ES2301195T3

ES2301195T3 - Proteinas recombinantes de una cepa paquistani de hepatitis e y su utilizacion en procedimientos de diagnostico y vacunas.

Info

Publication number: ES2301195T3
Application number: ES98919756T
Authority: ES
Inventors: Suzanne U. Emerson; Robert H. Purcell; Sergei A. Tsarev; Robin A. Robinson
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2018-04-09
Also published as: CN1260000A; US6054567A; ATE389021T1; WO1998046761A1; DE69839242T2; ATE530563T1; EP1958958B1; CA2286399C; EP0972048B1; JP2001524821A; JP4390293B2; EP1958958A1; DE69839242D1; CA2286399A1; CN1202252C; AU7247098A; EP0972048A1; AU739915B2

Abstract

Molécula de ADN que presenta una secuencia constituida por nucleótidos que codifican una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E, teniendo dicha proteína su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2.

Description

Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní de hepatitis E y su utilización en procedimientos de diagnóstico y vacunas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la virología de la hepatitis. Más particularmente, la presente invención se refiere a proteínas recombinantes procedentes de una cepa SAR-55 de la hepatitis E del Pakistán transmitida por vía entérica, a los procedimientos de detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E y a las aplicaciones en vacunas que emplean estas proteínas.

Antecedentes de la invención

Se han descrito epidemias de hepatitis E, una hepatitis ni A ni B transmitida por vía entérica, en Asia, África y América central (Balayan, M.S. (1987), Soviet Medical Reviews, apartado E, Virology Reviews, Zhdanov, 0-V.M. (ed), Chur, Suiza: Harwood Academic Publishers, vol. 2, 235-261; Purcell, R.G., et al. (1988) en Zuckerman, A.J. (ed), "Viral Hepatitis and Liver Disease", Nueva York: Alan R. Liss, 131-137; Bradley, D.W. (1990), British Medical Bulletin, 46:442-461; Ticehurst, J.R. (1991) en Hollinger, F.B., Lemon, S.M., Margolis, H.S. (eds): "Viral Hepatitis and Liver Disease", Williams y Wilkins, Baltimore, 501-513). Los casos de hepatitis esporádica, que se supone que son de hepatitis E, totalizan hasta el 90% de la hepatitis descrita en países en los que el virus de la hepatitis E (VHE) es endémico. La necesidad de desarrollar una prueba serológica para la detección de anticuerpos anti-VHE en los sueros de individuos infectados es reconocida generalmente en este campo, pero la concentración muy baja del VHE excretado por seres humanos o animales infectados hace imposible utilizar dicho VHE como fuente de antígenos para las pruebas serológicas y a pesar de que se ha descrito un éxito limitado en la propagación de VHE en el cultivo celular (Huang, R.T. et al. (1992), J. Gen. Virol., 73:1143-1148), el cultivo celular es actualmente demasiado ineficaz para producir las cantidades de antígeno requeridas para las pruebas serológicas.

Recientemente, los esfuerzos realizados en todo el mundo por identificar las secuencias genómicas víricas asociadas a la hepatitis E han dado como resultado la clonación de los genomas de un número limitado de cepas de VHE (Tam, A.W. et al. (1991), Virology, 185:120-131; Tsarev, S.A. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:559-563; Fry, K.E. et al. (1992), Virus Genes, 6:173-185). El análisis de las secuencias de ADN ha conducido a los investigadores a suponer que el genoma del VHE está organizado en tres marcos de lectura abierta (ORF) y a suponer que estos ORF codifican proteínas de VHE intactas.

Una secuencia parcial de ADN del genoma de una cepa de VHE procedente de Burma (Myanmar) se describe en Reyes et al., 1990, Science, 247:1135-1339. Tam et al., 1991, y Reyes et al., solicitud de patente PCT WO 91/15603 publicada el 17 de octubre de 1991 da a conocer la secuencia nucleotídica completa y una secuencia de aminoácidos deducida de la cepa Burma de VHE. Estos autores supusieron que tres marcos de lectura abierta transcritos están contenidos dentro de la secuencia de esta cepa.

Ichikawa et al., 1991, Microbiol. Immunol., 35:535-543, da a conocer el aislamiento de una serie de clones de 240 a 320 nucleótidos de longitud en el cribado de un banco de expresión \lambdagt11 con sueros procedentes de monos Cynomolgus infectados por el VHE. La proteína recombinante expresada por un clon está expresada en E. coli. Esta proteína de fusión está codificada por la zona 3' del ORF-2 de la cepa Myanmar del VHE.

La expresión de las proteínas adicionales codificadas dentro de la zona 3' del ORF-2 de la cepa mejicana del VHE y de una cepa Burmese de VHE está descrita en Yarbough et al., 1991, J. Virology, 65:5790-5797. Este artículo describe el aislamiento de dos clones de ADNc procedentes de VHE. Estos clones codifican las proteínas en la zona 3' de ORF-2. Los clones estaban expresados en E. coli como proteínas de fusión.

Purdy et al., 1992, Archives of Virology, 123:335-349, y Favorov et al., 1992, J. of Medical Virology, 36:246-250, dan a conocer la expresión de un fragmento de proteína mayor de ORF-2 procedente de la cepa Burma en E. coli. Estas referencias, así como las expuestas anteriormente, solamente dan a conocer la expresión de una fracción del gen del ORF-2 que utiliza sistemas bacterianos de expresión. La expresión con éxito de la proteína completa del ORF-2 no se ha dado a conocer hasta la presente invención.

La comparación de la organización del genoma y de la estructura morfológica del VHE es la más íntimamente relacionada con los calicivirus. Es interesante que, las proteínas estructurales de los calicivirus están codificadas por la fracción 3' de su genoma (Neil, J.D. et al. (1991) J. Virol., 65:5440-5447; y Carter, M.J. et al. (1992), J. Arch. Virol., 122:223-235) y aunque no existen pruebas directas de que la parte terminal 3' del genoma del VHE codifica también las proteínas estructurales, la expresión de determinadas pequeñas fracciones de la zona 3' del genoma en células bacterianas resultantes en la producción de las proteínas reactivas con los sueros anti-VHE en ELISA y las inmunoelectrotransferencias Western (Yarborough et al., (1991); Ichikawa et al. (1991); Favorov et al. (1992) y Dawson, G.J. et al. (1992) J. Virol. Meth.; 38:175-186). Sin embargo, la función de la proteína en el ORF-2 como proteína estructural no se demostró hasta la presente invención.

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Los documentos WO 94/06913 y WO 96/10580 dan a conocer proteínas recombinantes procedentes de una cepa de hepatitis E del Pakistán, SAR-55, transmitida por vía entérica y los procedimientos de diagnóstico y las aplicaciones en vacunas que emplean estas proteínas.

El documento WO 95/08632 da a conocer moléculas tales como péptidos, polipéptidos y proteínas que llevan epítopos y en particular epítopos de linfocitos B de proteínas antigénicas codificadas por el virus de la hepatitis E.

El documento WO 96/12807 da a conocer antígenos procedentes de virus de la hepatitis E transmitido por vía entérica y procedimientos de diagnóstico, ensayos para diagnóstico, composiciones de vacunas y procedimientos de vacunas que emplean dichos antígenos.

Las pequeñas proteínas codificadas por la fracción del gen ORF-2 se han utilizado en inmunoanálisis para detectar los anticuerpos contra el VHE en sueros de animales. La utilización de pequeñas proteínas expresadas en bacterias como antígenos en inmunoanálisis serológico adolecen de varios inconvenientes potenciales. En primer lugar, la expresión de estas pequeñas proteínas en las células bacterianas produce problemas de solubilidad y en la reactividad cruzada no específica de los sueros de pacientes con proteínas de E. coli cuando se utilizan los lisados de E. coli en bruto como antígenos en inmunoanálisis (Purdy et al. (1992)). En segundo lugar la utilización de inmunoelectrotransferencias Western como prueba serológica de primera línea para anticuerpos anti-VHE en epidemiología de rutina no es práctica debido a restricciones de tiempo y coste. Un ELISA que utiliza pequeños péptidos procedentes de la parte terminal 3' del genoma del VHE dieron como resultado la detección de solamente 41% de positivos de pacientes conocidos infectados por VHE. En tercer lugar, se ha demostrado que para muchos virus, incluyendo los Picornaviridae, epítopos antigénicos e inmunógenos importantes son muy configuracionales (Lemon, S.M. et al. (1991), en Hollinger, F.B., Lemon, S.M., Margolis, H.S. (eds.): "Viral Hepatitis and Liver disease", Williams y Wilkins, Baltimore, 20-24). Por esta razón, se cree que la expresión en un sistema eucariótico de un ORF completo que codifica un gen del VHE intacto daría como resultado la producción de una proteína que podría formar partículas similares al virus VHE. Dicha proteína completa del ORF tendría una estructura inmunológica más próxima a la de la(s) proteína(s) de la cápside que las pequeñas proteínas indicadas anteriormente que representan solamente fracciones de las proteínas estructurales del VHE. Por consiguiente, estas proteínas completas del ORF servirían probablemente como un antígeno más representativo y un inmunógeno más eficaz que las pequeñas proteínas utilizadas actualmente.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una molécula de ADN que presenta una secuencia constituida por nucleótidos que codifican una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E, teniendo dicha proteína su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2, un vector de expresión recombinante que comprende dicha molécula de ADN y una célula hospedadora que contiene dicho vector de expresión.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de producción de una proteína recombinante del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E, comprendiendo dicho procedimiento:

(a): cultivar una célula hospedadora tal como la descrita anteriormente en condiciones apropiadas para producir la expresión de dicha proteína; y

(b): obtener dicha proteína expresada en la célula hospedadora.

La presente invención se refiere asimismo a una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E que tiene su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2, una composición farmacéutica que comprende dicha proteína y un excipiente, diluyente o portador adecuado, la utilización de dicha proteína en la preparación de un medicamento para su utilización en la prevención de la hepatitis E en un mamífero, una vacuna para inmunizar un mamífero contra la infección por la hepatitis E, comprendiendo dicha vacuna dicha proteína en un portador farmacéuticamente aceptable y un kit para prevenir la hepatitis E en un mamífero, comprendiendo dicho kit dicha proteína.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

(a): poner en contacto dicha muestra con una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E que tiene su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2; y

(b): detectar los complejos inmunitarios formados entre dicha proteína y dichos anticuerpos, en el que la detección de dichos complejos indica la presencia de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en dicha muestra.

La presente invención se refiere asimismo a un kit para su utilización en un procedimiento de detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E que tiene su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2.

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Las secuencias de ácido nucleico capaces de dirigir la producción de proteínas del VHE pueden aislarse de un ADNc o de un banco genómico en el que el gen capaz de dirigir la síntesis de las proteínas del VHE puede ser identificado y aislado. En aras de esta aplicación, la secuencia de ácido nucleico se refiere a ARN, ADN, ADNc o a cualquier variante sintética de los mismos que codifique una proteína.

Los procedimientos de detección de anticuerpos específicos para el virus de la hepatitis E en muestras biológicas son útiles para el diagnóstico de la infección y de las enfermedades producidas por el VHE y para controlar la evolución de dicha enfermedad. Dichos procedimientos son también útiles para controlar la eficacia de los agentes terapéuticos durante el curso del tratamiento de la infección por VHE y de la enfermedad en un mamífero.

Descripción de las figuras

La Figura 1 presenta el vector recombinante utilizado para expresar la proteína completa del ORF-2 del genoma de la cepa SAR-55 del VHE.

Las Figuras 2A y 2B son unos geles de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) en los que los lisados celulares de las células de insecto infectadas con baculovirus natural o baculovirus recombinante (que contiene el gen que codifica a ORF-2) se tiñeron con Coomassie azul (A) o se sometieron a inmunoelectrotransferencia Western con suero de un chimpancé infectado por VHE (B). En ambas Figuras 2A y 2B, la banda 1 contiene el lisado celular completo de las células SF-9 no infectadas. La banda 2 contiene el lisado de las células infectadas con baculovirus natural; la banda 3 contiene el lisado de las células infectadas con baculovirus recombinante y la banda 4 contiene marcadores de peso molecular.

Las Figuras 3A y 3B muestran las micrografías inmunoelectrónicas (IEM) de partículas viroides de 30 y 20 nm respectivamente, que se forman como resultado de la expresión de la proteína en el ORF-2 en las células de insecto infectadas de manera recombinante.

La Figura 4 presenta los resultados de un ELISA utilizando como antígeno, ORF-2 recombinante que estaba expresado en células de insecto que contienen el gen que codifica el ORF-2 completo. Se determinaron los niveles de anticuerpo anti-VHE en el suero a varios tiempos después de la inoculación de monos Cynomolgus con las cepas mejicana (Cyno-80A82, Cyno-A97 y Cyno 83) o paquistaní (Cyno-374) del VHE.

Las Figuras 5A a D presentan los resultados de un ELISA utilizando como antígeno, ORF-2 recombinante que estaba expresado en células de insecto que contienen el gen que codifica el ORF-2 completo. Se determinaron los niveles de IgG o IgM anti-VHE en el suero durante el tiempo tras la inoculación de dos chimpacés con VHE.

Las Figuras 6A a J presentan una comparación de los datos del ELISA obtenidos utilizando como antígeno la proteína en el ORF-2 recombinante completa procedente del SAR-55 como antígeno frente a una proteína ORF-2 recombinante parcial de la cepa Burma del VHE (Genelabs).

Las Figuras 7A a J presentan el ELISA de la IgG anti-VHE y los valores de la alanina-aminotransferasa (ALT) para monos Cynomolgus inoculados con diluciones diez veces en serie (indicado entre paréntesis en la parte superior de cada panel) de una suspensión fecal al 10% de VHE de la SAR-55. Los antígenos recombinantes utilizados en el ELISA fueron: glutatión-S-transferasa (GST); 3-2 (M), una fusión del epítopo 3-2 [Yarbough et al., (1991) J. Virol., 65:5790-5797] y GST; SG3 (B), una fusión de los 327 aminoácidos del terminal C de ORF-2 y GST [Yarbough et al., (1993): Assay Development of diganostic tests for Hepatitis E en "International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Scientific Program and Abstract Volume". Tokyo: VHFL pág. 87]; y un producto de ORF-2 de 55 kDa expresado directamente en células de insecto.

Las Figuras 8A a E presentan el ELISA de la IgM anti-VHE y los valores de la ALT para monos Cynomolgus positivos inoculados con diluciones diez veces en serie (indicado entre paréntesis en la parte superior de cada panel) de una suspensión fecal al 10% de VHE de la SAR-55. Los antígenos recombinantes utilizados en el ELISA fueron: glutatión-S-transferasa (GST); 3-2 (M), una fusión del epítopo 3-2 [Yarbough et al., (1991)] y (GST); SG3 (B), una fusión de los 327 aminoácidos del terminal C del ORF-2 y GST [Yarbough et al., (1993)]; y el producto del ORF-2 de 55 kDa expresado directamente en células de insecto.

La Figura 9 presenta una cepa en bromuro de etidio de un gel de agarosa al 2% en el que se separaron los productos de la PCR producidos a partir de extractos de diluciones diez veces en serie (indicado en la parte superior de cada banda del gel) de la suspensión fecal al 10% del VHE de la SAR-55. La longitud prevista de los productos de la PCR fue aproximadamente de 640 pares de bases y la columna marcada con una (M) contiene marcadores de tamaño del ADN.

La Figura 10 presenta el vector pPIC9 utilizado para expresar la proteína completa del ORF-2 o fragmentos de peso molecular inferior en levadura.

La Figura 11 presenta la organización esquemática del genoma del virus de la hepatitis E (VHE) y los baculovirus recombinantes que codifican los genes de la cápside con ORF-2 del VHE completo (bVHE ORF2 f1) y truncados (bVHE ORF2 5' tr y bVHE ORF2 5'-3' tr) y.

Las Figuras 12A y 12B presentan la expresión temporal proteica del baculovirus recombinante que codifica el gen completo en el ORF2 del VHE. Se infectaron células Sf-9 de insecto a una multiplicidad de infección (MOI) = 5 con virus f1 del ORF2 del bVHE. Las células infectadas y los sobrenadantes del medio se recogieron cada día durante los cuatro días de la infección. Los lisados celulares y los sobrenadantes del medio fueron fraccionados por SDS-PAGE en geles con gradiente de proteína del 8 al 16% y se tiñeron con colorante coloidal Coomassie azul (Figura 12A). Las proteínas de los geles proteicos por duplicado se transfirieron a membranas de nitrocelulosa por inmunoelectrotransferencia y se detectaron las proteínas del VHE cromogénicamente por fijación al anticuerpo (Figura 12B) contra antisueros de chimpancé primarios contra VHE (1:500) seguido de IgG2 humano con antisuero de cabra secundario - fosfatasa alcalina (1:5.000). Banda 1, marcadores de peso molecular azul marino; banda 2, células pseudoinfectadas; banda 3, células 1 día después de la infección (p.i.); banda 4, células 2 días p.i.; banda 5, células 3 días p.i.; banda 6, células 4 días p.i.; banda 7, marcadores azul marino de PM de proteínas; banda 8, sobrenadante pseudoinfectado; banda 9, sobrenadante 1 día p.i.; banda 10, sobrenadante 2 días p.i.; banda 11, sobrenadante 3 días p.i.; banda 12, sobrenadante 4 días p.i. Las asignaciones de bandas son similares para los paneles A y B.

Las Figuras 13A a 13C presentan los perfiles de elución por cromatografía de la proteína de los lisados celulares de las células de insecto infectadas por el virus f1 del ORF2 del bVHE. La Figura 13A presenta el perfil de elución de la proteína en la cromatografía por intercambio aniónico en una columna de intercambio aniónico fuerte Q Sepharose Fast Flow utilizando gradiente lineal de NaCl 0 a 300 mM en un tampón de carga Q. La Figura 13B presenta el perfil de elución proteico de la proteína de 55 kDa del VHE de las fracciones del máximo Q en la columna de intercambio aniónico fuerte de alta resolución SOURCE 15 Q utilizando gradiente lineal de NaCl de 0 a 300 mM en un tampón de carga Q. La Figura 13C presenta el perfil de elución de las fracciones mezcladas procedentes de la cromatografía SOURCE 15 Q que contenía la proteína de 55 kD en la que se sometieron a continuación a filtración en gel en una columna Sephacryl S 200.

La Figura 14 presenta los resultados SDS-PAGE y de la inmunoelectrotransferencia Western de la proteína de 55 kD del VHE contenida en las fracciones de la filtración en gel en una columna Sephacryl G 200. Las fracciones mezcladas que contenían la proteína de 55 kD de la cromatografía SOURCE 15 Q de los lisados celulares se sometieron a filtración en gel en una columna Sephacryl S-200. Las alícuotas de las fracciones de la columna seleccionada se sometieron a análisis de SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia Western (panel inferior) o a un gel NOVEX con gradiente del 8 al 20% teñido con Coomassie azul (panel superior). Las proteínas del VHE fueron detectadas por inmunoelectrotransferencia Western con antisueros de chimpancés convalecientes infectados con VHE. Banda 1, marcadores azul marino de peso molecular de proteína; banda 2, fracciones Q mezcladas; bandas 3 a 12, fracciones de filtración en gel.

La Figura 15 presenta el perfil del péptido de digestión de Lys C de 55 kD en el ORF2 del VHE purificado procedente de lisados celulares de células Sf-9 de insecto infectadas con el virus f1 del ORF2 del bVHE.

La Figura 16 presenta los resultados del análisis del aminoácido del terminal carboxilo de las proteínas de 55 kD en el ORF2 del VHE purificadas a partir de los lisados celulares de las células Sf-9 de insecto infectadas con el virus f1 del ORF2 del bVHE.

La Figura 17 presenta el perfil de la espectroscopia de masas con electroatomización de la proteína de 55 kD del VHE recombinante procedente de los lisados celulares de las células Sf-9 de insecto infectadas con el virus f1 del ORF2 del bVHE.

Las Figuras 18A y 18B presentan la expresión temporal de la proteína de los baculovirus recombinantes que codifican los genes en el ORF2 del VHE. Se infectaron células Sf-9 de insecto a una multiplicidad de infección (MOI) = 5 con virus 5' tr del ORF2 del bVHE o 5'-3' tr durante cuatro días p.i. Las células infectadas y los sobrenadantes del medio se recogieron cada día durante los cuatro días de la infección y se analizaron como se describe en la leyenda a la Figura 12. Las Figuras 18A y B presentan los resultados de SDS-PAGE (bandas 1 a 5) y de la inmunoelectrotransferencia Western (bandas 6 a 10) de las proteínas asociadas a la célula en las infecciones por los virus 5' tr del ORF2 del bVHE (Figura 18A) y 5'-3' tr (Figura 18B) respectivamente. Las Figuras 18C y D presentan los resultados de la SDS-PAGE (bandas 1 a 5) y de la inmunoelectrotransferencia Western (bandas 6 a 10) de las proteínas segregadas en las infecciones por los virus 5' tr del ORF2 del bVHE (Figura 18C) y 5'-3' tr (Figura 18D) respectivamente. Bandas 1 y 6, células pseudoinfectadas; bandas 2 y 7, células 1 día p.i.; bandas 3 y 8, células 2 días p.i.; bandas 4 y 9, células 3 días p.i.; y bandas 5 y 10, células 4 días p.i.

Se utilizaron marcadores azul marino del PM de proteínas para determinar el peso molecular de las proteínas indicadas. El anticuerpo anti-VHE de chimpancés infectados con VHE vivo se utilizó para detectar las proteínas del VHE en inmunoelectrotransferencias Western.

Descripción detallada de la invención

Una cepa SAR-55 del virus de la hepatitis E (VHE) del Pakistán, ha sido aislada y purificada sustancialmente. Se han clonado los genes víricos que codifican las proteínas del VHE y se han expresado las proteínas recombinantes utilizando un sistema de expresión. Más específicamente, se han clonado y expresado los marcos de lectura abierta (ORF) del VHE procedente de la SAR-55.

Se han aislado las proteínas del VHE. Las proteínas del VHE pueden ser sustancialmente homólogas, y más preferentemente biológicamente equivalentes, a las proteínas del VHE natural. Tal como se utiliza en toda la memoria, la expresión "biológicamente equivalente", significa que las composiciones son antigénicas y/o inmunógenas. Las proteínas del VHE pueden estimular también la producción de anticuerpos protectores durante la inyección a un mamífero lo que serviría para proteger al mamífero de la prueba de provocación con un VHE natural. Tal como se utiliza en toda la memoria a continuación "sustancialmente homólogo", significa un grado de homología en la secuencia de aminoácidos para las proteínas del VHE natural. Preferentemente el grado de homología excede del 70%, preferentemente excede del 90%, con un grupo particularmente preferido de proteínas que exceden del 99% homólogo con las proteínas del VHE natural en toda la zona de comparación entre las dos proteínas.

Las proteínas preferidas del VHE son las proteínas que están codificadas por los genes del ORF. De particular interés son las proteínas codificadas por el gen del ORF-2 del VHE y aún más específicamente las proteínas codificadas por el gen del ORF-2 de la cepa SAR-55 del VHE. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas del ORF-1, ORF-2 y ORF-3 se presentan a continuación como SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 2 y SEC. ID. nº: 3, respectivamente:

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SEC ID nº 1

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3

4

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SEC ID nº 2

6

7

8

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SEC ID nº 3

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Las abreviaturas de tres letras siguen la taquigrafía convencional del aminoácido para los veinte aminoácidos naturales.

Las proteínas del VHE recombinantes preferidas comprenden por lo menos una proteína en el ORF. Otras proteínas recombinantes preparadas de más de una de las proteínas iguales o diferentes del ORF pueden prepararse para alterar las propiedades biológicas de la proteína. Se contempla que las adiciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácidos discretos o de secuencias discretas de aminoácidos pueden aumentar la actividad biológica de las proteínas del VHE.

Una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de dirigir la producción de la proteína o proteínas del VHE expuestas anteriormente sustancialmente homólogas a las proteínas del VHE, denominada SAR-55, se publica a continuación como SEC. ID. nº: 4 y fue depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) el 17 de septiembre de 1992 (número de registro en la ATCC 75302).

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Las abreviaturas utilizadas para los nucleótidos son las utilizadas normalmente en la técnica.

La secuencia en una dirección ha sido diseñada por acuerdo como secuencia "más" ya que es la cadena que codifica la proteína de los virus con ARN y ésta es la secuencia mostrada anteriormente como SEC. ID. nº: 4.

Las secuencias deducidas de aminoácidos de los marcos de lectura abierta de SAR-55 tienen las SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 2 y SEC. ID. nº: 3. El ORF-1 comienza en el nucleótido 28 de la SEC. ID. nº: 4 y se prolonga 5078 nucleótidos; el ORF-2 comienza en el nucleótido 5147 de la SEC. ID. nº: 4 y se prolonga 1979 nucleótidos; y el ORF-3 comienza en el nucleótido 5106 de la SEC. ID. nº: 4 y se prolonga 368 nucleótidos.

Se contemplan variaciones en la secuencia del ADN que den como resultado una secuencia de ADN que es capaz de dirigir la producción de análogos de la proteína en el ORF-2. Tal como se utiliza en toda la memoria "análogos de la proteína en el ORF-2" significa una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada en la presente memoria en la que uno o más de los restos mostrados en las secuencias presentadas en la presente memoria ha sido sustituido por un resto biológicamente equivalente de modo que la proteína resultante (es decir, "el análogo") es antigénico y/o inmunógeno. Debido a la degeneración del código genético, debe entenderse que pueden hacerse numerosas elecciones de nucleótidos que conduzcan a una secuencia de ADN capaz de dirigir la producción de las presentes proteínas del ORF o sus análogos.

Un procedimiento para detectar el virus de la hepatitis E en muestras biológicas puede estar basado en la ampliación selectiva de los fragmentos de los genes de la hepatitis E. Preferentemente, este procedimiento utiliza un par de cebadores monocatenarios procedentes de zonas no homólogas de cadenas opuestas de un fragmento doble de ADN, que a su vez procede de un virus de la hepatitis E cuyo genoma contiene una zona homóloga a la secuencia de la SAR-55 mostrada en la SEC. ID. nº: 4. Estos cebadores pueden utilizarse en un procedimiento después del procedimiento de amplificación de secuencias de aminoácidos seleccionadas tal como se define en la patente US nº 4.683.202.

Los polioligonucleótidos u oligonucleótidos complementarios monocatenarios procedentes de secuencias homólogas a la del ADNc de la SAR-55 pueden utilizarse para inhibir la expresión de los genes de la hepatitis E. Estos polioligonucleótidos u oligonucleótidos complementarios pueden ser ADN o ARN. La secuencia dirigida es por lo general, de ARN mensajero y más preferentemente, una secuencia señal requerida para el tratamiento o la traducción del ARN. Los polioligonucleótidos u oligonucleótidos complementarios pueden conjugarse con un policatión tal como la polilisina como se da a conocer en Lemaitre, M. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; y este conjugado puede administrarse a un mamífero en una cantidad suficiente para hibridarse con el ARN mensajero e inhibir la función del mismo.

Un procedimiento con ADN recombinante puede utilizarse para la preparación de proteínas del VHE, preferentemente una proteína compuesta de por lo menos una proteína en el ORF, aún más preferentemente por lo menos una proteína en el ORF-2. La proteína recombinante del ORF puede estar compuesta por una proteína en el ORF o una combinación de las mismas o diferentes proteínas del ORF. Una secuencia del ácido nucleico natural o sintético puede utilizarse para dirigir la producción de las proteínas del VHE. El procedimiento puede comprender:

(a) la preparación de una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir un organismo hospedador para producir una proteína del VHE;

(b) la clonación de la secuencia del ácido nucleico en un vector capaz de ser transferido a un organismo hospedador y replicarse en éste, conteniendo dicho vector elementos operativos para la secuencia del ácido nucleico;

(c) la transferencia del vector que contiene el ácido nucleico y de los elementos operativos al organismo hospedador capaz de expresar la proteína;

(d) el cultivo del organismo hospedador en condiciones apropiadas para la ampliación del vector y la expresión de la proteína; y

(e) la recogida de la proteína.

Un procedimiento para la síntesis del ADN recombinante de una proteína codificada por ácidos nucleicos del VHE, preferentemente una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un ORF del VHE o una combinación de proteínas iguales o diferentes del ORF, aún más preferentemente que codifica por lo menos a una secuencia de aminoácidos del ORF-2, puede comprender:

(a) cultivar un organismo hospedador transformado o transfectado que contiene una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir el organismo hospedador para producir una proteína, en condiciones tales que se produce la proteína, presentando dicha proteína una homología sustancial con una proteína del VHE natural (en toda la zona de comparación entre las dos proteínas) aislada del VHE que contiene la secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. nº: 1, SEC. ID. nº: 2 o SEC. ID. nº: 3, o combinaciones de las mismas.

La secuencia del ARN del genoma vírico de la cepa SAR-55 del VHE puede aislarse y clonarse al ADNc de la manera siguiente. El ARN vírico es extraído de una muestra biológica recogida de monos Cynomolgus infectados con SAR-55 y el ARN vírico se transcribe a continuación a la inversa y es ampliado por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores complementarios a las cadenas más o menos del genoma de una cepa del VHE de Burma (Tam et al. (1991)) o el genoma de SAR-55. Los fragmentos de la PCR se subclonan en pBR322 o pGEM-32 y se secuencian los fragmentos bicatenarios de la PCR.

Los vectores contemplados para su utilización en la presente invención incluyen algunos vectores en los que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico como la descrita anteriormente, junto con cualquier elemento operativo preferido o requerido y cuyo vector a continuación puede transferirse ulteriormente a un organismo hospedador y replicarse en dicho organismo. Los vectores preferidos son aquellos cuyos puntos de restricción han estado bien documentados y que contienen los elementos operativos preferidos o requeridos para la transcripción de la secuencia de ácido nucleico.

Los "elementos operativos" tal como se ha expuesto en la presente memoria incluyen por lo menos un iniciador, por lo menos un codón terminador y cualquier otra de las secuencias de ADN necesarias o preferidas para la transcripción apropiada y la traducción ulterior del ácido nucleico vector. En particular, se contempla que dichos vectores contengan por lo menos un origen de replicación reconocido por el organismo hospedador junto con, por lo menos, un marcador seleccionable y por lo menos una secuencia iniciadora capaz de iniciar la transcripción de la secuencia del ácido nucleico.

En la construcción del vector de clonación de la presente invención, debería indicarse además que en cada vector pueden insertarse múltiples copias de la secuencia del ácido nucleico y sus elementos operativos acompañantes. En dicha forma de realización, el organismo hospedador produciría cantidades mayores por vector de la proteína deseada del VHE. El número de las múltiples copias de la secuencia de ADN (una única secuencia o dos secuencias distintas), que pueden insertarse en el vector está limitado solamente por la capacidad del vector resultante debido a su tamaño, para ser transferida a un microorganismo hospedador apropiado y replicada y transcrita en el mismo.

Los fragmentos del digesto de restricción que contienen una secuencia de codificación para las proteínas del VHE pueden insertarse en un vector de expresión adecuado que funciona en las células procarióticas o eucarióticas. Adecuado significa que el vector es capaz de transportar y expresar una secuencia de ácido nucleico completa que codifica las proteínas del VHE, preferentemente por lo menos una proteína en el ORF. Los vectores de expresión preferidos son los que funcionan en una célula eucariótica. Ejemplos de dichos vectores incluyen pero no se limitan a los vectores útiles para la expresión en levaduras (p. ej., el vector pPIC9 de Invitrogen), los vectores del virus de la vacuna, adenovirus o herpesvirus, preferentemente los vectores de transferencia del baculovirus. Los vectores preferidos son p63-2, que contiene el gen completo del ORF-2, y P59-4, que contiene los genes completos de ORF-3 y ORF-2. Estos vectores fueron depositados en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 UEA el 10 de septiembre de 1992 y que tiene los números de registro 75299 (P63-2) y 75300 (P59-4). Los vectores más preferidos son 5' tr del ORF-2 del bVHE, que codifica los aminoácidos 112 a 660 del ORF-2, 5'-3' tr del ORF-2del bVHE, que codifica los aminoácidos 112 a 607 del ORF-2 y un vector del baculovirus que codifica los aminoácidos 112 a 578 en el ORF2 del VHE. El Ejemplo 1 ilustra la clonación del gen del ORF-2 en pBlueBac para producir el p63-2. Este procedimiento incluye digerir el genoma de la cepa SAR-55 del VHE con las enzimas de restricción NruI y BglII, insertando un polienlazador que contiene las secuencias BlnI y BglII en la única secuencia NheI del vector e insertando el fragmento NruI-BglII de ORF-2 en pBlueBac del BlnI-BglII utilizando un adaptador.

En una forma de realización, el vector de expresión recombinante seleccionado puede transferirse a continuación a un sistema de célula eucariótica adecuado con objeto de expresar la proteína recombinante. Dichos sistemas de células eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, levadura y estirpes celulares tales como HeLa, MRC-5, CV-1, HuH7 o HepG2. Un sistema preferido de células eucarióticas es el de las células Sf9 de insecto. Un procedimiento preferido implica la utilización de los vectores de expresión en baculovirus y la línea celular Sf9 de insecto.

La proteína recombinante expresada puede ser detectada por procedimientos conocidos en la técnica que incluyen la tinción con azul de Coomassie y la inmunoelectrotransferencia de Western utilizando sueros que contienen anticuerpo anti-VHE como se muestra en el Ejemplo 2. Otro procedimiento es la detección de partículas viroides por microscopia inmunoelectrónica como se muestra en el Ejemplo 3.

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En una forma de realización adicional, la proteína recombinante expresada por las células SF9 puede obtenerse como lisado en bruto o puede purificarse por procedimientos de purificación de proteínas convencionales conocidos en la técnica que pueden incluir la precipitación diferencial, la cromatografía en tamices moleculares, la cromatografía de intercambio iónico, el enfoque isoeléctrico, la electroforesis en gel, la afinidad y la cromatografía de inmunoafinidad y similares. En el caso de la cromatografía de inmunoafinidad, la proteína recombinante puede purificarse por el paso a través de la columna que contiene una resina que ha unido a ésta anticuerpos específicos para la proteína en el ORF. En el Ejemplo 16 se describe un ejemplo de protocolos para la purificación de la proteína en el ORF-2 del VHE a partir de lisados celulares clarificados infectados por baculovirus y el medio sobrenadante respectivamente.

En otra forma de realización, las proteínas recombinantes expresadas de la presente invención pueden utilizarse en inmunoanálisis para diagnosticar o pronosticar la hepatitis E en un mamífero que incluye pero no se limita a seres humanos, chimpancés, cercopitécidos, cébidos, otros primates y similares. En una forma de realización preferida, el inmunoanálisis es útil en el diagnóstico de la infección por hepatitis E en seres humanos. El inmunoanálisis que utiliza las proteínas del VHE, particularmente las proteínas del ORF, y especialmente las proteínas del ORF 2, proporciona un método muy específico, sensible y reproducible para diagnosticar las infecciones por VHE, en contraste con el inmunoanálisis que utiliza las proteínas parciales del ORF.

El inmunoanálisis de la presente invención puede ser un radioinmunoanálisis, ensayo de inmunoelectrotransferencia Western, ensayo inmunofluorescente, inmunoanálisis enzimático, ensayo quimioluminiscente, ensayo inmunohistoquímico y similares. Las técnicas habituales conocidas en la materia para ELISA se describen en Methods in Immunodiagnosis, 2ª edición, Rose y Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980 y Campbell et al., Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc., 1964, las cuales están incorporadas en la presente memoria como referencia. Dichos análisis pueden ser un inmunoanálisis directo, indirecto, competitivo o no competitivo tal como está descrito en la técnica. (Oellerich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904). Las muestras biológicas apropiadas para dichos análisis de detección incluyen, pero no se limitan a, extractos de tejidos por biopsia, sangre completa, plasma, suero, fluido cerebro espinal, fluido pleural, orina y similares.

El suero del ensayo puede hacerse reaccionar con un reactivo en fase sólida que tiene una proteína del VHE recombinante unida en la superficie como antígeno, preferentemente una proteína en el ORF o una combinación de diferentes proteínas del ORF tales como ORF-2 y ORF-3, ORF-1 y ORF-3 y similares. Aún más preferentemente, la proteína del VHE es una proteína constituida esencialmente por aminoácidos 112 a 607 en el ORF2 del VHE. El reactivo de la superficie sólida puede prepararse por técnicas conocidas para el acoplamiento de la proteína a un material de soporte sólido. Estos procedimientos de acoplamiento incluyen la adsorción no específica de la proteína al soporte o el enlace covalente de la proteína a un grupo reactivo sobre el soporte. Después de la reacción del antígeno con el anticuerpo anti-VHE, se eliminan los componentes del suero no unidos lavando y el complejo antígeno-anticuerpo se hace reaccionar con un anticuerpo secundario tal como un anticuerpo anti-humano marcado. El marcador puede ser una enzima que se detecta incubando el soporte sólido en presencia de un reactivo fluorimétrico o colorimétrico adecuado. Otros marcadores detectables pueden utilizarse también, tales como radiomarcadores u oro coloidal y similares.

En una forma de realización preferida, la proteína expresada por el vector baculovirus recombinante que contiene la secuencia del ORF-2 de la SAR-55 que codifica los aminoácidos 112 a 607 en el ORF2 del VHE se utiliza como agente de fijación específico para detectar los anticuerpos anti-VHE, preferentemente los anticuerpos de IgG o IgM. El Ejemplo 10 presenta los resultados de un ELISA en el que el reactivo de la fase sólida tiene la proteína recombinante de 55 kilodaltons constituida por los aminoácidos 112 a 607 como antígeno de superficie. Esta proteína es capaz de detectar los anticuerpos producidos en respuesta a diferentes cepas del VHE pero no detecta los anticuerpos producidos en respuesta a la hepatitis A, B, C o D.

La proteína del VHE y análogos pueden prepararse en forma de kit, solos o en combinación con otros reactivos tales como los anticuerpos secundarios, para su aplicación en inmunoanálisis.

Las proteínas recombinantes del VHE, preferentemente una proteína en el ORF o combinación de proteínas del ORF, más preferentemente una proteína en el ORF-2 y proteínas sustancialmente homólogas y análogas pueden utilizarse como vacuna para proteger a los mamíferos contra la prueba de provocación con hepatitis E. La vacuna, que actúa como inmunógeno, puede ser una célula, un lisado celular de células transfectadas con un vector de expresión recombinante o un sobrenadante del cultivo que contiene la proteína expresada. Alternativamente, el inmunógeno es una proteína recombinante parcial o sustancialmente purificada. Aunque es posible que el inmunógeno se administre en forma pura o sustancialmente pura, es preferible presentarlo en forma de composición, formulación o preparación farmacéutica.

Las formulaciones tanto para veterinaria como para aplicación humana, pueden comprender un inmunógeno tal como se ha descrito anteriormente, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El/los portador(es) debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor de la misma. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica farmacéutica.

Todos los procedimientos incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con el portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo a los portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o a ambos, y a continuación, si es necesario, diseñando el producto en la formulación deseada.

Las formulaciones adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal comprenden convenientemente soluciones acuosas estériles del ingrediente activo con soluciones que preferentemente son isotónicas con la sangre del receptor. Dichas formulaciones pueden prepararse convenientemente disolviendo el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles tales como cloruro sódico (p. ej. 0,1 a 2,0 M), glicina y similares y que tienen un pH tamponado compatible con los estados fisiológicos para producir una solución acuosa y hacer estéril dicha solución. Éstos pueden estar presentes en recipientes de dosis unitaria o múltiple, por ejemplo, ampollas o viales sellados.

Las formulaciones de la presente invención pueden incorporar un estabilizador. Estabilizadores ilustrativos son el polietilenglicol, las proteínas, los sacáridos, los aminoácidos, los ácidos inorgánicos y los ácidos orgánicos que pueden utilizarse solos o como mezclas. Estos estabilizadores se incorporan preferentemente en una cantidad entre 0,11 y 10.000 partes en peso por parte en peso de inmunógeno. Si han de utilizarse dos o más estabilizadores, su cantidad total está comprendida preferentemente dentro del intervalo especificado anteriormente. Estos estabilizadores se utilizan en soluciones acuosas a la concentración y pH apropiados. La presión osmótica específica de dichas soluciones acuosas está comprendida generalmente en el intervalo entre 0,1 y 3,0 osmoles, preferentemente en el intervalo entre 0,8 y 1,2. El pH de la solución acuosa se ajusta para que esté comprendido dentro del intervalo entre 5,0 y 9,0, preferentemente dentro del intervalo entre 6 y 8. Al formular el inmunógeno de la presente invención, puede utilizarse un agente contra la adsorción.

Pueden emplearse procedimientos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Las preparaciones de liberación controlada pueden conseguirse mediante la utilización de polímero para acomplejar o absorber las proteínas o sus derivados. La administración controlada puede ejercerse seleccionando macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliéster, poliaminoácidos, polividona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina) y la concentración de macromoléculas así como los procedimientos de incorporación con objeto de controlar la liberación. Otro posible procedimiento para controlar la duración de la acción mediante preparaciones de liberación controlada consiste en incorporar las proteínas, los análogos de proteínas o sus derivados funcionales, en las partículas de un material polimérico tales como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de etileno y acetato de vinilo. Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes dentro de partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de aglomeración, o mediante polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente o en sistemas de administración coloidales de fármacos, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas o en
macroemulsiones.

Cuando se desean preparaciones orales, las composiciones pueden combinarse con portadores típicos, tales como lactosa, sacarosa, almidón, talco, estearato de magnesio, celulosa cristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, glicerina, alginato sódico o goma arábiga entre otros.

Las proteínas de la presente invención pueden suministrarse en forma de kit, solas o en forma de una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente.

La vacunación puede realizarse por procedimientos convencionales. Por ejemplo, puede utilizarse el inmunógeno en un diluyente adecuado tal como solución salina o agua o adyuvantes completos o incompletos. Además, el inmunógeno puede estar unido o no a un portador para hacer inmunógena la proteína. Ejemplos de dichas moléculas de portador incluyen pero no se limitan a la albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de la lapa californiana (KLH), vacuna contra el tétanos y similares. El inmunógeno puede administrarse por cualquier vía apropiada para la producción de anticuerpos tales como intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea y similares. El inmunógeno puede administrarse una vez o a intervalos periódicos hasta que se produzca un valor significativo de anticuerpo anti-VHE. El anticuerpo puede ser detectado en el suero utilizando inmunoanálisis.

Un inmunógeno puede ser una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la síntesis del organismo hospedador de una proteína en el ORF del VHE. Dicha secuencia de ácido nucleico puede insertarse en un vector de expresión adecuado por procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los vectores de expresión adecuados para producir la transferencia génica con gran eficacia in vivo incluyen, pero no se limitan a, los vectores retrovíricos, adenovíricos y víricos de las vacunas. Los elementos operativos de dichos vectores de expresión se dan a conocer anteriormente en la presente memoria y son conocidos por un experto en la materia. Dichos vectores de expresión pueden administrarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal u oral.

La transferencia génica directa puede realizarse por inyección intramuscular, por ejemplo, de vectores de expresión eucarióticos a base de plásmidos que contienen una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la síntesis del organismo hospedador de la(s) proteína(s) del ORF del VHE. Dicho método se ha utilizado anteriormente para producir el antígeno de superficie de la hepatitis B in vivo y produjo una respuesta del anticuerpo contra el antígeno de superficie (Davis, H.L. et al. (1993) Human Molecular Genetics, 2:1847-1851; véase también Davis et al. (1993) Human Gene Therapy, 4:151-159 y 733-740) y Davis, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:7213-7218).

Cuando el inmunógeno es una proteína en el ORF del VHE recombinante parcial o sustancialmente purificada, las dosis eficaces para provocar una respuesta protectora del anticuerpo contra el VHE están comprendidas entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 100 \mug. Un intervalo más preferido es entre aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 70 \mug y un intervalo aún más preferido está comprendido entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 50 \mug.

Las dosis de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína en el ORF del VHE eficaces para provocar una respuesta protectora del anticuerpo contra el VHE oscilan entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5.000 \mug; siendo un intervalo más preferido entre aproximadamente 300 y aproximadamente 2.000 \mug.

Los vectores de expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la síntesis del organismo hospedador de una(s) proteína(s) del ORF del VHE pueden suministrarse en forma de kit, solos o en forma de una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente.

La administración del inmunógeno de la presente invención puede ser con fines profilácticos o terapéuticos. Cuando se proporciona con fines profilácticos, el inmunógeno se proporciona con antelación a cualquier exposición al VHE o con antelación a cualquier síntoma debido a la infección por el VHE. La administración profiláctica del inmunógeno sirve para impedir o atenuar cualquier infección ulterior por VHE en un mamífero. Cuando se proporciona por vía terapéutica, el inmunógeno se proporciona al comienzo (o justamente después) de la infección o al comienzo de cualquier síntoma de infección o enfermedad producido por el VHE. La administración terapéutica del inmunógeno sirve para atenuar la infección o la enfermedad.

Una vacuna puede prepararse utilizando la proteína recombinante del ORF-2 expresada por la secuencia del ORF-2 de la cepa SAR-55 del VHE y equivalentes de la misma. Dado que la proteína recombinante del ORF-2 se ha demostrado que proporciona protección contra la prueba de provocación con cepas de VHE heterólogas u homólogas, su utilidad en la protección contra una variedad de cepas de VHE está indicada.

Además de utilizarse como vacuna, las composiciones pueden utilizarse para preparar anticuerpos contra partículas viroides del VHE. Los anticuerpos pueden utilizarse directamente como agentes antivíricos. Para preparar anticuerpos, se inmuniza un animal hospedador utilizando las partículas de virus o, cuando proceda, antígenos naturales no en partículas contra la partícula vírica se unen a un portador como se ha descrito anteriormente para las vacunas. El suero o plasma del hospedador se recoge después de un intervalo de tiempo apropiado para proporcionar una composición que comprende anticuerpos reactivos con la partícula vírica. La fracción de gamma globulina o los anticuerpos IgG pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la utilización de sulfato amónico saturado o de DEAE Sephadex, u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Los anticuerpos están sustancialmente exentos de muchos de los efectos secundarios desfavorables que pueden estar asociados a otros agentes antivíricos tales como los fármacos.

Las composiciones de anticuerpo pueden prepararse aún más compatibles con el sistema hospedador minimizando las potenciales respuestas desfavorables del sistema inmunitario. Esto se lleva a cabo eliminando toda o una parte de la fracción de Fc de un anticuerpo de especie extraña o utilizando un anticuerpo de las mismas especies que el animal hospedador, por ejemplo, la utilización de anticuerpos de hibridomas humano/humano. Los anticuerpos humanizados (es decir, no inmunógenos en un ser humano) pueden producirse, por ejemplo, sustituyendo una fracción inmunógena de un anticuerpo por una fracción correspondiente, pero no inmunógena (es decir, anticuerpos híbridos). Dichos anticuerpos híbridos pueden contener el reactivo o el antígeno que se une a la fracción de un anticuerpo de una especie y la fracción Fc de un anticuerpo (no inmunógeno) de una especie diferente. Ejemplos de anticuerpos híbridos, incluyen pero no se limitan a, híbridos de mamífero no humano-humano, híbridos de roedor-humano, híbridos murino-humano y rata-humano (Robinson et al., solicitud de patente internacional nº 184.187; Taniguchi M., solicitud de patente europea nº 171.496; Morrison et al., solicitud de patente europea nº 173.494; Neuberger et al., solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439; Nishimura et al., 1987 Canc. Res. 47:999; Wood et al., 1985 Nature 314:446; Shaw et al., 1988 J. Natl. Cancer Inst. 80:15553, incorporadas todas a la presente memoria como referencia).

Estudios generales de anticuerpos híbridos "humanizados" son proporcionados por Morrison S., 1985 Science 229:1202 y por Oi et al., 1986 BioTechniques 4:214.

Los anticuerpos "humanizados" adecuados pueden producirse alternativamente por sustitución de CDR o CEA (Jones et al., 1986 Nature 321:552; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534; Biedler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053, incorporadas todas a la presente memoria como referencia).

Los fragmentos que se unen a los anticuerpos o al antígeno pueden también producirse por ingeniería genética. La tecnología para la expresión de los genes de cadena tanto pesada como ligera en E. coli es el tema de las solicitudes de patente PCT; las publicaciones número WO 901443, número WO 901443 y número WO 9014424 y en Huse et al., 1989 Science 246:1275-1281.

Los anticuerpos pueden utilizarse también como un medio de aumentar la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden administrarse en cantidades similares a las utilizadas en otras administraciones terapéuticas de anticuerpos. Por ejemplo, la gammaglobulina combinada se administra a razón de 0,02 a 0,1 ml/lb de peso corporal durante el periodo de incubación inicial de otras enfermedades víricas tales como la rabia, sarampión y hepatitis B para interferir con la introducción vírica en las células. De este modo, los anticuerpos reactivos con las partículas víricas de VHE pueden administrarse de forma pasiva solas o junto con otros agentes antivíricos a un hospedador infectado con un VHE para aumentar la eficacia de un fármaco antivírico.

Alternativamente, pueden producirse anticuerpos anti-VHE administrando anticuerpos anti-idiotipo como inmunógenos. De manera conveniente, una preparación purificada de anticuerpo anti-VHE preparada como se ha descrito anteriormente se utiliza para producir anticuerpo anti-idiotipo en un animal hospedador. La composición se administra al animal hospedador en un diluyente adecuado. Después de la administración, la administración repetida normalmente, el hospedador produce anticuerpo anti-idiotipo. Para eliminar una respuesta inmunógena a la zona Fc, pueden utilizarse los anticuerpos producidos por la misma especie que el animal hospedador o puede eliminarse la zona Fc de los anticuerpos administrados. Después de la producción del anticuerpo anti-idiotipo en el animal hospedador, se elimina el suero o el plasma para proporcionar una composición de anticuerpo. La composición puede purificarse como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos anti-VHE, o por cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos anti-VHE unidos a la matriz de afinidad. Los anticuerpos anti-idiotipo producidos son de configuración similar al VHE-antígeno auténtico y pueden utilizarse para preparar una vacuna de VHE en lugar de utilizar un antígeno con partículas de VHE.

Cuando se utiliza como medio de producción de anticuerpos antivíricos en un animal, la manera de inyectar el anticuerpo es la misma que con fines de vacunación, a saber por vía intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o similares en una concentración eficaz en un diluyente fisiológicamente adecuado con o sin adyuvante. Pueden ser deseables una o más inyecciones de refuerzo.

Las proteínas derivadas del VHE de la invención están concebidas asimismo para su aplicación en la producción de antisuero diseñado para la profilaxis antes o después de la exposición. En este caso, una proteína del VHE, o la mezcla de proteínas se formula con un adyuvante adecuado y se administra por inyección a voluntarios humanos, según procedimientos conocidos para producir antisueros humanos. La respuesta del anticuerpo a las proteínas inyectadas se controla, durante un periodo de varias semanas después de la inmunización, mediante toma de muestras de suero periódicas para detectar la presencia de anticuerpos en el suero anti-VHE, utilizando un inmunoanálisis como se ha descrito en la presente memoria.

El antisuero de individuos inmunizados puede administrarse como medida profiláctica antes de la exposición a individuos que están en situación de riesgo de contraer la infección. El antisuero es también útil para tratar a un individuo después de la exposición, lo mismo que la utilización de antisuero con valor alto contra el virus de la hepatitis B para la profilaxis después de la exposición. Desde luego, los expertos en la materia entenderían fácilmente que la inmunoglobulina purificada (inmunoglobulina del VHE) procedente del antisuero de individuos inmunizados utilizando técnicas habituales puede utilizarse como medida profiláctica antes de la exposición o en el tratamiento de individuos después de la exposición.

Tanto para la utilización in vivo de anticuerpos contra partículas viroides del VHE y proteínas y anticuerpos anti-idiotipo como para utilizaciones de diagnóstico, puede ser preferible utilizar anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales de partículas antivíricas o los anticuerpos anti-idiotipo pueden producirse de la manera siguiente. Los esplenocitos o linfocitos procedentes de un animal inmunizado se separan y se inmortalizan o se utilizan para preparar hibridomas por los métodos conocidos por los expertos en la materia (Goding, J.W. 1983. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, NY, págs. 56-97). Para producir un hibridoma humano-humano, se selecciona un donante humano de linfocitos. Un donante que se conoce que está infectado con VHE (cuando se ha presentado la infección por ejemplo por la presencia de anticuerpos anti-virus en la sangre o por cultivo del virus) puede servir como donante de linfocitos adecuado. Los linfocitos pueden aislarse de una muestra de la sangre periférica o pueden utilizarse esplenocitos si el donante está sometido a esplenectomía. Puede utilizarse el virus de Epstein-Barr (EBV) para inmortalizar los linfocitos humanos o puede utilizarse un acompañante humano de fusión para producir hibridomas humano-humano. Puede utilizarse también la inmunización primaria in vitro para la generación de anticuerpos monoclonales humanos.

Los anticuerpos segregados por las células inmortalizadas se identifican para determinar los clones que segregan anticuerpos de la especificidad deseada. Para los anticuerpos monoclonales de partículas anti-virus, los anticuerpos deben unirse a las partículas víricas del VHE. Para los anticuerpos monoclonales anti-idiotipo, los anticuerpos deben unirse a anticuerpos con partículas anti-víricas. Se seleccionan las células que producen anticuerpos de la especificidad deseada.

En otra forma de realización, los anticuerpos monoclonales proceden de la recogida del ARN mensajero que codifica los genes V de los linfocitos B de seres humanos o chimpancés que son inmunes al antígeno de interés. Los ARN mensajeros que codifican las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas se amplían por la reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa, combinada al azar y clonada en fago filamentoso para expresión. Los fagos se seleccionan a continuación para el transporte de los anticuerpos de interés por el ensayo de adherencia celular sobre plástico "panning" sobre el antígeno de selección, que está unido a una fase sólida. El fago recuperado que expresa las secuencias de combinación de los anticuerpos homólogos al antígeno se amplía y los genes del anticuerpo que llevan se reúnen para codificar las moléculas completas del anticuerpo. Dichos anticuerpos, específicos contra el antígeno de interés, se expresan en E. coli, se purifican y se utilizan como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos monoclonales humanos. La generación de anticuerpos monoclonales humanos de bancos combinatorios está descrita, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R., y Winter, G., (1992) Journal of Molecular Biology, volumen 227, páginas 381-388, y en Chanock, R.M., et al., (1993) Infectious Agents and Disease, volumen 2, páginas 118-131.

Los anticuerpos descritos anteriormente y los fragmentos de los mismos que se unen al antígeno pueden suministrarse en forma de kit solo, o en forma de composición farmacéutica para su utilización in vivo. Los anticuerpos pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas, aplicaciones de diagnóstico en inmunoanálisis o en forma de un agente de inmunoafinidad para purificar las proteínas del ORF como se ha descrito en la presente memoria.

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Material

Los materiales utilizados en los Ejemplos fueron los siguientes:

Primates. Chimpancé (Chimp) (Pan troglodytes). Cercopitécidos: monos cynomolgus (Cyno) (Macaca fascicularis), monos rhesus (Rhesus) (M. mulatta), monos de cola de cerdo (PT) (M. nemestrina) y monos verdes africanos (AGM) (Cercopithecus aethiops). Cébidos: tamarines bigotudos (Tam) (Saguinus mystax), monos ardilla (SQM) (Saimiri sciureus) y monos búho (OWL) (Aotus trivigatus). Los primates se enjaularon individualmente en condiciones de contención del riesgo biológico. El enjaulado, mantenimiento y cuidado de los animales reunía o superaba todos los requisitos para la conservación de primates.

La mayoría de los animales fueron inoculados por vía intravenosa con VHE, cepa SAR-55 contenida en 0,5 ml de suspensión de heces diluida en suero de ternero fetal como se describe en Tsarev, S.A. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, 89:559-563; y Tsarev, S.A. et al. (1993), J. Infect. Dis. (167:1302-1306). El Chimp-1313 y el 1310 se inocularon con un grupo de heces recogidas de 7 pacientes paquistaníes de hepatitis E.

Se recogieron muestras de suero aproximadamente dos veces a la semana antes y después de la inoculación. Se analizaron las concentraciones en el suero de las enzimas hepáticas alanina-aminotransferasa (ALT), isocitrato deshidrogenasa (ICD) y gamma-glutamil transferasa (GGT) por ensayos disponibles en el mercado (Medpath Inc., Rockville, MD). Se realizaron ensayos serológicos como se ha descrito anteriormente.

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Ejemplo 1 Identificación de la secuencia del ADN del genoma de la cepa SAR-55 del VHE

Preparación de la plantilla del ARN del virus para la PCR. La bilis de un mono cynomolgus infectado con VHE (10 \mul), SDS al 20% (p/v) (hasta una concentración final del 1%), proteinasa K (10 mg/ml; hasta una concentración final de 1 mg/ml), 1 \mul de ARNt (10 mg/ml) y 3 \mul de EDTA 0,5 M se mezclaron en un volumen final de 250 \mul y se incubaron durante 30 min. a 55ºC. Se extrajeron todos los ácidos nucleicos de la bilis dos veces con fenol/cloroformo, 1:1 (vol/vol), a 65ºC y una vez con cloroformo, a continuación se precipitaron con etanol, se lavaron con etanol al 95% y se utilizaron para la RT-PCR. La ampliación por RT-PCR del ARN del VHE de las heces y especialmente del suero fue más eficaz cuando el ARN se purificó más extensamente. Se trató suero (100 \mul) o una suspensión fecal al 10% (200 \mul) como anteriormente con proteinasa K. Después de una incubación durante 30 min., se añadieron 300 \mul de tampón CHAOS (tiocianato de guanidina 4,2 M/lauroilsarcosina 0,5 N/Tris-HCl 0,025 M, pH 8,0). Se extrajeron los ácidos nucleicos dos veces con fenol/cloroformo a 65ºC seguido de extracción con cloroformo a temperatura ambiente. A continuación, se añadió acetato amónico 7,5 M (225 \mul) a la fase superior y se precipitaron los ácidos nucleicos con 0,68 ml de 2-propanol. Se disolvió el sedimento en 300 \mul de tampón CHAOS y se añadieron 100 \mul de H_{2}O. La extracción en cloroformo y la precipitación con propanol se repitieron. Se disolvieron los ácidos nucleicos en agua, se precipitaron con etanol, se lavaron con etanol al 95% y se utilizaron para la RT-PCR.

Cebadores. Se sintetizaron noventa y cuatro cebadores, de 21 a 40 nucleótidos (nt) de longitud y complementarios a las cadenas más o menos del genoma de una cepa de VHE de Burma (BUR-121) (Tam, A.W. et al. (1991), Virology 185:120-131) o el genoma de SAR-55 utilizando un sintetizador de ADN modelo 391 de Applied Biosystems.

Las secuencias de estos 94 cebadores se presentan a continuación comenzando en la SEC. ID. nº: 5 y continuando hasta la SEC. ID. nº: 98:

Listado del cebador de VHE

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Las abreviaturas a la izquierda de las secuencias representan lo siguiente: R y D se refieren a cebadores inversos y directos, respectivamente; B y S se refieren a las secuencias procedentes de la cepa Burma-121 de la Hepatitis E y de la cepa SAR-55 de la Hepatitis E, respectivamente; 5'NC y 3'NC se refieren a las zonas no codificadoras 5 prima y 3 prima del genoma del VHE, respectivamente; y 1, 2 y 3 se refieren a la secuencia procedente de los marcos de lectura abierta 1, 2 ó 3, respectivamente. El símbolo (), mostrado a la derecha de algunas secuencias indica la inserción de una secuencia de restricción artificial en estas secuencias.

Para la clonación de los fragmentos de PCR, las secuencias de restricción EcoRI, BamHI o BglII precedidas por 3 a 7 nt se añadieron al extremo 5' de los cebadores.

RT-PCR. La mezcla habitual de 100 \mul de RT-PCR contenía la plantilla Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, los cuatro dNTP (cada uno a 0,2 mM), 50 pmoles del cebador directo, 50 pmoles del cebador inverso, 40 unidades de RNasin (Promega), 16 unidades de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Promega), 4 unidades de AmpliTaq (Cetus), en 100 \mul de aceite mineral ligero. La mezcla se incubó 1 h a 42ºC y a continuación se amplió mediante 35 ciclos de PCR; 1 min. a 94ºC, 1 min. a 45ºC y 1 min. a 72ºC. Los productos de la PCR se analizaron en geles de agarosa al 1%.

Clonación de los fragmentos de PCR. Los fragmentos de PCR que contenían las secuencias de restricción en los extremos se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI o EcoRI y BglII y se clonaron en el pBR322 o pGEM-3Z (Promega) digeridos con EcoRI/BamHI. Alternativamente, los fragmentos de la PCR se clonaron en pCR1000 (Invitrogen) utilizando el kit de clonación TA (Invitrogen).

Secuenciado de los fragmentos de PCR y de los plásmidos. Los fragmentos de la PCR se escindieron de los geles de agarosa al 1% y se purificaron por Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA). Los fragmentos de la PCR bicatenarios se secuenciaron utilizando Sequenase (United States Biochemical) como se describe en Winship, P.R. (1984), Nucleic Acids Rev., 17:1266. Los plásmidos bicatenarios purificados a través de gradientes de CsCl se secuenciaron con un kit de Sequenase (United States Biochemical).

Análisis informático de las secuencias. Las secuencias nucleotídicas de las cepas de VHE se compararon utilizando el paquete informático Genetics Computer Group (Madison, WI) (Devereaux, J. et al. (1984), Nucleic Acids Rev., 12:387-395, versión 7.5, en un ordenador VAX 8650 (en el National Cancer Institute, Frederick, MD)).

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Ejemplo 2 Construcción de un vector de expresión recombinante, P63-2

Se utilizó un plásmido que contiene el ORF-2 completo del genoma de la cepa SAR-55 del VHE (Tsarev, S.A. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, 89:559-563) para obtener un fragmento de restricción NruI-BglII. El NruI corta el ADNc del VHE cinco nucleótidos corriente arriba del codón de iniciación ATG del ORF-2. Una secuencia artificial BglII se ha colocado en el extremo 3' del genoma del VHE inmediatamente antes de la secuencia poli A (Tsarev, S.A. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, 89:559-563). Para insertar este fragmento en el vector de transferencia pBlueBac (Invitrogen) se introdujo un polienlazador sintético en la única secuencia NheI en el vector. Este polienlazador contenía las secuencias BlnI y BglII que están ausentes en ambas secuencias en el ADNc del VHE y en el pBlueBac. El fragmento NruI-BglI del ORF-2 se insertó en BlnI-BglII del pBlueBac utilizando un adaptador como se muestra en la Fig. 1.

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Ejemplo 3 Expresión de p63-2 en células de insecto SF9

El p63-2 y el ADN del baculovirus AcMNPV (Invitrogen) se cotransfectaron en células SF9 (Invitrogen) por el procedimiento de precipitación con Ca según el protocolo de Invitrogen. Siguiendo este protocolo, el ADN del baculovirus AcMNPV puede producir un baculovirus vivo intacto que puede concentrar el p63-2 para formar un baculovirus recombinante. Este baculovirus recombinante se purificó en placa 4 veces. El baculovirus recombinante 63-2-IV-2 se utilizó para infectar las células SF9.

SDS-PAGE y inmunoelectrotransferencia Western. Las células de insecto se volvieron a poner en suspensión en tampón de carga (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, DTT 100 mM, SDS al 2%, azul de bromofenol al 0,1% y glicerol al 10%) y se realizó la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida como se ha descrito, Laemmli, U.K. (1970), Nature, 227:680. Se tiñeron los geles con azul de Coomassie o se electrotransfirieron las proteínas sobre filtros BA-85 de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Después de la transferencia, se bloquearon las membranas de nitrocelulosa en PBS que contenía suero de ternero fetal al 10% y gelatina al 0,5%. Como anticuerpo primario, se utilizó el hiperanti-suero de chimpancé-1313 diluido 1:1.000. Como anticuerpo secundario, se utilizó anticuerpo contra la IgG humana de cabra purificado por afinidad y marcado con fosfatasa (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc.) diluido 1:2.000. Se revelaron los filtros en sustrato estabilizado azul Western para fosfatasa alcalina (Promega). Todas las incubaciones se realizaron en solución de bloqueo y los lavados se hicieron con PBS con Tween-20 al 0,05% (Sigma).

Expresión del ORF-2 del VHE. La proteína mayor sintetizada en células SF9 infectadas con baculovirus recombinante 63-2-IV-2 era una proteína con un peso molecular aparente de 74 kD (Fig. 2A, banda 3). Este tamaño es un poco mayor que el previsto para el ORF-2 completo (71 kD). La diferencia de tamaño podía ser debida a la glucosilación de la proteína ya que existe por lo menos una secuencia potencial de glucosilación (Asn-Leu-Ser) en la parte N-terminal. Esta proteína no fue detectada en las células no infectadas (Figura 2A, banda 1) o en las células infectadas con un baculovirus no recombinante natural (Figura 2A, banda 2). En este último caso, la proteína mayor detectada fue una proteína poliédrica. Cuando se analizaron los mismos lisados por inmunoelectrotransferencia Western (Figura 2B) con suero de chimp-1313 (hiperinmunizado con VHE), solamente reaccionaron las proteínas en el lisado celular recombinante (banda 3) y la banda mayor estaba representada de nuevo por una proteína de 74 kD (Fig. 2B). Las bandas menores de aproximadamente 25, 29, 35, 40 a 45 y 55 a 70 kDa presentes en el gel teñido con Coomassie (Fig. 2A, banda 3) reaccionaron también con suero en la inmunoelectrotransferencia Western (Figura 2B, banda 3). Algunas de las bandas que tienen pesos moleculares superiores a 74 kDa resultan de diferentes extensiones de glucosilación, mientras que las bandas de peso molecular menor podían reflejar tratamiento y/o degradación. El suero extraído de chimp-1313 antes de la inoculación con VHE no reaccionó con ninguna de las proteínas por inmunoelectrotransferencia Western.

Ejemplo 4 Microscopía inmunoelectrónica de células SF9 recombinantes infectadas

Se sometieron 5\times10^{6} células SF9 recombinantes infectadas a ultrasonidos en CsCl (1,30 g/ml) que contenían Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, sarcosil al 0,3% y se centrifugaron durante 68 h a 40.000 rpm (SW60Ti). Se diluyeron en 1 ml de PBS, 50 \mul de la fracción que presentaba la respuesta mayor a ELISA y una densidad ligera de 1,30 g/ml y se añadieron 5 \mul de hiperanti-suero de chimp-1313. El hiperanti-suero se preparó volviendo a realizar una prueba de provocación a un chimpancé infectado previamente con una segunda cepa de hepatitis E (VHE mejicano). Se incubaron las muestras 1 h a temperatura ambiente y a continuación durante la noche a 4ºC. Los complejos inmunitarios se precipitaron utilizando una centrifugadora SW60Ti a 30.000 rpm, 4ºC, 2 h. Se volvieron a poner en suspensión los sedimentos en agua destilada, se tiñeron por contraste con PTA al 3%, se colocaron sobre rejillas de carbono y se examinaron a 40.000 aumentos en un microscopio electrónico EM-10, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania.

Detección de las VLP. Lisados celulares de células de insecto infectadas con baculovirus 63-2-IV-2 natural o recombinante se fraccionaron por centrifugación por densidad con CsCl. Cuando las fracciones del gradiente en CsCl procedente de células de insecto recombinantes infectadas se incubaron con hiperanti-suero de Chimp-1313, se observaron dos tipos de partículas viroides (VLP) recubiertas con anticuerpo en la fracción de densidad ligera de 1,30 g/ml: en primer lugar (Fig. 3A), partículas individuales recubiertas de anticuerpo que tenían un tamaño (30 nm) y estructura morfológica sugerente de VHE, en segundo lugar (Fig. 3B) agregados recubiertos de anticuerpo de partículas menores que el VHE (aproximadamente 20 nm), pero que por otra parte se asemejaban al VHE. La EM directa mostró la presencia de una población muy heterogénea de objetos incluyendo algunos de 30 y 20 nm de diámetro respectivamente, que parecían partículas de virus pero, en ausencia de anticuerpo ligado, no se pudieron confirmar como VHE. Numerosos experimentos por IEM sugirieron que por lo menos alguna(s) de la(s) proteína(s) sintetizada(s) a partir de la zona ORF-2 del genoma del VHE, se había(n) montado en una estructura de partículas. Se observó que las células de insecto en una etapa posterior de la infección, cuando la proporción de proteínas más pequeñas era mayor, dio continuamente mejores resultados en el ELISA. Por consiguiente, los lisados no fraccionados de las células de insecto recombinantes
de una etapa posterior de la inferior se utilizaron como antígeno en el ELISA en las pruebas ulteriores.

Ejemplo 5 Detección por ELISA basado en antígeno de células de insecto que expresan el ORF-2 completo del anti-VHE después de la infección con diferentes cepas de VHE

Se volvieron a poner en suspensión 5\times10^{6} células SF9 infectadas con virus 63-2-IV-2 en 1 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M a continuación se congelaron y se descongelaron 3 veces. Se disolvieron 10 \mul de esta suspensión en 100 ml de tampón de carbonato (pH 9,6) y se utilizaron para cubrir una placa flexible de ensayo de microlitro (Falcon). Las muestras de suero se diluyeron 1:20, 1:400 y 1:8.000 o 1:100, 1:1.000 y 1:10.000. Se utilizaron en el ELISA las mismas soluciones de bloqueo y lavado descritas para la inmunoelectrotransferencia Western. Como anticuerpo secundario, se utilizó la fracción de IgG de cabra conjugada con peroxidasa contra IgG humana o inmunoglobulina de anti-cercopitécido o anti-cébido de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante. Los resultados se determinaron midiendo la densidad óptica (D.O.) a 405 nm.

Para determinar si el antígeno derivado de la célula de insecto que representa una cepa paquistaní de VHE podría detectar el anticuerpo anti-VHE en monos cynomolgus infectados con la cepa mejicana del VHE, se examinaron 3 monos (Fig. 4). Dos monos cyno-80A82 y cyno-9A97, se infectaron con heces que contenían la cepa 86 del VHE mejicana (Ticehurst, J. et al. (1992) J. Infect. Dis., 165:835-845) y el tercer mono cyno-83 se infectó con un segundo paso de la misma cepa. Como referencia, se analizaron muestras de suero de cyno-374, infectadas con la cepa SAR-55 del VHE paquistaní, en el mismo experimento. Los 3 monos infectados con la cepa mejicana se seroconvirtieron en anti-VHE. Los animales del primer paso se seroconvirtieron la semana 15 y los del segundo paso la semana 5. A destacar, el valor anti-VHE entre los 4 animales, que se observó en el cyno-83, inoculado con el segundo paso de la cepa mejicana. Los cynos inoculados con el primer paso de la cepa mejicana desarrollaron los valores menores mientras que los inoculados con la primera atenuación de la cepa paquistaní desarrollaron valores intermedios.

Ejemplo 6 Especificidad del ELISA del anti-VHE basado en el antígeno de células de insecto que expresa el ORF-2 completo

Para estimar si el ELISA descrito en la presente memoria detectaba específicamente el anti-VHE para la exclusión de cualquier otro tipo de anticuerpo relacionado con la hepatitis, se analizaron muestras de suero de chimpancés, en series de cuatro, infectadas con otros virus de hepatitis conocidos (Garci, P. et al. (1992), J. Infect. Dis., 165:1006-1011; Farci, P. et al. (1992), Science (en imprenta); Ponzetto, A. et al. (1987) J. Infect. Dis., 155: 72-77; Rizzetto, M. et al. (1981) Hepatology 1: 567-574; referencia para los chimpancés - 1413, 1373, 1442, 1551 (HAV); y para los chimpancés - 982, 1442, 1420, 1410 (HBV); son datos no publicados de Purcell et al.) (Tabla 1). Muestras de preinoculación y sueros 5 semanas y de 15 semanas después de la inoculación se analizaron en ELISA del VHE a diluciones de suero de 1:100, 1:1.000 y 1:10.000. Ninguno de los sueros de animales infectados con VHA, VHB, VHC y VHD reaccionó en el ELISA para el anticuerpo del VHE, pero los 4 chimpancés inoculados con VHE desarrollaron las clases IgM e IgG de anti-VHE.

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Ejemplo 7 Determinación de la diversidad de hospedador de la cepa SAR-55 del VHE en primates no humanos

Se inocularon por vía intravenosa diferentes especies de primates con una suspensión de VHE en heces típica y se recogieron muestras de suero en serie para controlar la infección. Se determinaron las concentraciones de ALT en el suero como indicador de la hepatitis a la vez que se definía la seroconversión como un aumento en anti-VHE. Los resultados se compararon con los obtenidos en monos cynomolgus y chimpancés.

Ambos monos rhesus inoculados con VHE (Tabla 2) demostraron máximos muy destacados de actividad de alanina-aminotransferasa así como una fuerte respuesta al anti-VHE. El valor máximo de actividad de la alanina-aminotransferasa se observó el día 35 para ambos animales y la seroconversión se produjo el día 21. El valor máximo de anti-VHE se alcanzó el día 29. Ambos monos verdes africanos utilizados en este estudio (Tabla 2) desarrollaron actividad aumentada de alanina-aminotransferasa y anti-VHE. Aunque el mono verde africano 230 murió 7 semanas después de la inoculación, la resistencia a la infección se obtuvo antes de este periodo. El valor máximo de actividad de alanina-aminotransferasa para el mono 74 superó el valor medio del suero de preinoculación en aproximadamente tres veces y para el mono 230 en aproximadamente cinco veces. Los valores máximos de actividad de la alanina-aminotransferasa y de seroconversión aparecieron simultáneamente los días 28 y 21 en los monos 74 y 230, respectivamente.

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TABLA 2 Características bioquímicas y serológicas de la infección por VHE en ocho especies de primate

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El macaco de cola de cerdo 99 demostró un aumento en la actividad de alanina-aminotransferasa > 3 SD superior al valor medio del suero de preinoculación, mientras que el macaco de cola de cerdo 98 no. Sin embargo, ambos monos seroconvertidos el día 21 y los valores de anti-VHE fueron equivalentes a los de los chimpancés y cercopitécidos. Debido a los bajos valores del máximo de alanina-aminotransferasa en los macacos de cola de cerdo, la posibilidad de inmunización en lugar de infección con el VHE no puede ser regulada completamente. Sin embargo, la inmunización es improbable por varias razones. En primer lugar, no se observó inmunización en uno de los dos tamarines, que son solamente una cuarta parte de grandes que los macacos de cola de cerdo aunque recibieron la misma cantidad de inóculo. En segundo lugar, es bien sabido que la cantidad de VHE excretada en las heces es normalmente muy pequeña, y 0,5 ml de la suspensión al 10% de las heces utilizadas en este estudio es improbable que contenga una cantidad de antígeno suficiente para inmunizar un animal, especialmente cuando se inocula por vía intravenosa.

Ni el tamarín inoculado en este estudio presentaba un aumento significativo en la actividad de alanina-aminotransferasa ni desarrollo de anti-VHE (Tabla 2). Por consiguiente, estos animales no parecían estar infectados. Los monos ardilla no desarrollaron anti-VHE, excepto a los niveles significativamente menores que los chimpancés o los cercopitécidos (Tabla 2). Además, la seroconversión se produjo después en otros animales. El mono ardilla 868 se seroconvirtió el día 41 y el 869 el día 35. El valor del anti-VHE no era > 1:20 en ningún momento durante > 3 meses de control y claramente fue disminuyendo en ambos animales después de alcanzar un valor máximo los días 47 a 54. Sin embargo, los aumentos en la actividad de alanina-aminotransferasa eran más bien destacados en ambos animales y estaban temporalmente relacionados con la duración de la seroconversión.

Los monos búho respondieron a la infección por VHE aproximadamente tan bien como las especies de cercopitécidos (Tabla 2). Ambos monos búho se seroconvirtieron el día 21 y el día 28 el valor de anti-VHE había alcanzado un valor de 1:8.000. La actividad de alanina-aminotransferasa alcanzó un máximo el día 35 en el mono búho 924 pero no hasta el día 49 en el mono 925.

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Ejemplo 8 Detección de IgM e IgG anti-VHE en chimpancés

En ambos chimpancés, las concentraciones de ALT en el suero aumentaron aproximadamente 4 semanas después de la inoculación (Tabla 2, Fig. 5). Ambos chimpancés se seroconvirtieron en el periodo de elevación de la enzima ALT o anteriormente (Figs. 5A y 5C). Las concentraciones de IgM anti-VHE también se determinaron para los chimpancés. En el chimpancé-1374, el valor de IgM anti-VHE (Fig. 5B) no fue tan alto como el valor de IgG (Fig. 5A) y se consiguió durante dos semanas. Aunque ambos anticuerpos de IgG e IgM se detectaron en primer lugar en este animal el día 20, el valor de IgM anti-VHE fue el mayor mientras que el valor de IgG fue el menor este día, pero a continuación aumentó y se estabilizó aproximadamente en el mismo nivel durante más de tres meses. En el chimp-1375, solamente IgM anti-VHE se detectó el día 20 (Fig. 5D). El valor fue mayor que en el chimp-1374 y se detectó IgM anti-VHE durante el periodo de control completo. Se observó en primer lugar IgG anti-VHE en este animal el día 27 (Fig. 5C) y permaneció a aproximadamente el mismo nivel en todo el experimento.

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Ejemplo 9 Comparación de ELISA basado en la proteína en el ORF-2 completa expresada en células de insectos con ésta basada en fragmentos de proteínas estructurales expresadas en E. coli

Para estimar si la expresión de la zona ORF-2 completa del genoma del VHE en células eucarióticas presentaba alguna ventaja sobre la expresión de los fragmentos de proteínas estructurales en E. coli, se utilizó el antígeno anterior en ELISA para volver a analizar el suero del mono cynomolgus que había sido analizado al principio (Tsarev, S.A. et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, 89:559-563; y Tsarev, S.A. et al. (1993) J. Infect. Dis. (167:1302-1306)), utilizando los fragmentos del antígeno expresados en bacterias (Tabla 3).

TABLA 3 Comparación de ELISA basado en el antígeno de células de insecto que expresan el ORF-2 completo con éste basada en el antígeno de E. coli que expresa fragmentos de proteínas estructurales

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Para 3 de los 6 monos examinados por ELISA, el antígeno expresado en células de insectos detectó la seroconversión antes que el antígeno expresado en E. coli. Utilizando el antígeno procedente de células de insecto, los autores no fueron capaces de detectar el anticuerpo anti-VHE en sueros de los seis monos a la mayor dilución ensayada (1:8.000). Con el antígeno procedente de células de E. coli (cepa Burma) no se obtuvo ninguna información acerca de los valores de anti-VHE, ya que todos los sueros fueron analizados solamente a una dilución de 1:100 (Tsarev, S.A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 89:559-563; Tsarev et al. (1993) J. Infect. Dis. (167:1302-1306)).

En otro estudio, el virus de la hepatitis E, cepa SAR-55 se diluyó en serie en incrementos de 10 veces y las diluciones 10^{-1} hasta 10^{-5} se inocularon en parejas de monos cynomolgus para valorar el virus. Se midieron las concentraciones de ALT en el suero para determinar la hepatitis y se determinó el anticuerpo en el suero contra el VHE por el método ELISA (datos en las figuras) o por ELISA de Genelab (tres ELISA, basado cada uno en uno de los antígenos denominados 4-2, 3-2 y 612 en Yarbrough et al. (J. Virol., (1991) 65:5790-5797) (datos mostrados como prueba positiva (+) o negativa (-) al final de las Figuras 6 a-g). Todas las muestras fueron analizadas bajo código.

El método ELISA detectó la seroconversión a IgG anti-VHE en todos los cynos inoculados y a todas las diluciones del virus.

En cambio, los resultados de Genelab fueron sorprendentemente variables, tal como se resume a continuación.

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TABLA 4

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Dado que Cyno 385 (10^{-5}) era positivo en los análisis de ELISA tanto por Genelabs como se ha descrito en la presente memoria, la 10^{-4} (diez veces más virus inoculados) y 10^{-3} (100 veces más virus inoculados) también habría sido de esperar que fueran positivos. El ELISA descrito en la presente memoria les puntuó como positivos en contraste con el análisis ELISA de Genelab que perdió ambos positivos a 10^{-3} y uno a 10^{-4} aun cuando las concentraciones en ALT de Cyno 383 y 393 sugerían hepatitis activa. Por consiguiente los datos apoyan las ventajas del presente método ELISA sobre los métodos de la técnica anterior de detección de anticuerpos contra VHE.

Ejemplo 10 Comparación de los ELISA basados en antígenos del ORF-2 recombinantes constituidos por una proteína de 55 kDa expresada en la zona del ORF-2 completa de la cepa SAR-55 paquistaní del VHE o por zonas más cortas de ORF-2 expresadas como proteínas de fusión en bacterias

Tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 y como se presenta en las Figuras 2A y 2B, numerosas proteínas de pesos moleculares variables se expresan en células de insecto infectadas con el baculovirus recombinante que contiene el ORF-2 completo. Una proteína con un peso molecular de aproximadamente 55 kDa se purificó parcialmente en 5\times10^{8} células SF-9 recogidas siete días después de la inoculación de la manera siguiente: Las células infectadas se centrifugaron, se volvieron a poner en suspensión en 10 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0, NaCl 50 mM, que contenía 40 \mug/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Sigma, St. Louis, Missouri), se sometieron a ultrasonidos para destruir las células y el lisado se centrifugó a 90.000\times g a 4ºC durante 30 minutos. Se cargó el sobrenadante en una columna CL-6B con DEAE-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibrada con Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM. Se lavó la columna con tampón de carga y la proteína de 55 kDa se eluyó con Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 250 mM. Las fracciones que contenían la proteína de 55 kDa se combinaron y la proteína se precipitó mediante la adición de 3 g de (NH_{4})_{2}SO_{4} para 10 ml de la solución proteica. El sedimento proteico se disolvió en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM. La proteína de 55 kDa se utilizó a continuación como antígeno del VHE expresado en la célula de insecto en el ELISA en el ensayo de comparación frente a los ELISA basados en uno de los dos antígenos de VHE expresados en bacterias, (3-2 (Méjico) (Goldsmith et al., (1992) Lancet, 339:328-331) o SG3 (Burma) (Yarbough et al., (1993) Assay development of diagnostics tests for hepatitis E. en el "International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Scientific program and abstract volume". Tokio:VHFL, pág. 87, resumen nº 687). Estos antígenos bacterianos eran proteínas de fusión de la glutatión-S-transferasa (GST) de 26 kDa y la secuencia antigénica 3-2 (M) constituida por 42 aminoácidos situados 6 aminoácidos corriente arriba del terminal C del ORF-2 (Yarbough et al., (1991) J. Virol., 65:5790-5797) o los 327 aminoácidos del terminal C del ORF-2 (Yarbough et al., (1993)). Los ELISA se realizaron de la forma siguiente.

Sesenta ng por pocillo de la proteína de 55 kDa o 200 ng por pocillo de los antígenos de fusión en tampón de carbonato (pH 9,6) se incubaron en pocillos de una placa de poliestireno de ensayo de microvaloración (Dynateck, S. Windham, ME) durante 2 h a 37ºC. Se bloquearon las placas con PBS que contenía suero de ternero fetal al 10% y gelatina al 0,5%. Muestras de suero de monos cynomolgus inoculados por vía intravenosa (nota: los cynos 387 y 392 se inocularon por vía oral) con una dilución de heces que contenía la cepa SAR-55 del VHE que oscila entre 10^{-1} y 10^{-8}, como se indica en la Tabla 5 y en las Figuras 7A a 7J y 8A a 8D, se diluyeron 1:100 en la solución de bloqueo. IgM anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa (Zymed, San Francisco, CA) diluida 1:1.000 ó 1:2.000, o inmunoglobulina anti-humana de cabra marcada con peroxidasa diluida 1:1.000 se utilizó como anticuerpo detector.

En todos los ensayos ELISA excepto en los de los dos monos inoculados por vía oral, cyno-387 y cyno-392, los antígenos de 55 kDa y de fusión se analizaron simultáneamente en el mismo laboratorio a fin de que la única variable fuera el antígeno utilizado. Los criterios para puntuar las reacciones positivas en el ELISA de anti-VHE con el antígeno de 55 kDa fueron un valor de densidad óptica \geq 0,2 y mayor de dos veces el de la muestra del suero de pre-inoculación para el mismo animal. Además, dado que ambos antígenos expresados en bacterias eran proteínas de fusión con GST, la densidad óptica de una muestra analizada con estos antígenos había de ser 3 veces mayor que la obtenida con la GST no fusionada para que fuera considerada positiva (Goldsmith et al., (1992)).

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Resultados

Ambos monos cynomolgus (377 y 378) inoculados con la dilución 10^{-1} de la suspensión fecal del VHE patrón presentaba un aumento pronunciado en la actividad de ALT a las 4 a 5 semanas después de la inoculación, indicativa de hepatitis (Tabla 5, Figuras 7A y 7B).

26

Los 3 antígenos analizados detectaron IgM anti-VHE en las muestras tomadas de cyno-377, 3 semanas después de la inoculación (Tabla 5, Figura 8A), pero IgM anti-VHE no se detectó en ninguna de las muestras del segundo animal, cyno-378. Se detectó IgG anti-VHE en ambos animales con ELISA basado en 55 kDa, pero solamente en el cyno-377 con el ELISA basado en antígenos de fusión. Los valores de la D.O. para la IgG anti-VHE fueron significativamente mayores que los de la IgM anti-VHE. Los valores de ELISA obtenidos con el antígeno de 55 kDa fueron también significativamente mayores que los obtenidos con uno de los dos antígenos de fusión (Figuras 7A y 7B). Los modelos de los valores de D.O. observados en ELISA con los antígenos procedentes de las dos fuentes también se diferenciaban significativamente. En el caso del ELISA basado en los antígenos de fusión, las señales positivas alcanzaron un máximo brevemente después de la seroconversión y después lo consiguieron durante las 15 semanas del experimento. En el ELISA basado en el antígeno de 55 kDa, la señal positiva alcanzó un máximo brevemente después de la seroconversión y permaneció en aproximadamente el mismo alto nivel durante todo el experimento
(15 semanas).

La elevación en las actividades de ALT en ambos monos (394 y 395) inoculados con una dilución de 10^{-2} de la suspensión de heces con VHE patrón fue significativamente menos pronunciada en el tiempo esperado de la hepatitis que en los animales inoculados con la dosis mayor de diez veces (Tabla 5, Figuras 7C y 7D). Cyno-395 de hecho presentaba actividades de ALT mayores antes de la inoculación así como a las 15 semanas después de la inoculación. Esta última no estaba probablemente relacionada con la infección por VHE. Se detectó a la semana IgM anti-VHE positiva solamente en cyno-394 (Figura 8 B) y solamente con el ELISA basado en el antígeno de 55 kDa. Sin embargo, ambos animales estaban infectados, ya que la seroconversión de IgG anti-VHE se detectó en ambos animales. En el cyno-394, la IgG anti-VHE fue detectada en primer lugar por el antígeno de 55 kDa en la tercera semana y una semana después con el antígeno 3-2(M). El antígeno SG3 (B) no detectó seroconversión en cyno-395 y la IgG anti-VHE se detectó solamente con el antígeno de 55 kDa. El anti-VHE tendía a disminuir de valor con el tiempo en este
animal.

Se inoculó al cyno-380 y al cyno-383 con una dilución 10^{-3} de la suspensión fecal patrón de VHE (Tabla 5, Figuras 7E, 7F y 8C). El cyno-380 tenía actividades de ALT fluctuantes antes y después de la inoculación; por consiguiente, no pudieron utilizarse niveles de ALT para documentar la hepatitis E en este animal. En el cyno-383, se observó un ligero aumento de las actividades de ALT (Figura 7F), que era coincidente con la seroconversión y, por consiguiente, podía ser debido a hepatitis E leve. No se detectó IgG anti-VHE en el suero de cyno-380 con ninguno de los tres antígenos. El cyno-380 se seroconvirtió para el anti-VHE de la IgG cuando se ensayó por ELISA con SG3 (B) pero no con el antígeno 3-2 (M). Este animal presentaba IgG anti-VHE preexistente cuando se ensayó con el antígeno 55 kDa, pero presentaba un aumento mayor en IgG anti-VHE comenzando en la 5ª semana (Figura 7E). La identificación del anticuerpo preexistente fue descrita inicialmente en los sueros procedentes de otro mono cynomolgus [Ticehurst et al., (1992) J. Infect. Dis., 165:835-845; Tsarev et al., (1993) J. Infect. Dis., 168:369-378]. La seroconversión tuvo lugar en el tiempo esperado, pero los niveles de IgG anti-VHE en las muestras de cyno-383 permanecieron bajas y detectables solamente con el antígeno de 55 kDa.

Se inoculó el cyno-389 y ael cyno-393 con una dilución de 10^{-4} de la suspensión fecal patrón de VHE (Figuras 7G, 7H, 8D y Tabla 5). Ningún animal presentaba un aumento significativo de las actividades de ALT, aunque la duración de un máximo pequeño pero distinto de ALT en el suero del cyno-393 la 5ª semana (Figura 7H) sugirió la hepatitis intermedia. El ELISA basado en los antígenos SG3 (B) o 3-2 (M) puntuó ambos animales como negativos para la infección por VHE. En cambio, el antígeno de 55 kDa detectó IgM anti-VHE en los sueros del cyno-389 a las 6 a 8 semanas después de la inoculación (Figura 8D) y la IgG anti-VHE desde la 6ª semana hasta la 15ª en ambos
animales.

Ningún animal inoculado con la dilución de 10^{-5} de la suspensión fecal patrón desarrolló un aumento considerable en las actividades de ALT (Figura 7I, 7J y Tabla 5), pero, en el cyno-386, la IgM anti-VHE y de IgG se detectaron en las semanas 8 a 13 y 8 a 15 respectivamente con el antígeno de 55 kDa (Figura 7J y 8E). Se detectó IgG anti-VHE en el cyno-385 con el antígeno de 55 kDa y el 3-2(M) pero no con el antígeno SG3 (B). En contraste con anteriores patrones, se detectó IgG anti-VHE con un antígeno de fusión cuatro semanas antes y a concentraciones superiores que con el antígeno de 55 kDa.

Ninguno de los animales inoculados con las diluciones de la suspensión fecal de VHE patrón en el intervalo entre 10^{-6} y 10^{-8} desarrolló anticuerpos contra ninguno de los tres antígenos de VHE. No se observaron aumentos de actividades de ALT en estos animales, excepto para un máximo algo destacado de actividad de ALT en la 9ª semana en cyno-400 (Tabla 5). Sin embargo, la ausencia de seroconversión en este animal indicaba que este máximo probablemente no estaba relacionado con la infección por VHE.

Con respecto a los dos monos cynomolgus (387 y 392) inoculados por vía oral con la dilución 10^{-1} de la suspensión fecal al 10%, ningún mono fue infectado ya que las concentraciones de ALT no aumentaron y el ELISA realizado con los antígenos 3-2(M) y de 55 kDa no detectó seroconversión para VHE (Tabla 5).

Por último, se encontraron pruebas serológicas para la infección por VHE en todos los animales inoculados con diluciones decimales de la suspensión fecal hasta 10^{-5}, ninguno de los animales que recibieron diluciones mayores presentaba tal prueba. Se observó hepatitis destacada definida por una ALT elevada, solamente en los dos monos infectados con la dilución 10^{-1}. Se observaron elevaciones significativamente menores de actividades de ALT en algunos animales inoculados con diluciones mayores de la suspensión fecal mientras que, en otros, no se encontraron elevaciones. Considerados aisladamente, estos bajos aumentos de ALT no eran diagnóstico de hepatitis. Sin embargo, la coincidencia de la seroconversión y del aspecto de estos máximos de ALT sugiere la presencia de hepatitis leve en estos animales. Se detectó seroconversión de IgG anti-VHE en todos los animales inoculados con diluciones de la suspensión fecal que oscilan entre 10^{-1} y 10^{-5}. Una tendencia hacia concentraciones menores de IgG anti-VHE y de seroconversión retardada se observó en los animales inoculados con diluciones mayores de la solución
madre.

En resumen, el antígeno del ORF-2 paquistaní de 55 kDa fue más eficaz que uno de los dos antígenos 3-2(M) o SG3 (B) para detectar IgM e IgG anti-VHE en monos cynomolgus infectados con la cepa paquistaní del VHE. Por ejemplo, para todos los sueros de animales excepto los del cyno-385, la detección de IgG o IgM anti-VHE por ELISA fue más eficaz para el antígeno de 55 kDa que para el antígeno 3-2(M) o SG3. El ELISA con el antígeno de 55 kDa produjo resultados internamente coherentes y reproducibles, detectando la IgG anti-VHE en los diez animales inoculados con la dilución fecal de 10^{-5} o menor. La magnitud de las señales de ELISA también disminuía a medida que se diluía el inóculo. Los antígenos de fusión no produjeron resultados coherentes entre pares de animales. Solamente un animal de cada par inoculado con la dilución de 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3} o 10^{-5} presentaba seroconversión para IgG anti-VHE y se detectó solamente una única seroconversión para IgM anti-VHE con estos antígenos. Ninguno de los animales inoculados con la dilución 10^{-4} del inóculo original se seroconvirtió en uno de los dos antígenos de fusión aun cuando el suero de un animal (cyno-393) había mantenido altos niveles de IgG anti-VHE cuando se ensayó con el antígeno de 55 kDa. Aunque como se expuso anteriormente, el ELISA para la IgM anti-VHE era significativamente menos sensible que el ELISA para la IgG anti-VHE de cynomolgus, el antígeno de 55 kDa era capaz de detectar la IgG anti-VHE en más animales que el antígeno 3-2(M) o SG3 (B). En resumen, no pudo llegarse a una conclusión definitiva acerca del valor infeccioso del inóculo vírico paquistaní utilizado en este estudio con los datos combinados del ELISA basado en de 3-2(M) y SG3 (B) pero pudo llegarse con los datos obtenidos con el ELISA solo del antígeno paquistaní
de 55 kDa.

En cuanto al cyno-385, la diferencia en la detección de IgG anti-VHE entre los dos resultados del ensayo fue de cuatro semanas. Estos datos sugieren la presencia de un epítopo distinto en el antígeno 3-2(M) reconocido por este animal que está ausente en los antígenos mayores de 55 kDa y SG3 (B). Cuando el lisado completo de la célula de insecto, que contenía las proteínas tanto de ORF-2 (75 kDa) como la de 55 kDa, se utilizaba como antígeno para volver a ensayar estas muestras, los resultados fueron los mismos que cuando se utilizaba el de 55 kDa solo. Este descubrimiento sugiere que la proteína de 55 kDa no puede carecer de los aminoácidos del epítopo 3-2 sino más bien que la configuración de la secuencia del epítopo 3-2 se diferenciaba entre los tres antígenos utilizados en este estudio. Por último, es interesante observar que a pesar del hecho de que el antígeno SG3 (B) contenía una fracción mayor de ORF-2 e incluía la secuencia completa del epítopo 3-2, no detectó más suero positivo que el antígeno 3-2(M).

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Ejemplo 11 Determinación del valor infeccioso de la solución madre vírica del VHE SAR-55 por RT-PCR

El conocimiento del valor infeccioso de los inóculos es crítico para la interpretación de muchos de los datos obtenidos en las infecciones experimentales de modelos animales. Sin embargo, hasta ahora no se ha descrito el valor infeccioso de una solución madre vírica de VHE. Se extrajeron diluciones de diez veces de la suspensión fecal que contiene la cepa SAR-55 del VHE y se realizó la ampliación por RT-PCR de la manera siguiente para determinar la dilución mayor a la que podían detectarse los genomas del VHE. Se mezclaron 200 \mul de suspensión fecal con 0,4 ml de NaCl 1,5 M más polietilenglicol (PEG) 8000 al 15% y se mantuvieron durante la noche a 4ºC. Se recogieron los sedimentos por centrifugación durante 3 minutos en una microcentrifugadora (Beckman, Palo Alto, CA) a 16.000 g y se disolvieron en 475 \mul de solución que contenía tiocianato de guanidina 4,2 M, N-lauroilsarcosina al 0,5%, TRIS-HCl 0,25 M (pH 8,0), ditiotreitol (DTT) 0,15 M y 1,0 \mug de ARNt. Se añadieron a continuación cincuenta microlitros de TRIS-HCl 1 M (pH 8,0), EDTA 100 mM y SDS al 10%. Se extrajo dos veces el ARN con fenol-cloroformo (1:1) a 65ºC, seguido de extracción en cloroformo a temperatura ambiente. A la fase superior, se añadieron 250 \mul de acetato amónico 7,5 M y se precipitaron los ácidos nucleicos con 0,6 ml de 2-propanol, se lavó con etanol al 75%, se lavó con etanol al 100% y se utilizó para la PCR por transcripción inversa (RT).

Para la detección del genoma del VHE, se utilizaron dos series de cebadores anidados que representaban las secuencias de la zona 3' (ORF-2) del genoma de SAR-55. Los cebadores para la transcripción inversa y la primera PCR se presentan como SEC. ID. nº: 99: GTATAACGGATCCACATCTCCCCTTACCTC y la SEC. ID. nº: 100: TACAGATCTATACAACTTAACAGTCGG respectivamente. Los cebadores para la segunda PCR se presentan como SEC. ID. nº: 101: GCGGCAGATCTCACCGACACCATTAGTAC y la SEC. ID. nº: 102: TAACCTGGATCCT
TATGCCGCCCCTCTTAG respectivamente. El sedimento del ARN se disolvió en 20 \mul de TRIS-HCl 0,05 M (pH 7,6), KCl 0,06 M, MgCl_{2} 0,01 M, DTT 0,001 M, 40 unidades de RNasin (Promega Biotec, Madison, WI), 16 unidades de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Promega Biotec) y 10 pmoles de cebador inverso y se incubó 1 hora a 42ºC. A 20 \mul de mezcla de transcriptasa inversa se añadieron 100 \mul de TRIS-HCl 0,01 M (pH 8,4), KCl 0,05 M, MgCl_{2} 0,0025 M, a cada dNTP 0,0002 M, 50 pmoles de cebador directo, 50 pmoles de cebador inverso y 4 unidades de AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) en 100 \mul de aceite mineral ligero. El ADNc de VHE se amplió mediante 35 ciclos de PCR: 1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC y 1 min. a 72ºC. Los productos de la PCR se analizaron en geles de agarosa al 1%. A continuación se utilizaron 5 \mul de esta mezcla para la segunda ronda de ampliación en las mismas condiciones, excepto el tiempo de prolongación que se aumentó en 3 min.

Los productos de la RT-PCR producidos en todas las diluciones de heces con VHE patrón en el intervalo entre 10^{-1} y 10^{-5} (Figura 9) se separaron en un gel de agarosa al 2% y fueron detectados mediante tinción del gel con bromuro de etidio. Se observó una disminución en la cantidad del producto específico de la PCR a concentraciones mayores y la dilución mayor de la suspensión fecal al 10% en la que se detectó el genoma del VHE fue de 10^{-5}. Por consiguiente, teniendo en cuenta el factor de dilución, el valor del genoma del VHE fue aproximadamente de 10^{6,7} por gramo de heces.

Además, solamente las diluciones que se demostró por RT-PCR que contenían el genoma del VHE fueron infecciosas para los monos cynomolgus. Por consiguiente, el valor de infectividad de la suspensión fecal patrón y su valor del genoma detectado por RT-PCR fueron aproximadamente los mismos. Se obtuvo una correlación similar entre la RT-PCR y el valor de infección para una cepa del virus de la hepatitis C [Cristiano et al., (1991) Hepatology, 14:51-55; Farci et al., (1991) N. Engl. J. Med., 25:98-104; Bukh et al., (1992); Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, 89:187-191].

Ejemplo 12 Inmunización activa utilizando la proteína en el ORF-2 como vacuna e inmunización pasiva con el plasma anti-VHE de convalecencia positivo

Monos cynomolgus (Macaca fascicularis) que eran negativos al anticuerpo del VHE (<1:10) en un ELISA basado en la proteína en el ORF-2 de 55 kDa se enjaularon individualmente bajo la contención de riesgo biológico BL-2 y se utilizó una suspensión (en suero bovino fetal) de heces que contenía la cepa SAR-55 del VHE paquistaní, diluida hasta contener 10.000 ó 1.000 CID_{50}, para la inoculación intravenosa de los animales.

Para los estudios de inmunización activa, se purificó la proteína en el ORF-2 de 55 kDa expresada en baculovirus recombinante 5\times10^{8} células SF-9 recogidas 7 días después de la inoculación como se describe en el Ejemplo 10. Se precipitaron con alúmina 3 mg de la proteína de 55 kDa purificada y se inmunizaron ocho monos cynomolgus por inyección intramuscular con 0,5 ml de vacuna que contenía 50 \mug de la proteína de 55 kDa precipitada con alúmina. Cuatro monos recibieron una sola dosis y cuatro monos recibieron dos dosis por separado durante cuatro semanas. Se sometieron los primates a la prueba de provocación por vía intravenosa con 1.000 a 10.000 CID_{50} de VHE cuatro semanas de la última inmunización.

Cuatro monos cynomolgus sirvieron como referencias en los estudios de inmunización activa. Los cyno-412 y 413 recibieron una dosis de placebo (0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato) y cyno-397 y 849 recibieron dos dosis de placebo. Los animales de referencia se sometieron a la prueba de provocación con 1.000 a 10.000 CID_{50} de VHE.

Para los estudios de inmunización pasiva, el cyno-384 se infectó con 0,5 ml de una suspensión de heces mezclada al 10% que contenía dos cepas del VHE chino, KS1-1987 y KS2-1987 y el plasma se extrajo repetidamente del animal durante la convalecencia. (Yin et al. (1993) J. Med. Virol., 41:230-241). Aproximadamente el 1% de la sangre del cyno-396 y del cyno-399 y 10% de la sangre del cyno-401 y del cyno-402 se sustituyó por plasma de convalecencia procedente del cyno-384 que tiene un valor de anticuerpo de VHE de 1:10.000. Los animales se sometieron a la prueba de provocación con 1.000 CID_{50} de VHE dos días después de la infusión del plasma. Como referencia, el 10% de la sangre del cyno-405 se sustituyó por plasma negativo a anti-VHE obtenido del cyno-384 antes de la infección con VHE. El cyno-405 se sometió también a la prueba de provocación con 1.000 CID_{50} de VHE.

Para ambos estudios de inmunización pasiva y activa, se recogieron biopsias con aguja percutánea del hígado y muestras de suero y de heces antes de la inoculación y semanalmente durante 15 semanas después de la inoculación. Se analizaron las concentraciones de alanina-aminotransferasa (ALT) en los sueros con análisis disponibles en el mercado (Metpath Inc., Rockville, MD) y la prueba bioquímica de la hepatitis se definió como un aumento del doble o mayor de la ALT. Las biopsias de hígado se examinaron bajo código y el ELISA de anti-VHE utilizado se describió en el Ejemplo 10. La extracción del ARN y la RT-PCR se realizaron tal como en el Ejemplo 11 excepto que el ARN de 100 \mul de suero o de 100 \mul de la suspensión de heces al 10% se extrajo con reactivo TRIzol (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) según el protocolo del fabricante. Para la cuantificación, se combinaron sueros en serie positivos a PCR o heces de cada animal y se diluyeron en serie en incrementos de diez veces en suero de ternero. Para la extracción del ARN se utilizaron 100 \mul de cada dilución y RT-PCR tal como se describe al principio en este Ejemplo. El protocolo de PCR utilizado en este estudio pudo detectar como poco 10 CID_{50} de VHE por ml de suero y tan poco como 100 CID_{50} por gramo de heces.

Los valores máximos de ALT de las muestras de suero semanales durante 5 semanas antes de la inoculación y durante 15 semanas después de la inoculación se expresaron como relaciones (pos/pre) para cada animal. La media geométrica de las relaciones del grupo de referencia de los animales se comparó con la de los animales inmunizados pasiva o activamente utilizando la prueba de Simes (Simes, R.J. (1986) Biométrika, 73:751-754).

Las duraciones de la viremia y de la eliminación de virus en las heces y los valores del genoma del VHE en el grupo de referencia de animales se compararon con los de los animales inmunizados pasiva o activamente utilizando el ensayo de Wilcoxon [Noether, G. (1967) en Elements of nonparametric statistics (John Wiley & Sons Inc., Nueva York), págs. 31-36]. La misma prueba se utilizó para comparar los parámetros anteriores entre los animales inmunizados pasiva y activamente.

Para análisis estadístico, a las muestras de suero que presentaban <10 genomas de VHE en 1 ml de suero se les asignó un valor de 1:1 y a las muestras fecales que tenían <100 genomas del VHE en 1 g de heces se les asignó un valor de 1:10.

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Resultados

Curso de la infección de la hepatitis E en animales no inmunizados.

En 3 de cada 5 animales no inmunizados que se sometieron a la prueba de provocación con el VHE, se documentó una prueba bioquímica de hepatitis mediante con por lo menos un aumento del doble en los valores de ALT en el suero. En dos animales, no se obtuvieron aumentos significativos en la actividad de ALT. Sin embargo, los datos histopatológicos documentaron hepatitis en los 5 animales como se muestra en la Tabla 6.

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(Tabla pasa a página siguiente)

27

Los cambios necro-inflamatorios oscilaron entre 1+ y 2+ en la escala de 1+ a 4+ y se asociaron temporalmente a elevaciones de actividades de ALT en los animales con dichas elevaciones.

Todos los animales de referencia se seroconvirtieron a VHE 3 a 5 semanas después de la prueba de provocación y desarrollaron valores máximos de anticuerpo del VHE que oscilaban entre 1:1.000 y 1:32.000. Había una buena correlación entre la gravedad de la infección, la hepatitis y el nivel de respuesta del anti-VHE. Cyno-405, que tenía la puntuación acumulativa mayor para la hepatitis, también tenía el periodo más prolongado de viremia y de excreción vírica y el nivel mayor de anti-VHE (Tabla 6). La duración de la eliminación de virus en las heces fue la misma, o mayor que, la de la viremia. Para todos los animales de referencia, los valores del genoma del VHE en el suero fueron inferiores (10^{-3} a 10^{-4,7}) que los valores en las heces (10^{-5,7} a 10^{-7}). En cinco de estos animales, la viremia y la eliminación de virus en las heces se detectaron durante 4 a 11 semanas y durante un promedio de 4,2 semanas después de la seroconversión (intervalo de 2 a 9 semanas).

Inmunización pasiva. El cyno-396 y el 399, que tenía aproximadamente 1% de su sangre remplazada con plasma de convalecencia positivo anti-VHE, presentaba un valor de anticuerpo del VHE de 1:40 cuando se determinó dos días después de la transfusión (en el momento de la prueba de provocación) (Tabla 6). Una disminución doble en el valor del anticuerpo del VHE se observó en ambos animales una semana después de la transfusión y los anticuerpos del VHE disminuyeron por debajo del nivel detectable (<1:10) 2 semanas después de la transfusión. Se detectó de nuevo anti-VHE 5 semanas después de la prueba de provocación en cyno-396 y 4 semanas después de la prueba de provocación en cyno-399, lo que indica que se había producido la infección con el VHE. El valor máximo del anticuerpo del VHE (1:8.000) se alcanzó 9 a 10 semanas después de la prueba de provocación. Ningún mono cynomolgus demostró una elevación significativa de la actividad de ALT después de la prueba de provocación. Sin embargo, la prueba histológica de hepatitis fue detectada en cyno-396 y el genoma del VHE se detectó en el suero y las heces de ambos animales (Tabla 6).

El cyno-401 y el 402 tenían aproximadamente el 10% de su sangre reemplazada con plasma de convalecencia. Dos días después de la transfusión, en el momento de la prueba de provocación, el valor del anticuerpo del VHE en ambos monos cynomolgus fue de 1:200 (Tabla 7).

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(Tabla pasa a página siguiente)

28

Se detectó el anti-VHE continuamente en ambos animales durante las 15 semanas después de la prueba de provocación y alcanzó un valor máximo de 1:4.000 en cyno-401 pero solamente de 1:80 en cyno-402. Los análisis bioquímico e histológico no pusieron de manifiesto hepatitis en ninguno de los dos animales. Sin embargo, en ambos animales, se observaron viremia por VHE y eliminación fecal del virus lo que indica que se había producido la infección (Tabla 6). De este modo, la inmunoprofilaxis pasiva que consiguió un valor mayor de anticuerpo protegió los monos cynomolgus contra la hepatitis tras la prueba de provocación con el VHE.

Inmunización activa. Cuatro primates inmunizados con una dosis de 50 \mug de la proteína de 55 kDa desarrollaron anticuerpos contra la proteína recombinante que oscilaban en un valor entre 1:100 y 1:10.000 (Tabla 7). Uno (cyno 013) murió de un accidente por anestesia 9 semanas después de la prueba de provocación y está incluido en los análisis (Tabla 6). Los cuatro animales que recibieron dos dosis del antígeno desarrollaron anticuerpos de VHE con valores de 1:10.000. Dos de los cuatro monos murieron después de la prueba de provocación intravenosa con VHE. Éste puede haber sido también el resultado de un accidente por anestesia pero la etiología exacta no pudo determinarse. Estos dos monos fueron eliminados de los análisis adicionales. Ninguno de los 6 animales restantes desarrolló concentraciones anormales de ALT o pruebas histológicas de hepatitis después de la prueba de provocación (Tabla 6). Los monos cynomolgus inmunizados con 1 ó 2 dosis de la proteína de 55 kDa no contrajeron viremia. Sin embargo, 3 de los 4 animales que recibieron una dosis del inmunógeno excretaron el virus en sus heces. En cambio, no se observó eliminación del virus en ninguno de los dos animales sometidos a prueba de provocación que habían recibido dos dosis de la vacuna.

La mayoría de los animales inmunizados activamente desarrollaron valores de anticuerpo del VHE mayores que los animales inmunizados pasivamente. Sin embargo, el cyno-013 tenía un título de anticuerpo del VHE de 1:100 en el momento de la prueba de provocación, en comparación con un valor de 1:200 en dos animales inmunizados pasivamente con plasma anti-VHE. El cyno-013, sin embargo, demostró mayor protección contra la infección por VHE que los animales inmunizados pasivamente. El cyno-009, que tenía un valor de anticuerpo del VHE de 1:1.000 en el momento de la prueba de provocación, se protegió completamente contra la hepatitis y la infección por VHE (Tabla 6). En cambio, el cyno-003 se infectó y desprendió VHE en las heces, aun cuando tenía un valor de anticuerpo del VHE de 1:10.000 en el momento de la prueba de provocación. Sin embargo, no se detectó hepatitis ni viremia en este animal ni en otros monos cynomolgus que habían recibido una dosis de inmunógeno y tenían valores de anticuerpo de VHE de 1:10.000 o superiores.

Comparación del curso de la infección por VHE en animales de referencia e inmunizados.

Como se midió por histopatología, todos los animales inmunizados, a excepción de uno de los monos inmunizados pasivamente, se protegieron contra la hepatitis después de la prueba de provocación intravenosa con VHE. La comparación de los valores medios para la gravedad de la hepatitis y del nivel de replicación vírica entre el grupo de referencia y los animales inmunizados pasiva y activamente indicó que, en general, la gravedad de la infección estaba inversamente relacionada con el valor de anticuerpo del VHE en el momento de la prueba de provocación y disminuyó en el orden siguiente: no inmunizado > inmunización pasiva (1%) > inmunización pasiva (10%) > inmunización activa > (1 dosis) > inmunización activa (2 dosis) (Tablas 6 y 8). Sin embargo, el número de animales en cada uno de los dos subgrupos de animales inmunizados pasiva y activamente no fue suficiente para permitir el análisis estadístico. Por consiguiente, se realizó el análisis estadístico para grupos inmunizados pasivamente combinados e inmunizados activamente combinados respectivamente en comparación con los grupos de referencia combinados. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 8.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los resultados demuestran que las puntuaciones de la histopatología y la duración de los cambios histológicos en el grupo de referencia eran estadísticamente diferentes de las de los animales pasiva o activamente inmunizados. Las relaciones de pos/pre-inoculación mayores de los valores máximos de ALT en el grupo de referencia eran estadísticamente significativas cuando se comparaban con las de los animales pasiva o activamente inmunizados, lo que indica protección contra las manifestaciones bioquímicas de la hepatitis en ambos grupos de animales inmunizados. La duración de la viremia y el valor del VHE en la heces fueron significativamente menores en ambos grupos de animales inmunizados que en el grupo de referencia. Las diferencias en la duración de la eliminación del virus y el valor del VHE en el suero, sin embargo, no fueron estadísticamente diferentes entre el grupo de referencia y el grupo inmunizado de forma pasiva, aunque estos parámetros eran significativamente diferentes cuando el grupo de referencia se comparaba con el grupo inmunizado de forma activa. Las diferencias significativas se encontraron también entre los grupos de animales inmunizados de forma pasiva y activa para la duración de la viremia y la eliminación fecal así como para los valores de VHE.

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En resumen, los resultados presentados en las Tablas 6 a 8 demuestran que tanto los anticuerpos del VHE adquiridos de forma pasiva como activa protegían a los monos cynomolgus contra la hepatitis tras la prueba de provocación con el VHE virulento. Aunque los 5 monos cynomolgus no inmunizados desarrollaron pruebas histológicas de hepatitis cuando se sometieron a la prueba de provocación con 1.000 a 10.000 CID_{50} de SAR-55, ambos animales con valores de anticuerpo adquiridos de forma pasiva de 1:200 estaban protegidos contra la hepatitis y uno de cada dos animales con un valor de anticuerpo tan bajo como 1:4 tampoco desarrolló la hepatitis.

Sin embargo, debe señalarse que los animales inmunizados de forma activa demostraron una protección completa contra la hepatitis y una resistencia más eficaz contra la infección por el VHE que los animales inmunizados de forma pasiva. Por ejemplo, en contraste con los resultados obtenidos en los animales inmunizados de forma pasiva, no se detectó viremia en los animales inmunizados de forma activa después de la prueba de provocación con el VHE. Un valor de anticuerpo del VHE tan alto como 1:10.000 pudo conseguirse en los monos cynomolgus después de una o dos inmunizaciones con la proteína recombinante de 55 kDa. Aunque un mono (013) desarrolló un valor de 1:100 después de la inmunización activa, este nivel todavía previno la hepatitis y la viremia.

Los estudios de inmunización activa también demostraron que aunque una dosis única de vacuna prevenía la viremia por VHE, la eliminación de virus en las heces se detectó todavía. Sin embargo, se observó que dos dosis de la vacuna prevenían todos los signos de la hepatitis y la infección por VHE. Estos resultados por lo tanto sugieren que una única dosis de vacuna administrada, por ejemplo, a individuos antes de un viaje al extranjero les protegerían de la hepatitis E en ambientes con alto riesgo.

Por último, debe señalarse que los resultados presentados son muy similares a los resultados descritos anteriormente para la inmunoprofilaxis pasiva y activa de primates no humanos contra la hepatitis A: la inmunoprofilaxis pasiva previno la hepatitis pero no la infección mientras que la vacunación previno no solamente la hepatitis sino también la infección por VHA (Purcell, R.H. et al. (1992) Vaccine, 10:5148-5149). Es de interés que el estudio de la inmunoprofilaxis para el VHE presentado en la presente memoria es equivalente al estudio previo de la inmunoprofilaxis contra el VHA, tanto en la determinación del valor del anticuerpo que protegía (<1:100) como en el resultado después de la prueba de provocación intravenosa con virus virulento. Dado que otros estudios han demostrado eficacia de valores comparables de anti-VHA adquirido de forma pasiva y activa en seres humanos y han confirmado el valor previsto de los estudios de primates en la investigación de la hepatitis (Stapleton, J., et al. (1985) Gastroenterology 89:637-642; Innis, B.L., et al. (1992) Vaccine, 10:S159), es muy probable, por consiguiente, que estos resultados en los monos cynomolgus sean pronóstico de protección en seres humanos.

Ejemplo 13 Expresión directa en levaduras de la proteína completa del ORF-2 y en fragmentos de peso molecular más bajo

Cuatro fragmentos del ORF-2 del ADNc que codifican:

1.: Fragmento 1778-1703 de la proteína en el ORF-2 completa (aa 1-660, PM 70979). (En la que los números del fragmento se refieren a los números del cebador proporcionados a continuación).

2.: Proteína en el ORF-2 que comienza en el aa 34º (aa 34-660, PM 67206), fragmento 1779-1703.

3.: Proteína en el ORF-2 que comienza en el aa 96º (aa 96-660, PM 60782), fragmento 1780-1703.

4.: proteína en el ORF-2 que comienza en el aa 124º (aa 124-660, PM 58050), fragmento 1781-1703.

se obtuvieron utilizando la PCR mediante la utilización del plásmido P63-2 como plantilla y los oligonucleótidos sintéticos mostrados a continuación:

SEC. ID. nº: 103 (cebador inverso nº 1703) GCACAACCTAGGTTACTATAACTCCCGAGTTTTACC, SEC. ID. nº: 104 (cebador directo nº 1778) GGGTTCCCTAGGATGCGCCCTCGGCCTATTTTG, SEC. ID. nº: 105 (cebador directo nº 1779) CGTGGGCCTAGGAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGT, SEC. ID. nº: 106 (cebador directo nº 1780) GCTTGGCCTAGGCAGGCCCAGCGCCCCGCCGCT y la SEC. ID. nº: 107 (cebador directo nº 1781) CCGCCACC
TAGGGATGTTGACTCCCGCGGCGCC.

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Todas las secuencias mostradas en las secuencias nº: 103 a nº: 107 contienen la secuencia artificial CCTAGG y sus extremos 5' precedidos por 4 nucleótidos. La secuencia artificial fue un punto de reconocimiento para la enzima de restricción AvrII (BlnI). Los fragmentos sintetizados por PCR se escindieron con BlnI y se clonaron en la secuencia AvrII del vector pPIC9 (Figura 10) (Invitrogen). La orientación correcta de los fragmentos fue confirmada por análisis de restricción, utilizando la secuencia asimétrica EcoRI presente en las secuencias del ORF-2 y en el vector. Los plásmidos pPIC9-1778 recombinantes purificados (que contienen el fragmento 1778-1703); pPIC9-1779 (que contienen el fragmento 1779-1703); pPIC9-1780 (que contienen el fragmento 1780-1703) y pPIC9-1781 (que contiene el fragmento 1781-1730) se utilizaron para la transformación del esferoplasto de levadura (cepa Picha) según el protocolo de Invitrogen. La identificación de los clones recombinantes y el análisis de la expresión se realizaron utilizando el mismo protocolo. Estas proteínas expresadas pueden utilizarse como inmunógenos en vacunas y como antígenos en inmunoanálisis como se describe en la presente solicitud. Por último, los expertos en la materia reconocerían que el vector y la cepa de levadura utilizada en el ejemplo anterior podría sustituirse por otros vectores (p. ej. pHIL-F1; Invitrogen) o por las cepas de la levadura (p. ej. Saccharomyces cerevisiae).

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Ejemplo 14 Purificación y análisis de la secuencia del terminal amino de los productos génicos del ORF-2 del VHE sintetizados en células de insecto SF-9 infectadas con baculovirus recombinante 63-2-IV-2

Tal como se ha descrito en el Ejemplo 10, se infectaron células SF-9 con baculovirus recombinante 63-2-IV-2 y se recogieron siete días después de la inoculación. La banda de la proteína predominante presente en el SDS-PAGE de lisado de células de insecto era aproximadamente de 55 kDa de peso molecular. La purificación adicional de esta banda de 55 kDa se realizó por cromatografía en columna de intercambio iónico utilizando DEAE-sepharose con un gradiente en NaCl de 150 a 450 mM. Se analizó la presencia en las fracciones de DEAE de la banda de 55 kDa por SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomasie. La fracción máxima se resolvió a continuación por electroforesis en gel de poliacrilamida en ausencia de SDS en tres bandas de 55 kDa, 61 kDa y una banda de peso molecular intermedio. El análisis de cada banda de proteína del gel de poliacrilamida por secuenciado de la microproteína amino-terminal puso de manifiesto que las proteínas de 55 y 61 kDa compartían un único terminal N en el Ala-112 de la SEC. ID. nº: 2. Se cree que las diferencias de tamaño en los dos productos de escisión del ORF-2 pueden reflejar la escisión diferente del terminal COOH del producto mayor.

Se demostró que la tercera proteína intermedia en el gel de poliacrilamida era una proteína quitinasa de baculovirus. Las proteínas del ORF-2 de 55 y 61 kDa se resolvieron en una única fracción del máximo simétrica desprovista de cualquier quitinasa sometiendo las fracciones máximas de DEAE a HPLC en fase inversa utilizando un sistema de microporo con NaCl y disolventes de acetonitrilo.

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Ejemplo 15 Expresión directa de los productos de escisión de 55 y 61 kDa

Un fragmento de ORF-2 del ADNc que codifica una proteína en el ORF-2 que comienza en el aminoácido 112º (aminoácidos 112 a 660 del ORF-2) se obtuvo por PCR utilizando el plásmido p63-2 como plantilla. El fragmento de ADNc se insertó a continuación en un vector de transferencia pBlueBac-3 en la secuencia BamHI-PstI en el vector. Las células de insecto SF9 están infectadas con el baculovirus recombinante generado a partir de este vector y en los lisados de células de insecto se analiza la presencia de las proteínas de 55 y 61 kDa del ORF-2 por tinción con azul de Coomassie de los geles de poliacrilamida. La(s) proteína(s) expresada(s) directamente puede(n) utilizarse como inmunógenos en vacunas y como antígenos en inmunoanálisis como se ha descrito en la presente memoria.

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Ejemplo 16 Cinética de la expresión de la proteína en el ORF-2 del VHE en células de insecto

Se examinó la cinética de expresión y la purificación de versiones completas y truncadas en el ORF2 del VHE (cepa del Pakistán) en células de insecto infectadas con baculovirus. Las proteínas del ORF2 de 72 y 63 kDa descritas en este Ejemplo son las mismas proteínas que las proteínas de 74 y 61 kDa descritas en la presente memoria en los Ejemplos 3 y 14 respectivamente; estando comprendida la diferencia en los pesos moleculares dentro del pequeño intervalo de la variabilidad normal observada para la determinación de los pesos moleculares por movilidad en electroforesis en gel.

Cultivo celular. Se cultivaron células de Spodoptera frugiperda, clon 9 (Sf-9), como cultivos en monocapa para ensayos en placa y transfecciones y cultivos en suspensión con agitador para infecciones víricas destinadas a producir estirpes de virus muy valoradas y proteína recombinante. Las células Sf-9 se mantuvieron a 28ºC y 150 rpm en medio exento de suero Sf-900 II (SFM) (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) en incubadoras con aire seco y se subcultivaron desde una densidad de partida de 0,2 \times 10^{6} células/ml hasta una densidad final de 1,0 \times 10^{7} células/ml como cultivos en suspensión hasta el paso 70.

Infecciones víricas. Se atenuaron baculovirus de polihedrosis multinuclear de Autographa californica recombinante (AcMNPV) en células Sf-9 (2,0 \times 10^{6} células/ml) a baja multiplicidad de infección (MOI; 0,01). Las infecciones víricas con el propósito de la producción de proteína recombinante se iniciaron a una MOI = 5 y se mantuvieron durante cuatro días hasta que la viabilidad alcanzó <10%. Se realizaron ensayos en placa de agarosa en placas de seis pocillos con monocapas de células Sf-9 a una confluencia del 75% por métodos normalizados.

Construcción de baculovirus recombinantes. Se construyeron baculovirus recombinantes (Fig. 11) que contenían la deleción completa (bHEV ORF2 f1) y una deleción truncada en 5' (bHEV ORF2 5' tr) en el ORF2 del VHE (cepa de Pakistán) por recombinación homóloga habitual en células de insecto Sf-9. Se construyó un baculovirus recombinante que contiene una deleción del truncamiento 5'-3' en el ORF-2 del VHE utilizando vectores de bácmido (Luckow, V.A., et al. (1993) J. Virol. 67: 4566-4579) de la manera siguiente:

Se utilizaron cebadores de oligonucleótido VHE-140 (5'-TTCGGATCCATGGCGGTCGCTCCGGCC-3') (SEC. ID. nº: 108) y VHE-141 (5'-TCAAGCTTATCATCATAGCACAGAGTGGGGGGC-3') (SEC. ID. nº: 109) para clonar un fragmento de ADN generado por PCR que codifica los aminoácidos 112 al 607 en el ORF2 del VHE con su propio codón ATG de iniciación de la traducción y múltiples codones de terminación procedentes del p61.2 en el pCR2.1 (InVitrogen, San Diego, CA) mediante clonación por T/A PCR. Un fragmento de ADN BamHI - EcoRI de 1520 bp que contiene las secuencias del ADN en el ORF2 del VHE se insertó corriente abajo del iniciador polh dentro del locus polh en el plásmido donante de baculovirus, pFASTBAC-1 (Life Technologies, Inc.). Los baculovirus recombinantes que contienen el ADN del ORF del VHE se aislaron de las células Sf-9 transfectadas con el ADN del bácmido recombinante utilizando el lípido catiónico CELLFECTIN (Life Technologies, Inc.).

Se identificó la integridad de la inserción del ADN en el ORF2 del VHE en cepas de virus purificados en placa y la expresión de la proteína en células de insecto y se expandió en un banco de siembra de virus patrón denominado bVHE ORF2 5'-3' tr virus.

Célula infectada y tratamiento del sobrenadante. Se recogieron las células infectadas y el medio sobrenadante en los tiempos indicados por centrifugación a 500 \times g y 4ºC durante 5 min. y fueron procesadas por las proteínas recombinantes en el ORF2 del VHE. Se prepararon lisados celulares por resuspensión de los sedimentos celulares en tampón de lisis (NP-40 al 0,5%, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM) a razón de 2 ml por mg de sedimento celular y se enriquecieron con aprotinina reciente hasta una concentración final de 0,2 mg/ml, se agitaron brevemente con intensidad y se incubaron durante 20 min. en hielo. Se sedimentaron los núcleos por centrifugación a baja velocidad a 3.000 \times g y 4ºC durante 15 min. y se recogió la fracción citoplásmica y se utilizó como lisado celular en bruto. Los sobrenadantes de las células infectadas y los lisados celulares se clarificaron por centrifugación a 12.000 \times g y 4ºC durante 60 min. utilizando la centrifugadora Sorvall SS34.

Purificación de los productos proteicos en el ORF2 del VHE. Las proteínas recombinantes en el ORF2 del VHE se purificaron a partir de los lisados de células infectadas con baculovirus clarificados y el medio sobrenadante por separado. El lisado celular en bruto se diluyó 1:10 con tampón de carga (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 10 mM).

Los sobrenadantes clarificados de las células infectadas se concentraron diez veces por ultrafiltración en flujo tangencial utilizando un cartucho de ultrafiltración celulósico tejido en espiral (S1Y10; área: 0,093 m^{2} (1 pie cuadrado); PM de corte: 10.000; Amicon, Beverly, MA) en un sistema de ultrafiltración Proflux M-12 de Amicon a una velocidad de recirculación de 4 l/min. y a una presión de transmembrana de 138 mPa (20 psi). El sobrenadante concentrado se dializó frente a 4 volúmenes de tampón de carga.

El dializado o el lisado diluido en bruto (1,5 vol. de lecho) se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Q Sepharose Fast Flow (columna XK50, 5,0 \times 7,5 cm, 150 ml; Pharmacia, Piscataway, NJ) a un caudal de 5,0 ml/min. Se lavó la columna en primer lugar con 1,0 volúmenes de lecho de tampón de carga a un caudal de 5 ml/min. seguido de un segundo lavado con 1,0 volúmenes de lecho de tampón de carga a un caudal de 20 ml/min. Se eluyeron las proteínas con 6,5 volúmenes de lecho de un gradiente lineal continuo de NaCl desde 10 hasta 300 mM en el mismo tampón a un caudal de 20 ml/min.

Se sometieron alícuotas de 10 \mul de las fracciones máximas de proteína de la columna Q Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) a análisis SDS-PAGE para identificar las fracciones de la proteína (+) en el ORF2 del VHE. Se desalaron fracciones (+) mezcladas por filtración en gel utilizando Sepharose G-25 (Pharmacia) y tampón de carga. Se recogió la fracción máxima de proteína y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte de alta resolución Source 15 Q (Pharmacia) para resolver los polipéptidos en el ORF2 del VHE. Se lavó la columna y se eluyó como se ha descrito anteriormente para la cromatografía líquida en Sepharose Q. Las fracciones (+) mezcladas de la proteína en el ORF2 del VHE se identificaron como anteriormente, se mezclaron y se sometieron a filtración final en gel en una columna Sephacryl S-200 (Pharmacia) utilizando tampón de carga para la purificación de la proteína final. Se identificaron fracciones de proteína en el ORF2 del VHE por SDS-PAGE y análisis de inmunoelectrotransferencia Western como se describe a continuación.

Se determinaron concentraciones de proteína por el análisis de microproteínas BCA/Pierce a 60ºC utilizando albúmina de suero bovino como proteína patrón. Toda la cromatografía se realizó utilizando un sistema de estación de trabajo de cromatografía Waters 600E (Medford, MA) equipado con el programa informático Millennium 2010 para el control y seguimiento del proceso. Se determinaron las conductividades del tampón utilizando un medidor de conductividad AccuMet 20. Se utilizó un pH-metro Corning 220 para determinaciones de pH del tampón. Todos los componentes del tampón eran USP o materias primas de calidad para biología molecular.

Análisis SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia Western. Se diluyeron dos veces las proteínas en tampón de muestra de desnaturalización de proteínas (Tris-HCl 126 mM, pH 6,8, \beta-mercaptoetanol al 5%, glicerol al 20%, SDS al 2% y azul de bromofenol al 0,005%) y se desnaturalizaron a 99ºC durante 5 min. Las muestras desnaturalizadas se sometieron a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (NOVEX) en gradiente 8 a 16% (Laemmli, U.K. et al. (1970) Nature 227:6880-685). Las proteínas se observaron tiñendo los geles de proteína con solución de tinción colidal de azul de Coomasie (NOVEX, San Diego, CA) tal como sugiere el fabricante.

Se transfirieron las proteínas a membranas de PVDF por técnicas de inmunoelectrotransferencia (Tsarev, S.A., et al. (1993) J. Inf. Dis. 168: 369-378). Se detectaron cromogénicamente productos en el ORF2 del VHE mediante fijación a antisueros primarios (\alpha-VHE policlonal de chimpancé; 1:500) seguido de fijación a antisueros secundarios (IgG_{2} \alpha-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina; 1:5.000; Life Technologies, Inc.). Se utilizó NBT/BCIP (Life Technologies, Inc.) como sustrato cromógeno.

Análisis de la secuencia del terminal amino. Se sometieron las proteínas a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS utilizando los sistemas tampón de Laemmli, U.K. et al. (1970) Nature 227:680-685). Se transfirieron electroforéticamente las proteínas desde el gel a una membrana Pro Blot (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Se observaron las proteínas mediante tinción con azul de Coomassie y las proteínas de 63 kD y de 55 kD en el ORF2 del VHE se escindieron para análisis de la secuencia del terminal amino utilizando un secuenciador de proteínas en fase gas/líquido pulsado modelo 473 de Applied Biosystems con analizador PTH en línea.

Análisis de la secuencia de aminoácidos interna. Se sometieron las proteínas a electroforesis como se ha descrito anteriormente. Se transfirieron las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa y se observaron con tinción S de Ponceau. Se cortaron bandas pertinentes en la membrana y se procesaron para digestión proteolítica in situ con Lys C (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) según el procedimiento de Abersold et al. (Abersold, R.H., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. UEA 84:6970-6974). Se aislaron los fragmentos procedentes de Lys C utilizando un sistema de cromatografía líquida a alta presión de Waters Associates (Medford, MA) y una columna en fase inversa Vydac C4 (Hesperia, CA). Se determinaron las secuencias de aminoácidos de los péptidos aislados utilizando un secuenciador de proteínas modelo 477A de Applied Biosystems y un analizador PTH en línea modelo 120A.

Análisis de aminoácidos. Se determinaron las composiciones de aminoácidos de los fragmentos derivados de Lys C descritos anteriormente siguiendo la hidrólisis en fase de vapor en HCl 6 N a 150ºC durante 1 hora utilizando la estación Pico Tag de Waters. Se modificaron los aminoácidos con fenilisotiocianato (PTC) y se separaron y cuantificaron los aminoácidos PTC resultantes utilizando un sistema de análisis de aminoácidos Pico Tag de Waters.

Análisis de la secuencia carboxi-terminal. Se utilizó carboxipeptidasa Y inmovilizada (Pierce, Rockford, IL) para la liberación secuencial de aminoácidos del terminal carboxi de la proteína del VHE de 55 kDa. Aproximadamente 150 \mug de la proteína en 800 \mul de tampón de acetato sódico 0,05 M, pH 5,5, se mezclaron con una suspensión de 200 \mul de la resina a 37ºC. Se tomaron alícuotas del sobrenadante (100 \mul) a 0, 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos. Se recogió una alícuota final a las 16 horas. Se secaron las muestras al vacío y se sometieron a análisis de aminoácidos como se ha descrito anteriormente sin la etapa de hidrólisis.

Espectroscopia de masas. La detección espectrométrica de masas de las proteínas purificadas se realizó con un espectrómetro de masas de cuadrupolo de triple etapa Sciex API-III de Perkin-Elmer (Foster City, CA) equipado con una fuente de atomización de iones articulada a presión atmosférica. El nitrógeno de alta pureza sirvió tanto como gas nebulizador (presión de operación = 0,5 MPa) como de cortina de gas (caudal = 0,8 l/min.). Se utilizó argón como gas diana en una masa de gas de colisión de 3 \times 10^{15} átomos/cm^{2}. Se obtuvieron 100 a 1.500 iones positivos del intervalo mIz de barrido del espectro de masas por infusión directa de 50 \mul/min. con una bomba de jeringuilla modelo 11 del aparato de Harvard (Southnatick, MA) de soluciones patrón de albúmina de suero bovina diluidas 1:200 en la fase móvil. Los espectros se recogieron a intervalos de 1,0 s. Se mantuvo el voltaje capilar en 2 kV y 60ºC.

Se investigó la expresión temporal de los productos en el ORF2 del VHE para identificar las proteínas del VHE recombinante procesadas. Células de insecto Sf-9 cultivadas como cultivos en suspensión en medio exento de suero se infectaron con baculovirus recombinantes que codifican el gen de la cápside del virus de la hepatitis E completo (cepa de Pakistán) (Figura 11). Se recogieron los lisados celulares y los sobrenadantes del medio de las infecciones por virus diariamente durante cuatro días consecutivos. Los resultados de los análisis SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia Western de los lisados celulares de VHE demostraron la presencia de una proteína de 72 kD en el ORF2 del VHE un día después de la infección (p.i.) que desapareció después (Figura 12). Dos días p. i. las proteínas de 63 y 55 kD del VHE estaban presentes en las células infectadas. La proteína de de 55 kD del VHE se volvió predominante en las células infectadas tres días p. i. (Figura 12). La proteína abundante en 63-65 kD observada a los dos a cuatro días después de la infección fue identificada como la quitinasa de baculovirus y no la proteína de 63 kD del VHE. Una proteína del VHE de 55 kD fue segregada en los sobrenadantes del medio celular infectados tan pronto como un día p.i. y fue abundante al máximo durante tres días p.i. Estos resultados indicaron que se produjo una escisión proteolítica estocástica de la proteína principal de 72 kD del VHE para generar un producto final de proteína de 55 kD (lisado celular) o de 53 kD (medio) del VHE.

Purificación de proteínas del VHE. Las proteínas recombinantes de 63 y 55 kDa del VHE se purificaron por cromatografía de intercambio aniónico y filtración en gel de los lisados celulares producidos por la lisis en NP-40 de las células Sf-9 infectadas con virus f1 en el ORF2 del bVHE recombinante o virus truncados y recogidos a los 4 días p. i. La proteína de 53 kD segregada se purificó de los sobrenadantes del medio de las infecciones por virus recogidas que se clarificaron por centrifugación y se concentraron 10 veces por ultrafiltración en flujo tangencial. Los lisados celulares y los sobrenadantes del medio concentrados se diluyeron 10 veces y se dializaron, respectivamente, con tampón de carga Q (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 10 mM) procedente de células infectadas con el montaje 5' doblemente travented. Los lisados celulares equilibrados (proteína de 55 kD) y los sobrenadantes del medio (proteína de 53 kD) se cargaron por separado en una columna de intercambio aniónico fuerte Fast Flow Q Sepharose. Las proteínas de 55 kD del VHE se unieron y se eluyeron a una fuerza iónica de NaCl 140 mM (Figura 13A). Las fracciones con la máxima proteína del VHE de los lisados celulares cromatografiados y los sobrenadantes se mezclaron, se desalaron por paso a través de una columna Sephacryl G-25 y se sometieron a una segunda ronda de cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna de alta resolución aniónica fuerte SOURCE 15 Q. Se ligaron las proteínas del VHE y a continuación se eluyeron en NaCl 140 mM (Figura 13B). Las fracciones con la máxima proteína del VHE se mezclaron y se fraccionaron por filtración en gel utilizando una columna Sephacryl S 200 (Figura 13C). Los análisis de SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia Western de las fracciones proteicas de 55 kD demostraron que la proteína de 55 kD era de origen del VHE (Figura 14, panel inferior). A partir de los geles de proteína teñidos con azul de Coomassie, se estimó que la pureza de la proteína de 55 kD era del 99% o superior (Figura 14, panel superior).

Análisis de la secuencia amino terminal. Para determinar los terminales amino de las proteínas recombinantes de 63 y 55 kD del VHE detectadas durante la infección por bVHE de células de insecto, se emprendió el análisis de la secuencia de aminoácidos del terminal amino. Se recogieron fracciones mezcladas de la proteína del VHE en columnas Q Sepharose Fast Flow cargadas con lisados celulares diluidos procedentes de células de insecto Sf-9 infectadas con virus f1 del ORF2 del bVHE y se recogieron a los 2 días p.i. Se purificaron dos proteínas del VHE procedentes de las fracciones máximas de Q en NaCl 140 mM en una proporción de 1:20 (63 kD: 55 kD). La degradación directa de Edman de las bandas de las proteínas de 63 kD y 55 kD del VHE escindidas de la membrana ProBlot dio como resultado una secuencia de aminoácidos idéntica durante 20 ciclos (Tabla 9).

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TABLA 9 Análisis de la secuencia de aminoácidos de terminal amino de proteínas recombinantes de SEC. ID. nº: 110 63 kD del VHE y de 55 kD de la SEC. ID. nº: 111 purificadas en lisados celulares

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La secuencia correspondía a los restos 112 a 131 del marco de lectura abierto 2 del genoma del VHE. Estos resultados indicaron que la diferencia en el peso molecular aparente entre las dos proteínas inmunorreactivas era debida a los truncamientos del terminal carboxi.

Análisis de la secuencia de aminoácidos interna. Para determinar con más detalle la identidad compartida de las proteínas recombinantes de 63 y 55 kD del VHE, se realizó la digestión con peptidasa y el fraccionamiento. La proteína purificada de 55 kD del VHE se digirió con Lys C proteasa ya que la especificidad de esta enzima para la escisión del terminal carboxi a restos de lisina se estimó más adecuada que la tripsina para la producción de péptidos y la determinación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de 55 kD del VHE. Las características del péptido del digesto Lys C resultante se presentan en la Figura 15.

Se sometieron alícuotas de los máximos a análisis de la secuencia de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos internos para la proteína recombinante de 55 kD en el ORF2 del VHE correspondían a la secuencia de aminoácidos esperada en el ORF2 del VHE (cepa de Pakistán). No se encontraron los péptidos que contienen secuencias de aminoácidos procedentes de la zona 607 a la 670 de aminoácidos en el ORF2 del VHE. De particular interés fue la fracción 24 que proporcionó 52 ciclos de secuencia clara correspondiente a los restos 554 a 606 de aminoácidos en el ORF2 del VHE. No se observaron aumentos en PTH de leucina en los ciclos 53 ó 55 (restos 606 ó 608), aunque se observó un aumento en PTH de alanina en el ciclo 54. Dado que >50 restos de aminoácidos de secuencia legible de aminoácidos no era corriente en el laboratorio de los autores, no estaba claro si el fallo para obtener los datos de la secuencia adicional estaba producido por una pérdida de señal debida a alcanzar el final del péptido (es decir, el terminal carboxi de la proteína) o una anomalía en la química de Edman. Por consiguiente, era necesaria la determinación del terminal carboxi de la proteína recombinante de 55 kD en el ORF2 del VHE por varios otros medios.

Análisis de la composición de aminoácidos: Un medio alternativo para determinar si los aminoácidos 606 a 608 de la proteína recombinante de 55 kD del OR2 del VHE estaban presentes en la digestión de Lys C fracción 24 era el análisis de la composición de aminoácidos de este péptido. Los resultados del análisis de aminoácidos de una alícuota de la fracción 24 se muestra en la Tabla 10.

TABLA 10 Resumen del análisis de la composición de aminoácidos de la fracción 24 de la proteína de 55 kD del VHE digerida con Lys-C

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Este análisis indicó que el fallo para obtener los datos de la secuencia de aminoácidos más allá del ciclo 54 (resto 607) era debido al hecho de que el secuenciado de aminoácidos había alcanzado el terminal carboxi de la proteína de 55 kD. Los resultados eran coherentes con la terminación del péptido en leucina 607. Aunque este análisis adaptó otras variaciones menores, demuestra claramente que el péptido terminó bien más de un resto de lisina anterior (resto 600) en el ORF2 del VHE.

Análisis de la secuencia con terminal carboxi. Un medio adicional para determinar el terminal carboxi de la proteína de 55 kD en el ORF2 del VHE recombinante era el análisis de aminoácidos del terminal carboxi de la proteína de 55 kD digerida por carboxipeptidasa. El análisis en aminoácido de los aminoácidos libres liberados durante una incubación cronometrada con carbopeptidasa Y inmovilizada puso de manifiesto un rápido aumento en la leucina seguido de valina, serina e histidina (Figura 16). No se observaron aumentos significativos en las cantidades de los demás aminoácidos. Estos resultados corroboraron la asignación del terminal carboxi de la proteína recombinante de 55 kD en el ORF2 del VHE en el aminoácido leucina 607.

Análisis espectrométrico de masas. El peso molecular esperado de la proteína de 55 kD del VHE (aminoácidos 112 a 607 en el ORF2 del VHE) de la secuencia nucleotídica en el ORF2 del VHE (cepa de Pakistán) se estimó en 53 kD. Para obtener una masa absoluta de esta proteína, se emprendió la espectroscopia de masas con electroatomización de la proteína recombinante de 55 kD del VHE purificada. El resultado de varias rondas de mediciones por MS fue que un solo polipéptido con una masa molecular de \sim 56.000 daltons estaba presente en la preparación de la proteína purificada (Figura 17). Dado que la espectroscopia de masas tiene un grado del 0,01% de precisión, se corroboró la conclusión de que la proteína de 55 kD del VHE fue generada por las escisiones proteolíticas tanto del terminal N como del terminal C.

Cinética de la expresión de la proteína truncada en el ORF2 del VHE en células de insecto. Para determinar si las proteínas primarias que se eliminaron en los terminales amino y/o carboxi en el ORF2 del VHE podrían expresarse de forma estable y a altos niveles en células de insecto, se clonaron mutantes de la deleción truncada en 5' y 5'-3' en el ORF2 del VHE en vectores de baculovirus. Los resultados de las infecciones con los virus 5' tr en el ORF2 del bVHE y 5'-3' tr en el ORF2 del bVHE indicaron que las proteínas de 66 y 55 kD estaban ambas expresadas en células de insecto (Figura 18). Sin embargo, la proteína de 55 kD se volvió > 50 veces más abundante tres días p.i. en la infección por el 5' tr en el ORF2 del bVHE y estaba solamente presente en las infecciones por el virus 5'-3' tr en el ORF2 del bVHE. Una proteína de 53 kD se segregó también en el medio sobrenadante el primer día de infección con ambos virus y alcanzó los niveles máximos tres días p.i. La abundancia de la proteína de 53 kD segregada fue más de 20 veces más abundante en las células de insecto infectadas con el virus 5'-3' tr en el ORF2 del bVHE que en las células infectadas con el virus 5' tr en el ORF2 del bVHE. La proteína de 55 kD se purificó en los lisados celulares procedentes de ambas infecciones víricas y la proteína de 53 kD se purificó en el medio sobrenadante mediante los esquemas de purificación descritos anteriormente. El terminal amino y carboxi de la proteína de 53 kD segregada ha sido identificado como los aminoácidos 112 y 578 en el ORF2 del VHE y la proteína de 53 kD se ha demostrado que es antigénica en el ELISA. El peso molecular esperado de la proteína de 53 kD fue de 50 kD pero se demostró que la proteína tiene una masa molecular de aproximadamente 53 kilodaltons por espectroscopia de masas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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La mutagénesis de la PCR dirigida al punto de los 112 a 607 bVHE se realizó también utilizando un cebador oligonucleotídico que contenía un codón AUU y los nucleótidos circundantes al aminoácido 578 (cepa paquistaní en el ORF2 del VHE) para crear una sustitución de arginina por isoleucina en el aminoácido 578. Otros mutantes de los 112 a 607 bVHE incluían aquellos con la sustitución del aminoácido arginina por glicina, serina o ácido glutámico en el aminoácido 578. Estos mutantes se construyeron como se describió anteriormente utilizando cebadores oligonucleotídicos que contienen codones para los cambios de aminoácido deseados. Se cree que estos mutantes de 112 a 607 bVHE impulsarían el equilibrio de producción de las proteínas ORF2 del VHE hacia una sola proteína.

Ejemplo 18 Estudios de la vacuna en monos rhesus

Primates. En este estudio se utilizaron 32 monos rhesus (Macacca mulatta) que eran anticuerpos del VHE (anti-VHE) negativos (<1,10) en un ELISA sensible (Tsarev S.A., et al. J. Infect. Dis. (1993); 89:369-78).

Solución madre de la prueba de provocación con VHE. La cepa SAR-55 del VHE paquistaní [Iqbal M., et al. J. Trop. Med. Hyg. 1989; 40, 438-443] (heces humanas) o la cepa Mex-14 del VHE mejicano [Velázquez O., et al. JAMA (1990); 263:3281-5] (heces de mono, proporcionadas por la CDC) se utilizó como fuente de virus de provocación. Para la inoculación intravenosa de animales se utilizó una suspensión [en suero seronegativo de cynomolgus (Macacca fascicularis) de heces que contenían la cepa del VHE paquistaní o mejicano diluida hasta contener 10.000 dosis infecciosas de mono (MID_{50}).

Inóculos para inmunización. La proteína de 55 kD en el ORF-2 [Tsarev S.A., et al., Prospects for prevention of hepatitis E. En: Enterically transmitted hepatitis viruses. (Y. Buisson, P. Coursaget, M. Kane eds.). La Simarre, Joueles-Tours, Francia (1996) pág. 373-383] purificada procedente de células de insecto infectadas (infectadas con baculovirus recombinante que contenía el ORF2 completo) se precipitó con alúmina como se ha descrito [Tsarev, S.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, (1994); 191:10198-202]. La eficacia de la precipitación fue superior al 99%, determinada por análisis ELISA del antígeno soluble residual. El complejo proteína-alúmina se almacenó a +4ºC hasta 1 año.

Programa de inoculación

Se vacunaron monos rhesus por inyección intramuscular de 0,5 ml de vacuna que contenía 50 \mug, 10 \mug, 2 \mug ó 0,4 \mug de la proteína de 55 kD precipitada con alúmina. Se administraron dos dosis un mes aparte. Se inyectaron otros animales con 0,5 ml de suspensión de alúmina que carecía de la proteína recombinante (placebo).

Control de primates. Se recogieron biopsias del hígado con aguja percutánea y muestras de suero y de heces antes de la inoculación y semanalmente durante 15 semanas después de la inoculación. Se analizaron las concentraciones de alanina aminotransferasa (ALT) en el suero con análisis disponibles en el mercado (Metpath Inc., Rockville, MD). La prueba bioquímica de la hepatitis se definió como un aumento del doble o superior en la relación pos-inoculación/pre-inoculación de ALT. La biopsia del hígado se realizó y se puntuó la histopatología como se ha descrito [Tsarev, S.A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, (1994); 191:10198-202]. La evaluación clínica de los animales se realizó a ciegas. El ELISA con anti-VHE y la reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se realizó como se ha descrito [Tsarev, S.A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, 1994; 191:10198-202]. Para la cuantificación, los sueros o heces consecutivos positivos en la PCR de cada animal se combinaron y se diluyeron en serie en incrementos de diez veces en suero de ternero. Se utilizaron 100 \mul de cada dilución para la extracción del ARN y RT-PCR. El protocolo de la PCR utilizado en este estudio pudo detectar concentraciones tan pequeñas como 10 MID_{50} de VHE por ml de suero y tan pequeñas como 100 MID_{50} por gramo de heces.

Análisis estadístico. Se utilizaron las pruebas de la t de Student para comparación de parejas de parámetros cuantitativos de hepatitis e infección por VHE para un grupo placebo frente al grupo de vacunación después de la exposición y para un grupo placebo frente al grupo de la prueba de provocación con el virus heterólogo. Se utilizó la prueba de Dunnett para la comparación múltiple del grupo placebo frente a los grupos vacunados con diferentes dosis de la vacuna recombinante. Se utilizó la prueba de Tukley para comparaciones múltiples de valores de anti-VHE en el periodo de la prueba de provocación en animales vacunados con diferentes dosis.

Para análisis estadístico, a las muestras de suero que contenían <10 genomas de VHE en 1 ml de suero se les asignó un título de 1:1 y a las muestras fecales que contenían <100 genomas de VHE en 1 g de heces se les asignó un valor de 1:10.

Resultados

Infección por hepatitis E en los grupos con placebo. Cada uno de los cuatro monos rhesus vacunados con alúmina sola y sometidos a la prueba de provocación con la cepa SAR-55 del VHE contrajo hepatitis: relaciones de ALT máximas pos/pre en estos animales fueron significativamente superiores al valor de corte de 2,0 y variaron entre 3,1 y 10,6 (Tabla 12).

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La hepatitis fue confirmada por los resultados de las pruebas histológicas. La puntuación de la histopatología acumulativa osciló entre 4,5+ y 6,0+. La viremia y la excreción del virus se controlaron en cada animal. La viremia estaba presente durante 5 a 6 semanas y el virus se excretó un total de 5 a 7 semanas. El suero positivo o las muestras fecales se combinaron y se determinaron los valores del genoma del VHE en las mezclas para cada animal. El valor del genoma del VHE osciló entre 10^{3} y 10^{4} en los sueros mezclados y entre 10^{6} y 10^{8} en las muestras fecales mezcladas. Los valores del genoma del VHE eran comparables a los publicados por los autores previamente para los monos cynomolgus sometidos a la prueba de provocación con la misma cepa SAR-55 del VHE (Tsarev, S.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, (1994); 191:10198-202). La duración de la viremia y la excreción del virus fueron también comparables.

Cada uno de los cuatro animales sometidos a la prueba de provocación con la cepa Mex-14 de VHE contrajo hepatitis con parámetros cuantitativos de la enfermedad, exceptuando las puntuaciones de la histopatología similares a las de los animales sometidos a la prueba de provocación con la cepa SAR-55 (Tabla 13).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los parámetros cuantitativos de la infección eran también similares en los dos grupos de animales. Por lo tanto, las estirpes de la prueba de provocación con VHE fueron capaces de producir hepatitis en cada uno y en cada cada animal sometido a la prueba de provocación y por consiguiente no pudieron utilizarse para la validación de la eficacia de la vacuna contra la hepatitis E.

Infección de hepatitis E en el grupo vacunado después de la exposición. Se sometieron a la prueba de provocación cuatro animales con la cepa SAR-55. Cuarenta y ocho horas después de la prueba de provocación estos animales se vacunaron con una dosis de 50 \mug de la vacuna seguido de una dosis de refuerzo (50 \mug) un mes después. No se hallaron diferencias significativas en los parámetros de la enfermedad o de la infección en este grupo en comparación con el grupo del placebo, a excepción de que la duración de la viremia y de la excreción viral se redujo 1,5 veces y 1,7 veces respectivamente (datos no mostrados).

Vacunación. Todos los primates vacunados con la dosis de 50 \mug, 10 \mug ó 2 \mug de la vacuna y 3 de los 4 primates vacunados con la dosis de 0,4 \mug de la proteína recombinante se seroconvirtieron a VHE después de la primera inmunización (Tablas 12 y 13). Se observó una correlación directa entre la dosis de la vacuna y el valor anti-VHE después de la primera dosis; una media geométrica (GM) de 1:32 para la dosis de 0,4 \mug, 1:316 para la dosis de 2 \mug, 1:1.000 para la dosis de 10 \mug y 1:3.200 para la dosis de 50 \mug. Cuando se administró la segunda dosis de la vacuna, se observaron todavía diferencias relacionadas con la dosis en los valores de GM un mes después de la segunda vacunación, pero el intervalo era más estrecho (entre 1:1.800 y 1:5.600 como se observa en la Tabla 14).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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El análisis estadístico que utiliza una prueba de comparación múltiple para valores de GM anti-VHE indicó que las diferencias relacionadas con la dosis en los valores de GM después de dos dosis de vacuna no eran significativas. En este periodo los monos rhesus se sometieron a la prueba de provocación.

Pruebas de provocación homólogas. Los 16 animales vacunados con alguna de las cuatro dosis de la vacuna se protegieron contra la hepatitis según el criterio bioquímico ya que ninguno desarrolló concentraciones de ALT en el suero elevadas (Tabla 12). Se hallaron cambios histológicos solamente en dos de los 16 animales y estos habían recibido las dos dosis más bajas de la vacuna. Las anomalías histológicas fueron mínimas y en uno de estos dos animales (rhesus-5978) podía incluso no estar relacionada con la infección por VHE porque se encontraron anomalías similares en muestras de hígado también antes de la inoculación. En general, los cuatro grupos de animales vacunados dos veces con dosis de 50 \mug, 10 \mug, 2 \mug ó 0,4 \mug de vacuna se protegieron contra la hepatitis y los parámetros cuantitativos de la hepatitis en cada uno de estos cuatro grupos eran estadísticamente diferentes de los del grupo del placebo (Tabla 14).

Aunque los animales en todos los grupos vacunados estaban protegidos contra la enfermedad de la hepatitis E, no estaban protegidos contra la infección por el VHE. Aun cuando los valores del virus en los animales vacunados eran estadísticamente inferiores a los de los grupos del placebo, en la mayoría de los casos la duración de la viremia y la excreción vírica no se redujeron de manera significativa. Comparado con el grupo del placebo, el nivel de viremia en los animales vacunados se redujo aproximadamente 80 veces y el nivel de excreción vírica se redujo aproximadamente 1.000 veces por término medio. Se protegieron dos animales contra la viremia, con la cepa Mex-14 del VHE, la más genética y geográficamente diferente de la cepa de la vacuna, se protegieron contra la hepatitis mediante la administración de dos dosis de 50 \mug de vacuna recombinante (Tabla 13). La prueba histológica o bioquímica de la hepatitis no se detectó en ninguno de estos animales. Cuando los animales inmunizados se compararon como grupo al grupo del placebo, las diferencias en la expresión de la enfermedad fueron estadísticamente significativas (Tabla 14). Sin embargo, como en el caso de la prueba de provocación homóloga, la mayoría de los animales no estaban protegidos contra la infección con VHE. Se detectó tanto la viremia como la excreción vírica en los tres animales. El cuarto animal no experimentó ninguna de las dos y por consiguiente estaba completamente protegido contra la infección. Los niveles de viremia y excreción vírica se redujeron significativamente (aproximadamente 180 veces y 1.800 veces) cuando se compara con los animales vacunados con el placebo. La diferencia en la duración de la excreción vírica era significativa pero la de la viremia no.

En resumen, estos experimentos demostraron que una dosis de la proteína recombinante tan baja como 0,4 \mug administrada dos veces protegía a los monos rhesus de la hepatitis. No se observaron diferencias significativas en los valores por GM de anti-VHE después de dos dosis de vacuna que oscilaba entre 0,4 \mug y 50 \mug. Cuando se sometieron a la prueba de provocación con la cepa del virus homólogo, todos los animales vacunados estaban protegidos contra la hepatitis E medida por las elevaciones de ALT y solamente dos animales, los cuales recibieron la dosis menor de la vacuna, presentaban histopatología mínima. El efecto protector de la vacuna se cuantificó por comparación de multigrupo lo que indicaba que, a excepción del grupo vacunado después de la exposición, los parámetros cuantitativos de la hepatitis en todos los primates vacunados eran menores que los del grupo del placebo y esta diferencia era estadísticamente significativa. Además, los animales vacunados que recibieron la dosis de 50 \mug de la vacuna dos veces, la única dosis probada, estaban protegidos de la prueba de provocación heteróloga con la cepa más distante genética y geográficamente del VHE identificado hasta la fecha. En cambio, la vacunación después de la exposición no tuvo éxito. Todos los animales que se vacunaron 48 horas después de la prueba de provocación contrajeron hepatitis según ambos criterios bioquímico e histológico.

Aunque los primates seropositivos estaban protegidos contra la hepatitis E después de la prueba de provocación con una dosis elevada de VHE la mayoría de ellos no estaban protegidos contra la infección por VHE. Esto quizás no es sorprendente ya que este virus, que se transmite normalmente por vía oral, se administró por vía intravenosa para asegurar uniformidad de exposición. Sin embargo, la extensión de la infección medida por los niveles de viremia y de excreción vírica se redujo significativamente en todos los animales vacunados comparados con los animales con placebo. Y de hecho, un animal sometido a prueba de provocación con la cepa heteróloga estaba protegido completamente contra la infección con VHE y dos animales sometidos a la prueba de provocación con la cepa homóloga del VHE excretaron virus pero no presentaban viremia detectable. El mayor porcentaje de animales completamente protegido contra la infección en el estudio previo de los autores [Tsarev, S.A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UEA, (1994); 191:10198-202] puede explicarse por el hecho de que en el estudio previo los autores utilizaron ambas dosis de 1.000 y 10.000 MID_{50} de virus de la prueba de provocación mientras que en este estudio los autores han utilizado solamente la dosis mayor. Ya que existe una respuesta dependiente de la dosis a la infección por VHE en primates [Tsarev, S.A., et al. Prospects for prevention of hepatitis E. En: Enterically transmitted hepatitis virases. (Y. Buisson, P. Coursaget, M. Kane eds.). La Simarre, Joueles-Tours; Francia, 1996, pág. 373-383], se seleccionó la dosis mayor para asegurar que cada animal no vacunado desarrollaba hepatitis pronunciada.

En este estudio y en el anterior, se demostró que, sin excepción, el valor vírico en el suero era inferior que en las heces (aproximadamente 1.000 veces por término medio) en todos los primates con placebo y vacunados. Este descubrimiento es coherente con el hecho de que el VHE se transmite por vía fecal-bucal. En cada animal vacunado disminuyeron los niveles de viremia y se observó excreción viral cuando se comparaba con los animales con placebo. Sin embargo, la duración de la viremia, aunque más corta en todos los primates vacunados, no se redujo de manera significativa en comparación con la de los placebos en la mayoría de los casos. La viremia ha ido siempre paralela a la excreción de VHE en las heces en varias docenas de primates investigados. Por consiguiente, pueden utilizarse muestras de suero como indicador principal de la infección vírica con el valor que refleja el nivel de la infección por VHE. Esto es una observación importante porque las muestras de suero están normalmente disponibles más fácilmente que las muestras fecales.

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Ejemplo 19 Protocolo de purificación alternativo para los productos de la proteína en el ORF2 del VHE

El siguiente protocolo de purificación es una forma de realización alternativa al protocolo de purificación dado a conocer en las páginas 89 a 90 de esta solicitud.

El protocolo de purificación es de la forma siguiente:

Se purificaron proteínas recombinantes en el ORF2 del VHE de lisados celulares infectados con baculovirus clarificado y medio sobrenadante por separado. El lisado celular en bruto se diluyó 1:10 con tampón de carga (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 10 mM).

Los sobrenadantes de las células infectadas clarificados se concentraron diez veces por ultrafiltración en flujo tangencial utilizando un cartucho de ultrafiltración celulósico tejido en espiral (S1Y10; área: 0,093 m^{2} (1 pie cuadrado); PM de corte: 10.000; Amicon, Beverly, MA) en un sistema de ultrafiltración Proflux M-12 de Amicon a un caudal de recirculación de 4 l/min. y una presión de transmembrana de 138 mPa (20 psi). El sobrenadante concentrado se dializó frente a 4 volúmenes de tampón de carga.

El dializado o el lisado en bruto diluido (1,5 vol. de lecho) se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Fast Flow Q Sepharose (columan XK50, 5,0 \times 7,5 cm, 150 ml; Pharmacia, Piscataway, NJ) a un caudal de 10,0 ml/min. Se lavó la columna en primer lugar con 1,0 volúmenes de lecho de tampón de carga a un caudal de 10,0 ml/min. seguido de un segundo lavado con 1,0 volúmenes de lecho de tampón de carga a un caudal de 20 ml/min. Se eluyeron las proteínas con 7,5 volúmenes de lecho de un gradiente lineal continuo de NaCl de 10 a 300 mM en el mismo tampón a un caudal de 20 ml/min.

Alícuotas de 10 \mul de las fracciones de proteína máxima de la columna Q Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) se sometieron a análisis de SDS-PAGE para identificar las fracciones de proteína (+) en el ORF2 del VHE. Las fracciones (+) mezcladas se desalaron por filtración en gel utilizando Sephadex G-25 (Pharmacia) y tampón de carga. Se recogió la fracción máxima en proteína y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte de alta resolución Source 15 Q (Pharmacia) para resolver los polipéptidos en el ORF2 del VHE. La columna se lavó y se eluyó como se ha descrito anteriormente para la cromatografía líquida en Q Sepharose. Las fracciones (+) de la proteína en el ORF2 del VHE mezcladas como anteriormente, se mezclaron y se sometieron a una filtración final en gel en una columna Superdex 75 (Pharmacia) utilizando solución salina tamponada con fosfato (6,8) para la purificación de la proteína final. Las fracciones de la proteína en el ORF2 de VHE fueron identificadas por análisis de SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia Western.

La proteína en el ORF2 del VHE purificada mediante este protocolo es adecuada para la formulación como vacuna con VHE para su utilización en estudios clínicos en fase I y II.

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTES: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní de hepatitis E y su utilización en procedimientos de diagnóstico y vacunas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 111

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): REMITENTE: MORGAN & FINNEGAN

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 345 PARK AVENUE

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: NUEVA YORK

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: NUEVA YORK

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: USA.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 10154

\vskip0.800000\baselineskip

(v): LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: DISQUETE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC COMPATIBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: WORDPREFECT 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: Pendiente de asignar

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-ABR-1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/840.316

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-ABR-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Richard W. Bork

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.459

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: 2026-4255PC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212) 758-4800

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212) 751-6849

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1693

\vskip0.500000\baselineskip

(B): RESTOS DE AMINOÁCIDOS TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

36

37

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 660 restos de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 restos de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7168 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

48

49

50

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATTTGAAT TCACAGACAT TGTGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGGATCC ATGGTGTTTG AGAATG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTAAACTG GTACTGCACA AC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTCCCGCT CTATTACCCA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCACGGGT GTTGGTTTTT G

\hfill

21

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTATTCAGAATT CATGTCAACG GACGTC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATAATTCAT GCCGTCGCTC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTCCAGGA AGGTACAACT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAATCGATGG CTGGGATCTG ATTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCATTGT AGAGCTTTGT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGTTGCAC GGACAGCAAA TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATCCATTC TGTCCCGAGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTGTGACC TTGGTCCAGTC

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTTCACTG AGTCAGTGAA CGTGAG

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATTATAAC ACCACTGCTA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTGCAATA CCTTATCCTG

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTTCGATA GCCAGATTTG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATGTTGGT TGTCATAATC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGACGCAC TTCTCAGTGT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAACAACGA ACGGAGAAC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATCCCAGC CATCGACTTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGTAGTGTA GGTGGAAATA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTGGTTAT TCAGGATTAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTCAAGTT CGAGGGCAAA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTTACCCT GTTTAACCTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTCATGT TTCTGCCTAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGAACGA AATGGAGATA GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAGACATA AAACCTAAGT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCCTATAC AGGTTTAATC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGGCATAT ACCAGGTGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATGGCTCA CTCGTAAATT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACATTAGAC GCGTTAACGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTACCCGG ATGGCTCTAA GG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGGGAGCA GTATACCAGC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCTATTGA GCAGGCTGCT C

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCCATTAG TCTCTAAAAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGTTTTCT GGAATCATC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATAGGTGA GACTG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTACAGCC AGAAAACC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCAGACCA CATATGTG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGCACTCC TGACCAAGCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTGGCTGCC ACTTTGTTC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCTCATAC GTCACCACAA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGATATGT CACCATCTG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCCATA ACGAGCTGG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AGG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGCC TATGCC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT AACATGTC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCCTG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATGAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGTGGATC GCCTCCCAGG CGTCAAAAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTAGAATTC CGGCCCACGT GTGGTAGGTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGCCGATG TGGACGTTGT CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGAAACTA GTGTTGACCC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACAATCTTT CAGGAAGAAG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCACACTCC TCCATAATAG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATAGTCGTT TGCAGTGAGT ACCG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCACAACCTA GGTTACTATA ACTCCCGAGT TTTACC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTTCCCTA GGATGCGCCC TCGGCCTATT TTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTGGGCCTA GGAGCGGCGG TTCCGGCGGT GGT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTGGCCTA GGCAGGCCCA GCGCCCCGCC GCT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCCACCTA GGGATGTTGA CTCCCGCGGC GCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 108:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGGATCCA TGGCGGTCGC TCCGGCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAAGCTTAT CATCATAGCA CAGAGTGGGG GGC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 restos de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro}

\sac{Val Pro Asp Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 restos de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 111:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro}

\sac{Val Pro Asp Val Asp}

Claims

1. Molécula de ADN que presenta una secuencia constituida por nucleótidos que codifican una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E, teniendo dicha proteína su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2.

2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, que presenta una secuencia constituida por nucleótidos que codifican los aminoácidos 112 a 607 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

3. Molécula de ADN según la reivindicación 1, que presenta una secuencia constituida por nucleótidos que codifican los aminoácidos 112 a 578 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

4. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que la molécula codifica una proteína que tiene su terminal amino en el aminoácido 112 de la SEC. ID. nº: 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 de la SEC. ID. nº: 2.

5. Molécula de ADN según la reivindicación 2, en la que la molécula codifica los aminoácidos 112 a 607 de la SEC. ID. nº: 2.

6. Molécula de ADN según la reivindicación 3, en la que la molécula codifica los aminoácidos 112 a 578 de la SEC. ID. nº: 2.

7. Vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

8. Célula hospedadora que contiene un vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Procedimiento de producción de una proteína recombinante del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E, comprendiendo dicho procedimiento:

(a): cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 8 en condiciones apropiadas para producir la expresión a partir de dicha proteína; y

(b): obtener dicha proteína expresada en la célula hospedadora.

10. Proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E, que tiene su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2.

11. Proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E según la reivindicación 10, que está constituida por los aminoácidos 112 a 607 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

12. Proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E según la reivindicación 10, que está constituida por los aminoácidos 112 a 578 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

13. Proteína del virus de la hepatitis E según la reivindicación 10, en la que dicha proteína tiene su terminal amino en el aminoácido 112 de la SEC. ID. nº: 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 de la SEC. ID. nº: 2.

14. Proteína del virus de la hepatitis E según la reivindicación 11, en la que dicha proteína está constituida por los aminoácidos 112 a 607 de la SEC. ID. nº: 2.

15. Proteína del virus de la hepatitis E según la reivindicación 12, en la que dicha proteína está constituida por los aminoácidos 112 a 578 de la SEC. ID. nº: 2.

16. Composición farmacéutica que comprende la proteína según la reivindicación 10, 11, 13 ó 14 y un excipiente, diluyente o vehículo adecuado.

17. Utilización de la proteína según la reivindicación 10, 11, 13 ó 14 en la preparación de un medicamento para su utilización en la prevención de la hepatitis E en un mamífero.

18. Vacuna para inmunizar un animal contra la infección por hepatitis E, comprendiendo dicha vacuna una proteína según la reivindicación 10, 11, 13 ó 14 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Kit para prevenir la hepatitis E en un mamífero, que comprende una proteína según la reivindicación 10, 11, 13 ó 14.

\newpage

20. Procedimiento de detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E está constituida por los aminoácidos 112 a 607 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

22. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E está constituida por los aminoácidos 112 a 578 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

23. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la proteína tiene su terminal amino en el aminoácido 112 de la SEC. ID. nº: 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 de la SEC. ID. nº: 2.

24. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la proteína está constituida por los aminoácidos 112 a 607 de la SEC. ID. nº: 2.

25. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la proteína está constituida por los aminoácidos 112 a 578 de la SEC. ID. nº: 2.

26. Kit para su utilización en un procedimiento de detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E que tiene su terminal amino en el aminoácido 112 del marco de lectura abierto 2 y su terminal carboxi en el aminoácido 578 ó 607 del marco de lectura abierto 2.

27. Kit según la reivindicación 26, comprendiendo dicho kit una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E constituida por los aminoácidos 112 a 607 de una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

28. Kit según la reivindicación 26, comprendiendo dicho kit una proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E constituida por los aminoácidos 112 a 578 de la proteína del marco de lectura abierto 2 del virus de la hepatitis E.

29. Kit según la reivindicación 26, en el que la proteína tiene su terminal amino en el aminoácido 112 de la SEC. ID. nº: 2 y su terminal carboxi en el aminoácido en el intervalo de aminoácidos comprendido entre 578 y 607 de la SEC. ID. nº: 2.

30. Kit según la reivindicación 27, en el que la proteína está constituida por los aminoácidos 112 a 607 de la SEC. ID. nº: 2.

31. Kit según la reivindicación 28, en el que la proteína está constituida por los aminoácidos 112 a 578 de la SEC. ID. nº: 2.