、合わせたコントロール群と比較して行った。本解析の結果は表8に示している。
そしてこれらは、コントロール群における組織病理学スコアおよび組織学的変化の期間が、受動または能動免疫された動物のものとは統計的に異なっていたことを示している。コントロール群において、ピークALT値の接種後/接種前比は、受動または能動免疫された動物のものと比較した際、統計的に有意に高く、免疫された動物群は両方とも、肝炎の生化学的発現に対し防御されていることを示している。ウイルス血症の期間および糞便中のHEV力価は、免疫された動物群両方でコントロール群より有意に低かった。しかし、ウイルス排出期間および血清中のHEV力価の相違は、コントロール群および受動免疫群の間で統計的に異ならなかったが、これらのパラメーターは、コントロール群を能動免疫群と比較した際には有意に異なっていた。HEV力価と共にウイルス血症および糞便排出期間に関し、受動および能動免疫動物群間でも有意差が見られた。
要約すると、表6から8に示された結果は、受動的および能動的に獲得されたHEV抗体はどちらも、病原性(virulent)HEV攻撃後、肝炎に対しカニクイザルを防御した。免疫されなかったカニクイザルは5頭すべて、SAR-55の1,000から10,000CID50で攻撃された際、肝炎の組織学的徴候を示したが、1:200の抗体力価を受動的に獲得した動物はどちらも肝炎から防御され、そして抗体力価がわずか1:40であった動物2頭のうち1頭もまた、肝炎を示さなかった。
しかし、能動免疫された動物が肝炎に対し完全な防御を示し、そして受動免疫された動物よりHEV感染に対しより有効な耐性を示したことに注目しなくてはならない。例えば、受動免疫された動物から得られた結果と対照的に、能動免疫された動物にはHEV攻撃後、ウイルス血症は検出されなかった。カニクイザルにおいて、組換え体55kDaタンパク質の1回または2回免疫後、1:10,000という高いHEV抗体力価を達成することが可能であった。1頭のサル(013)は能動免疫後1:100の力価を示したが、このレベルであってもまだ肝炎およびウイルス血症を防いだ。
能動免疫研究はまた、ワクチンの単回投与がHEVウイルス血症を防ぐ一方、糞便中へのウイルス排出はまだ検出されたことも示した。しかし、ワクチンの2回投与は肝炎およびHEV感染のすべての徴候を防ぐことが観察された。これらの結果はしたがって、例えば外国旅行前に個人に投与されるワクチンの単回投与は、高危険性環境においてE型肝炎から該個人を防御するであろうことを示唆する。
最後に、示された結果は、A型肝炎に対するヒトでない霊長類の受動および能動免疫予防に関し、以前報告された結果と非常によく似ていることが注目される:受動免疫予防は肝炎を防いだが感染を防がず、一方ワクチン投与は肝炎だけでなくHAV感染もまた防いだ(Purcell,R.H.ら.(1992)Vaccine,10:5148-5149)。本明細書に示されるHEV免疫予防研究が、HAVに対する免疫予防の以前の研究と、防御した抗体力価の決定(<1:100)および病原性ウイルスの静脈内攻撃に続く結果両方において、等しいのは興味深い。他の研究により、ヒトにおいて受動的および能動的に獲得された抗HAVの匹敵する力価の効能が立証されており、そして肝炎研究において霊長類研究の予測的価値が確認されていることから(Stapleton,J.ら.(1985)Gastroenterology 89:637-642;Innis,B.L.,ら.(1992)Vaccine,10:S159)、したがって、カニクイザルにおけるこれらの結果はヒトにおける防御を予測するであろう公算が極めて高い。
実施例13
酵母における完全長ORF-2タンパク質およびより低い分子量断片の直接発現
1.完全長ORF-2タンパク質(アミノ酸1−660、分子量70979)、断片1778−1703(断片番号は以下に示されるプライマー番号を示す)
2.34番目のアミノ酸から開始するORF-2タンパク質(アミノ酸34−660、分子量67206)、断片1779−1703
3.96番目のアミノ酸から開始するORF-2タンパク質(アミノ酸96−660、分子量60782)、断片1780−1703
4.124番目のアミノ酸から開始するORF-2タンパク質(アミノ酸124−660、分子量58050)、断片1781−1703
をコードする4つのcDNA ORF-2断片を、プラスミドP63-2をテンプレートとして、そして以下に示される合成オリゴヌクレオチドを用いることにより、PCRを用いて得た:
SEQ ID NO:103(逆方向プライマー#1703)GCACAACCTA GGTTACTATA ACTCCCGAGT TTTACC、SEQ ID NO:104(順方向プライマー#1778)GGGTTCCCTA GGATGCGCCC TCGGCCTATT TTG、SEQ ID NO:105(順方向プライマー#1779)CGTGGGCCTA GGAGCGGCGG TTCCGGCGGT GGT、SEQ ID NO:106(順方向プライマー#1780)GCTTGGCCTA GGCAGGCCCA GCGCCCCGCC GCTおよびSEQ ID NO:107(順方向プライマー#1781)CCGCCACCTA GGGATGTTGA CTCCCGCGGC GCC。
SEQ ID NO:103−107に示されたすべての配列は、5’端に、4ヌクレオチドが先行する人工配列CCTAGGを含む。該人工配列はAvr II(Bln I)制限酵素の認識部位であった。合成されたPCR断片をBln Iで切断し、そしてpPIC9ベクター(図10)(Invitrogen)のAvrII部位にクローンした。断片の方向が正しいかどうかORF-2配列およびベクターに存在する非対称的なEcoRI部位を用いて、制限解析により確認した。精製組換えプラスミドpPIC9-1778(断片1778−1703を含む);pPIC9-1779(断片1779−1703を含む);pPIC9-1780(断片1780−1703を含む)およびpPIC9-1781(断片1781−1703を含む)を、Invitrogenプロトコルにしたがい、酵母スフェロプラスト(ピキア(Picha)株)の形質転換に用いた。組換えクローンのスクリーニングおよび発現解析を、同じプロトコルを用いて行った。これらの発現タンパク質は、本出願に記載されるように、ワクチンの免疫原として用いてもよく、そして免疫検定の抗原として用いてもよい。最後に、当業者は上記の例に用いられたベクターおよび酵母株は他のベクター(例えばpHIL-F1;Invitrogen)または酵母株(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae))により置き換えることも可能であることを認識するであろう。
実施例14
組換えバキュロウイルス63-2-IV-2で感染させたSF-9昆虫細胞において合成されたHEV ORF-2遺伝子産物の精製およびアミノ末端配列解析
実施例10に記載されるように、SF-9細胞を組換えバキュロウイルス63-2-IV-2で感染させ、そして接種7日後に採取した。昆虫細胞溶解物のSDS-PAGEに存在する顕著なタンパク質バンドは分子量にしておよそ55kDaであった。この55kDaバンドのさらなる精製は、150-450mM NaCl勾配を用いたDEAE Sepharoseを用いた、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより行った。DEAE分画をSDS-PAGE後クーマシーブルー染色することにより、55kDaバンドの存在に関し検定した。ピーク画分をその後、SDSの非存在下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、55kDa、61kDaおよび中間の分子量のバンドの3つのバンドに分離した。アミノ末端微小タンパク質配列解析によるポリアクリルアミドゲルの各タンパク質バンドの解析により、55および61kDaタンパク質は、SEQ ID NO:2のAla-112の、固有なN末端を共有していることが明らかになった。2つのORF-2切断産物の大きさの違いは、より大きい産物のCOOH末端切断が異なることを反映している可能性があると考えられている。
ポリアクリルアミドゲル上の第三の中間のタンパク質は、バキュロウイルスのキチナーゼタンパク質であることが示された。55および61kDa ORF-2タンパク質は、ピークDEAE分画をNaClおよびアセトニトリル溶媒と共に微小孔(micropore)系を用いた逆相HPLCに供することにより、いかなるキチナーゼも除いた単一の対称ピーク画分に分離した。
実施例15
55および61kDa切断産物の直接発現
112番目のアミノ酸から開始するORF-2タンパク質(ORF-2のアミノ酸112−660)をコードするcDNA ORF-2断片を、プラスミドp63-2をテンプレートとして用いたPCRにより得た。その後、cDNA断片をpBlueBac-3トランスファーベクターのBamHI−PstI部位に挿入した。SF9昆虫細胞をこのベクターから生成した組換えバキュロウイルスに感染させ、そして昆虫細胞溶解物に55および61kDa ORF-2タンパク質が存在するか、ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色により解析する。本明細書に記載されるように、直接発現されたタンパク質をワクチンにおける免疫原として、そして免疫検定における抗原として使用してもよい。
実施例16
昆虫細胞におけるHEV ORF2タンパク質発現の動力学
バキュロウイルスに感染した昆虫細胞における、HEV ORF2(パキスタン株)の全長および一部切除された型の発現動力学および精製を調べた。本実施例に記載される72および63kD ORF2タンパク質は、先にそれぞれ実施例3および14に記載された74および61kDタンパク質と同一のタンパク質である;分子量の違いは、ゲル電気泳動における移動度を通じて分子量を決定する際に通常見られる可変性の小さな範囲に当たる。
細胞培養。スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞、クローン9(Sf-9)をプラーク検定およびトランスフェクション用に単層培養として、そして高力価ウイルスストックおよび組換えタンパク質を産生するためのウイルス感染用に震蕩器懸濁培養として培養した。Sf-9細胞は乾燥空気インキュベーターにおいてSf-900II無血清培地(SFM)(Life Technologies,Inc.,メリーランド州ゲイザーズバーグ)中で28℃および150rpmに維持し、そして懸濁培養として、最高継代70回まで、開始密度0.2x106細胞/mlから最終密度1.0x107細胞/mlにまで継代培養した。
ウイルス感染。組換えアウトグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)多核多角体病バキュロウイルス(AcMNPV)を低感染効率(MOI;0.01)でSf-9細胞(2.0x106細胞/ml)中で継代した。組換えタンパク質産生を目的としたウイルス感染をMOI=5で開始し、そして生存率が10%未満に達するまで4日間維持した。標準的方法により、プラーク・アガロース検定を、集密度(confluency)75%であるSf-9細胞単層の6ウェルプレート中で行った。
組換えバキュロウイルスの構築。HEV ORF2(パキスタン株)の全長(bHEV ORF2fl)および5’が一部切除された欠失体(bHEV ORF2 5’tr)を含む組換えバキュロウイルスを、標準的な相同的組換えによりSf-9昆虫細胞において構築した。HEV ORF2の5’−3’一部切除欠失体を含む組換えバキュロウイルスを、バクミド(bacmid)ベクター(Luckow,V.A.,ら.(1993)J,Virol.67:4566-4579)を用いて以下のように構築した:
オリゴヌクレオチドプライマーHEV-140(5’-TTCGGATCCA TGGCGGTCGC TCCGGCC-3’)(SEQ ID NO:108)およびHEV-141(5’-TCAAGCTTAT CATCATAGCA CAGAGTGGGG GGC-3’)(SEQ ID NO:109)を用い、T/A PCRクローニングにより、HEV ORF2のアミノ酸112から607までを自身のATG翻訳開始コドンおよび複数の停止コドンと共にコードする1512bpのPCR生成DNA断片を、P61.2からpCR2.1(Invitrogen,カリフォルニア州サンディエゴ)にクローンした。HEV ORF2のDNA配列を含む1520bpのBamHI-EcoRI DNA断片をバキュロウイルスドナープラスミドであるpFASTBAC-1(Life Technologies,Inc)のpolh遺伝子座中のpolhプロモーターの下流に挿入した。陽イオン脂質CELLFECTIN(Life Technologies,Inc)を用いて組換えバクミドDNAでトランスフェクションしたSf-9細胞から、HEV ORF2 DNAを含む組換えバキュロウイルスを単離した。プラーク精製ウイルス単離体をHEV ORF2 DNA挿入物完全性(integrity)および昆虫細胞におけるタンパク質発現に関しスクリーニングし、そしてbHEV ORF2 5’-3’trウイルスと称されるマスターウイルスシード貯蔵(master virus seed bank)に拡大した。
感染細胞および上清処理。感染細胞および上清培地を、示した時点で、500xgおよび4℃で5分遠心分離することにより採取し、そして組換えHEV ORF2タンパク質用に処理した。細胞溶解物は、細胞沈澱を細胞沈澱1mg当たり2mlの溶解緩衝液(0.5% NP-40、50mM Tris-HCl、pH8.0、2mM EDTA)に再懸濁することにより調製し、そして新鮮なアプロチニンを最終濃度0.2mg/mlになるよう補って、しばらくボルテックスし、そして氷上で20分インキュベーションした。3000xgおよび4℃で15分低速度遠心することにより核を沈澱させ、そして細胞質分画を集め、そして未精製細胞溶解物として用いた。感染細胞上清および細胞溶解物を、Sorvall SS34ローターを用いて12,000xgおよび4℃で60分遠心分離することにより、浄化(clarify)した。
HEV ORF2タンパク質産物の精製。組換えHEV ORF2タンパク質を浄化バキュロウイルス感染細胞溶解物および上清培地から別々に精製した。未精製細胞溶解物を装填緩衝液(50mM Tris-HCl、pH8.0、10mM NaCl)で1:10に希釈した。
再循環速度4l/分および膜間圧20psiでAmicon Proflux M-12限外ろ過系上で、らせん状セルロース限外ろ過カートリッジ(S1Y10;面積1平方フィート;分子量10,000切り捨て;Amicon、マサチューセッツ州ビバリー)を用いた接触流動限外ろ過(tangential flow ultrafiltration)により、浄化感染細胞上清を10倍に濃縮した。濃縮上清を4体積の装填緩衝液に対し分離ろ過(diafilter)した。
分離ろ過物または希釈未精製溶解物(1.5ベッド体積)をQ Sepharose高流速強陰イオン交換カラム(XK50カラム、5.0x7.5cm、150ml;Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ)上に、流速5.0ml/分で装填した。カラムをまず1.0ベッド体積の装填緩衝液で、流速5ml/分で洗浄し、続いて1.0ベッド体積の装填緩衝液で、流速20ml/分で第二の洗浄を行った。タンパク質は、6.5ベッド体積の、同じ緩衝液中の10から300mMのNaCl連続直線勾配で、流速20ml/分で溶出した。
Q Sepharoseカラム(Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ)ピークタンパク質画分のアリコット10μlを、HEV ORF(+)タンパク質画分を同定するためSDS-PAGE解析に供した。集めた(+)画分をSepharose G-25(Pharmacia)および装填緩衝液を用いたゲルろ過により脱塩した。ピークタンパク質画分を集め、そしてSource 15Q高性能(Pharmacia)強陰イオン交換カラム上に装填し、HEV ORF2ポリペプチドを分離した。Q Sepharose液体クロマトグラフィーに関し上述したように、カラムを洗浄し、そして溶出させた。集めたHEV ORF2タンパク質(+)分画を上記のように同定し、集め、そして最終的なタンパク質精製のため、装填緩衝液を用いSephacryl S-200カラム(Pharmacia)上で最後のゲルろ過に供した。HEV ORF2タンパク質分画をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析により、以下に記載するように同定した。
タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として用い、60℃でBCA/Pierce微小タンパク質検定により測定した。すべてのクロマトグラフィーは、過程コントロールおよびモニタリングのためにMillenium 2010ソフトウェアを備えたWaters 600Eクロマトグラフィーワークステーション系(マサチューセッツ州メドフォード)を用いて行った。緩衝液伝導度はAccuMet 20伝導度計を用いて測定した。緩衝液pH測定には、Corning 220pH計を用いた。すべての緩衝液構成要素は、USPまたは分子生物学等級の未加工成分であった。
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析。タンパク質をタンパク質変性試料緩衝液(126mM Tris-HCl、pH6.8、5%βメルカプトエタノール、20%グリセロール、2% SDS、および0.005%ブロモフェノールブルー)中に2倍希釈し、そして99℃で5分変性させた。変性試料を8−16%勾配SDS−ポリアクリルアミドゲル(NOVEX)(Laemmli,U.K.ら.(1970)Nature 227:680-685)上で電気泳動した。タンパク質は、製造者に示唆されるように、コロイド性クーマシーブルー染色溶液(NOVEX、カリフォルニア州サンディエゴ)でタンパク質ゲルを染色することにより視覚化した。
タンパク質は電気ブロット技術(Tsarev,S.A.,ら.(1993)J.Inf.Dis.168:369-378)によりPVDF膜に移した。HEV ORF2産物を第一抗血清(チンパンジーポリクローナルα−HEV;1:500)に結合させた後、第二抗血清(アルカリホスファターゼに結合させたヤギα−ヒトIgG2(1:5,000;Life Technologies,Inc.))に結合させることにより、発色させ検出した。NBT/BCIP(Life Technologies,Inc.)を発色基質として用いた。
アミノ末端配列解析。Laemmliの緩衝液系(Laemmli,U.K.ら.(1970)Nature227:680-685)を用い、タンパク質をSDSの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。製造者の指示にしたがい、タンパク質を電気泳動的にゲルからProBlot膜(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ)に移した。タンパク質はクーマシーブルー染色により視覚化し、そしてオンラインPTH解析装置を持つApplied Biosystems Model 473ガス/パルス液相タンパク質配列解析装置を用いたアミノ末端配列解析のため、63kDおよび55kD HEV ORF2タンパク質を切り出した。
内部アミノ酸配列解析。タンパク質を上記のように電気泳動に供した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、そしてポンソー(Ponceau)S染色により視覚化した。相応するバンドを膜から切りだし、そしてAbersoldらの方法(Abersold,R.H.,ら.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6970-6974)にしたがい、Lys C(Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス)を用いたin situタンパク質分解消化のため処理した。Lys C由来断片をWaters Associates(マサチューセッツ州メドフォード)高圧液体クロマトグラフィー系およびVydac C4(カリフォルニア州ヘスペリア)逆相カラムを用い単離した。単離ペプチドのアミノ酸配列を、Applied Biosystems model 477Aタンパク質配列解析装置およびmodel 120AオンラインPTH解析装置を用いて決定した。
アミノ酸解析。上記のLys C由来断片のアミノ酸組成物は、Waters Pico Tagワークステーションを用い、6N HCl中、150℃で1時間、蒸気相加水分解の後、決定した。アミノ酸はフェニルイソチオシアネート(PTC)で誘導体化(derivatize)し、そして生じたPTCアミノ酸を分離し、そしてWaters Pico Tagアミノ酸解析系を用い定量化した。
C末端配列解析。55kD HEVタンパク質のカルボキシ末端からアミノ酸を連続的に放出させるため、固定カルボキシペプチダーゼY(Pierce、イリノイ州ロックフォード)を用いた。0.05M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)800μl中のタンパク質およそ150μgを、37℃で樹脂懸濁物200μlと混合した。上清のアリコット(100μl)を0、5、15、30、60、90および120分で取り分けた。最後のアリコットを16時間後に収集した。試料を真空下で乾燥させ、そして加水分解段階を含まず、上記のようにアミノ酸解析に供した。
質量分析法(mass spectroscopy)。精製タンパク質の質量分析的検出は、大気圧連結イオンスプレー源を備えたPerkin-Elmer Sciex API-III三段階四極子質量分析装置(カリフォルニア州フォスターシティ)を用いて行った。高純度窒素を、霧状化(nebulizer)ガス(実施圧=0.5MPa)およびカーテンガス(流速=0.8I/分)の両方に使用した。アルゴンガスは標的ガスとして、衝突ガス量3x1015原子/cm2で使用した。質量スペクトルスキャンニング範囲mIz 100−1500陽性イオンは、移動相中に1:200に希釈されたウシ血清アルブミン標準溶液をHarvard Apparatus Model 11シリンジポンプで50μl/分で直接注入することにより得た。スペクトルを1.0秒間隔で集めた。キャピラリー電圧は2kVおよび60℃に維持した。
HEV ORF2遺伝子産物の一時的発現を調べ、プロセシングされた組換えHEVタンパク質を同定した。無血清培地中で懸濁培養として培養したSf-9昆虫細胞を、全長E型肝炎ウイルスキャプシド遺伝子(パキスタン株)をコードする組換えバキュロウイルスで感染させた(図11)。細胞溶解物および培地上清を、連続4日間、毎日ウイルス感染から採取した。HEV細胞溶解物のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析の結果から、感染1日後にHEV ORF2 72kDタンパク質が存在し、その後消滅することが示された(図12)。感染2日目、感染細胞中に63および55kD HEVタンパク質が存在した。感染3日目、55kD HEVタンパク質は感染細胞中に顕著になった(図12)。感染後2日目から4日目に観察された63−65kDの豊富なタンパク質は、バキュロウイルス・キチナーゼと同定され、そしてHEV 63kDタンパク質ではなかった。53kD HEVタンパク質は、非常に早い感染後1日目から感染細胞培地上清に分泌され、そして感染3日目までに最大に豊富になった。これらの結果は、最初の72kDタンパク質の確率的なタンパク質分解切断が起こり、最終的な55kD(細胞溶解物)または53kD(培地)HEVタンパク質産物が生成されたことを示す。
HEVタンパク質精製。陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過により、組換えbHEV ORF2 flウイルスまたは一部切除ウイルスに感染させ、そして感染4日後に採取したSf-9細胞のNP-40溶解により産生された細胞溶解物から、組換えHEV63および55kDタンパク質を精製した。遠心分離により浄化し、そして接触流動限外ろ過により10倍に濃縮した、採取ウイルス感染培地上清から、53kD分泌タンパク質を精製した。5’端が二重にtraventされた構築物で感染させた細胞由来の、細胞溶解物および濃縮培地上清をQ装填緩衝液(50mM Tris-HCl、pH8.0、10mM NaCl)でそれぞれ10倍に希釈および分離ろ過した。平衡化した細胞溶解物(55kDタンパク質)および培地上清(53kDタンパク質)を別々にQ Sepharose高流速強陰イオン交換カラム上に装填した。HEV 55kDタンパク質を結合させ、140mM NaClのイオン強度で溶出させた(図13A)。クロマトグラフィーにかけた細胞溶解物および上清のHEVタンパク質画分を集め、Sephacryl G-25カラムを通過させることにより脱塩し、そしてSOURCE 15Q強陰イオン高性能カラムを用い、第二回の陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。HEVタンパク質を結合させ、そしてその後140mM NaClで溶出した(図13B)。HEVタンパク質ピーク画分を集め、そしてSephacryl S 200カラムを用いてゲルろ過により分画した(図13C)。55kDタンパク質画分のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析により、該55kDタンパク質はHEV起源であることが示された(図14、下のパネル)。クーマシーブルー染色タンパク質ゲルより、55kDタンパク質の純度は99%またはそれ以上であると概算された(図14、上のパネル)。
アミノ末端配列解析。昆虫細胞のbHEV感染中に検出された組換えHEV 66および55kDタンパク質のアミノ末端を決定するため、アミノ末端アミノ酸配列解析を行った。bHEV ORF2 flウイルスで感染させそして感染2日後に採取したSf-9昆虫細胞の希釈した細胞溶解物を装填した、Q Sepharose高流速カラムから、集めたHEVタンパク質画分を収集した。140mM NaClで、ピークQ画分から1:20の比で2つのHEVタンパク質(63kD:55kD)を精製した。ProBlot膜から切り出したHEV 63kDおよび55kDタンパク質バンドの直接エドマン分解により、20サイクルを通し同一のアミノ酸配列が生じた(表9)。
該配列は、HEVゲノムの読み枠(open-reading frame)2の残基112から131に対応した。これらの結果は、2つの免疫反応性タンパク質の間の明らかな分子量の相違は、カルボキシ末端の一部切除によることを示した。
内部アミノ酸配列解析。組換えHEV 63および55kDタンパク質が共有する同一性をさらに決定するため、ペプチダーゼ消化および分画化を行った。精製55kD HEVタンパク質をLys Cプロテアーゼで消化した。これは55kD HEVタンパク質からのペプチド産生およびアミノ酸配列決定には、カルボキシ末端からリジン残基へ切断するこの酵素の特異性が、トリプシンより適切であるとみなされたからであった。Lys C消化で生じたペプチドプロフィールは、図15に示されている。
ピークのアリコットをアミノ酸配列解析に供した。組換えHEV ORF2 55kDタンパク質の内部ペプチドのアミノ酸配列は、HEV ORF2(パキスタン株)の予想されたアミノ酸配列に対応した。HEV ORF2アミノ酸領域607から670までのアミノ酸配列を含むペプチドは見られなかった。特に重要なのは、HEV ORF2のアミノ酸残基554から606に対応する明確な配列の52サイクルを生じた画分24であった。サイクル53または55(残基606または608)ではPTHロイシンの増加は見られなかったが、サイクル54においてPTHアラニンの増加が見られた。読解可能なアミノ酸が50アミノ酸残基を超えることは我々の研究室では一般的でないため、さらなる配列データが得られなかったのが、ペプチドの末端(すなわちタンパク質のカルボキシ末端)に達したためシグナルが失われたからなのか、またはエドマン化学反応の失敗のためなのかは明確ではなかった。したがって、他のいくつかの手段により、組換えHEV ORF2 55kDタンパク質のカルボキシ末端を決定することが必要であった。
アミノ酸組成物解析。組換えHEV ORF2 55kDタンパク質のアミノ酸606から608がLys C消化画分24に存在するかを決定する代替手段は、このペプチドのアミノ酸組成物解析であった。画分24のアリコットのアミノ酸解析結果を表10に示す。
本解析により、サイクル54以降のアミノ酸配列データが得られなかったのは、アミノ酸配列解析が55kDタンパク質のカルボキシ末端に達していた事実によるものであることがしめされた。結果はロイシン607で終わるペプチドと一致していた。本解析は、他の重要でない変動を含んだが、該ペプチドがHEV ORF2における前のリジン残基(残基600)をはるかに越えて終結していることが明らかに示された。
カルボキシ末端配列解析。組換えHEV ORF2 55kDタンパク質のカルボキシ末端を決定するさらなる手段は、カルボキシペプチダーゼで消化した55kDタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸解析であった。固定カルボキシペプチダーゼYとの経時インキュベーション中に放出された遊離アミノ酸のアミノ酸解析により、ロイシンが迅速に増加した後、バリン、セリン、およびヒスチジンが続くことが明らかになった(図16)。他のアミノ酸量の顕著な増加は見られなかった。これらの結果は組換えHEV ORF2 55kDタンパク質のカルボキシ末端がアミノ酸ロイシン607に定められることを裏付けた。
質量分析解析。HEV ORF2(パキスタン株)のヌクレオチド配列由来の、HEV 55kDタンパク質(HEV ORF2のアミノ酸112−607)の予想される分子量は、53kDと概算された。このタンパク質の絶対質量を得るため、精製組換えHEV 55kDタンパク質の電子スプレー質量分析を行った。MS測定を数回行った結果、精製タンパク質調製中に分子量-56,000ダルトンの単一ポリペプチドが存在していた(図17)。質量分析は0.01%の正確度を有するため、HEV 55kDタンパク質がNおよびC末端両方がタンパク質分解切断されることにより生成されたことが裏付けられた。
昆虫細胞におけるHEV ORF2一部切除タンパク質発現の動力学。HEV ORF2のアミノおよび/またはカルボキシ末端が欠失した一次タンパク質を、昆虫細胞中で安定して、そして高レベルで発現させることが可能であるか決定するため、HEV ORF2の5’および5’-3’一部切除欠失突然変異体をバキュロウイルスベクターにクローンした。bHEV ORF2 5’trおよびbHEV ORF2 5’-3’trウイルスで感染させた結果から、昆虫細胞において63および55kDタンパク質がどちらも発現されていることが示された(図18)。しかし、bHEV ORF2 5’tr感染において、感染3日後までには55kDタンパク質が50倍以上より豊富になり、そしてbHEV ORF2 5’-3’trウイルス感染では単独で存在していた。53kDタンパク質もまた、どちらのウイルスでの感染でも感染の最初の日のうちに上清培地に分泌されており、そして感染3日後までには最大レベルに達していた。53kD分泌タンパク質は、bHEV ORF2 5’-3’trウイルスに感染した昆虫細胞で、bHEV ORF2 5’trウイルスに感染した細胞より20倍以上より豊富だった。55kDタンパク質をウイルス感染両方の細胞抽出物から精製し、そして53kDタンパク質は上述の精製計画により上清培地から精製した。分泌53kDタンパク質のアミノおよびカルボキシ末端は、HEV ORF2のアミノ酸112および578と同定されており、そして53kDタンパク質はELISAにおいて抗原性を持つことが示されている。53kDタンパク質の予想される分子量は50kDであるが、該タンパク質は質量分析によりおよそ53キロダルトンの分子量を持つことが示された。
112−607bHEVの部位特異的PCR突然変異誘発もまた、アミノ酸578(HEV ORF2パキスタン株)でアルギニンのイソロイシンへの置換を生成するため、アミノ酸578でAUUコドンおよび前後のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。112−607bHEVの他の突然変異体には、アミノ酸578でアルギニンをグリシン、セリンまたはグルタミン酸でアミノ酸置換するものが含まれた。これらの突然変異体は、望ましいアミノ酸変化のためのコドンを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて上述のように構築した。これら112−607bHEV突然変異体は、HEV ORF2タンパク質産生平衡を単一のタンパク質の方向に押すであろうと考えられる。
実施例18
フェサス(Phesus)アカゲザルにおけるワクチン研究
霊長類:
この研究においては、高感度ELISA(Tsarev SA,et al.J Infect Dis(1993);89:369-78)においてHEV抗体(抗HEV)ネガティブ(<1.10)であった32匹のアカゲザル(Macacca mulatta)を用いた。
HEVチャレンジストック:
パキスタンHEV株SAR-55(Iqbal M.,et al.J.Trop.Med.Hyg.1989;40,438-443)(ヒト糞)またはメキシコHEV株Mex-14(Velazquez O,et al.JAMA(1990);263:3281-5;サル糞、CDCにより提供された)を、チャレンジウイルス源として用いた。10,000サル感染用量(MID50)を含むよう希釈されたパキスタンまたはメキシコHEV株を含む糞の懸濁液(カニクイザル(Macacca fascicularis)血清反応陰性の血清中)を動物の静脈内接種に用いた。
免疫用接種物:
感染昆虫細胞(完全長ORF2を含む組換えバキュロウイルスで感染)から精製した55kDaのORF-2蛋白質(Tsarev S.A.,et al.Prospects for prevention of hepatitis E.:Enterically transmitted hepatitis viruses.(Y.Buisson,P.Coursaget,M.Kane eds).La Simarre,Joueles-Tours,France,(1996)p.373-383)をTsarev S.A.ら、(Proc Natl Acad Sic USA,(1994);191:10198-202)に記載のように明礬で沈殿させた。残存可溶性抗原のELISA分析により判定して、沈殿の効率は99%より高かった。タンパク質−明礬複合体は+4℃で1年まで保存した。
接種スケジュール:
50μg、10μg、2μgまたは0.4μgの明礬沈殿55kDaタンパク質を含む0.5mlのワクチンを筋肉内注射することにより、アカゲザルをワクチン接種した。1ヶ月隔てて2回投与した。他の動物には、組換え蛋白質を含まない0.5mlの明礬懸濁液(プラセボ)を投与した。
霊長類のモニター:
接種前、および接種後15週にわたり週に1回、肝臓の経皮針生検および血清および糞の試料を回収した。血清は、市販の試験(Metpath Inc.,Rockville,MD)を用いて、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレベルについてアッセイした。肝炎の生化学的証拠は、接種後/接種前のALTの比率の2倍以上の増加として定義した。肝臓生検を実施し、組織病理学はTsarev S.A.ら(Proc Natl Acad Sci USA,(1994);191:10198-202)に記載のように評点した。動物の臨床的評価はブラインドで行った。抗HEV ELISAおよびリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)は、Tsarev S.A.ら(Proc Natl Acad Sic USA,1994;191:10198-202)に記載のように実施した。定量のため、各動物からのPCR-陽性の一連の血清または糞を合わせ、ウシ血清中で10倍増加で連続希釈した。100μlの各希釈物をRNA抽出およびRT-PCRに用いた。この研究において用いたPCRプロトコルは、10MID50程度の低さのHEV/血清1ml、および100MID50程度の低さのHEV/糞1gを検出することができた。
統計学的分析:
プラセボ群対暴露後ワクチン接種群、およびプラセボ群対異種ウイルスチャレンジ群について、スチューデント−t試験を用いて、肝炎およびHEV感染の定量的パラメータの2つ1組の比較を行った。ダンネット(Dunnett)試験を用いて、プラセボ群と異なる用量の組換えワクチンでワクチン接種した群との多重比較を行った。ターキー(Tukley)試験を用いて、異なる用量でワクチン接種された動物におけるチャレンジ時の抗HEVタイターの多重比較を行った。
統計学的分析のため、1mlの血清中に<10のHEVゲノムを含む血清試料を1:1のタイターであると定め、1gの糞中に<100のHEVゲノムを含む糞試料を1:10のタイターであると定めた。
結果:
プラセボ群におけるE型肝炎感染:
明礬のみでワクチン接種し、HEV SAR-55株でチャレンジした4匹のアカゲザルの各々は、肝炎を発症した。これらの動物における後/前のピークALT比は、カットオフ値である2.0より有意に高く、3.1から10.6の範囲であった(表12)。
肝炎は、組織学的試験の結果により確認した。組織病理学の累積評点は、4.5+から6.0+の範囲であった。各動物においてウイルス血症およびウイルス排出をモニターした。ウイルス血症は5-6週間存在し、ウイルスは合計で5-7週間排出された。陽性血清または糞試料を合わせ、すべての動物についてこれらのプール中のHEVゲノムのタイターを判定した。プールされた血清中のHEVゲノムのタイターは103から104の範囲であり、プールされた糞試料中では106-108の範囲であった。HEVゲノムのタイターは同じHEV SAR-55株でチャレンジしたカニクイザルについて我々が先に報告したものに匹敵した(Tsarev S.A.et al.Proc Natl Acad Sci USA,(1994);191:10198-202)。ウイルス血症およびウイルス排出の持続時間もまた同等であった。
HEV Mex14株でチャレンジした4匹の動物の各々は、定量的な疾患のパラメータで肝炎を発症したが、組織病理学評点は、SAR-55株でチャレンジした動物のものと同様であった(表13)。
感染の定量的パラメータもまた、動物の2つの群で同様であった。すなわち、HEVチャレンジストックは、チャレンジされたそれぞれのそしてすべての動物において肝炎を生じさせることができ、したがって、E型肝炎に対するワクチンの有効性の確認に用いることができた。
暴露後ワクチン接種群におけるE型肝炎の感染:
4匹の動物をSAR-55株でチャレンジした。これらの動物をチャレンジの48時間後に50μg用量のワクチンで、続いて1ヶ月後にブースター用量(50μg)でワクチン接種した。この群ではプラセボ群と比較して疾患または感染のパラメータにおいて有意な相違が認められなかった。ただし、ウイルス血症およびウイルス排出の持続時間は、それぞれ1.5倍および1.7倍減少した(データ示さず)。
ワクチン接種:
50μg、10μgまたは2μg用量のワクチンでワクチン接種したすべての霊長類および0.4μg用量の組換え蛋白質でワクチン接種した4匹のうち3匹は、第1回免疫感作後にHEVにセロコンバージョンした(表12および13)。第1回投与後、ワクチン用量と抗HEVタイターとの間に直接の相関が認められた。相乗平均(GM)は、0.4μg用量では1:32、2μg用量では1:316、10μg用量では1:1,000、50μg用量では1:3,200であった。ワクチンの第2回用量を投与したとき、第2回ワクチン接種の1ヶ月後においてもなお、GMタイターの用量相関的相違が認められたが、その範囲はより狭かった(表14に示されるように、1:1,800と1:5,600の間)。
多重比較試験を用いる抗HEV GMタイターについての統計学的分析は、ワクチンの2回投与後のGMタイターにおける用量相関的相違は有意ではないことを示した。この時点で、アカゲザルをチャレンジした。
同種チャレンジ:
4つの用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した16匹の動物すべてが、生化学的基準に従えば肝炎に対して防護された。すなわち、上昇した血清ALTレベルを示した動物はなかった(表12)。組織学的変化は16匹の動物のうち2匹にのみ認められ、これらは最も低い2つの用量のワクチンを接種されていた。組織学的異常は最小限であり、これらの2匹の動物のうちの1つ(rhesus-5978)は、接種前肝臓試料にも類似の異常が認められたため、HEV感染と関連していそうにもなかった。総合的に、50μg、10μg、2μgまたは0.4μg用量のワクチンで2回ワクチン接種された動物の4つすべての群は、肝炎から防護され、これらの4つの群のそれぞれにおけるE型肝炎の定量的パラメータは、プラセボ群と統計学的に異なるものであった(表14)。
すべてのワクチン接種群の動物がE型肝炎疾患から防護されたが、HEVによる感染に対しては防護されなかった。ワクチンを接種した動物におけるウイルスのタイターは統計学的にプラセボ群より低かったにもかかわらず、大部分の場合、ウイルス血症およびウイルス排出の持続時間は有意に減少しなかった。プラセボ群と比較したとき、ワクチンを接種した動物におけるウイルス血症のレベルは約80倍減少し、ウイルス排出のレベルは平均で約1,000倍減少した。2匹の動物がHEV Mex-14株(ワクチン株と最も遺伝的および地理的に異なる)によるウイルス血症から防護された。50μg用量の組換えワクチンの2回投与により肝炎から防護された(表13)。肝炎の組織学的または生化学的証拠は、これらの動物のいずれにおいても検出されなかった。免疫感作された動物を1群としてプラセボ群と比較したとき、疾患の発現における相違は統計学的に有意であった(表14)。しかし、同種チャレンジの場合と同様に、ほとんどの動物はHEV感染に対して防護されなかった。3匹の動物ではウイルス血症およびウイルス排出の両方とも検出され、4匹目の動物は両方とも経験せず、したがって、感染に対して完全に防護された。プラセボでワクチン接種された動物と比較したとき、ウイルス血症およびウイルス排出のレベルは有意に低下した(約180倍および1,800倍)。ウイルス排出の持続時間における相違は有意であったが、ウイルス血症については有意ではなかった。
まとめると、これらの実験は、2回投与された0.4μg程度の低い用量の組換え蛋白質は、アカゲザルを肝炎から防護することを示した。0.4μg-50μgの範囲のワクチンの2回接種後、抗HEV GMタイターの有意な相違は認められなかった。同種ウイルス株でチャレンジしたとき、すべてのワクチン接種動物は、ALT上昇で測定してE型肝炎から防護されており、より低い用量のワクチンを接種した2匹の動物のみが、最小限の組織病理学を有していた。ワクチンの防護効果を多重群比較により定量したところ、暴露後ワクチン接種群を除き、すべてのワクチン接種霊長類における肝炎の定量的パラメータはプラセボ群より低く、この相違は統計学的に有意であることが示された。さらに、試験した唯一の用量である50μg用量のワクチンを2回受けたワクチン接種動物は、これまでに同定されたうちで最も遺伝的および地理的に異なるHEVの株による異種チャレンジから防護された。これに対し、暴露後ワクチン接種は成功しなかった。チャレンジの48時間後にワクチン接種されたすべての動物は、生化学的基準および組織学的基準の両方により、肝炎を発症した。
血清反応陽性の霊長類は、高用量のHEVでチャレンジした後E型肝炎に対して防護されたが、これらのほとんどはHEV感染に対しては防護されなかった。これは、通常は経口経路で伝染するこのウイルスを静脈内に投与して暴露の均一性を確実にしたため、おそらくは驚くべきことではない。しかし、ウイルス血症およびウイルス排出のレベルで測定した感染の程度は、すべてのワクチン接種動物でプラセボ動物と比較して有意に減少していた。さらに、実際、異種株でチャレンジした1匹の動物はHEVによる感染に対して完全に防護され、HEVの同種株でチャレンジした2匹の動物は、ウイルスを排出したが、検出可能なウイルス血症を有していなかった。我々の先の研究ではより高いパーセンテージの動物が感染から完全に防護された(Tsarev S.A.et al.Proc Natl Acad Sci USA,(1994);191:10198-202)。これは、先の研究においては、1,000および10,000MID50用量のチャレンジウイルスを用いたが、この研究では高い方の用量のみを用いたという事実により説明することができるだろう。霊長類においてはHEV感染に対して用量依存性応答があるため(Tsarev SA,et al.Prospects for prevention of hepatitis E.:Enterically transmitted hepatitis viruses.(Y.Buisson,P.Coursaget,M.Kane eds).La Simarre,Joueles-Tours,France,1996,p.373-383)、各非ワクチン接種動物が明白な肝炎を発症することを確実にするために、高い方の用量を選択した。
この研究および先の研究においては、すべてのプラセボおよびワクチン接種霊長類において、血清中のウイルスのタイターは例外なしに糞中におけるものより低いことが示された(平均約1,000倍)。この知見は、HEVが糞−経口経路で伝染するという事実と一致する。すべてのワクチン接種動物において、プラセボ動物と比較して減少したレベルのウイルス血症およびウイルス排出が認められた。しかし、ウイルス血症の持続時間は、すべてのワクチン接種霊長類においてより短かったが、ほとんどの場合プラセボより有意に減少していなかった。検査した数ダースの霊長類において、ウイルス血症は常に糞中のHEV排出と平行していた。したがって、血清試料をウイルス感染の一次指標として用いることができ、ここで、タイターはHEV感染のレベルを反映するであろう。血清試料は通常は糞試料より容易にに入手可能であるため、このことは重要な所見である。
実施例19
HEV ORF2タンパク質産物の別の精製プロトコル
以下の精製プロトコルは、本願の第89-90頁に開示される精製プロトコルに対する別の態様である。
精製プロトコルは以下のとおりである。
組換えHEV ORF2タンパク質は、不純物を除いたバキュロウイルス感染細胞溶解物および上清媒体から別々に精製した。粗細胞溶解物を負荷緩衝液(50mM Tris-HCl、pH8.0、10mM NaCl)で1:10に希釈した。
不純物を除いた感染細胞上清を、らせんに巻いたセルロース性限外濾過カートリッジ(S1Y10;面積1平方フィート;10,000MWカットオフ;Amicon,Beverly,MA)を用いて、Amicon Proflux M-12限外濾過システムで再循環速度4L/minおよび膜内外圧20psiで、接線流限外濾過により10倍に濃縮した。濃縮した上清を、4倍容量の負荷緩衝液に対して透析濾過(diafilter)した。
透析濾過物または希釈した粗溶解物(1.5ベッド容量)を、Qセファロース・ファスト・フロー強陰イオン交換カラム(XK50カラム、5.0x7.5cm、150ml;Pharmacia,Piscataway,NJ)に、流速10.0ml/minで負荷した。カラムは、1.0ベッド容量の負荷緩衝液で流速10.0ml/minで第1の洗浄を行い、続いて1.0ベッド容量の負荷緩衝液で流速20ml/minで第2の洗浄を行った。タンパク質は、7.5ベッド容量の、同一の緩衝液中の10-300mM NaClの連続直線勾配により、流速20ml/minで溶出した。
Qセファロースカラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)のピークタンパク質画分からの10μlのアリコートを、SDS-PAGEにより分析して、HEV ORF2(+)タンパク質画分を同定した。プールした(+)画分をセファデックスG-25(Pharmacia)および負荷緩衝液を用いてゲル濾過により脱塩した。ピークタンパク質画分を回収し、Source15Q高性能強陰イオン交換カラム(Pharmacia)に負荷して、HEV ORF2ポリペプチドを分離した。カラムを、Qセファロース液体クロマトグラフィーについて上述したように洗浄し溶出した。プールしたHEV ORF2タンパク質(+)画分を上述のようにして同定し、プールし、スーパーデックス75カラム(Pharmacia)によりリン酸緩衝化食塩水(pH6.8)を用いて、最終タンパク質精製のための最終ゲル濾過を行った。HEV ORF2タンパク質画分は、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析により同定した。
このプロトコルにより精製したHEV ORF2タンパク質は、第I相および第II相臨床試験において用いるためのHEVワクチンとして処方するのに適している。
Claims (43)
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質をコードするヌクレオチドからなるDNA分子であって、前記タンパク質がオープンリーディングフレーム2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつオープンリーディングフレーム2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端がある、前記DNA分子。
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質の112番〜607番のアミノ酸をコードするヌクレオチドからなるDNA分子。
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質の112番〜578番アミノ酸をコードするヌクレオチドからなるDNA分子。
- SEQ ID NO:2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつSEQ ID NO:2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端があるタンパク質をコードする、請求項1に記載のDNA分子。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜607番をコードする、請求項2に記載のDNA分子。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜578番をコードする、請求項3に記載のDNA分子。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のDNA分子を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 組換えE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質を産生する方法であって、前記方法が以下の工程:
(a) 前記タンパク質の発現を引き起こすために適切な条件下で、請求項8に記載の宿主細胞を培養すること;そして
(b) 宿主細胞から前記発現されたタンパク質を得ること;
を含む、前記方法。 - オープンリーディングフレーム2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつオープンリーディングフレーム2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端がある、E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質。
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質のアミノ酸112番〜607番からなる、E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質。
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質のアミノ酸112番〜578番からなる、E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質。
- SEQ ID NO:2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつSEQ ID NO:2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端がある、請求項10に記載のE型肝炎ウィルスタンパク質。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜607番からなる、請求項11に記載のE型肝炎ウィルスタンパク質。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜578番からなる、請求項12に記載のE型肝炎ウィルスタンパク質。
- 請求項10に記載のタンパク質、および適した賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
- 請求項11に記載のタンパク質、および適した賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
- 請求項13に記載のタンパク質、および適した賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
- 請求項14に記載のタンパク質、および適した賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
- 哺乳類におけるE型肝炎の予防に使用する医薬組成物を製造するための、請求項10に記載のタンパク質の使用。
- 哺乳類におけるE型肝炎の予防に使用する医薬組成物を製造するための、請求項11に記載のタンパク質の使用。
- 哺乳類におけるE型肝炎の予防に使用する医薬組成物を製造するための、請求項13に記載のタンパク質の使用。
- 哺乳類におけるE型肝炎の予防に使用する医薬組成物を製造するための、請求項14に記載のタンパク質の使用。
- 請求項10に記載のタンパク質を、薬学的に許容可能な担体中に含む、哺乳類をE型肝炎感染に対して免疫化するためのワクチン。
- 請求項11に記載のタンパク質を、薬学的に許容可能な担体中に含む、哺乳類をE型肝炎感染に対して免疫化するためのワクチン。
- 請求項13に記載のタンパク質を、薬学的に許容可能な担体中に含む、哺乳類をE型肝炎感染に対して免疫化するためのワクチン。
- 請求項14に記載のタンパク質を、薬学的に許容可能な担体中に含む、哺乳類をE型肝炎感染に対して免疫化するためのワクチン。
- 請求項10に記載のタンパク質を含む、哺乳類においてE型肝炎を予防するためのキット。
- 請求項11に記載のタンパク質を含む、哺乳類においてE型肝炎を予防するためのキット。
- 請求項13に記載のタンパク質を含む、哺乳類においてE型肝炎を予防するためのキット。
- 請求項14に記載のタンパク質を含む、哺乳類においてE型肝炎を予防するためのキット。
- 単離された生物学的サンプル中においてE型肝炎ウィルスに対する抗体を検出する方法であって、前記方法が以下の工程:
(a) 前記サンプルを、オープンリーディングフレーム2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつオープンリーディングフレーム2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端があるE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質と接触させること;そして
(b) 前記タンパク質と前記抗体との間で形成される免疫複合体を検出し、前記複合体を検出することが、前記サンプル中におけるE型肝炎ウィルスに対する抗体の存在を示すこと;
を含む前記方法。 - 単離された生物学的サンプル中においてE型肝炎ウィルスに対する抗体を検出する方法であって、前記方法が以下の工程:
(a) 前記サンプルを、E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質のアミノ酸112番〜607番からなるE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質と接触させること;そして
(b) 前記タンパク質と前記抗体との間で形成される免疫複合体を検出し、前記複合体を検出することが、前記サンプル中におけるE型肝炎ウィルスに対する抗体の存在を示すこと;
を含む前記方法。 - 単離された生物学的サンプル中においてE型肝炎ウィルスに対する抗体を検出する方法であって、前記方法が以下の工程:
(a) 前記サンプルを、E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2のアミノ酸112番〜578番からなるE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質と接触させること;そして
(b) 前記タンパク質と前記抗体との間で形成される免疫複合体を検出し、前記複合体を検出することが、前記サンプル中におけるE型肝炎ウィルスに対する抗体の存在を示すこと;
を含む方法。 - タンパク質がSEQ ID NO:2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつSEQ ID NO:2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端がある、請求項32に記載の方法。
- タンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜607番からなる、請求項33に記載の方法。
- タンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜578番からなる、請求項34に記載の方法。
- 単離された生物学的サンプル中においてE型肝炎ウィルスに対する抗体を検出する方法において使用するためのキットであって、オープンリーディングフレーム2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつオープンリーディングフレーム2の578番又は607番のアミノ酸にカルボキシ末端があるE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質を含む、前記キット。
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質のアミノ酸112番〜607番からなるE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2タンパク質を含む、単離された生物学的サンプル中においてE型肝炎ウィルスに対する抗体を検出する方法において使用するためのキット。
- E型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2のアミノ酸112番〜578番からなるE型肝炎ウィルスのオープンリーディングフレーム2を含む、単離された生物学的サンプル中においてE型肝炎ウィルスに対する抗体を検出するための方法において使用するためのキット。
- タンパク質がSEQ ID NO:2の112番のアミノ酸にアミノ末端があり、かつSEQ ID NO:2のアミノ酸578番〜607番の範囲内のアミノ酸においてそのカルボキシ末端を有する、請求項38に記載のキット。
- タンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜607番からなる、請求項39に記載の方法。
- タンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸112番〜578番からなる、請求項40に記載の方法。
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