ES2223054T3

ES2223054T3 - Antigenos del virus de la hepatitis e y sus utilizaciones.

Info

Publication number: ES2223054T3
Application number: ES95940546T
Authority: ES
Inventors: Thomas R. Fuerst; C. Patrick Mcatee; Patrice O. Yarbough; Yi-Fan Zhang
Original assignee: Genelabs Technologies Inc
Current assignee: Genelabs Technologies Inc
Priority date: 1994-10-24
Filing date: 1995-10-23
Publication date: 2005-02-16
Anticipated expiration: 2015-10-23
Also published as: AU4195696A; WO1996012807A2; DE69533067T2; ATE267256T1; US20020107360A1; WO1996012807A3; JP4237747B2; JP2006141400A; EP0787190B1; DE69533067D1; US6214970B1; JPH10509588A; EP0787190A2

Abstract

SE DISPONEN ANTIGENOS QUE ESTAN DERIVADOS DEL AGENTE DE HEPATITIS VIRICA NO-A/NO-B TRANSMITIDA ENTERICAMENTE, CONOCIDO COMO VIRUS DE HEPATITIS E (HEV). LOS ANTIGENOS HEV Y EN PARTICULAR, ESPECIES SOLUBLES DE LA PROTEINA CAPSIDA CODIFICADA POR LA REGION TERMINAL DE CARBOXI DE HEV ORF2, SON INMUNOREACTIVAS CON SUERO DE INDIVIDUOS INFECTADOS CON HEV. EN UNA REALIZACION, ESTOS ANTIGENOS PUEDEN SER PRODUCIDOS POR UN VECTOR DE EXPRESION DE BACULOVIRUS Y FORMAN PARTICULAS TIPO VIRUS (VLPS). LOS ANTIGENOS SON UTILES COMO REACTIVOS DE DIAGNOSTICO EN METODOS DE DIAGNOSTICO Y KITS PARA DETERMINAR LA INFECCION DE UN INDIVIDUO CON HEV. LOS ANTIGENOS SON TAMBIEN UTILES EN COMPOSICIONES DE VACUNA EFECTIVAS EN METODOS PARA PREVENIR LA INFECCION POR HEV.

Description

Antígenos del virus de la hepatitis E y sus utilizaciones.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a antígenos derivados del agente viral de la hepatitis no-A/no-B transmitido entéricamente, también denominado en ésta como Virus de la Hepatitis E (HEV), y a procedimientos de diagnóstico, composiciones de vacunas y procedimientos de vacunación, que emplean tales antígenos.

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Antecedentes de la invención

El agente viral de la hepatitis no-A/no-B transmitido entéricamente (ET-NANB; también denominado en ésta como HEV) es la causa descrita de la hepatitis en varios casos epidémicos y esporádicos en Asia, África, Europa, México, y en el subcontinente indio. La infección ocurre usualmente mediante agua contaminada con heces, aunque hay cierta evidencia de la transmisión de persona a persona. El virus no parece causar una infección crónica. La etiología viral de la ET-NANB se ha demostrado mediante la infección de voluntarios con aislados fecales juntados; los estudios de microscopía electrónica inmune (IEM) ha mostrado partículas de virus con 27-34 nm de diámetro en deposiciones procedentes de individuos infectados. Las partículas de virus reaccionaron con anticuerpos en el suero de individuos infectados procedentes de regiones geográficamente distintas, sugiriendo que un único agente o clase viral es responsable de la mayoría de la hepatitis ET-NANB observada en todo el mundo. No se observó reacción con anticuerpo ninguna en suero de individuos infectados con virus NANB transmitido parenteralmente (también conocido como virus de la hepatitis C o HCV), indicando una especificidad diferente entre los dos tipos de NANB.

Además de las diferencias serológicas, los dos tipos de infección NANB muestran diferencias clínicas características. La ET-NANB se caracteriza por una infección aguda, a menudo asociada con fiebre y artralgia, y con inflamación portal, y con estasis biliar asociada en especímenes de biopsias de hígado (Arankalle, 1988). Los síntomas se resuelven habitualmente en seis semanas. Por contra, la NANB transmitida parenteralmente produce una infección crónica en aproximadamente el 50% de los casos. Raramente se observan fiebre y artralgia, y la inflamación tiene una distribución predominantemente parenquimatosa (Khuroo, 1980). El curso de la ET-NANBH generalmente carece de sucesos en individuos sanos, y una amplia mayoría de los infectados se recuperan sin las secuelas crónicas observadas en la HCV. Ocasionalmente, el curso de la enfermedad puede ser grave, no obstante, tal como se observó recientemente en un voluntario humano (Chauhan, 1993). Sin embargo, una característica epidemiológica peculiar de esta enfermedad es la mortalidad marcadamente elevada observada en mujeres embarazadas; ésta se menciona en numerosos estudios que es del orden del 10-20% (Khuroo, 1981; Reyes, 1993). Este hallazgo se ha observado en un cierto número de estudios epidemiológicos, pero permanece sin explicación hasta la fecha. Queda por aclarar, si esto refleja la patogenicidad viral, la consecuencia letal de la interacción del virus y el huésped inmunodeprimido (embarazada), o si es un reflejo de la salud prenatal debilitada de un población mal nutrida susceptible.

Los dos agentes virales también pueden distinguirse en base a la susceptibilidad del huésped primate. La ET-NANB, pero no el agente transmitido parenteralmente, puede transmitirse a monos cinomolgus. El agente transmitido parenteralmente se transmite más fácilmente a chimpancés que la ET-NANB (Bradley, 1987).

Resumen de la invención

La presente invención incluye una composición de polipéptidos del virus de la Hepatitis E (HEV), consistente en al menos un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierto (ORF) 2 del HEV, polipéptido que tiene al menos un aminoácido suprimido del extremo terminal de los 549 aminoácidos. En una realización, al menos un polipéptido de la composición contiene una supresión carboxi terminal de hasta aproximadamente 24 aminoácidos carboxi terminales de dicho polipéptido del ORF2 del HEV de 549 aminoácidos. Los polipéptidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25, SEC. Nº ID.: 26, SEC. Nº ID.: 27, SEC. Nº ID.: 28, y secuencias homólogas a aquéllas presentadas en ésta.

En una realización, la composición de la presente invención comprende al menos dos de tales polipéptidos, por ejemplo, los polipéptidos que tienen las secuencias presentadas como SEC. Nº ID.: 25 y SEC. Nº ID.: 27, o SEC. Nº ID.: 26 y SEC. Nº ID.: 28 (incluyendo también secuencias homólogas).

En otra realización, la invención incluye un vector de expresión para producir una composición de antígeno del polipéptido del virus de la Hepatitis E. Un vector tal contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierto 2 del HEV, polipéptido que tiene al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos, en donde la secuencia de ácido nucleico se (i) inserta en un vector de expresión, y (ii) se une operativamente a un promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula hospedadora seleccionada. El vector de expresión podría incluirse en un sistema de expresión en donde el vector de expresión está incluido en una célula hospedadora apropiada, en donde la célula hospedadora permite la expresión de los polipéptidos de la presente invención. En una realización, el sistema de expresión incluye un vector de expresión de baculovirus, en donde la célula hospedadora es una célula de insecto. Hay numerosos vectores y sistemas de expresión útiles conocidos por los especialistas en la técnica y se describen
en ésta.

En una realización ulterior, la presente invención incluye un procedimiento para producir una composición de polipéptido del virus de la Hepatitis E (HEV) mediante el cultivo de una célula de insecto que contiene un vector de expresión, tal como se ha descrito más arriba, en condiciones suficientes para expresar un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura 2 del HEV, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos. Tal composición podría contener al menos un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25, SEC. Nº ID.: 26, SEC. Nº ID.: 27, SEC. Nº ID.: 28, y secuencias homólogas de las mismas.

La presente invención también incluye otro procedimiento para producir una composición de polipéptido ("antígeno 62K") del virus de la Hepatitis E (HEV). En este procedimiento, una célula que contiene uno de los vectores de expresión descritos más arriba se cultiva en condiciones suficientes para expresar un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta 2 del HEV, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos.

La invención incluye además un procedimiento para detectar la infección por el virus de la Hepatitis E en un individuo. En este procedimiento, una composición de polipéptido del virus de la Hepatitis E (HEV), consistente en al menos un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta (ORF) 2 del HEV, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos, se hace reaccionar con una muestra de suero obtenida del individuo. Los polipéptidos del HEV se examinan a continuación en busca de la presencia de anticuerpo unido. En este procedimiento, los polipéptidos de la composición de polipéptido del HEV están unidos a un soporte sólido, dicha reacción incluye poner en contacto tal suero con el soporte, y dicho examen incluye hacer reaccionar el soporte y el anticuerpo unido con un anticuerpo anti-humano marcado de revelado. La invención incluye también un equipo para verificar la presencia de anticuerpos contra el HEV en una muestra de suero obtenida de un individuo. Típicamente, el equipo incluye un soporte sólido con antígenos unidos a la superficie, en donde los antígenos unidos a la superficie son polipéptidos de la composición del polipéptido ("antígeno 62K") del HEV descrita en ésta.

Además, la invención incluye composiciones de vacunas que emplean los antígenos del polipéptido de HEV de la presente invención. Una composición de vacuna usada para inmunizar individuos contra el virus de la Hepatitis E (HEV) contiene al menos un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta (ORF) 2 del HEV, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos. Los polipéptidos de la presente invención pueden formularse en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, al menos un polipéptidos de la composición de la vacuna contiene una supresión carboxi terminal de hasta aproximadamente 24 aminoácidos carboxi terminales de dicho polipéptidos de 549 aminoácidos del ORF2 del HEV. Los polipéptidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25, SEC. Nº ID.: 26, SEC. Nº ID.: 27, SEC. Nº ID.: 28, y secuencias homólogas de aquéllas presentadas en ésta. La invención también incluye un procedimiento para inhibir la infección de un individuo por parte del HEV. En este procedimiento, se administra una composición de vacuna de la presente invención a un sujeto usando un cantidad terapéuticamente efectiva.

La invención también incluye equipos que contienen los polipéptidos de la composición de polipéptido del HEV de la presente invención para su uso en la práctica de los procedimientos antes descritos.

En una realización ulterior, la presente invención incluye una composición del polipéptido del virus de la Hepatitis E (HEV), consistente en al menos un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta (ORF) 2 del HEV, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos, en donde el(los) polipéptido(s) de dicha composición son capaces de formar partículas parecidas a virus (VLP).

Estas y otras características de la invención se entenderán de forma más completa cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención de forma conjunta con las figuras que la acompañan.

Breve descripción de las figuras

Figura 1, presenta un diagrama esquemático de la organización genómica del HEV, mostrando el genoma del HEV, la disposición de los marcos de lectura abierta en el genoma, y las regiones codificantes aproximadas para los antígenos 406.3-2, 406.4-2, SG3 y 62K del HEV;

Figuras 2A a 2E, presentan las secuencias de nucleótidos del ORF2 y ORF3, mostrando las secuencias de nucleótidos del ORF2 y ORF3 del HEV para las cepas Burma (línea superior) y México (línea inferior) del HEV;

Figura 3, presenta la secuencia de aminoácidos del ORF3, mostrando las secuencias de aminoácidos de la proteína del ORF3 para las cepas Burma (línea superior) y México (línea inferior) del HEV;

Figuras 4A y 4B, presenta la secuencia de aminoácidos del ORF2, mostrando las secuencia de aminoácidos de la proteína del ORF2 para las cepas Burma (línea superior) y México (línea inferior) del HEV, así como los extremos amino terminales de cada uno de los antígenos 62K, C-2, SG3, 406.3-2:

Figura 5, presenta un diagrama esquemático de la construcción de un plásmido para la expresión del antígeno manipulado r62K en baculovirus, mostrando un diagrama de flujo de la construcción del pBBIII-62K. Las barras representan los fragmentos de ADN que codifican el r62K.

Figuras 6A y 6B, presentan datos concernientes a la generación de la proteína ORF3 de 73K de longitud completa en cultivo en suspensión de Sf9, y el corte desde 73K para formar las especie de 62K en células monocapa de Sf9. La Figura 6A muestra las proteínas soluble (S) e insoluble (I) en PBS procedentes del lisado de las células del cultivo en suspensión de Sf9 con baculovirus recombinante ORF2-rAc-MNPV a diferentes días posteriores a la infección (DPI) que se analizaron mediante SDS-PAGE. La flecha apunta a la proteína ORF-2 recombinante producida. La Figura 6B es esencialmente la misma que la Figura 6A, excepto que se realizó una inmunotransferencia en vez de la tinción con azul de Coomassie. Las flechas apuntan respectivamente a la migración de las proteínas de 73K y 62K.

Figura 7, "Corte proteolítico de la proteína ORF2 del HEV in vitro", muestra el corte in vitro de la proteína ORF2 de longitud completa de 73K insoluble (I) hasta la proteína soluble (S) de 62K en diferentes intervalos de tiempo. Se indica la presencia (+) o ausencia (-) de inhibidores de proteinasas.

Figura 8, "Conversión 73K-62K mediante células de cultivo en suspensión de Sf9", es una comparación del corte de 73K a 62K entre los extractos soluble del células en cultivo en suspensión infectadas por el baculovirus del tipo salvaje (panel superior), o de las no infectadas (panel inferior). Se invirtió la carga de las muestras en los dos carriles de más a la derecha del panel inferior.

Figura 9, "Gel de proceso de la ORF2 de 73K", muestra varias fracciones tomadas durante el proceso de purificación de la 73K, y corridas en un 4-20% SDS-PAGE, y la correspondiente transferencia Western. Carril 1, carga Hyper-D-S; carril 2, fracciones juntadas pH 8,5; carril 3, flujo a través pH 7,5; carril 4, flujo a través pH 8,5; carril 5, estándares de P.M. de BioRad; carril 6, carga Hyper-D-S; carril 2, fracciones juntadas pH 8,5; carril 3, flujo a través pH 7,5; carril 4, flujo a través pH 8,5; carril 5, estándares de P.M. de Promega. Estándares de P.M. (Promega, de rango medio) como sigue (de arriba a abajo): fosforilasa B, 97 kDa; BSA, 66 kDa; deshidrogenasa del glutámico, 55 kDa; ovoalbúmina, 43 kDa; aldolasa, 40 kDa; anhidrasa carbónica, 31 kDa; inhibidor de soja de la tripsina, 21 kDa; lisozima, 14 kDa. Carriles 1-5, condiciones no reductoras; carriles 6-10, reducidas con beta-mercaptoetanol en el tampón de preparación de muestras.

Figura 10, "62K purificada final", muestra la proteína c62K soluble purificada corrida en un 4-20% SDS-PAGE. Carril 1, estándares de P.M. pre-teñidos "SeeBlue™" de Novex; carril 2, proteína c62K purificada final. Los estándares de P.M. oscilan como sigue (de arriba a abajo): miosina, 250 kDa; BSA 98 kDa; deshidrogenasa del glutámico, 64 kDa; deshidrogenasa del alcohol, 50 kDa; anhidrasa carbónica, 36 kDa; mioglobina, 30 kDa; lisozima, 16 kDa; aprotinina, 6 kDa; cadena B de la insulina, 4 kDa. El proceso de purificación para la c62K se describe en detalle en el Ejemplo 6B.

Figuras 11A y 11B, muestran una comparación entre micrografías electrónicas respectivamente de las proteínas c62K y 73K de ORF2 recombinantes purificadas. La Figura 11A tiene una ampliación de \times 95.000, y la Figura 11B de \times 200.000. La Figura 11B muestra la formación de partículas similares a virus por parte de la proteína 73K.

Figura 12, "Expresión de la ORF2-62K en baculovirus", muestra la expresión de múltiples aislados de BBIII-62K en células en cultivo en suspensión.

Figura 13, "Cromatografía con S-1000", muestra la determinación del tamaño de partícula viral de r62K manipulada y c62K cortada mediante cromatografía de exclusión por tamaño con Sephacryl S-1000. Los estándares de tamaño de partícula viral (virus de la viruela vacuna y antígeno de superficie de la Hepatitis B, HBsAg), albúmina de suero bovino (BSA), y las preparaciones purificadas de c62K y r62K se cromatografiaron en una columna AP-2 2 \times 60 cm de Waters, empaquetada con resina Sephacryl S-1000 Superfine, a una velocidad lineal superficial de 120 cm/h. Se indican los tiempos de retención (minutos) y la absorbancia relativa (280 nm) para las muestras individuales.

Figuras 14A y 14B, presentan los resultados de un análisis del proceso de purificación de la r62K usando la electroforesis en gel de 4-20% SDS-poliacrilamida (14B) y una transferencia Western correspondiente (14B).

Figura 15, presenta resultados que demuestran la presencia de anticuerpos neutralizantes en monos cino vacunados con antígeno r62K de HEV.

Figura 16, muestra un comparación de homología para le antígeno 406.4-2 entre las cepas Burma (B) y México (M).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Los términos definidos más abajo tienen en ésta los siguientes significados:

A.: "Agente viral de la Hepatitis no-A/no-B transmitida entéricamente", "virus de la Hepatitis E", o "HEV", indica un virus, tipo de virus, o clase de virus, la cual (i) causa una hepatitis infecciosa transmitida por agua, (ii) es transmisible en monos cinomolgus, (iii) es serológicamente distinto del virus de la Hepatitis A (HAV), del virus de la Hepatitis B (HBV), del virus de la Hepatitis C (HCV), del virus de la Hepatitis D (HDV), y (iv) incluye una región genómica que es homóloga al inserto de cADN de 1,33 kb en el plásmido pTZKF1(ET1.1) portado en la cepa BB4 de E. Coli identificada con el número de depósito 67.717 de la ATCC.

B.: "Variantes del HEV", se definen como aislados virales que tiene al menos aproximadamente el 40%, preferiblemente el 50%, o más preferiblemente el 70% de homología de secuencia global, esto es, identidad de secuencia a los largo de una longitud de la secuencia polinucleotídica del genoma viral (por ejemplo, ORF2) a las secuencias polinucleotídicas del HEV conocidas descritas en ésta (por ejemplo, SEC. Nº ID.: 1 o SEC. Nº ID.: 2).

: La "homología de secuencia" se determina esencialmente como sigue. Se considera que dos secuencias polinucleotídicas de la misma longitud (preferiblemente, el genoma viral entero) son homólogas entre ellas si, cuando se alinean usando del programa ALIGN, más del 40%, preferiblemente el 50%, y más preferiblemente el 70% de los ácidos nucleicos, en el alineamiento con la mayor puntuación, están alineados idénticamente usando un ktup de 1, los parámetros por defecto y la matriz PAM por defecto.

: El programa ALIGN se halla en la versión 1.7 de FASTA, un conjunto de programas para la comparación de secuencias (Pearson, et al., 1988; Pearson, 1990; programa disponible de William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA).

: Para determinar si dos virus son "altamente homólogos" entre ellos, la secuencia completa de todas las proteínas virales de un virus se alinean globalmente, óptimamente, con las proteínas o poliproteínas del otro virus usando el programa ALIGN del conjunto anterior, usando un ktup de 1, los parámetros por defecto, y la matriz PAM por defecto. Las regiones de disimilitud o de similitud no se excluyen del análisis. Las diferencias en longitud entre las dos secuencias se consideran como emparejamientos erróneos. Alternativamente, se usan típicamente regiones de proteína estructural viral para determinar el parentesco entre los aislados virales. Los virus altamente homólogos tienen más del 40%, o preferiblemente el 50%, o más preferiblemente el 70% de identidad de secuencia polipeptídica global.

C.: Se considera que dos fragmentos de ácido nucleico pueden "hibridarse selectivamente" con un polinucleótido del HEV, si son capaces de (1) hibridarse específicamente al HEV o a una variante del mismo, o (2) cebar específicamente una reacción en cadena de la polimerasa: (i) en condiciones de hibridación y lavado típicas, tal como se describen, por ejemplo, en Maniatis, et al., páginas 320-328 y 382-389, (ii) usando condiciones de lavado con baja rigurosidad que permites como mucho aproximadamente un 25-30% de emparejamientos incorrectos entre bases, por ejemplo: 2 \times SSC, 0,1% de SDS, dos veces a temperatura ambiente, de 30 minutos cada una; a continuación 2 \times SSC, 0,1% de SDS, 37ºC, una vez, 30 minutos; a continuación 2 \times SSC, dos veces a temperatura ambiente, de 10 minutos cada una; o (ii) seleccionando cebadores para su uso en reacciones en cadena de la polimerasa típicas (PCR) en condiciones estándares (por ejemplo, en Saiki, R.K. et al.; Mullis; Mullis et al.), las cuales resultan en la amplificación específica de secuencias del HEV o sus variantes.

: Los grados de homología (identidad de secuencia) discutidos más arriba pueden seleccionarse mediante hibridación usando condiciones de lavado con la rigurosidad apropiada para la identificación de clones procedentes de bibliotecas de genes (u otras fuentes de material genético), tal como es bien conocido en la técnica.

D.: Un "polipéptido del HEV" se define en ésta como cualquier polipéptido homólogo de un polipéptido del HEV. "Homología," tal como se usa en ésta, se define como sigue. En una realización, un polipéptido es homólogo de un polipéptido del HEV si está codificado por un ácido nucleico que selectivamente se hibrida con secuencias del HEV o sus variantes.

: En otra realización, un polipéptido es homólogo a un polipéptido del HEV si está codificado por el HEV o sus variantes, tal como se definieron más arriba, los polipéptidos de este grupo son típicamente mayores de 15, preferiblemente 25, o más preferiblemente 35, aminoácidos contiguos. Más aún, para polipéptidos más largos de aproximadamente 60 aminoácidos, las comparaciones de secuencias, para el propósito de determinar la "homología del polipéptido", se realizan usando el programa de alineamiento local LALIGN. La secuencia del polipéptido se compara respecto a la secuencia de aminoácidos del HEV o cualquiera de sus variantes, tal como se definieron más arriba, usando el programa LALIGN con un kupt de 1, los parámetros por defecto, y la PAM por defecto.

: Cualquier polipéptido con un alineamiento óptimo, más largo de 60 aminoácidos, y con más del 40%, preferiblemente el 50%, o más preferiblemente el 70% de aminoácidos alineados idénticamente, se considera que es un "polipéptido homólogo". El programa LALIGN se halla en conjunto de programas de comparación de secuencias FASTA versión 1,7 (Pearson, et al., 1988; Pearson, 1990; programa disponible de William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA).

E.: Un polinucleótido se "deriva del" HEV si tiene la misma, o sustancialmente la misma, secuencia de pares de bases que una región de un genoma del HEV, cADN del HEV, o complementos de los mismos, o si presenta homología tal como se ha mencionado más arriba bajo "B" o "C".

: Un polipéptido o "fragmento" de polipéptido se "deriva del" HEV si (i) está codificado por un marco de lectura abierto de un polinucleótido del HEV, o (ii) presenta homología con polipéptidos del HEV tal como se ha mencionado más arriba bajo "B" o "C", o (iii) es específicamente inmunoreactivo con suero positivo para el HEV.

F.: En el contexto de la presente invención, la frase "secuencias de ácido nucleico", cuando se refiere a secuencias que codifican una proteína, polipéptido, o péptido, se pretende que incluye secuencias de ácido nucleico degenerativas que codifican secuencias homólogas de una proteína, polipéptido, o péptido, así como la secuencia descubierta.

G.: Un "epítopo" es el determinante antigénico definido como la porción específica de un antígeno con el cual interacciona la porción de unión de un anticuerpo específico. Los términos "región inmunogénica" o "epítopo" se usan de forma intercambiable.

H.: Un antígeno o epítopo es "específicamente inmunoreactivo" con sueros positivos para el HEV cuando el epítopo/antígeno se une a anticuerpos presentes en los sueros infectados por el HEV, pero no se une a anticuerpos presentes en la mayoría (más de aproximadamente el 90%, preferiblemente más del 95%) de los sueros procedentes de individuos que no están infectados o no han sido infectados por el HEV. Los antígenos o epítopos "específicamente inmunoreactivos" también podrían ser inmunoreactivos con anticuerpos monoclonales o policlonales generados contra epítopos o antígenos específicos del HEV.

: Un anticuerpo o composición de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos policlonales) es "específicamente inmunoreactivo" con el HEV cuando el anticuerpo o composición de anticuerpo es inmunoreactiva con un antígeno del HEV pero no con antígenos de virus de la hepatitis no relacionados (por ejemplo, el HAV, HBV, HCV o HDV). Además, los "anticuerpos específicamente inmunoreactivos" no son inmunoreactivos con antígenos típicamente presentes en sueros normales.

I.: En dos o más secuencias de péptidos conocidas, las cuales son más de aproximadamente el 70% homólogas en la secuencia de aminoácidos, una tercera secuencia de aminoácidos será "internamente consistente con las secuencias conocidas" si cada aminoácido en la tercera secuencia es idéntico a al menos uno de los aminoácidos en las secuencias conocidas.

J.: El "epítopo formado por" una determinada secuencia de aminoácidos es el epítopo producido por la estructura secundaria/terciaria de esa secuencia en solución acuosa.

K.: El "sitio de unión a antígeno" es aquella región de una molécula de anticuerpo, contenida dentro de las regiones variables del anticuerpo, que participa directamente en la unión al antígeno.

L.: Un "antígeno de péptido especificado que contiene el epítopo formado por" una secuencia de aminoácidos especificada incluye la propia secuencia especificada o una porción de la misma, la cual es suficiente para definir el epítopo presente en la secuencia especificada, tal como se evidencia mediante inmunoreactividad con un anticuerpo contenido en una muestra de suero humano. El antígeno de péptido especificado podría incluir sustituciones de aminoácidos que preserven el epítopo.

M.: "Sustancialmente aislado" y "purificado" se usa en varios contextos, y típicamente se refiere a al menos la purificación parcial de una partícula, componente (por ejemplo, polinucleótido o polipéptido), o compuesto relacionado (por ejemplo, anticuerpos anti-HEV) del virus HEV, respecto componentes no relacionados o contaminantes (por ejemplo, células del suero, proteínas, polinucleótidos que no son del HEV, y anticuerpos que no son anti-HEV). Los métodos y procedimientos para el aislamiento y purificación de compuestos o componentes de interés se describen más abajo (por ejemplo, la purificación de proteínas y la producción recombinante de polipéptidos del HEV).

N.: "Antígeno 62K" es la denominación genérica de una proteína o mezcla de proteínas, en donde la proteína o proteínas se derivan de los 549 aminoácidos carboxi terminales codificados por el ORF2 del HEV (por ejemplo, SEC. Nº ID.: 15 o SEC. Nº ID.: 16, o secuencias homólogas de las mismas); proteínas derivadas que podrían tener un extremo amino terminal comparable al de la proteína de 549 aminoácidos, y hasta una supresión de aproximadamente 24 aminoácidos del extremo carboxi terminal (por ejemplo, SEC. Nº ID.: 25, SEC. Nº ID.: 26, SEC. Nº ID.: 27, y SEC. Nº ID.: 28)

Podrían determinarse proteínas similares a partir de la secuencia de aminoácidos carboxi terminal de otras variantes mediante alineamiento de las variantes con, por ejemplo, las variantes Burma o México (Solicitud Internacional PCT US91/02.368, con fecha de registro del 5 de Abril de 1991, WO91/15.603; Solicitud Internacional PCT US89/02.648, registrada el 16 de Junio de 1989, WO89/12.462).

Los polipéptidos del "antígeno 62K" ilustrativos incluyen los siguientes polipéptidos derivados de las variantes Burma y México del HEV: SEC. Nº ID.: 15 / SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25 / SEC. Nº ID.: 26, y SEC. Nº ID.: 27 / SEC. Nº ID.: 28, o una secuencia homóloga de las mismas. Además, el "antígeno 62K" incluye mezclas de tales polipéptidos, por ejemplo, una preparación que contenga los polipéptidos cuyas secuencias se proporcionan como SEC. Nº ID.: 25 y SEC. Nº ID.: 27.

Incluidas en el significado del "antígeno 62K" se hallan las proteínas que tienen más de 564 aminoácidos, a condición de que contengan las secuencias carboxi terminales, recientemente especificadas, codificadas por el ORF2 del HEV. Por ejemplo, una antígeno 62K rediseñado "r62K" podría tener opcionalmente una metionina N-terminal; es decir, una secuencia de 550 aminoácidos. Alternativa, el antígeno 62K podría generarse como una proteína de fusión que contendría, por ejemplo, la secuencia carboxi terminal de 549 aminoácidos del ORF2 del HEV, además de secuencias codificando la \beta-galactosidasa.

II. Antígenos del HEV

Esta sección describe procedimientos para preparar antígenos del HEV útiles como reactivos de diagnóstico y en composiciones de vacunación acordes con la invención.

A. Secuencias genómicas del HEV

Los clones genómicos del HEV, y las secuencias correspondientes a la totalidad del genoma del HEV, para diferentes cepas del HEV, se obtuvieron de acuerdo con procedimientos publicados (Huang, 1992; Yarbough, 1991), y tal como se describe en la Solicitud Internacional PCT US91/02.368 (fecha de registro del 5 de Abril de 1991, WO 91/15.603) y Solicitud Internacional PCT US89/02.648 (registrada el 16 de Junio de 1989, WO 89/12.462). En resumen, se clonó el ARN aislado a partir de la bilis de un mono cinomolgus que tenía una infección del HEV conocida, como fragmentos de cADN, para formar un biblioteca del fragmento, y la biblioteca se examinó en busca de hibridación diferencial con cADN marcados radiactivamente procedentes de fuentes de bilis infectadas y no infectadas.

La secuencia de pares de bases de las regiones clonadas de los fragmentos del HEV en clones identificados se determinó mediante procedimientos de secuenciación estándares. En relación a la Figura 1, el HEV es un virus con un genoma de ARN poliadenilado, de aproximadamente 7,5 kilobases (kb), de hebra única, y con polaridad de sentido positivo. Se han asignado tres marcos de lectura abierta (ORF) al HEV, como el ORF1, que codifica los polipéptidos con dominios de la polimerasa de ARN dirigida por ARN y una helicasa, el ORF2, que codifica la proteína putativa de la cápside del virus, y el ORF3, una segunda proteína estructural putativa.

La organización genómica del HEV asigna su(s) gen(es) no estructural(es) al extremo 5' con el(los) gen(es) estructural(es) en el extremo 30. Se han detectado dos transcritos poliadenilados subgenómicos de aproximadamente 2,0 kb y 3,7 kb de tamaño en el hígado infectado, y están co-terminados en sus extremos 3' con el transcrito genómico de longitud completa de 7,5 kb. La organización genómica y la estrategia de expresión del HEV sugieren que pudiera se el prototipo patógeno humano para una nueva clase de virus de ARN, o, tal vez, un género separado dentro de la familia Caliciviridae.

Las secuencias genómicas y peptídicas mostradas en la Figura 2 corresponden a las regiones ORF-2 y ORF-3 de las cepas Burma (B) (líneas superiores) y México (M) (líneas inferiores) del HEV. Las bases indicadas en las líneas medias representan los nucleótidos conservados. El sistema de numeración usado en la comparación se basa en la secuencia de Burma. La región correspondiente al ORF2 tiene respectivamente la SEC. Nº ID.: 1 y SEC. Nº ID.: 2 para las cepas Burma y México. La región correspondiente al antígeno 62K tiene respectivamente la SEC. Nº ID.: 3 y SEC. Nº ID.: 4 para las cepas Burma y México. La región correspondiente al SG3 tiene respectivamente la SEC. Nº ID.: 5 y SEC. Nº ID.: 6 para las cepas Burma y México. La región correspondiente al 406.3-2 tiene respectivamente la SEC. Nº ID.: 7 y SEC. Nº ID.: 8 para las cepas Burma y México. La región correspondiente al ORF3 tiene respectivamente la SEC. Nº ID.: 9 y SEC. Nº ID.: 10 para las cepas Burma y México. La región correspondiente al 406.4-2 tiene respectivamente la SEC. Nº ID.: 11 y SEC. Nº ID.: 12 para las cepas Burma y México.

B. Secuencias de antígenos del HEV

Las secuencias de aminoácidos correspondientes al segundo y tercer marcos de lectura abierta de las cepas Burma y México se proporcionan respectivamente en las Figuras 3 y 4. Los listados de las secuencias son como sigue:

: SEC. Nº ID.: 13 y SEC. Nº ID.: 14, corresponden a las secuencias de aminoácidos de las proteínas de cápside enteras putativas codificadas respectivamente por los ORF2 de las cepas Burma y México.

: SEC. Nº ID.: 15 y SEC. Nº ID.: 16, corresponden a las secuencias de aminoácidos de los antígenos 62K procedentes respectivamente de los ORF2 de las cepas Burma y México.

: SEC. Nº ID.: 17 y SEC. Nº ID.: 18, corresponden a las secuencias de aminoácidos de los péptidos SG3 (B) y SG3 (M) respectivamente. Cada péptido incluye los 327 aminoácidos carboxílicos de la cápside del HEV.

: SEC. Nº ID.: 19 y SEC. Nº ID.: 20, corresponden a las secuencias de aminoácidos de la proteína de cápside entera putativa codificada respectivamente por el ORF2 de las cepas Burma y México.

: SEC. Nº ID.: 21 y SEC. Nº ID.: 22, corresponden a las secuencias de aminoácidos de la proteína entera codificada respectivamente por los ORF3 de las cepas Burma y México.

: SEC. Nº ID.: 23 y SEC. Nº ID.: 24, corresponden a las secuencias de aminoácidos de los péptidos 406.3-2 (B) y 406.3-2 (M) respectivamente. Cada péptido es un péptido de 42 aminoácidos en la región C-terminal de la proteína de la cápside codificada por el ORF2, tal como se indica en la secuencia del ORF2. (Figura 4).

También se contemplan secuencias, que son internamente consistentes con las secuencias especificadas más arriba, procedentes de diferentes cepas de antígenos del HEV. Estas incluyen, la SEC. Nº ID.: 13; SEC. Nº ID.: 14; y variaciones internamente consistentes entre la SEC. Nº ID.: 13 y la SEC. Nº ID.: 14; la SEC. Nº ID.: 15; SEC. Nº ID.: 16; y variaciones internamente consistentes entre la SEC. Nº ID.: 15 y la SEC. Nº ID.: 16; la SEC. Nº ID.: 17; SEC. Nº ID.: 18; y variaciones internamente consistentes entre la SEC. Nº ID.: 17 y la SEC. Nº ID.: 18; la SEC. Nº ID.: 19; SEC. Nº ID.: 20; y variaciones internamente consistentes entre la SEC. Nº ID.: 19 y la SEC. Nº ID.: 20; la SEC. Nº ID.: 21; SEC. Nº ID.: 22; y variaciones internamente consistentes entre la SEC. Nº ID.: 21 y la SEC. Nº ID.: 22; la SEC. Nº ID.: 23; SEC. Nº ID.: 24; y variaciones internamente consistentes entre la SEC. Nº ID.: 23 y la SEC. Nº ID.: 24.

Por ejemplo, los antígenos 406.4-2 del HEV tienen la homología de secuencia mostrada en la Figura 16 para las cepas Burma (B) y México (M). Los puntos solos en la comparación de secuencias indican una probabilidad elevada reconocida de sustituciones de aminoácidos "neutras". Los espacios en blanco indican una sustitución no neutra.

Una secuencia que fuera internamente consistente con estas dos secuencias tendría una de las secuencias presentadas en la SEC. Nº ID.: 31.

Las secuencias de aminoácidos del ORF3, de 124 aminoácidos de longitud, de las cepas Burma y México tienen un 87,1% de identidad en los 124 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos del ORF2, que tienen un solapamiento de 659 aminoácidos, tienen un 93,0% de identidad en los 659 aminoácidos.

C. Preparación de antígenos del HEV

Para preparar el péptido 406.3-2 (M), se subclonaron fragmentos de ADN procedentes del lambda gt11 406.3-2 descrito en el Ejemplo 1, en el vector de la glutatión S-transferasa pGEX™ para expresar el antígeno 406.3-2 (M), tal como se detalla en el Ejemplo 1 y en la referencia Tam (1991-b).

El antígeno 406.3-2 (B) puede prepararse mediante amplificación por PCR de la SEC. Nº ID.: 5 de Burma de más arriba, mediante amplificación con PCR del plásmido pBET1 (Tam, 1991-b). Este plásmido contiene un inserto de 2,3 kb que abarca del ORF2 y ORF3 para la secuencia de la cepa Burma del HEV. El plásmido se amplifica mediante amplificación con PCR, usando un cebador de 5' que contiene un sitio NcoI y un cebador de 3' que contiene un sitio BamHI (Sakai). El fragmento amplificado se inserta en el sitio NcoI/BamHI de un vector pGEX™, y se expresa en un sistema de expresión E. coli tal como se describe en el Ejemplo 1.

El péptido SG3(B) se preparó amplificando primero la SEC. Nº ID.: 7 con engarces 5' EcoRI-NcoI y 3' BamHI, usando un plásmido del clon pBET1 que contenía las regiones ORF2 y ORF3 del HEV (B) enteras. El fragmento amplificado se insertó en el sitio EcoRI/BamHI de un vector Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación de la propagación del vector y de su recolección, el inserto clonado se liberó mediante digestión con NcoI y BamHI, y se purificó en gel. El fragmento purificado se insertó en el sitio NcoI/BamHI de un vector pGEX™, y se expresó en un sistema de expresión E. coli tal como se describe en el Ejemplo 1. El péptido SG3(M) puede prepararse de forma similar, usando la SEC. Nº ID.: 8 en vez de la SEC. Nº ID.: 7.

La proteína (B) de la cápside se preparó sustancialmente tal como se ha descrito más arriba, mediante amplificación con PCR de la SEC. Nº ID.: 1, a partir de un plásmido pBET1, usando un cebador 5' que contenía un sitio NcoI y un cebador 3' que contenía un sitio BamHI. El fragmento amplificado se insertó en el sitio NcoI/BamHI de un vector pGEX™, y se expresó en un sistema de expresión E. coli tal como se describe en el Ejemplo 1. La proteína (M) de la cápside se prepara similarmente.

Para preparar el péptido 406.4-2(M) se subclonó el lambda gt11 406.4-2 descrito en el Ejemplo 1 en el vector de la glutatión S-transferasa pGEX™ para expresar el antígeno 406.4-2(M), tal como se detalla en el Ejemplo 1.

El antígeno 406.4-2(B) puede prepararse mediante amplificación por PCR de la SEC. Nº ID.: 9 de Burma de más arriba, mediante amplificación con PCR, usando un cebador de 5' que contiene un sitio NcoI y un cebador de 3' que contiene un sitio BamHI. El fragmento amplificado se inserta en el sitio NcoI/BamHI de un vector pGEX™, y se expresa en un sistema de expresión E. coli tal como se describe en el Ejemplo 1.

D. Proteína madura de la cápside

Los antígenos de péptido del HEV también podrían prepararse a partir de virus HEV purificados propagados en hepatocitos primarios obtenidos a partir de hígado de primates, preferiblemente a partir de hígado humano o de monos cinomolgus. Los procedimientos para preparar hepatocitos primarios de primates para su cultivo, y las condiciones de medio de cultivo efectivas para preservar las funciones específicas del hígado durante períodos de cultivo prolongados, se detallan más abajo, en el Ejemplo 2, para hepatocitos humanos.

Después de 3 días de cultivo, las células se infectan con un inoculo mezclado procedente de deposiciones juntas de mono cinomolgus (cuarto tránsito), tal como se detalla en el Ejemplo 3. La presencia y nivel de propagación del virus HEV en las células puede medirse mediante inmunofluorescencia indirecta. Cuando, por ejemplo, las células primarias son células de cinomolgus, las células pueden hacer inmunoreaccionar con antisuero de HEV humano, seguido por inmunoreacción con anticuerpos IgG anti-humanos de ratón.

Alternativamente, los virus HEV pueden detectarse y medirse mediante procedimientos de amplificación selectivos que impliquen la formación inicial de cADN, y la amplificación mediante PCR de secuencias de cADN del HEV, tal como se detalla en el Ejemplo 3. Las partículas de virus pueden aislarse, a partir de hepatocitos humanos infectados con HEV en medio de cultivo, precipitando el virus a través de una banda de sacarosa al 30% mediante ultracentrifugación. El virus precipitado podría purificarse aún más, si se desea, mediante centrifugación zonal a través de un gradiente de sacarosa al 10-40%, combinando fracciones con picos de virus.

Podrían usarse otros procedimientos para separar partículas de virus a partir de componentes del medio de cultivo solubles. Por ejemplo, puede hacerse pasar medio de cultivo clarificado a través de una matriz de exclusión por tamaño, para separar los componentes solubles mediante exclusión por tamaño.

Alternativamente, el medio de cultivo clarificado puede hacerse pasar a través de una membrana de ultrafiltración que tenga un tamaño de poro de 10-20 nm, capaz de las retener partículas de virus, pero que deja pasar los componentes del medio de cultivo que son soluto (sin partículas).

La presente invención permite la glicosilación y otras modificación posteriores a la traducción de la proteína de la cápside del HEV. El aislamiento de la cápside a partir de las partículas de virus puede realizarse mediante procedimientos estándares, tales como intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño, y purificación mediante HPLC, después de la solubilización de las partículas del virus en un medio solubilizante, tal como una solución de un tensioactivo no iónico. La proteína podría purificarse mediante cromatografía de afinidad, empleando, por ejemplo, anticuerpos purificados procedentes de antisuero anti-HEV. Podrían emplearse procesos de degradación para obtener fragmentos parciales y péptidos a partir de la proteína de cápside intacta (así como de proteínas producidas de forma recombinante); por ejemplo, podrían emplearse proteasas. Tales procedimientos son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

E. Producción de antígeno de cápside, antígeno 62k cortado, y antígeno 62k recombinante, en células de insecto

Esta sección describe la producción de un ORF2 de longitud completa (73K), de especies cortadas de 62K del ORF2 (c62K), y de especies rediseñadas de 62K del ORF2 (r62K), producidas en células de insecto.

1. Expresión del ORF2 en células de insecto

Los procedimientos generales, por ejemplo, para manipular y preparar vectores de baculovirus y ADN baculoviral, así como los procedimientos de cultivo de células de insecto, se explican en términos generales en A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures (Summers, M.D. et al., 1988), incorporada en ésta por referencia. El baculovirus recombinante ORF2-Virus de la Poliedrosis Nuclear de Autographica californica (ORF2-rAc-NPV) se construyó tal como se ha descrito previamente, He, J. et al., J. Clin. Microbiology 31:2167 (1993), incorporada en ésta por referencia. El baculovirus recombinante ORF2-rAcMNPB, que expresa la proteína del ORF2 del HEV, se usó para infectar tanto cultivos en suspensión de Spodoptera frugiperda (Sf9) como cultivos de células en monocapa, de acuerdo con los procedimientos detallados en Hee (1993), y descritos más abajo en el Ejemplo 4.

Los lisados de células infectadas preparados después de varios intervalos después de la infección se separaron mediante ultracentrifugación para generar fracciones solubles en solución salina tamponada con fosfato (PBS) e insolubles. Las proteínas de ambas fracciones se analizaron mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida, los cuales, o se tiñeron con solución de azul de Coomassie (Figura 6A), o se transfirieron a papel de nitrocelulosa seguida por un análisis de transferencia Western (Figura 6B), de acuerdo con el Ejemplo 5.

Se observó una proteína viral prominente, de aproximadamente 73 kDa de tamaño, casi exclusivamente en las fracciones insolubles en PBS de las células del cultivo en suspensión procedentes de los días 2-7 después de la infección (Figura 6A). La migración de esta proteína se correlaciona bien con el peso molecular predicho del ORF2 de longitud completa. Una transferencia Western separada confirmó que esta proteína de 73K era reactiva con el antisuero 1L6 específico para el ORF2, el cual reconoce el extremo C-terminal del ORF2. Aunque la degradación de las proteínas del huésped es evidente en las etapas más tardías de la infección (fracciones solubles procedentes de los días 4-7 posteriores a la infección), la proteína ORF2 de 73K parece ser estable a lo largo de la infección.

Cuando el mismo virus recombinante se usó para infectar las células en monocapa de Sf-9, se observó un patrón de expresión diferente (Figura 6B). En vez de observarse especies de proteína 73K insoluble, la proteína de ORF2 se convirtió a una forma soluble que formaba una banda a aproximadamente 62 kDa de tamaño procedente de los días 4-7 posteriores al infección. Estas observaciones sugirieron que la proteína ORF2 (73K) insoluble experimenta un corte proteolítico para generar una proteína 62K cortada o soluble, denominada como "c62K", en las células de la monocapa. También se observaron varias especies más pequeñas que migraban alrededor o por debajo de los 30 kDa en las etapas tardías de la infección. Las especies más pequeñas fueron productos de degradación de la proteína de 73K.

2. Procesamiento proteolítico del ORF2

Se observó que la conversión de la proteína 73K a las especies solubles c62K ocurría progresivamente durante el curso de la infección. Por tanto, esta conversión podría ser el resultado del corte autocatalítico, estimulando la actividad proteasa, durante el curso de la infección o en el momento de la recolección de las células, o una combinación de estos sucesos. Para estudiar esta cuestión, se prepararon lisados de células del día 5 posterior a la infección, seguida por la incubación durante diferentes tiempos antes de desnaturalizar las proteínas de los lisados. La conversión de 73K a c62K se monitorizó respecto el tiempo de incubación, tal como se muestra en la Figura 7.

Cuando los lisados de células se desnaturalizaron inmediatamente después de la lisis celular (0 minutos de tiempo de incubación), la proteína ORF2 estaba presente principalmente como un polipéptido 73K insoluble, y se observó muy poca proteína c62K soluble. Sin embargo, cuando el tiempo de incubación se incrementó entre 30 a 300 minutos, la cantidad de proteína c62K en las fracciones solubles incrementó proporcionalmente. Por contra, la cantidad de proteína 73K en las fracciones insolubles disminuyó, indicando un papel importante jugado por la proteinasa después de la lisis celular. La conclusión de este experimento es que la proteína 73K podría cortarse hasta c62K mediante actividad proteinasa después de la lisis celular.

La proteína c62K observada in vivo en infecciones tardías, tal como se muestra en la Figura 6B, podría explicarse por la prolongada infección viral, en la cual un porcentaje significativo de células no eran viables, causando la liberación de la actividad proteinasa.

3. La conversión del 73k a c62k podría ser específica de la infección con baculovirus

La fuente de la proteinasa responsable del corte de la 73K a c62K podrían ser las células Sf9, las células Sf9 infectadas con baculovirus, o ambas. Para estudiar esta cuestión, se realizó un experimento de mezcla de extractos para distinguir entre estas posibilidades. Se mezcló una preparación de 73K insoluble, procedente de células Sf9 en cultivo en suspensión, con varios extractos solubles, y se monitorizó el corte mediante análisis de inmunotransferencia (Figura 8, panel superior). Los extractos de células no infectadas, tanto de cultivo en suspensión como de monocapas, no tuvieron efecto alguno sobre el corte, sugiriendo que el corte estaba mediado por la infección viral. PBS no mostró efecto alguno, tal como se esperaba. Sólo se observó el corte de la proteína 73K cuando se usó el extracto procedente de un extracto de célula infectada.

El corte concurrente de la 73K y la acumulación de la proteína c62K se demostró además en un segundo experimento, en el cual la preparación de 73K insoluble se mezcló con extracto soluble procedente de células en cultivo en suspensión infectadas con baculovirus del tipo salvaje (Figura 8, panel inferior). Aunque pudo observarse el corte después de 1 hora de incubación, éste no ocurrió durante tanto como 24 horas cuando se sustituyó un extracto de célula no infectada con el extracto de célula infectada (Figura 8, panel inferior).

4. Purificación de las proteínas 73K y c62K

Para determinar si las proteínas del ORF2 expresadas en células infectadas con baculovirus formaban estructuras proteicas complejas, así como para determinar el sitio de corte dentro del ORF2 que resultaba en la formación de la proteína c62K, se prepararon preparaciones de proteína altamente purificadas. En la Figura 9 se muestra un análisis de SDS-PAGE que resume la purificación de la proteína 73K. Los detalles del proceso de purificación se describen en el Ejemplo 6A. La carga de la columna Hyper-D-S se muestra en los carriles 1 y 6, mostrándose en los carriles 2-4 y 7-9 el subsiguiente eluyente y las fracciones de columna eluidas. En los carriles en los que se suprimió el beta-mercaptoetanol del tampón de alteración de las muestras (carriles 2-4) está claro que hay un enlace disulfuro intracadena dentro de la proteína 73K, y que su asociación se elimina fácilmente en condiciones
reductoras.

Las proteínas recombinantes expresadas con niveles elevados tanto en sistemas de expresión procariotas como baculovirus pueden acumularse dentro de la célula en forma de cuerpos de inclusión, tal como se observó con la proteína 73K. En estas condiciones, fue necesario desarrollar un procedimiento para la extracción, solubilización, y plegamiento de nuevo de la proteína. Se usaron estrategias estándares para aislar y lavar los cuerpos de inclusión en un tampón para suprimir los contaminantes celulares, seguidas por la solubilización de los precipitados con SDS al 0,5% como desnaturalizante fuerte. A continuación se suprimió el desnaturalizante mediante dilución rápida y diálisis para permitir que la proteína se plegara de nuevo en su estado nativo. Con objeto de evitar la agregación durante el proceso de plegado de nuevo, se añadió polietilenglicol (PEG) al tampón de dilución como co-solvente, lo que parecía potenciar el plegamiento de nuevo de la proteína 73K en una forma soluble, estable.

El producto final del proceso de purificación de la c62K se muestra en la Figura 10. Los detalles del proceso de purificación se describen en el Ejemplo 6B. En resumen, se centrifugó el lisado de células c62K/Sf9, y el sobrenadante se cargó a continuación sobre una columna DEAE EMD 650(S) de E. Merck, en donde se capturó la 62-kDa y se eluyó con más del 80% de pureza. Las fracciones del pico de DEAE se juntaron y cromatografiaron sobre una columna de Sephacryl S-100. Las fracciones que contenían la c62K procedente de la columna de Sephacryl S-100 se purificaron y concentraron a continuación sobre una columna Poros HQ/F. La banda de proteína observada en el carril 2 de la Figura 10 representa la proteína purificada final procedente de la columna Poros HQ/F.

Con objeto de facilitar la purificación de la proteína c62K, se añadió un agente reductor, por ejemplo, el DTT, al sobrenadante de la lisis, seguido por un intercambio en dos pasos del tampón reductor hasta un entorno inicialmente menos reductor (DTT 50 mM hasta DTT 0,5 mM), hasta un entorno final no reductor. En estas condiciones, se elimina la potencial agregación de la proteína c62K a proteínas celulares contaminantes. A continuación, la proteína c62K se recupera fácilmente en una forma homogénea altamente purificada. En base a la tinción con azul de Coomassie, es estimó que la pureza de las proteínas 73K y c62K era del 95 al 99%.

5. Evidencia de microscopía electrónica de VLPS

Las proteínas recombinantes 73K y c62K se tiñeron negativamente y se examinaron mediante microscopía electrónica directa (Ejemplo 7). Las micrografías electrónicas de la proteína c62K revelaron partículas determinantes (Figura 11A) de aproximadamente 30 nm de tamaño, lo cual coincide con informes publicados que describen partículas de virus auténticas (28-34 nm) halladas en deposiciones y bilis (Bradley, 1988; Reyes, 1993). La proteína 73K plegada de nuevo generó un rango de partículas pleiomórficas de 25-40 nm de tamaño, la mayoría de las cuales presentaban una morfología no determinante (Figura 11B).

6. Secuencia N-terminal de la proteína c62K

La estructura similar a partículas de virus mostrada por la proteína c62K purificada, así como su solubilidad, sugirieron que esta proteína podría presentar una estructura conformacional similar a la del virión nativo; es decir una partícula viral o partícula similar al virus. En consecuencia, fue deseable identificar la secuencia codificante correspondiente a la proteína c62K, permitiendo de ese modo la expresión subsiguiente en cultivo de células en suspensión, que podría permitir la capacidad de prescindir del proceso de corte para la producción de esta proteína. Por este motivo se llevó a cabo el análisis de la secuencia N-terminal de la proteína c62K purificada.

La secuencia de los 10 primeros aminoácidos secuenciados se determinó que era: Ala-Val-Ala-Pro-Ala-His-Asp-Thr-Pro-Pro. Esta secuencia era perfectamente homóloga con los residuos aminoácidos que se iniciaban en la posición 112 del ORF2 (SEC. Nº ID.: 13). Por tanto, el corte ocurría entre la Thr y la Ala que corresponden respectivamente a los aminoácidos 111 y 112.

Por tanto, la proteína c62K podría producirse transfectando células de insectos con un vector de expresión de baculovirus que contuviera una secuencia de ácido nucleico codificando la proteína de la cápside del HEV. Más generalmente, se apreciará que sólo debe es necesario expresar la porción de la secuencia de nucleótidos del ORF2 que codifica el fragmento de la c62K (por ejemplo, secuencias que codifican los aminoácidos 112-660 derivados de la secuencia 73K del ORF2; en las SEC. Nº ID.: 3 y SEC. Nº ID.: 4 se representan ejemplos de tales secuencias) puesto que una proteasa cortará el exceso de aminoácidos N-terminales de la proteína c62K.

Hay otros baculovirus conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, Orygia pesudotsugata es un vector comúnmente usado. Los baculovirus tienen rangos de huéspedes relativamente estrechos, y generalmente están confinados a la replicación en células de insectos lepidópteros. Hay otras líneas celulares de lepidópteros apropiadas, distintas de la Spodoptera frugiperda, conocidas por los especialistas en la técnica, por ejemplo, Lamantria dispar y Helicos zea.

Los especialistas en la técnica también apreciarán que, aunque el sistema de expresión preferible es un sistema de expresión de baculovirus, la secuencia del ORF2 que contiene la región codificante de los 549 aminoácidos C-terminales codificados por el ORF2 del HEV (en relación a la variante de la cepa Burma), con al menos un aminoácido suprimido del extremo C-terminal de los 549 aminoácidos, también podría expresarse en otros sistemas de expresión, y podría cortarse mediante proteinasas inherentes a estos sistemas, o podría cortarse sustancialmente in vitro mediante un extracto de célula infectada con baculovirus. Además, las proteínas de la cápside del HEV podrían obtenerse a partir de HEV propagado in vivo o in vitro en hígado humano o de mono tal como se describió más arriba, y las proteínas de la cápside podrían cortarse con lisado de células de insecto infectadas con baculovirus para también los antígenos de 62K.

Adicionalmente, el sitio de corte contenido en la proteína de la cápside podría usarse como un sitio de corte artificialmente insertado para su uso en productos de proteínas recombinantes, sistemas de expresión, y procesos industriales para preparar dichos productos. Por ejemplo, es beneficioso construir proteínas recombinantes de tal forma que se generen como proteínas de fusión. Un beneficio es que la pareja de fusión podría usarse como medio para purificar la proteína recombinante de interés. Por ejemplo, una pareja de fusión particularmente útil es un fragmento polihistidina que es eficientemente purificado por medio de una cromatografía de afinidad por metal quelado sobre una resina NTA, descrita en la patente estadounidense nº 5.310.663, incorporada en ésta por referencia. Es útil tener un sitio de corte diseñado entre la pareja de fusión y la proteína recombinante, de tal forma que la proteína recombinante pueda ser liberada de la pareja de fusión después de la purificación. Por tanto, el descubrimiento de un nuevo sitio de corte específico de baculovirus proporciona una alternativa a los sitios convencionales actualmente usados para las proteínas recombinantes producidas en sistemas que no son de baculovirus.

El sitio de corte también podría ser ventajoso para sistemas de baculovirus. Por ejemplo, una pareja de fusión útil para dirigir el nuevo polipéptido hacia el citoplasma podría cortarse preferentemente una vez en el citoplasma.

Los límites que definen los aminoácidos que comprenden el sitio de corte podrían determinarse mediante técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Una de tales técnicas emplea el uso de la mutagénesis dirigida a un sitio para alterar aminoácidos individuales que flanqueen el sitio de corte, y el ensayo subsiguiente de la actividad proteinasa sobre los péptidos mutantes.

Además, podría determinarse la identidad de la proteinasa específica de baculovirus, y clonarse y expresarse su secuencia de ácidos nucleicos mediante técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Esto permitirá el uso de la proteinasa específica y un forma purificada en vez de como lisado de células infectadas con baculovirus.

7. Producción recombinante y purificación de un antígeno HEV r62K rediseñado

Permanecía la cuestión de si las especies de proteína 62K rediseñadas, denominadas en ésta como r62K, resultarían en la formación de una proteína estable con propiedades bioquímicas y estructurales similares a las de la forma procesada de la c62K. Por tanto, la secuencia de ADN desde el aminoácido 112 hasta el último aminoácido del extremo 30' del ORF2 (cepa Burma) se clonó en el vector de expresión en baculovirus pBluBacIII, tal como se muestra en la Figura 5 y se describe en el Ejemplo 4. Se incorporó un codón de metionina en el extremo 5' para garantizar el inicio correcto de la traducción.

Después de la transfección y de 4 rondas de purificación de las calvas, se prepararon soluciones de reserva virales y lisados de células a partir de 10 asilados de calvas individuales. Se realizó un análisis de transferencia Western para examinar en busca de aislados virales que produjeran proteína r62K soluble con el máximo nivel (Figura 12). Prácticamente la totalidad de los aislados virales producían r62K soluble. La solubilidad de la r62K oscilaba desde aproximadamente el 60-70% del extracto total. Se escogió un aislado para amplificación para estudios ulteriores.

Se halló que la r62K era completamente soluble en el tampón de lisis, con una recuperación cuantitativa de la molécula en el sobrenadante de lisis de las células. El sobrenadante de lisis fue subsiguientemente procesado a través de tres pasos de cromatografía para obtener la proteína r62K purificada, de acuerdo con el Ejemplo 6B. El paso de cromatografía inicial se realizó con una columna DEAE EMD 650(S) de E. Merck. Se halló que el uso del derivado de la EMD DEAE potenciaba la recuperación de la r62K respecto otras resinas similares de intercambio aniónico débil (Toyopearl 650(S), DEAE Sepharose Fast Flow, etc.). La recuperación mejorada se atribuyó a la estructura en forma de "brazo de tentáculo" de la resina derivatizada de E. Merck.

Se consiguió una purificación adicional usando una columna Sephacryl S-100, la cual se usó primariamente para intercambio de tampón con alguna purificación menor. El material final se obtuvo a partir de fracciones de pico purificadas con una resina Poros HQ/F de intercambio aniónico fuerte.

Mediante un ensayo con lisado de amebocitos de limulus se determinó que el material final obtenido mediante este procedimiento era más del 95% puro y esencialmente libre de endotoxinas. Para el propósito de transferencia Western, la muestras de gel correspondientes se diluyeron 1:10 antes de la SDS-PAGE y de la transferencia a membrana PVDF. La banda de r62K aparece como un doblete, lo que sugiere la existencia de un forma modificada de la r62K. El análisis de la secuencia N-terminal, el mapado del péptido, y los datos de espectroscopia de masas apoyan la existencia de una única secuencia de aminoácidos primaria para la 62K rediseñada.

La caracterización bioquímica ulterior de la proteína 62-kDa se realizó usando una variedad de procedimientos (Ejemplo 9). La transferencia de la secuencia de la 62-kDa recombinante a la PVDF, y el subsiguiente análisis de la secuencia de aminoácidos, indicó que el extremo amino terminal de la proteína 62-kDa estaba intacto con excepción de la metionina N-terminal introducida para asegurar la correcta iniciación de la traducción, la cual había sido suprimida. Los rendimientos globales en cada uno de los primeros cinco ciclos durante la secuenciación fueron bajos, indicando que una porción significativa de la 62-kDa estaba probablemente bloqueada en el extremo amino.

El análisis tríptico reveló tantos como 143 picos mediante HPLC de fase reversa. Se seleccionaron ocho picos para LDMS para determinar la integridad estructural y potenciales modificaciones posteriores a la traducción (Ejemplo 9). De estos ocho picos, cuatro dieron lugar a péptidos de especies únicas. Tres de estos péptidos eran iguales a varias regiones internas de la proteína 62-kDa, tal como se determinó por secuenciación mediante degradación de Edman. Un pico, el pico 65, no originó una secuencia mediante degradación de Edman. No obstante, la masa molecular coincidía muy bien con la masa predicha para el péptido tríptico amino terminal, tomando en consideración la supresión de la metionina N-terminal por parte de un aminopeptidasa celular, seguida por la acilación del residuo alanina adyacente. Los resultados sugieren que el amino terminal de los polipéptidos antígenos de 62K están bloqueados, probablemente acetilados.

El análisis de atenuación posterior a la fuente mediante espectrometría de masas con desorción por láser indicó que el pico 65 era el péptido tríptico amino terminal (Ejemplo 9). También se secuenciaron los otros cuatro picos de HPLC del digerido tríptico que daban lugar a múltiples especies de péptidos, y proporcionaron una confirmación adicional de que se había preservado el secuenciado del HEV auténtico.

Los datos de LC-MS (Ejemplo 9) establecieron las masas moleculares verdaderas de los componentes del doblete de la 62-kDa que se había observado mediante transferencia Western. Con la elucidación del extremo amino terminal en los experimentos anteriores, fue posible predecir a partir de datos de ES-MS los pasos de procesamiento putativos del extremo carboxi terminal que dan lugar a la especies de la "62-kDa" distribuidas bimodalmente.

La masa molecular predicha de la proteína 62-kDa, usando la secuencia codificante desde el residuo 112 hasta el residuo 660 de la región ORF-2 es de 59,1-kDa. Se halló que la proteína no estaba glicosilada, tanto mediante oxidación con peryodato como análisis GC-MS. Los datos presentados en el Ejemplo 9 sugieren que ocurría una supresión en la molécula, y que la supresión ocurría probablemente en el extremo amino o carboxi.

En combinación con la confirmación del extremo amino terminal, los datos de ES-MS sugieren que el extremo carboxi podría estar cortado entre los residuos 539-540 y los residuos 536-537 (respecto la secuencia predicha de la proteína 62-kDa). La secuenciación automatizada del extremo carboxi terminal validó el procesamiento carboxi terminal de la proteína y estableció firmemente los residuos 539-540 (una supresión carboxi terminal de 9 aminoácidos; por ejemplo, SEC. Nº ID.: 25 y SEC. Nº ID.: 26) y 524-525 (una supresión carboxi terminal de 23 aminoácidos; por ejemplo, SEC. Nº ID.: 27 y SEC. Nº ID.: 28) como el extremo carboxi respectivamente de las proteínas 58.1-kDa y 56.5-kDa. En consecuencia, el antígeno 62K original aislado a partir de células de insecto está compuesto por estas dos especies relacionadas de polipéptidos.

Por tanto, la proteína deseada se expresaba en niveles elevados, y se purificada hasta más del 95% de pureza, aunque no se anticipó el procesamiento carboxi terminal aparente. Este procesamiento no parecía interferir con la capacidad de la proteína para servir como un antígeno efectivo, por ejemplo, ver los resultados presentados en la Tabla 1 (Ejemplo 9). De hecho, el antígeno 62K representa un antígeno mejorado en comparación con proteínas expresadas en bacterias en los ensayos de diagnóstico del HEV.

Las excelentes propiedades inmunogénicas de este antígeno también se evidenciaron a partir de la capacidad de la preparación de antígeno 62K para elicitar respuestas inmunes protectoras en primates después de un desafío heterólogo con HEV (ver Sección IV, más abajo). Estas observaciones sugieren que la proteína expresada en baculovirus podría contener una estructura inmunogénica que se parece estrechamente a la proteína nativa de la cápside del virus.

8. Determinación del tamaño de la subunidad de 62K de VLPS

La filtración en gel es una técnica atractiva para la purificación y caracterización analítica de partículas virales puesto que requiere menos tiempo que la ultracentrifugación en gradiente de densidad, y permite la resolución cromatográfica y supresión de partículas mayores o menores que la partícula viral deseada. La Sephacryl S-1000 Superfine tiene un porosidad muy elevada, lo que la convierte en la resina apropiada para aplicaciones que impliquen la separación de partículas virales, partículas subcelulares, y vesículas microsomales talles como el Percoll. Los límites de exclusión de la S-1000 Superfine corresponden a partículas de aproximadamente 300-400 nm de diámetro.

El perfil de absorbancia de la cromatografía con Sephacryl S-1000 Superfine de las partículas de virus de c62K y r62K se muestra en la Figura 13. La elución de las partículas c62K y r62K correspondía a los picos que tenían un tiempo de retención de 95-105 minutos. Esto correspondía a un tamaño de partícula de aproximadamente 20-30 nm de diámetro. La columna S-1000 se equilibró también con tres estándares; dos de partículas, y uno de estructura monomérica. Se halló que el virus de la viruela bovina (250 nm) tenía un tiempo de retención de aproximadamente 48 minutos. Se halló que las partículas de antígeno de superficie derivado de plasma de hepatitis B (HBsAg) (22 nm) tenían un tiempo de retención de 95 minutos, mientras que la albúmina de suero bovino (estándar de proteína monomérica) tenía un tiempo de retención de 132 minutos.

Los antígenos de 62K de la presente invención (consistentes en los 549 aminoácidos C-terminales codificados por el ORF2 de HEV de la variante de cepa Burma, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos, y secuencias homólogas de la misma) pueden prepararse similarmente en otros tipos de sistemas de expresión, preferiblemente sistemas eucariotas (por ejemplo, de mamíferos y levaduras), usando los anteriores plásmidos de inserto genómico del HEV, con amplificación de las secuencias deseadas y clonación en un vector de expresión apropiado. Las secuencias codificantes usadas para producir los péptidos rediseñados pueden derivarse a partir de los vectores de clonación descritos más arriba y detallados en otros sitios (Tam, 1991-a), o mediante síntesis de nucleótidos sintéticos usando procedimientos de empalme mediante PCR para unir fragmentos de oligonucleótidos, de acuerdo con procedimientos conocidos, para construir secuencias de nucleótidos. Tales modificaciones pueden ser fácilmente preparadas por aquéllos con formación ordinaria en la técnica.

Los antígenos 62K de la presente invención producidos de esta forma podrían examinarse en busca de antigenicidad mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. En resumen, los antígenos se purifican de acuerdo con el procedimiento detallado en el Ejemplo 6B, y se siembran en pocillos de placas de microvaloración. Los polipéptidos se lavan con solución de bloqueo, y a continuación se hacen reaccionar con sueros que se sabe contienen anticuerpos anti-HEV. Los anticuerpos no unidos se eliminan mediante lavado, y entonces se hace reaccionar un segundo anticuerpo, conjugado con la molécula informadora, con los complejos péptido-anticuerpo. Los resultados podrían obtenerse, después de eliminar mediante lavado el segundo anticuerpo no unido, mediante detección de la molécula
informadora.

Los antígenos 62K de la presente invención producidos de esta forma de acuerdo con la invención, son aquéllos que muestran una inmunoreactividad sustancialmente similar a la del suero positivo para el HEV, como lo es el antígeno 62K que tiene la secuencia de la SEC. Nº ID.: 15 producida en células de insecto. La inmunoreactividad es sustancialmente similar cuando el porcentaje de muestras de suero que son reactivas con ambos antígenos es, preferentemente, superior al 80%, más preferiblemente superior al 90%, e incluso más preferiblemente superior al 95%.

F. Preparación de polipéptidos antigénicos y anticuerpos

Tal como se describe en ésta, el antígeno 62K comprende mezclas de proteínas (por ejemplo, especies de 58,1-kDa y 56,5-kDa, Ejemplos 6 y 9) o polipéptidos individuales (por ejemplo, SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25, SEC. Nº ID.: 26, SEC. Nº ID.: 27, y SEC. Nº ID.: 28) derivadas de los 549 aminoácidos carboxi terminales del ORF2 del HEV. Una realización de la presente invención incluye la producción de un antígeno 62K que contiene dos polipéptidos obtenidos mediante expresión de una secuencia codificante en células de insecto (Ejemplos 4 y 6). Pueden usarse otros sistemas de expresión para producir los polipéptidos individuales o mezclas de polipéptidos de la presente invención.

Por ejemplo, pueden clonarse secuencias polinucleotídicas que codifican un antígeno o antígenos de la presente invención en el plásmido p-GEX o en varios derivados del mismo. El plásmido pGEX (Smith et al., 1988) y sus derivados expresan las secuencias de polipéptido de un inserto clonado fusionado en pauta con la proteína transferasa del glutatión-S (sj26). En una construcción de vector, el plásmido pGEX-hisB, se introduce una secuencia de aminoácidos de 6 histidinas en el extremo carboxi terminal de la proteína de fusión.

Los diversos plásmidos pGEX recombinantes pueden transformarse en cepas de E. coli apropiadas, y puede inducirse la producción de proteína de fusión mediante la adición de IPTG (isopropil-tio-galactopiranósido). La proteína de fusión recombinante solubilizada podría purificarse a continuación a partir de lisados de células de los cultivos inducidos usando la cromatografía de afinidad con agarosa-glutatión.

En el caso de las proteínas de fusión con \beta-galactosidasa (tales como las producidas mediante clones lambda gt11), la proteína fusionada podría aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad o pasando el material de la lisis de células sobre un soporte sólido que tiene anticuerpo anti-\beta-galactosidasa unido sobre su superficie.

También se incluye en la invención un vector de expresión, tal como los vectores lambda gt11 o pGEX descritos más arriba, que contienen secuencias que codifican los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, SEC. Nº ID.: 15/SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25/SEC. Nº ID.: 26, y SEC. Nº ID.: 27/SEC. Nº ID.: 28, o una secuencia homóloga de éstas), y elementos de control de la expresión, los cuales permiten la expresión de las regiones codificantes en un huésped apropiado. Los elementos de control generalmente incluyen un promotor, un codón de iniciación de la traducción, y secuencias terminadoras de la traducción y transcripción, y un sitio de inserción para introducir el inserto en el vector.

El ADN que codifica el polipéptido antigénico deseado puede clonarse en cualquier número de los vectores comercialmente disponibles para generar la expresión del polipéptido en el sistema huésped apropiado. Estos sistemas incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: expresión en baculovirus (Reilly, et al.; Bearnes, et al.; Pharmingen; Clontech, Palo Alto, California), la expresión en el virus de la viruela vacuna (Earl, 1991; Moss, et al.), la expresión en bacterias (Ausubel, et al.; Clontech), la expresión en levaduras (Gellissen, 1992; Romanos, 1992; Goeddel; Guthrie y Fink), la expresión en células de mamíferos (Clontech; Gibco-BRL, Ground Island, N.Y.), por ejemplo, las líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) (Haynes, 1983; Lau, 1984; Kaufman, 1990). Estos antígenos de polipéptido recombinantes pueden expresarse directamente o como proteínas de fusión.

La expresión en sistemas de levadura tiene la ventaja de la producción comercial. La producción de proteína recombinante mediante el virus de la viruela vacuna y la línea celular de CHO tiene la ventaja de ser en sistemas de expresión en mamíferos. Además, la expresión en el virus de la viruela vacuna tiene varias ventajas, incluyendo las siguientes: (i) su amplio rango de huéspedes; *(ii) una fiel modificación posterior a la traducción, procesamiento, plegado, transporte, secreción, y ensamblaje de proteínas recombinantes; (iii) un nivel de expresión elevado de proteínas recombinantes solubles; y (iv) una gran capacidad para acomodar ADN ajeno.

Los antígenos de polipéptidos expresados de forma recombinante se aíslan típicamente a partir de células lisadas o medio de cultivo. La purificación puede llevarse a cabo mediante procedimientos descritos en ésta.

Los antígenos obtenidos mediante cualquiera de estos procedimientos puede usarse para la generación de anticuerpos, ensayos de diagnóstico, y desarrollo de vacunas.

Podrían prepararse anticuerpos específicos (policlonales o monoclonales) dirigidos contra los antígenos de polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, podría usarse antígeno purificado o proteína de antígeno fusionado para producir anticuerpos monoclonales. En este caso, se retiran el bazo o linfocitos de un animal inmunizado y se inmortalizan o usan para preparar hibridomas mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica (Harlow, et al.). Para producir un hibridoma derivado de humano, se selecciona un donante de linfocitos humano. Un donante vacunado con los polipéptidos de la presente invención podría servir como donante de linfocitos apropiado. Los linfocitos pueden aislarse a partir de una muestra de sangre periférica. El virus de Epstein-Barr (EBV) puede usarse para inmortalizar linfocitos humanos, o puede usarse una pareja de fusión apropiada para producir hibridomas derivados de humano. La sensibilización in vivo primaria con polipéptidos virales específicos puede usarse en la generación de anticuerpos monoclonales de humano.

Los anticuerpos secretados por las células inmortalizadas se examinan para determinar los clones que secretan anticuerpos con la especificidad deseada, por ejemplo, usando los procedimientos de ELISA o de transferencia Western.

En otro aspecto, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que codifican los antígenos de polipéptido de la presente invención.

G. Producción sintética de péptidos del HEV

Además de los procedimientos para producir los péptidos descritos más arriba, podrían producirse péptidos de hasta aproximadamente cincuenta aminoácidos de longitud mediante procedimientos convencionales de síntesis en fase sólida. Tales procedimientos son conocidos por los especialistas en la técnica. Los péptidos producidos de esta manera podrían unirse covalentemente a otros péptidos o conjugados o porciones de proteína, tal como se formarían, por ejemplo, de forma recombinante en una proteína de fusión.

III. Procedimiento de diagnóstico

En un aspecto relacionado, la invención se dirige a un procedimiento para diagnosticar individuos con infecciones del HEV, en donde los antígenos de péptido derivados del HEV se usan para examinar el suero de un individuo en busca de la presencia de anticuerpos anti-HEV.

A. Inmunoreactividad de los antígenos de HEV

A continuación de la producción de antígenos del HEV, de acuerdo con la invención, las muestras de suero procedentes de individuos que se sabe están infectados con el HEV se ensayan por su capacidad de unir tales antígenos. Los ensayos de unión anticuerpo-antígeno son bien conocidos en la técnica (Harlow, 1988). Los ensayos de unión en fase sólida, tales como el ensayo inmunosorbente unido de enzima unido (ELISA), son particularmente apropiados para medir la unión anticuerpo-antígeno. Tales ensayos podrían llevarse a cabo en formato de ensayo de unión directa o competitiva. En el procedimiento directo, el péptido de ensayo se adsorbe sobre una fase sólida. En antisuero anti-HEV de ensayo se añade al péptido, y se mide la unión del anticuerpo humano al péptido, por ejemplo, tal como en el procedimiento del Ejemplo 8.

Alternativamente, cuando los péptidos se expresan como proteínas de fusión de tamaño suficiente como para ser retenidas por una SDS-PAGE, podrían usarse transferencias Western para determinar la unión de la porción de péptido de la proteína de fusión a una muestra de suero.

Se observó que los clones 406.3-2(M) y 406.4-2(M) codificaban péptidos inmunoreactivos (solicitud internacional de PCT PCT/US93/00.457, registrada el 15 de enero de 1993; solicitud internacional de PCT PCT/US91/02.368, registrada el 5 de abril de 1991, WO91/15.603, publicada el 17 de octubre de 1991). En estudios continuado con estos péptidos y sus análogos de la cepa Burma, con suero humano HEV-positivo (procedente de cinco epidemias distintas), el péptido 406.3-2(M) fue inmunoreactivo con ocho de las once muestras ensayadas, el péptido 406.4-2(M) fue inmunoreactivo con nueve de las once muestras ensayadas, y los péptidos 404.3-2(B) y 406.4-2 fueron ambos inmunoreactivos con la totalidad de las seis muestras ensayadas, Yarbough, 1991, incorporada en ésta por referencia. En el Ejemplo 1 puede hallarse una explicación de los experimentos que condujeron a los resultados anteriores. Se observó que el antígeno de péptido SG3 era altamente inmunoreactivo con el suero infectado (solicitud internacional de PCT, PCT/US93/00.457, registrada el 15 de enero de 1993; solicitud internacional de PCT, PCT/US93/00.459, registrada el 15 de enero de 1993).

En la presente invención, para evaluar la antigenicidad de una preparación de proteína c62K purificada, se realizaron inmunoensayos usando un panel de sueros humanos de la fase aguda y de la fase convaleciente obtenidos durante varias epidemias de hepatitis E. Los sueros se ensayaron mediante ELISA en busca de anticuerpos IgG e IgM contra el HEV de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 8. Se usaron tres antígenos derivados de la proteína putativa de la cápside del HEV: (1) SG3, 327 aminoácidos del ORF2 (SEC. Nº ID.: 17), expresado en E. coli; (2) 73K, 660 aminoácidos del ORF2 (SEC. Nº ID.: 13), expresado en baculovirus; y (3) c62K, 549 aminoácidos del ORF2 (SEC. Nº ID.: 15), procesada por una(s) proteinasa(s) de baculovirus.

Las muestras de suero procedían de casos sospechados y confirmados de hepatitis E de regiones endémicas. Tal como se muestra más abajo en la Tabla 1, la proteína c62K expresada en baculovirus detectó anticuerpo contra el HEV medible en varios especímenes certificados procedentes de casos con hepatitis E aguda, que no hubieran permanecido sin detectar usando el SG3, el mejor antígeno del HEV expresado en E. coli (Yarbough, 1994). Los especímenes que daban positivo solamente contra el antígeno c62K se indican con un asterisco. Para la IgG anti-HEV, 3/18 muestras de suero (17%) dieron como positivas para el anticuerpo únicamente con la proteína c62K. Para la IgM anti-HEV, 7/18 muestras de suero (39%) dieron como positivas para el anticuerpo únicamente con la proteína c62K. En la mayoría de los casos, los valores de O.D. sugirieron que el anti-HEV detectado por la proteína SG3 o la proteína 73K estaban justo por debajo del nivel de detección creíble.

TABLA 1 Estudios de antigenicidad comparada. Proteínas expresadas en E. coli y baculovirus

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En conjunto, los resultados demostraron que la sensibilidad y especificidad del ensayo mejoraba significativamente usando la c62K como una fuente de antígeno. Esta observación sugiere que los determinantes estructurales presentes sobre la c62K, reconocidos por los anticuerpos anti-HEV generados durante una infección natural, se parecían más estrechamente al virión nativo al contrario que la 73K de baculovirus y las proteínas recombinantes expresadas en E. coli. Tomado conjuntamente, el antígeno c62K es un avance significativo para detectar niveles bajos de anticuerpo dirigido contra el virus de la hepatitis E.

B. Comparación de la inmunoreactividad entre c62K y r62K

Se realizaron ensayos ELISA comparativos para medir las similitudes antigénicas entre estas dos proteínas, y apoyar aún más la correspondencia de las preparaciones de proteína c62K y r62K. De acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 8, se usaron cantidades equivalentes de las proteínas c62K y r62K para medir las similitudes antigénicas entre estas dos preparaciones de proteína. La detección de la IgG anti-HEV con diversas muestras de suero mostró que las especies cortada (c) y rediseñada (r) de la proteína 62K eran comparables en su especificidad y sensibilidad para detectar anti-HEV (Tabla 2, más abajo).

TABLA 2 Estudios de antigenicidad comparada. Valoraciones de punto final para proteínas expresadas en E. coli y baculovirus

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C. Sensibilidad del antígeno r62K

Un pequeño subconjunto de sueros de humanos y de primates no humanos se diluyó y ensayó en busca de IgG e IgM anti-HEV para definir la sensibilidad de la preparación de proteína r62K (Tabla 3, más abajo). Los sueros diluidos se ensayaron con cada uno de los antígenos expresados en E. coli y baculovirus. El punto final del ELISA se definió como la mayor dilución de sueros que todavía permitía un resultado positivo en el ensayo. Los datos de valoración del punto final establecieron que la proteína r62K tiene un límite de detección para IgG anti-HEV que como mínimo excede en 5 veces el del antígeno SG3 expresado en E. coli usado actualmente. En consecuencia, la detección de la IgG M anti-HEV se incrementó en 25 veces usando la preparación de proteína r62K como el antígeno de elección. El antígeno 62K es un avance significativo para detectar niveles bajos de anticuerpo dirigido contra el virus de la hepatitis E.

TABLA 3 Estudios comparativos de antigenicidad. ELISA para la IgG anti-HEV de proteínas expresadas en baculovirus cortadas y rediseñadas

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IV. Aplicaciones terapéuticas

Se investigó la eficacia de la inmunogenicidad in vivo del antígeno 62K del ORF2 para conferir protección frente a desafíos heterólogos (Ejemplo 11). Se usó el antígeno r62K (Ejemplos 4, 6 y 9) para inocular macacos cinomolgus que fueron subsiguientemente desafiados con la cepa heteróloga México del HEV. Los resultados indican que este antígeno candidato podría ser útil para desarrollar una vacuna para prevenir la hepatitis E aguda en países en vías de desarrollo y para proporcionar protección a los viajeros a regiones endémicas de la enfermedad.

La inmunización de cinos con la proteína r62K del ORF2 los protegió contra la subsiguiente infección por HEV del tipo salvaje y enfermedad. Los criterios aceptados para evidenciar la infección por HEV y la replicación del virus incluyen: (1) detección de antígeno del HEV en el hígado, (2) detección de ARN del HEV en las heces o suero, (3) conversión del suero a positivo para el anticuerpo contra el HEV. La enfermedad de la hepatitis E se define como una infección por HEV y (1) un incremento en los niveles de ALT superiores a dos desviaciones estándares por encima de la línea base, y (2) histopatología compatible con la hepatitis viral.

Los experimentos realizados para apoyar la presente invención demuestran que los animales inmunizados con una proteína de cápside recombinante derivada de la cepa Burma del HEV están protegido frente a un desafío con virus del tipo salvaje de la cepa divergente México del HEV. No hubo elevaciones significativas en los enzimas hepáticos y no hubo evidencia histopatológica de daño hepatocelular en ninguno de los tres animales inmunizados. Por tanto, la vacunación confiere protección frente a la enfermedad en todos los cinos inmunizados con la r62K.

En dos de los tres animales vacunados, la protección completa frente a la infección por HEV se comprobó por la ausencia de antígeno viral medible en el hígado, o de ARN viral en las deposiciones. Además, en estos dos animales, se demostró que estaban presentes anticuerpos neutralizantes (Ejemplo 11, figura 15). La protección parcial frente a la infección en un cino, tal como se evidenció por la presencia retrasada y transitoria de ARN viral en las deposiciones, podría estar relacionada con los niveles relativamente bajos de anticuerpos anti-HEV medibles. No obstante, en ausencia de cambios necro-inflamatorios, parece ser que se impidió la hepatitis mediante la inmunización con la vacuna de r62K, aunque en este animal no se consiguiera la completa protección frente a infección.

Cuando fuera necesario, los niveles de anticuerpos neutralizantes podrían incrementarse mediante el uso de dosis más elevadas de antígeno y/o inoculaciones repetidas antes del desafío con virus infeccioso. Tales inoculaciones repetidas se usan actualmente para la vacunación contra, por ejemplo, el virus de la hepatitis A (HAV) y el virus de la hepatitis B (HBV).

Ambos resultados, los del los animales vacunados y los de los animales usados para valorar el desafío con inóculo de virus, apoyan que el desarrollo de la infección por HEV y la enfermedad asociada dependen de un efecto nivel relacionado con la cantidad de inoculo y la presencia y características de una respuesta inmune específica pre-existente. En el estudio de valoración que usaba animales infectados por el HEV, la extensión de la hepatitis estaba relacionada, y el tiempo transcurrido hasta el inicio de las elevaciones de ALT estaba inversamente relacionada, con la cantidad de inóculo recibido.

En la porción de vacuna del estudio, los resultados con cino 9330 sugieren que, aunque no se impidió la infección por HEV, la presencia de inmunidad específica contra el HEV en el momento del desafío resultó en una infección limitada, caracterizada por una latencia retrasada del inicio de la replicación detectable del virus, una duración acortada de la replicación viral detectable, y la ausencia de rasgos característicos de la enfermedad inducida por el HEV.

En un estudio previo (Purdy et al., 1993), la inmunización con una versión truncada del ORF2 de Burma del HEV, trpE-C2, expresada en E. Coli, permitió grados variables de protección frente a la infección por HEV y enfermedad. Se informó que un cino estaba completamente protegido frente a la infección por virus y a la hepatitis después de un desafío con una cepa homóloga del tipo salvaje. No obstante, los animales desafiados con la cepa heteróloga México del HEV sólo estaban parcialmente protegidos. Aunque un cino inmunizado parecía estar protegido frente a la hepatitis, el animal presentaba evidencias de antígeno viral en el hígado y de ARN viral en las deposiciones después de un desafío con tipo salvaje heterólogo.

Los datos descritos en la presente especificación establecen definitivamente por primera vez la posibilidad de desarrollar una vacuna efectiva para la hepatitis E, capaz de proporcionar protección cruzada frente a las cepas de HEV más divergentes aisladas y caracterizadas hasta la fecha. Dentro de los 549 aminoácidos expresados en una "62K" de ORF2 candidata a vacuna, hay 31 cambios de aminoácidos entre las cepas Burma y Mexico (Tam, et al., 1991; Huang, et al., 1992), y no más de 4 cambios de aminoácidos entre las cepas más estrechamente relacionadas Burma, China y Pakistán (Tsarev, et al., 1992).

V. Antígenos de péptido específicos del HEV para ensayos del HEV

Esta sección describe los antígenos de péptido que se emplean en el equipo de ensayo y en el procedimiento de ensayo descritos más abajo en la Sección IV.

De acuerdo con la invención, los antígenos del HEV, caracterizados en ésta como útiles para el diagnóstico del HEV, incluyen el antígeno 62K (B) o (M), consistente en, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo formado por la SEC. Nº ID.: 15/SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 25/SEC. Nº ID.: 26, y SEC. Nº ID.: 27/SEC. Nº ID.: 28, o una secuencia homóloga de éstas. El antígeno 62K podría producirse mediante corte con una proteasa de proteínas derivadas del ORF2 nativo o recombinante, preferiblemente con una proteasa de baculovirus. Alternativamente, el antígeno 62K podría rediseñarse y expresarse en un sistema de expresión recombinante. El antígeno 62K rediseñado o "r62K" preferiblemente contiene una metionina en el extremo N-terminal, y preferiblemente se produce mediante un vector de expresión baculovirus en una célula de insecto.

Los antígenos 62K de la presente invención consisten en los 549 residuos carboxi terminales de la proteína de la cápside, la cual está codificada por el marco de lectura abierta 2 (en relación a la cepa Burma), con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos. Estos antígenos de péptido pueden prepararse tal como se describe más arriba en la Sección II, y en el Ejemplo 4 que sigue.

Los estudios realizados en apoyo de la presente invención, discutidos más arriba, demuestran que el antígeno 62K es específico para el HEV; es decir, el 62K inmunoreacciona con los anticuerpos presentes en el suero de individuos infectados por el HEV. El antígeno podría no detectar todos los sueros positivos para el HEV, y podría seleccionar algunos falsos positivos; es decir, individuos no infectados. Puede esperarse que el antígeno 62K derivado de la cepa México (u otras cepas variantes) del HEV sea específicamente inmunoreactivo con el suero positivo para el HEV.

Previamente se han caracterizado varios antígenos péptidos del HEV (solicitud internacional de PCT, PCT/US93/
00.457, registrada el 15 de enero de 1993; solicitud internacional de PCT, PCT/US93/00.459, registrada el 15 de enero de 1993; solicitud internacional de PCT, PCT/US91/02.368, registrada el 5 de abril de 1991, WO91/15.603, publicada el 17 de octubre de 1991). Estos péptidos podrían usarse en ensayos en combinación con los antígenos 62K de la presente invención.

Un primer antígeno en el grupo de los antígenos péptido del HEV previamente caracterizados contiene el epítopo formado por el péptido 406.4-2(B) (SEC.-Nº ID.: 19), o el péptido 406.4-2(M) (SEC.-Nº ID.: 20). También se contemplan antígenos péptido que contienen el epítopo formado por una secuencia de aminoácidos homóloga con, o una variación internamente consistente entre la SEC.-Nº ID.: 19 y la SEC.-Nº ID.: 20. El primer antígeno péptido se deriva del extremo carboxi terminal de la proteína codificada por el marco de lectura abierta 3. Un segundo antígeno péptido contiene el epítopo formado por el péptido 406.3-2(B) (SEC.-Nº ID.: 23) o el péptido 406.3-2(M) (SEC.-Nº ID.: 24). También se contemplan como segundo antígeno péptido antígenos péptido que contienen el epítopo formado por una secuencia de aminoácidos homóloga con, o una variación internamente consistente entre la SEC.-Nº ID.: 11 y la SEC.-Nº ID.: 12. Un tercer antígeno péptido contiene el epítopo formado por el péptido SG3(B) (SEC.-Nº ID.: 17) o el péptido SG3(M) (SEC.-Nº ID.: 18). También se contemplan como segundo antígeno péptido antígenos péptido que contienen el epítopo formado por una secuencia de aminoácidos homóloga con, o una variación internamente consistente entre la SEC.-Nº ID.: 17 y la SEC.-Nº ID.: 18. Estos segundo y tercer antígenos péptido se derivan del extremo carboxi de la proteína de la cápside codificada por el marco de lectura abierta 2. La Figura 3 muestra la secuencia de los péptidos 406.3-2 (B) y (M), y la Figura 4 muestra la secuencia de los péptidos 406.4-2 (B) y (M) y SG3(B) y SG3(M). Los procedimientos para obtener los péptidos confirmatorios se describen más arriba y se detallan el los ejemplos siguientes.

De acuerdo con la presente invención, la reactividad de los anticuerpos en una muestra de suero, procedente de un individuo sospechoso de estar infectado con un agente causante de la hepatitis, con un antígeno 62K de la presente invención es un procedimiento fiable para diagnosticar el agente causante como el HEV. La reactividad de los péptidos conocidos usados conjuntamente con un antígeno 62K podría potenciar la sensibilidad y fiabilidad del procedimiento de diagnóstico descrito más abajo.

VI. Utilidad

Esta sección describe usos para los péptidos y proteínas antigénicos de la invención como reactivos de diagnóstico para el diagnóstico de la infección viral de la hepatitis E, y en composiciones de vacunas para proteger un individuo de una infección con el HEV.

A. Procedimientos y equipos de diagnóstico

Se describirán tres tipos básicos de aplicaciones de diagnóstico de los antígenos. La primera se basa en la inhibición por parte del antígeno de la citólisis dependiente de anticuerpo, y mediada por complemento. En este procedimiento, el suero de un individuo de ensayo se hace reaccionar con hepatocitos humanos cultivados e infectados con el HEV en presencia del complemento. La presencia de anticuerpo anti-HEV se evidencia por la lisis celular, tal como se juzga, por ejemplo, mediante exclusión por "Trypan Blue". Cuando se observa lisis celular, la especificidad del anticuerpo anti-HEV se demuestra haciendo reaccionar primero el suero con un exceso de antígeno, mezclando a continuación el suero con las células en presencia de complemento. La especificidad del anticuerpo es indicada por una disminución sustancial en la lisis de células. El procedimiento también puede usarse para cuantificar el título del anticuerpo en el suero analito, mediante la valoración del suero con cantidades crecientes de concentración de antígeno, en el que primero se observa un efecto apreciable sobre la extensión de la lisis celular.

El segundo tipo de ensayo general es un inmunoensayo en fase sólida. En este procedimiento, se hace reaccionar un reactivo en fase sólida, la cual tiene antígeno unido sobre la superficie, con suero analito, en condiciones que permiten la unión del anticuerpo al antígeno sobre el reactivo. Después de lavar el reactivo para suprimir componentes del suero no unidos, se hace reaccionar el reactivo con anticuerpo informador anti-humano marcado, para unir el informador al reactivo en proporción a la cantidad de anticuerpo anti-HEV unido sobre el soporte sólido. El reactivo se lava de nuevo para suprimir el anticuerpo marcado y no unido, y se determina la cantidad de informador asociado con el reactivo. Típicamente, como en el sistema descrito en el Ejemplo 1, el informador es un enzima que se detecta incubando el reactivo sólido en presencia de un sustrato fluorimétrico o calorimétrico apropiado. No obstante, podrían usarse marcas radiactivas u otros informadores.

Después de hacer reaccionar el suero analito con el antígeno unido a la fase sólida, y de lavar para suprimir los componentes del suero no unidos, se podría alternativamente usar el propio antígeno para informar como un reactivo de detección en vez de usar un anticuerpo anti-humano como mediador del informador. El ensayo competitivo se aprovecha de la bivalencia del anticuerpo. En esta realización del ensayo en fase sólida podrían usarse los mismos informadores que se describen más arriba.

Podrían usarse múltiples antígenos conjuntamente o en tándem en cada uno de los ensayos descritos más arriba. Además, podría distinguirse la reacción de cada antígeno. Por ejemplo, en el ensayo en fase sólida descrito más arriba, dos o más antígenos podrían unirse a la fase sólida en ubicaciones separadas de forma que pudiera cuantificarse separadamente la reacción de cada antígeno. Alternativamente, podrían usarse antígenos marcados con informadores distinguibles para detectar antígenos que están entremezclados sobre el soporte sólido.

El reactivo de superficie sólida en el ensayo anterior se prepara mediante técnicas conocidas para unir material proteico sobre material soporte sólido, tal como cuentas poliméricas, "dip sticks", o material de filtro. Estos procedimientos de anclaje generalmente incluyen la adsorción no específica de la proteína sobre el soporte, o la unión covalente de la proteína, típicamente a través del grupo amino, a un grupo químicamente reactivo sobre el soporte sólido, tal como un grupo carboxilo, hidroxilo o aldehído activado.

El tercer tipo de ensayo general es un ensayo homogéneo, en el cual el anticuerpo que se une a un soporte sólido produce algún cambio en el medio de reacción. Los tipos generales conocidos de ensayos homogéneos propuestos hasta la fecha incluyen: (a) informadores de espín-marcado, en donde la unión del anticuerpo al antígeno se detecta por un cambio en la movilidad del informador (ensanchamiento de los picos de desdoblamiento del espín); (b) informadores fluorescentes, en donde la unión se detecta por un cambio en la eficiencia fluorescente; (c) informadores enzimáticos, en donde la unión del anticuerpo afecta las interacciones enzima/sustrato; y (d) informadores unidos a liposomas, en donde la unión conduce a la lisis de los liposomas y a la liberación del informador encapsulado. La adaptación de estos procedimientos a los antígenos de la presente invención sigue procedimientos convencionales para la preparación de reactivos de ensayos homogéneos.

En cada uno de los tres ensayos generales descritos más arriba, el procedimiento de ensayo implica hacer reaccionar el suero procedente de un individuo de ensayo con el antígeno, y examinar el antígeno en busca de la presencia de anticuerpo unido. En el primer ensayo, el examen se realiza observando la disminución en la lisis celular mediada por anticuerpo, cuando el anticuerpo está unido al antígeno. En el ensayo en fase sólida, el examen implica anclar un anticuerpo anti-humano marcado (o antígeno marcado) al anticuerpo que está siendo examinado, y medir la cantidad de informador unido al soporte sólido. Y en el tercer tipo de ensayo, el examen se realiza observando el efecto de la unión del anticuerpo sobre un reactivo de ensayo homogéneo.

B. Composiciones de vacuna y procedimientos 1. Preparación de composiciones de vacuna

Los antígenos 62K recombinante o cortado de la invención podrían incorporarse en una composición de vacuna, de acuerdo con procedimientos conocidos, para potenciar la antigenicidad de los antígenos inyectados.

En una composición, el antígeno del HEV está covalentemente unido a una proteína portadora, tal como la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, y se inyecta bien en forma de solución o en combinación con un adyuvante. Alternativamente, cuando el antígeno del HEV se prepara como parte de una proteína de fusión, la porción de la proteína que no es del HEV podría servir como proteína portadora. La proteína derivatizada o de fusión se transporta en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como en solución o en un adyuvante, tal como el alum convertido.

Alternativamente, el propio antígeno libre, por ejemplo, el antígeno 62K del HEV, podría formularse en alum o usarse sin adyuvante. Una vacuna con adyuvante apropiada tiene una concentración de antígeno preferida de aproximadamente 1 mg de antígeno/mg de alum, y no excede los 80 mg de alum por inyección.

2. Procedimiento de vacuna de antígeno

La invención podría permitir un procedimiento para inhibir la infección de un individuo por el virus de la hepatitis E, mediante la administración al sujeto, por inyección parenteral, por ejemplo, inyección intramuscular o intravenosa, de la composición de vacuna de la invención. Las composiciones de vacuna preferidas, para su uso en el procedimiento, son aquéllas en las cuales el antígeno del HEV incluye la secuencia de los péptidos identificados por: SEC. Nº ID.: 15; SEC. Nº ID.: 16; SEC. Nº ID.: 25; SEC. Nº ID.: 26; SEC. Nº ID.: 27; y SEC. Nº ID.: 28, con o sin una metionina amino terminal, y secuencias homólogas de las mismas. La composición de vacuna del antígeno se administra preferiblemente intramuscularmente en una serie de inoculaciones, por ejemplo, dos o tres inyecciones, administrada cada una con intervalos de cuatro semanas.

Las dosis individuales de la composición de vacuna se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva. Tales dosis son determinadas por los médicos, por ejemplo, en base a datos de ensayos clínicos. Los rangos de dosis de ejemplo para la composición de vacuna son aproximadamente de 0,05 \mug a 1 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug a 30 \mug. Las dosis individuales podrían contener un único polipéptido antígeno de 62K, o múltiples polipéptidos derivados de la región carboxi terminal de 549 aminoácidos del ORF2 del HEV. Además, tales antígenos 62K podrían combinarse con otros polipéptidos antigénicos del HEV para las formulaciones de las vacunas.

La preparación del antígeno 62K de la presente invención podría ser útil para (i) prevenir casos epidémicos y esporádicos de hepatitis E en países en desarrollo, (ii) proteger la mujeres embarazadas que estén en riesgo en regiones endémicas de la enfermedad, y (iii) proporcionar protección a los viajeros a esas regiones. Los experimentos in vitro e in vivo descritos en ésta pueden usarse para determinar el régimen de inmunización óptima con la preparación de antígeno de 62K.

Tal como se ha discutido más arriba, los antígenos 62K de la presente invención pueden usarse en la preparación de vacunas. Además, los anticuerpos generados contra los antígenos polipéptido de la presente invención pueden usarse para la inmunoterapia pasiva o la inmunoprofilaxis pasiva. Los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la presente invención pueden administrarse en cantidades similares a las usadas para otras administraciones terapéuticas de anticuerpo. Por ejemplo, la gamma globulina mezclada se administra a 0,02-0,1 ml/libra de peso corporal durante la incubación temprana de otras infecciones virales, tales como la rabia, el sarampión, y la hepatitis B, para interferir con el establecimiento de la infección. Por tanto, los anticuerpos reactivos con los antígenos 62K pueden administrarse pasivamente, solos o conjuntamente con otro agente antiviral, a un huésped infectado con el HEV para potenciar la capacidad del huésped para hacer frente a la infección.

La utilidad y eficacia de los procedimientos terapéuticos descritos más arriba puede evaluarse in vitro, usando los sistemas celulares descritos más arriba, e in vivo, usando los sistemas modelo animales descritos más arriba.

Los ejemplos siguientes, los cuales ilustran varios procedimientos y composiciones en la invención, se pretende que ilustre, pero no que limiten el ámbito de la invención.

Materiales

Enzimas: la DNAsa I y fosfatasa alcalina se obtuvieron de Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB, Indianapolis, IN); la metilasa de EcoRI, la ligasa de ADN, y la Polimerasa I del ADN, de New England Biolabs (NEB, Beverly, MA); y la RNAsa A se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO).

Otros reactivos: los engarces de EcoRI se obtuvieron de NEB; y el nitro azul de tetrazolio (NBT), 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactopiranósido (Xgal), p-nitrofenilfosfato, e isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG) se obtuvieron de Sigma. El equipo de síntesis del cADN y los equipos de marcaje por cebado aleatorio están disponibles de Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB, Indianapolis, IN).

Los vectores de clonación y expresión, tales como el pBluescript™ (pBS), pueden obtenerse de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA), el vector de expresión pGEX™ puede obtenerse de Pharmacia (Piscataway, NJ), y el pBlu-BacIII puede obtenerse de Invitrogen (San Diego, CA).

Los equipos de ensayo de inmunodiagnóstico para el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), están disponibles de Abbott Diagnostics (Abbott Park, IL, USA). Los equipos de ensayo de inmunodiagnóstico para el virus de la hepatitis E (HEV) están disponibles de Genelabs Diagnostics USA (Redwood City, CA).

La DEAE EMD 650(S) se obtuvo de E. Merck Separations (Darmstadt, Alemania). La Sephacryl S-100 y S-1000 se obtuvieron de Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Las columnas de cromatografía Poros Q/F y HQ/F se obtuvieron de PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA). Los ingredientes del tampón se obtuvieron de AMRESCO (Solon, OH), y las proteínas se purificaron en una estación de trabajo de cromatografía Waters 650E (Milford, MA), con la gestión de los datos proporcionada por el programa Millenium 2010 (Milford, MA).

Ejemplo 1 Preparación de los antígenos 406.3-2, 406.4-2 y SG3 A. Producción de fragmentos aleatorios de ADN de HEV

Se digirió un plásmido pBET1 (Tam, et al., 1991a) con EcoRI para liberar el inserto, el cual se purificó del plásmido linealizado mediante electroforesis en gel. El fragmento purificado se suspendió en un tampón de digestión estándar (Tris HCl 0,5 M; pH 7,5; BSA 1 mg/ml, MnCl_{2} 10 mM) hasta una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, y se digirió con DNAsa I a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Estas condiciones de reacción se determinaron a partir de un estudio de calibración previo, en el cual se determinó el tiempo de incubación requerido para producir predominantemente fragmentos de 100-300 pares de bases. El material se extrajo con fenol/cloroformo antes de su precipitación con etanol.

Los fragmentos en la mezcla de digestión se hicieron romos en sus extremos y se ligaron con engarces de EcoRI. Los fragmentos resultantes se analizaron mediante electroforesis (5-10 V/cm) en un gel de agarosa al 1,2%, usando los marcadores de tamaño PhiX174/HaeIII y lambda/HindIII. La fracción de 100-300 p.b. se eluyó sobre tiras de NA45 (Schleicher y Schuell, Keene, NH), las cuales a continuación se colocaron en microtubos de 1,5 ml con solución de elución (NaCl 1 M, arginina 50 mM, pH 9,0), y se incubaron a 67ºC durante 30-60 minutos. El ADN eluido se extrajo con fenol/cloroformo y a continuación se precipitó con dos volúmenes de etanol. El precipitado se resuspendió en 20 ml de TE (Tris HCl 0,01 M; pH 7,5; EDTA 0,001 M).

B. Clonaje en un vector de expresión

El vector de fago lambda gt11 (Huynh) se obtuvo de Promega Biotec (Madison, WI). Este vector de clonación tiene un único sitio de clonación EcoRI 53 pares de base cadena arriba desde el codón de terminación de traducción de la beta-galactosidasa. Los fragmentos genómicos de más arriba, proporcionados bien directamente a partir de secuencias codificantes o después de amplificación del cADN, se introdujeron en el sitio EcoRI mezclando 0,5-1,0 \mug de gt11 cortado con EcoRI, 0,3-3 \mul de los fragmentos medidos anteriores, 0,5 \mul de tampón de ligación IOX (más arriba), 0,5 \mul de ligasa (200 unidades), y agua destilada hasta 5 \mul. La mezcla se incubó durante la noche a 14ºC, seguida por empaquetado in vitro de acuerdo con procedimientos estándares (Maniatis, 1982, pp. 256-268).

El fago empaquetado se usó para infectar la cepa KM392 de E. coli, obtenida del Dr. Kevin Moore, DNAX (Palo Alto, CA). Alternativamente, puede usarse la cepa Y1090 de E. coli, disponible de la American Type Culture Collection (ATCC #37197). Las bacterias infectadas se sembraron, y las colonias resultantes se examinaron en busca de pérdida de actividad beta-galactosidasa (calvas claras) en presencia de X-gal, usando un procedimiento estándar de ensayo de calva con sustrato X-gal (Maniatis). Aproximadamente el 50% de las calvas de fagos mostraban pérdida de actividad del enzima beta-galactosidasa (recombinantes).

C. Exploración en busca de proteínas recombinantes del HEV

El antisuero convaleciente del HEV se obtuvo de pacientes infectados durante los brotes de HEV documentados de México, Borneo, Pakistán, Somalia y Burma. Los sueros eran inmunoreactivos con VLP en especímenes de deposiciones procedentes de cada uno de varios pacientes con la hepatitis ET-NANB.

Se preparó una capa de células E. coli KM392 infectadas con aproximadamente 10^{4} pfu de la reserva de fagos de más arriba sobre una placa de 150 mm y se incubó, invertida, durante 15-18 horas a 37ºC. La capa se recubrió con una lámina de nitrocelulosa, causando la transferencia de la proteína recombinante del HEV expresada desde las calvas hacia el papel. La placa y el filtro se indexaron para emparejar las posiciones correspondientes de la placa y del filtro.

Se lavó el filtro dos veces en tampón TBST (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05%), se bloqueó con IAB (tampón TBST con 1% de gelatina), se lavó de nuevo con TBST, y se incubó durante la noche después de adicionar antisuero (diluido a 1:50 en AIB, 12-15 ml/placa). La lámina se lavó dos veces con TBST y a continuación se puso en contacto con anticuerpo anti-humano marcado con enzima para anclar el anticuerpo marcado en los sitios del filtro que contenían péptidos reconocidos por el antisuero. Después de un lavado final, se reveló el filtro en un medio de sustrato que contenía 33 ml de NBT (50 mg/ml de solución de reserva, mantenido a 4ºC), mezclado con 16 ml de BCIP (50 mg/ml de solución de reserva, mantenida a 4ºC), en 5 ml de tampón de fosfatasa alcalina (Tris 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM). En los puntos de producción de péptido aparecía color púrpura, tal como se reconocía mediante el antisuero.

D. Sembrado en placa para exploración

Las áreas de producción de péptido determinadas en el paso anterior se resembraron a aproximadamente 100-200 pfu sobre una placa de 82 mm. Se repitieron los pasos anteriores, empezando con una incubación de 15-18 horas, hasta el revelado del NBT-BCIP, con objeto de purificar en placa los fagos que secretaban un antígeno capaz de reaccionar con el anticuerpo contra el HEV. Se recogieron las calvas identificadas y se eluyeron en tampón de fagos (Maniatis, p. 443).

Dos subclones que se seleccionaron son los clones 406.3-2 y 406.4-2, cuyas secuencias se detallan más arriba. Estas secuencias se aislaron a partir de una biblioteca de cADN amplificada procedente de un espécimen de deposición del HEV México humano. Usando las técnicas descritas en esta sección, se ha ensayado la inmunoreactividad de los polipéptidos expresados por estos clones frente a un cierto número de diferentes sueros humanos positivos para el HEV, obtenidos de fuentes procedentes de todo el mundo.

Tal como se muestra más abajo en la Tabla 4, 9 sueros inmunoreaccionaron con el polipéptido expresado por el clon 406.4-2, y 8 sueros inmunoreaccionaron con el polipéptido expresado por el clon 406.3-2.

En comparación, la tabla también muestra la reactividad de varios sueros humanos con el péptido no estructural Y2. Solo uno de los sueros reaccionó con el polipéptido expresado por este clon. No se observó inmunoreactividad para los productos de expresión normal del vector gt11.

TABLA 4 Inmunoreactividad de las proteínas recombinantes del HEV: sueros humanos

6

Y2 representa una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de 157 pares de bases procedente del primer marco de lectura abierta del genoma del HEV.

Los sueros procedentes de la fase aguda se recolectaron entre los días 1 y 12 después del inicio de los síntomas relacionados con el HEV.

Los sueros procedentes de las fases convalecientes se recolectaron entre los días 30 y 90 después del inicio de la ictericia.

+, hay reacción; -, no hay reacción; NT, no se ha ensayado; A, aguda; C, convaleciente.

E. Producción del antígeno 406.3-2(M)

El plásmido 406.3-2 gt11 de más arriba se digirió con EcoRI y el fragmento del HEV liberado se amplificó mediante PCR en presencia de engarces que añadieron un sitio NcoI al extremo 5' del fragmento, y un sitio BamHI al extremo 3' del fragmento. El material amplificado se digirió con NcoI y BamHI y se insertó en el sitio NcoI/BamHI del vector de expresión pGEX™ del vector de la S-transferasa del glutatión, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El plásmido pGEX™ se usó para transformar células hospedadoras de E. coli, y las células que se transformaron exitosamente con el vector pGEX™ se identificaron mediante inmunofluorescencia, usando antisuero humano anti-HEV.

F. Producción del antígeno 406.4-2

El plásmido 406.4-2 gt11 de más arriba se digirió con EcoRI, y el fragmento del HEV liberado se insertó en el sitio NcoI/BamHI del vector de expresión pGEX™, como más arriba. La expresión del péptido 406.4-2 fue similar a la descrita para el péptido de fusión 406.3-2.

G. Producción del antígeno SG3

El péptido SG3 se preparó amplificando primero la SEC. Nº ID.: 7 con engarces cebadores 5' EcoRI-NcoI y 3'-BamHI, usando un plásmido del clon BET1 del fago gt10 que contenía las regiones ORF2 y ORF3 enteras del HEV(B). El fragmento amplificado se insertó en el sitio EcoRI/BamHI de un vector pBluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la propagación y recolección del vector, el inserto clonado se liberó mediante digestión con NcoI y BamHI, y se purificó en gel. El fragmento purificado se insertó en el sitio NcoI/BamHI del vector pGEX™, y se expresó en un sistema de expresión E. coli. La expresión del péptido del SG3 fue similar a la descrita para el péptido de fusión 406.3-2.

H. Producción de la proteína de la cápside

La proteína de la cápside (B) se preparó sustancialmente tal como se ha descrito más arriba mediante la amplificación por PCR de la SEC. Nº ID.: 1, a partir de un plásmido pBET1, usando un cebador en 5' que contenía un sitio NcoI y un cebador en 3' que contenía un sitio BamHI. El fragmento amplificado se insertó en el sitio NcoI/BamHI de un vector pGEX™, y se expresó en un sistema de expresión E. coli. La proteína de la cápside (M) se preparó de forma similar.

I. Purificación del péptido

Los antígenos peptídicos del HEV que son solubles, tales como el 406.4-2 y 406.3-2, se purificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de lisados enteros de células expresados en bacterias. Las preparaciones de lisados crudas se cargaron sobre geles de SDS-PAGE al 7,5%, y se corrieron hasta que los marcadores de tamaño correspondientes al tamaño predicho de cada proteína habían prácticamente salido del cada gel. El tampón de funcionamiento del gel se remplazó con tampón fresco y se dejó continuar el gel durante intervalos de 5 minutos. El tampón de funcionamiento del gel se recolectó después de cada intervalo y se remplazó con tampón fresco. Las fracciones se dializaron y concentraron, y se ensayó cada fracción por su inmunoreactividad respecto una pareja de fusión del pGEX™, la transferasa del S-glutatión, un anticuerpo monoclonal específico. Las fracciones altamente reactivas se juntaron.

Alternativamente, los péptidos, cuando se expresaron como fusiones con la GST (pGEX™) se purificaron mediante cromatografía en columna usando Glutatión-Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ). En resumen, se eliminaron de la columna, mediante lavado, las proteínas de fusión que no eran de la GST, y a continuación se eluyó la proteína unida con glutatión 10 mM en Tris HCl 50 mM, pH 8,0.

Los péptidos del HEV insolubles, tales como el SG3, se purificaron como sigue. Se lisaron células inducidas a expresar la proteína de fusión del pGEX™ con dos pasajes a través de una prensa francesa. El lisato se depositó sobre una solución de glicerol al 40%, y se centrifugó a 3500 rpm, en un rotor J-20 en una centrífuga J221 Beckman, durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió en PBS, y a continuación se precipitó de nuevo. El precipitado se resuspendió entonces en urea 6 M, guanidina 6 M, en PBS, pH 8,0, con homogeneización durante 5 minutos, y precipitación de nuevo. La suspensión se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum (Nalgene, Kent, RU), y se cargó sobre una columna IMAC (Pharmacia) que contenía Fast Flow Chelating Sepharose™ (Pharmacia) cargada con 3 volúmenes de una solución de CoCl_{2} de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La proteína unida se eluyó con un gradiente de 2 columnas de urea 6 M, guanidina 6 M, y entre 0-1 M de imidazolio en PBS, con un rango de pH de 8,0 a 6,0. La columna se descargó con EDTA 0,1 M en PBS, y se analizaron las fracciones; por ejemplo, mediante el protocolo ELISA detallado en los Ejemplos 6, 8 ó 10.

Ejemplo 2 Hepatocitos primarios humanos en cultivo A. Aislamiento de hepatocitos

Los hepatocitos se aislaron a partir de hígado humano procedente del Stanford University Medical Center. El hígado, bien se perfundió in situ, o se extrajo como un pedazo para su perfusión en el laboratorio. La perfusión inicial se realizó durante 10 minutos a 60 ml/min usando una solución salina equilibrada de Hank libre de Ca^{++} y Mg^{++}, suplementada con HEPES 10 mM (pH 7,4) y ácido [etilen bis (oxietilennitrilo)]-tetraacético. La perfusión se continuó durante 20 minutos adicionales usando el medio E de William (WME) suplementad con HEPES 10 mM (pH 7,4) y 100 U/ml de colagenasa (tipo I, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Después de la perfusión se retiró la cápsula del hígado usando un fórceps fino, y los hepatocitos se desprendieron mediante agitación suave en solución de colagenasa. La suspensión de hepatocitos se filtró a través de varias capas de gasa, y se mezclaron con un volumen igual de WMW conteniendo un 10% de suero fetal bovino (FBS). Los hepatocitos se sedimentaron mediante centrifugación a 50 \times g durante 5 minutos, y se resuspendieron en WME conteniendo un 5% de FBS. Los hepatocitos se sedimentaron y resuspendieron de esta manera 2 veces adicionales. La preparación de células final se filtró además a través de varias capas de gasa antes de examinar la viabilidad usando trypan blue. Las células se sembraron a una densidad de 2 \times 10^{6} células por placa Primaria de 60 mm (Falcon / Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) recubiertos previamente con colágeno (Collaborative Research, Bedford, MA).

Los cultivos se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 3 horas para permitir el anclaje, y, a partir de entonces, el medio se cambió a una formulación carente de suero cada 48 horas. La formulación carente de suero fue un medio basado en el WME, suplementado con factores del crecimiento, hormonas, HEPES 10 mM (pH 7,4), 100 \mug/ml de gentamicina, tal como se ha descrito (Lanford, 1989).

B. Detección de proteínas específicas del hígado

Los cultivos de hepatocitos humanos se mantuvieron en medio carente de suero durante diversos períodos de tiempo, y se marcaron con [^{35}S]-metionina durante 24 horas. Se ajustó el medio para que contuviera PMSF 1 mM, EDTA 1 mM, y un 1% de NP40. Se unieron anticuerpos específicos para las diferentes proteínas del plasma a cuentas de proteína A-agarosa, se lavaron las cuentas con PBS, y se incubaron alícuotas del medio marcado, durante 16 horas, a 4ºC, con los complejos anticuerpo-cuenta. Se lavaron las cuentas 3 veces con un tampón que contenía NP40 al 1%, y las proteínas inmunoprecipitadas se eluyeron con tampón de muestras para electroforesis en gel, que contenía SDS al 2% y 2-mercaptoetanol al 2%. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE con gradiente (del 4 al 15%) y se autoradiografiaron.

Ejemplo 3 Infección in vitro con HEV de hepatocitos primarios humanos A. Infección con HEV de hepatocitos humanos

Se usó una mezcla de deposiciones #73 (cuarto pasaje) de mono cinomolgus infectado por el HEV como inóculo para infecciones de hepatocitos humanos primarios. Se diluyeron varias cantidades de inóculo en 1 ml de medio carente de suero (SFM), y se aplicaron al cultivo durante un período de incubación de 3 horas. A continuación, esta solución se suplementó con 2 ml de SFM fresco, y la totalidad de la mezcla se incubó durante la noche. Al día siguiente, se lavaron monocapas de células con WME (HEPES 10 mM, pH 7,4) durante tres veces y se cambiaron a SFM fresco, el cual, a partir de entonces, se cambió con intervalos de dos días.

B. Ensayo de tinción inmunofluorescente

Se aislaron hepatocitos de mono cinomolgus primarios y se sembraron en placas de cultivo de tejidos con cubreobjetos recubiertos de colágeno, tal como se ha descrito. Las células sobre los cubreobjetos se infectaron bien con la mezcla de deposiciones #73 de mono cinomolgus infectado por el HEV, o con un suero humano normal del NIH, tres días después de la siembra inicial. Las infecciones se dejaron progresar durante 2 semanas.

Las células sobre los cubreobjetos se fijaron en acetona al 90% a temperatura ambiente durante 1 minuto. A continuación, los cubreobjetos se secaron al aire. Se bloquearon los cubreobjetos en suero de cabra al 1% en PBS durante 1 hora, se lavaron con PBS tres veces, y se incubaron con una mezcla de antisueros de conejo contra las proteínas recombinantes del HEV 406.3-2(B), 406.4-2(M) y 406.4-2(B), a temperatura ambiente, durante 3 horas. Los cubreobjetos se lavaron de nuevo con PBS tres veces, y se hicieron reaccionar con IgG(H+L) anti-conejo de cabra (Zymed) conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC), diluida en PBS-suero de cabra al 1%, durante 30 minutos. Después, se lavaron 3 veces los cubreobjetos con PBS y se secaron al aire, se montaron con una solución de FITC-glicerol y se examinaron con un microscopio fluorescente.

C. Transcripción inversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT/PCR)

La infección por HEV de hepatocitos de macaco cinomolgus primarios se evaluó mediante ensayos de RT/PCR. Los cebadores para la síntesis del cADN y la PCR se basaron en las secuencias de nucleótidos del cADN del HEV de longitud completa (Tam et al., 1991a, 1991b). Los cebadores HEV3.2SF1 (nt 6578-6597) y HEV3.2SF2 (nt 6650-6668) tiene polaridad con sentido procedente de la región del ORF2 del genoma viral, y los HEV3.2SR1 (nt 7108-7127) y HEV3.2SR2 (nt 7078-7097) son cebadores anti-sentido dentro de la región.

A continuación de la extracción del ARN celular total de células infectadas por el HEV usando un procedimiento de guanidinio de un paso, o sobrenadantes infectados por el HEV de acuerdo con el procedimiento de Chomczynski, et al. (Chomczynski, 1987), se desnaturalizaron con calor alícuotas de muestras de ARN a 95ºC, durante 5 minutos, y se sometieron a transcripción inversa, a temperatura ambiente durante 5 minutos, y a 42ºC durante 60 minutos, usando 200 unidades por reacción de transcriptasa inversa MMLV (BRL) en un volumen de reacción de 20 \mul que contenía 20 unidades de RNasina (Promega), 1 \times tampón de PCR (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), con una concentración 1 mM de cada desoxiribonucleótido (Perkin-Elmer Cetus), y 2,5 \muM del cebador HEV3.2SR1. La mezcla de reacción se trató entonces con calor a 95ºC durante 5 minutos para desnaturalizar la transcriptasa inversa MMLV.

Se usaron diez microlitros del producto de la síntesis del cADN para la PCR, en un volumen final de 50 \mul con 0,5 \muM del cebador HEV3.2SF1, 1,25 unidades de la polimerasa Taq del ADN (AmpliTaq, Perkin-Elmer Cetus), y 1 \times tampón de PCR, recubiertos con 50 \mul de aceite mineral, y se sometieron a 40 ciclos de PCR en un termociclador Perkin-Elmer (95ºC \times 1 minuto, 52ºC \times 2 minutos, 72ºC \times 30 segundos). Entonces, diez microlitros del producto de la primera ronda de PCR se sometieron a otros 40 ciclos de PCR anidada (95ºC \times 1 minuto, 55ºC \times 2 minutos, 72ºC \times 30 segundos), en un volumen total de 50 \mul, conteniendo los cebadores de PCR internos HEV3.2SF2 y HEV3.2SR2.

Los productos de la PCR de la primera y segunda ronda se sometieron a electroforesis en agarosa, se tiñeron con bromuro de etidio, y se fotografiaron bajo luz UV. Se realizó la transferencia Southern, y los filtros se hibridaron con la sonda interna HEVORF2-7 marcada con [^{32}P-dCTP], exclusiva de los cebadores (nt 6782-6997), y se realizó una autoradiografía.

Ejemplo 4 Preparación de un antígeno de HEV de 62 kDa

Los antígenos 62K se produjeron mediante un sistema de expresión con baculovirus en células de insecto como sigue.

A.: Construcción de baculovirus recombinantes. El baculovirus ORF-2-rAcNPV que expresa el ORF2 entero de la cepa Burma del virus de la hepatitis E se construyó tal como se ha descrito previamente, He, J. et al., J. Clin. Microbiology, 31:2167 (1993), incorporada en ésta por referencia.

: La construcción del baculovirus recombinante pBBIII-62K que expresa los 549 aminoácidos C-terminales del ORF2 se describe como sigue más abajo, y se resume en la Figura 5. En resumen, se sintetizó un fragmento de ADN de 204 pares de bases (p.b.), que contenía los nucleótidos 5480 a 5684 del ORF-2 procedente de la cepa Burma del HEV (Figura 2), usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y una plantilla de plásmido de cADN del HEV pBBIII-ORF2, junto con dos cebadores (cebador en 5', SEC. Nº ID.: 23 y cebador en 3', SEC. Nº ID.: 30). El cebador en 5' contenía un sitio BamHI y el cebador en 3' tenía un sitio HindIII para facilitar la construcción del plásmido. El producto de la PCR se digirió con BamHI/HindIII y se ligó a un vector de expresión en baculovirus pBluBacIII (Invitrogen, San Diego), el cual previamente se había digerido con las mismas endonucleasas de restricción, para formar el plásmido pYZ1 (Figura 1).

: Se corta un fragmento de ADN HindIII de 1,5 pares de kilobases (k.b.p.), correspondiente a la porción 3' del ORF-2 del HEV, de un plásmido pBBIII-ORF2 previamente construido, y se inserta en el plásmido pYZ1 en el sitio HindIII para formar el vector de transferencia de baculovirus final pBBIII-62K, el cual se usa subsiguientemente en la construcción de virus recombinantes. La secuencia de nucleótidos derivada de la PCR se confirmó mediante secuenciación del ADN, y la correcta orientación del inserto HindIII/HindIII en pBBIII-62K se verifica mediante análisis con enzimas de restricción. La transfección, la purificación en placa, y la amplificación del virus del baculovirus recombinante BBIII-62K se realiza de acuerdo con protocolos descritos (Invitrogen, San Diego).

B.: Cultivo celular y condiciones de expresión. Se mantuvieron células de Spodoptera frugiperda (Sf9) en frascos de cultivo en suspensión a 27ºC en medio para insectos de Grace suplementado con un 5% de suero fetal bovina (v/v), 50 \mug/ml de gentamicina, y 0,1% de Pluronic F-68. Todos los ingredientes del cultivo se obtuvieron de Gibco/BRL (Gaithersburg, MD), y las células se cultivaron de acuerdo con los protocolos descritos por el fabricante (Invitrogen, La Jolla, CA). Las células viables con una densidad de 2 \times 10^{6}/ml de precipitaron mediante centrifugación. El precipitado de células se resuspendió en 1/10 del volumen original de medio que contenía el virus recombinante, BBIII-62K, con una multiplicidad de infección de 2 unidades formadoras de calvas (PFU) por célula. La infección se realizó durante una hora sin agitación. Las células infectadas se diluyeron hasta la densidad original con medio fresco y se mantuvieron a 27ºC durante 2-7 días con agitación (79-95 r.p.m.).

: Los procedimientos para la infección de las células en monocapa se describen en los protocolos proporcionados por Invitrogen, Inc.

Ejemplo 5 SDS-PAGE e Inmunotransferencia del ORF2 producido en cultivo en suspensión de Sf9 y en células en monocapa

Los lisados de células infectadas del Ejemplo 5 anterior, preparadas después de diversos intervalos después de la infección, se separaron mediante centrifugación para generar tanto la fracción soluble en solución salina tamponada con fosfato (PBS) como la insoluble. Las proteínas de ambas fracciones se analizaron mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida, los cuales se tiñeron con solución de azul de Coomassie (Figura 6A), o se transfirieron a papel de nitrocelulosa seguida por análisis de transferencia Western (Figura 6B), como sigue.

A. Antisuero anti-HEV

Se generaron dos antisueros policlonales de conejo, anti-SG3 y anti-1L6, contra la porción 3' del ORF-2: 327 y 42 aminoácidos de longitud que compartían el mismo extremo C-terminal del ORF-2 procedente de la cepa Burma del HEV, tal como se ha descrito previamente (Yarbough, 1991, 1994), incorporadas en ésta por referencia.

B. SDS-PAGE e inmunotransferencia

Para preparar las muestras de proteína para la SDS-PAGE, aproximadamente 2 \times 10^{6} células Sf9 infectadas con baculovirus se precipitaron en microcentrífuga, y se resuspendieron en 150 \mul de solución salina tamponada con fosfato. Las células se lisan mediante sonicación. El lisado se sometió a centrifugación en una microcentrífuga a 4ºC durante 15 minutos. El sobrenadante y el precipitado se separaron y desnaturalizaron en tampón de desnaturalización de proteínas que contenía Tris 20 mM (pH 6,8), 10% de 2-mercaptoetanol, 2% de SDS, 30% (v/v) de glicerol, y 0,1 mg/ml de azul de bromofenol. La muestras de proteína se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 4-20%, y se transfirieron a continuación a una membrana de PVDF. La inmunotransferencia se llevó a cabo usando el antisuero policlonal de conejo descrito más arriba y un ensayo de detección quimioluminiscente (equipo ECL de Amersham).

Ejemplo 6 Purificación de los productos del ORF2 73K, c62K y r62K A. Purificación del ORF2 de longitud completa (73K)

Los precipitados de células infectadas con el baculovirus recombinante ORF2-rAcNPV se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), que contenía EDTA 1 mM, 1 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina, 0,5 mg/ml de Pefabloc SC, y 10 \mug/ml de pepstatina, a una densidad celular del 20% (p/v). La suspensión se lisó mediante tres pasajes a través del microfluidizador M-110S de Microfluidics, con una presión de líquido de 14.000 PSI, seguidos por centrifugación del lisado a 10.000 \times g durante 30 minutos a 5ºC.

Se decantó el sobrenadante y el precipitado insoluble se resuspendió en BICINE 25 mM a pH 8,5. La suspensión se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones, y el precipitado lavado se extrajo en BICINE 25 mM que contenía un 0,5% de SDS (p/v) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El material extraído se centrifugó durante 30 minutos a 10.000 \times g a temperatura ambiente, y el sobrenadante resultante se separó y diluyó 1:5 en BICINE 25 mM, pH 8,5, en urea 8 M.

Este material se cromatografió en una columna de intercambio catiónico Hyper-D-S (BioSepra, Framingham, MA) en el mismo tampón, con una velocidad lineal superficial de 3000 cm/h. A continuación de la carga y lavado de la columna, se eluyó la proteína 73K en un gradiente lineal de 0 a 400 mM de NaCl en el mismo tampón.

Las fracciones que contenían la proteína 73K procedentes de la columna Hyper-D-S se dializaron durante la noche frente a un exceso de volumen de 500 veces de agua, seguida por centrifugación del dializado a 10.000 \times g a 4ºC. Se descartó el sobrenadante, y se extrajo el precipitado con SDS al 0,5% en Tris 25 mM, pH 8,5. Se añadió el Reactivo Solido de Cleland (DTT) hasta una concentración de 50 mM, y se calentó la solución hasta 100ºC durante tres minutos, seguido por dilución inmediata en una solución, en exceso volumétrico de 100 veces, que contenía glicina 50 mM, pH 10,5, 10% de glicerol, glutatión 5 mM (reducido), glutatión 0,5 mM (oxidado), y 1 g/l de PEG 3500. Se dejó oxidar la solución al aire durante la noche. A continuación de la oxidación, se concentró la solución y se diafiltró, mediante filtración por flujo cruzado tangencial, hasta Tris 25 mM, pH 8,5. El material se concentró aún más mediante ultrafiltración centrífuga.

B. Preparación de lisado de células y purificación del antígeno 62K recombinante

Se resuspendieron células Sf9 congeladas e infectadas con el baculovirus recombinante BBIII-62K en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1 \mug/ml de aprotinina, EDTA 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,5 mg/ml de Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), y 10 \mug/ml de pepstatina (Boehringer Mannheim), a una concentración del 20% (p/v). La suspensión celular se lisó en un microfluidizador M-110S de Microfluidics (Newton, MA) mediante dos pasajes a 14.000 PSI. Las células lisadas se centrifugaron
(15.000 \times g, 4ºC, 30 minutos). El sobrenadante celular se pre-trató entonces mediante la adición de ditiotreitol (DTT) sólido (Cleland, 1964) hasta una concentración de 50 mM, y se dializaron inicialmente frente a 100 volúmenes de Tris 10 mM, pH 8,5, NaCl 50 mM, y DTT 0,5 mM, durante 8 horas a 4ºC.

La diálisis se continuó durante otras 8 horas frente a medio fresco sin DTT. Usando este procedimiento de diálisis en dos pasos se eliminó virtualmente la agregación de la proteína 62-kDa con proteínas celulares contaminantes. Se halló que la proteína r62-kDa era completamente soluble en el tampón de lisis, con una recuperación cuantitativa de la molécula en el sobrenadante de la lisis celular.

El dializado se prefiltró a través de un filtro Millipore de 0,22 micrómetros, y se cargó a continuación directamente en una columna DEAE EMD 650(S) (E. Merck) equilibrada con Tris 10 mM, pH 8,6, NaCl 50 mM. La proteína r62-kDa se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 50-500 mM a lo largo de 15 volúmenes de columna, con una velocidad superficial lineal de 100 cm/h. La proteína 62-kDa eluyó temprano en el gradiente.

La presencia de 62-kDa relacionada con el ORF-2 se confirmó mediante transferencia Western de fracciones de la columna con anticuerpo policlonal de conejo, 1L6 (Yarbough, et al., 1991), un anticuerpo generado contra la región carboxi terminal de la proteína del ORF-2 progenitora.

Las fracciones de la columna de DEAE que contenían r62K se juntaron, y se concentraron mediante ultracentrifugación centrífuga (Amicon, Beverly, MA). La proteína r62-kDa fue purificada aún más y se intercambió su tampón en una columna Sephacryl S-100 de 60 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en Tris 25 mM, pH 7,2 (5 \times 100 cm), con una velocidad superficial lineal de 30 cm/h. Las fracciones que contenían la 62-kDa se juntaron y concentraron mediante ultrafiltración centrífuga. Este paso en el procedimiento se utilizó principalmente como un paso de intercambio de tampón.

El conjunto procedente de la columna S-100 que contenía 62-kDa se aplicó a la columna Poros Q/F de intercambio aniónico fuerte (4,6 \times 10 mm) (Perspective Biosystems, Cambridge, MA), equilibrada con tampón B (Tris 25 mM, pH 7,2) con una velocidad superficial lineal de 3000 cm/h. Se lavó la columna con d5 volúmenes de columna de tampón B. La 62-kDa se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl (en un total de 10 volúmenes de columna) en tampón B. La proteína 62-kDa eluyó a aproximadamente NaCl 300 mM. Si era necesario, se intercambió el tampón de la 62-kDa mediante diafiltración de flujo cruzado tangencial usando un cartucho enrollado en espiral (Millipore Prep TFF; Millipore, Bedford, MA). En esta etapa, la proteína 62-kDa era prácticamente homogénea en base a SDS-PAGE y transferencia Western.

En los pasos de purificación descritos más arriba, las conductividades y los pH se monitorizaron respectivamente con un conductímetro CDM 83 de Radiometer Copenhagen (Westlake, OH) y un pH-metro estándar de referencia PHM. Todos los constituyentes del tampón eran de la categoría para biotecnología o USP, y se determinó que estaban esencialmente libres de pirógenos mediante el ensayo de lisado de amebocitos de limulus.

Además, para la cuantificación de la recuperación del antígeno 62K a partir de lisados de células de insecto se utilizó la siguiente técnica (ELISA) de sandwich de anticuerpo doble. El anticuerpo anti-1L6, un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra la porción carboxi terminal de la proteína del ORF-2, se purificó mediante cromatografía de afinidad con Proteína G-Sepharose, y se usó para recubrir placas de microvaloración a una concentración de 1,6 \mug/ml por pocillo en tampón carbonato/bicarbonato. Después del lavado y bloqueo, se añadieron a la placa el antígeno 62-kDa purificado (cuantificado mediante análisis de aminoácidos) o muestras de proceso, y se diluyeron en series de diluciones de dos veces. Después de la incubación del antígeno y del lavado, se añadió un segundo anticuerpo, anti-SG3 conjugado con biotina, a la placa y se incubó. El antígeno SG3 corresponde a los 328 aminoácidos carboxi terminales de la proteína 62-kDa (Yarbough, et al., 1994). Esta incubación se siguió con una incubación final con estreptoavidina conjugada con peroxidasa de rábano silvestre. Después del lavado final, se añadió sustrato y se leyeron las placas a una absorbancia de 490 nm.

Las concentraciones de proteína de las muestras se establecieron usando el ensayo de Bradford (Pierce, Rockford, IL).

Ejemplo 7 Microscopía electrónica

Las muestras de proteína se aplicaron a rejillas de carbón recubiertas con Formvar, y se tiñeron con acetato de uranilo al 2% o ácido fosfotungstico al 2%, pH 6,5, antes de observarlas en un microscopio electrónico. Cuando se requirió fijación, las muestras de proteína se fijaron en PBS, que contenía un 2% de glutaraldehído, durante 30 minutos. A continuación se llevó a cabo el intercambio de tampón mediante centrifugación en Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) para cambiar el tampón de la muestra a PBS.

Ejemplo 8 Ensayos de ELISA

Se usó ELISA para comparar la antigenicidad de los productos de proteína del HEV expresados en E. coli y baculovirus. Se usó un pequeño panel de sueros codificados para definir la sensibilidad y especificidad de un diagnóstico que incorporase proteínas expresadas en baculovirus.

A. Suero humano

Los sueros humanos procedían de conjuntos almacenados previamente recolectados durante varias epidemias de hepatitis E en varias ubicaciones geográficas. Los sueros procedentes de primates que no eran humanos procedían de cinos y chimpancés infectados experimentalmente con el virus de la hepatitis E en el "Center for Disease Control", Atlanta, GA.

B. ELISA

Las proteínas usadas para el inmunodiagnóstico incluyen: (1) la SG3 que codifica 327 aminoácidos del ORF2 expresada como una proteína de fusión en E. coli (SEC. Nº ID.: 17), (2) la 73K que codifica 660 aminoácidos del ORF2 expresada en baculovirus, y (3) la 62K que codifica 549 aminoácidos del ORF2 expresados en baculovirus. Los antígenos se usaron individualmente para recubrir los pocillos de placas de microvaloración de poliestireno (Yarbough, et al., 1994). Cada pocillo se incubó durante la noche a 4ºC con 200 ng de cada una de las proteínas en 100 \mul de tampón carbonato sódico 0,05 M, pH 9,5 (1,59 g de Na_{2}CO_{3}, 2,93 g de NaHCO_{3}, 0,02% de azida sódica, pH 9,5, llevados hasta 1000 \mul). Después del lavado con PBS-0,05% de monolaurato de poliaxietileno (20) "Tween 20™" (Sigma), y del bloqueo con 200 \mul de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 1,5 horas a temperatura ambiente, las muestras de suero se diluyeron 1:100 en diluyente de anticuerpo (1000 ml de solución salina tamponada con Tris (Tris 40 mM, pH 7,5, NaCl 1 M), 30 ml de suero de cabra, 10 g de albúmina de suero bovino, fracción V, 10 g de leche descremada (Camation), 1 g de gelatina (EIA), y 0,2 g de thimersol (conservante); consultar la PRODUCCIÓN DE DILUYENTE DE ANTICUERPO, a continuación), y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Después de retirar el anticuerpo primario y lavar para retirar cualquier anticuerpo 1º no unido, los pocillos se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con el anticuerpo secundario, IgG anti-humana de cabra (específica para la cadena gamma) o IgM anti-human de cabra conjugada (específica para la cadena mu) conjugadas con HRP.

Después del lavado final, se añadió sustrato y se leyeron las placas a una absorbancia de 490 nm. Los sueros que producían un valor de O.D. de 0,300 o superior se marcaron como positivos para los anticuerpos del HEV. Esto coincide con una proporción P/N de más de 3,0 y un mínimo de 5 desviaciones estándares por encima de la media del suero normal.

C. Producción de diluyente de anticuerpo

El Diluyente de Anticuerpo se preparó como sigue: se calentaron 200 ml de TBS hasta 60ºC y se fundió 1 g de gelatina en ellos. El volumen se llevó hasta 1000 ml con TBS. Cuando la temperatura se enfrió hasta los 40ºC se añadieron 10 g de BSA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que la BSA estaba en solución. A continuación se añadieron 30 \mul de suero de cabra, seguidos por la adición de thimeresol hasta el 0,2%. El reactivo se pudo almacenar durante dos semanas a 4ºC. Antes de su uso, se agitó leche hasta el 1% a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Ejemplo 9 Caracterización adicional del antígeno 62K A. Caracterización de la proteína recombinante 62-kDa mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia western

Las fracciones procesadas de la proteína 62-kDa (Ejemplos 4 y 6B) se desnaturalizaron y analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. En resumen, la electroforesis en geles de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida se realizó de acuerdo con el procedimiento de SDS-PAGE tricine (Schagger y von Jagow, 1987). La transferencia western se realizó como se ha descrito previamente (Yarbough, et al., 1994). Un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra las regiones carboxi terminales del ORF-2, el 1L6, se usó para evaluar la proteína purificada (Ejemplo 5). El sistema de tampón tricine se usó con objeto de obtener una resolución elevada y minimizar la interferencia con los reactivos de Edman en la secuenciación en fase sólida a partir de las membranas de PVDF (difluoruro de polivinilideno).

Los resultados de un análisis del proceso de purificación de la 62-kDa usando la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 4-20%, y la correspondiente transferencia western se presentan en las Figuras 14A y 14B. En la Figura 14A: carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, lisado de células; carril 3, sobrenadante del lisado de células; carril 4, mezcla del pico de la DEAE; carril 5, mezcla del pico de la Sephacryl S-100; carril 6, mezcla del pico de la Porus HQ/F. Los marcadores de peso molecular son estándares pre-teñidos de Novex SeeBlue (Novex SeeBlue Pre-Stained Standards, San Diego, CA) y abarcan como sigue (de arriba a abajo): Miosina, 250-kDa; BSA, 98-kDa; deshidrogenasa del glutámico, 60-kDa; alcohol deshidrogenasa, 50-kDa; anhidrasa carbónica, 36-kDa; mioglobina, 30-kDa; lisozimas, 16-kDa; aprotinina, 6-kDa; cadena B de la insulina, 4-kDa. La Figura 14B presenta una transferencia western de los carriles 1-6 anteriores. Las muestras se diluyeron 15 veces antes de las SDS-PAGE y transferencia. El anticuerpo 1L6 se uso como anticuerpo inicial.

El análisis de lisado de células inicial (Figura 14A, carril 2) indicó que la proteína 62-kDa se expresaba adecuadamente en el sistema de expresión de baculovirus y era apropiada para su procesamiento ulterior. El sobrenadante de la lisis celular (Figura 14A, carril 3) parecía rendir esencialmente una recuperación cuantitativa de la proteína 62-kDa como un producto soluble. La mezcla de la DEAE (Figura 14A, carril 4) rindió una purificación significativa de la 62-kDa de la mezcla de sobrenadantes del lisado anterior, y los pasos de cromatografía con Sephacryl S-100 y Poros HQ/F resultaron en una purificación adicional de la proteína 62-kDa (Figura 14A, carriles 5 y 6). Un aspecto curioso de los perfiles de electroforesis en gel fue la purificación aparente de la banda de 62-kDa como un doblete. La transferencia Western ilustrada en la Figura 14B contiene una dilución de 15 veces de las muestras analizadas en paralelo mediante SDS-PAGE. En la transferencia Western, la proteína se visualizó como un doblete, y la banda inferior parecía acumularse a lo largo del curso de la purificación. No obstante, la proteolisis parecía ser mínima. Este resultado sugirió que la proteína podría existir como especies heterogéneas a través de modificaciones potenciales de la cadena lateral, tales como la glicosilación, la modificación N-terminal o C-terminal. Los siguientes experimentos se realizaron para determinar el origen de la heterogeneidad.

B. Secuencia aminoterminal y composición de aminoácidos

Se resolvió la proteína 62-kDa mediante geles de SDS-poliacrilamida y se transfirió a membranas de PVDF (Biorad, Richmond, CA). Se determinaron la composición de aminoácidos y las secuencias amino terminales de la proteína.

El análisis de la composición de aminoácidos se realizó en un instrumento de intercambio iónico Modelo 6300 de Beckman (Fullerton, CA) a continuación de 16 horas de hidrólisis a 115ºC en 100 \mul de HCl 6 N, 0,02% de fenol, más 2 nmoles de norleucina. A continuación de la hidrólisis, las muestras se secaron en un Speedvac, y los aminoácidos resultantes se disolvieron en 100 \mul de tampón de muestras (Beckman, Fullerton, CA) que contenía 2 nmoles de homoserina, actuando la homoserina como un segundo estándar interno para monitorizar independientemente la transferencia de la muestra al analizador (Rosenfeld, et al., 1992). El instrumento se calibró con un mezcla de 2 nmoles de aminoácidos, y se operó de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El análisis de la composición de aminoácidos se usó para cuantificar exactamente las concentraciones de proteínas en las muestras.

La secuenciación amino-terminal se realizó en un 470A ó 477 de Applied Biosystem (Foster City, CA), el cual estaba equipado en línea con HPLC para la identificación de los derivados de aminoácidos con feniltiohidantoína (Pth) resultantes. Antes de la aplicación de la muestra, se motearon primero 25 pmoles de un péptido de 16 residuos, con la fórmula [norleucina-(succinil-lisina)_{4}]_{3}, como estándar de secuenciación interno sobre el filtro de secuenciación (Elliott, et al., 1993). Los instrumentos 470A y 477 se operaron en base a las recomendaciones del fabricante, y rutinariamente se usaron 3 pmoles de estándares de Pth. Todas las secuencias se buscaron a través del BLAST Network Service operado por el National Center for Biotechnology Information.

Los niveles de aminoácidos presentes en los cinco primeros ciclos fueron aproximadamente 10 veces inferiores a lo esperado, sugiriendo que la mayor parte de la proteína 62-kDa estaba bloqueada en el extremo N-terminal. La secuencia obtenida parecía ser idéntica a la de la forma procesada de la 62-kDa originalmente producida en las células Sf9 que expresaban el ORF-2 de longitud completa. Presumiblemente, una aminopeptidasa de metionina presente en las células Sf9 infectadas con baculovirus cortaban la metionina terminal introducida en la secuencia codificante de la proteína recombinante para asegurar la correcta iniciación de la traducción.

C. Análisis de péptidos trípticos

Se digirieron ciento dos pmoles de la proteína 62-kDa in situ con tripsina en una porción de gel de electroforesis cortado. También se digirieron y analizaron en controles paralelos una porción del gel de en blanco, y una porción de gel que contenía 50 pmoles de transferrina. Los péptidos resultantes se resolvieron mediante HPLC en fase invertida.

La digestión enzimática en el gel se realizó de acuerdo con Willimas y Stone (Williams y Stone, 1995), usando la perfusión con tripsina (Promega, Madison, WI) en una proporción aproximada de 1:5 (peso de enzima:peso de sustrato), y la digestión durante 24 horas a 37ºC. Los péptidos resultantes se redujeron/carboximetilaron, se extrajeron con 0,1% de TFA, 60% de CH_{3}CN, y se sometieron a continuación a hidrólisis/análisis de aminoácidos, de forma que pudieran determinarse la cantidad y densidad (\mug de proteína/mm^{3}), sirviendo ambos parámetros como criterios valiosos para juzgar la probabilidad de éxito de la digestión inminente. El análisis de la composición de aminoácidos se realizó como se ha descrito más arriba.

La HPLC en fase inversa se realizó en un sistema de HPLC Hewlett Packard 1090 (Palo Alto, CA) equipado con un Separador de Picos Moles 2150 de ISCO y una columna Vydac C-18 de 25 cm (5 micrómetros, 300 Angstroms) (Hesperin, CA) equilibrada con un 98% de tampón A (ácido trifluoroacético al 0,06%; TFA) y 2% de tampón B (TFA al 0,052%, 80% de acetonitrilo), tal como se describe en Williams y Stone (1995). Los péptidos se diluyeron a continuación con el siguiente programa de gradiente: 0-60 minutos (2-37% de tampón B), 60-90 minutos (37-75% de tampón B) y 90-105 minutos (75-98% de tampón B), y se detectaron por su absorbancia a 210 nm. La alícuotas de las digestiones en el rango 25-250 pmoles se fraccionaron en una columna de 2,1 mm de diámetro interno (ID) eluída a 0,15 ml/min. Las fracciones se recolectaron en tubos Eppendorf sin tapón.

De un total posible de 38 péptidos trípticos y de 143 picos potenciales detectados mediante análisis de HPLC en fase inversa de la proteína 62-kDa digerida, se seleccionaron 8 picos para espectroscopia de masas, pusto que el perfil de HPLC sugería que estos picos parecían contener sólo una de las especies principales.

D. Espectroscopia de masas con desorción por láser (LDMS)

Los picos 45, 50, 62, 65, 73, 82, 101 y 116 se evaluaron además mediante LDMS. La LDMS se usó para resolver varios asuntos:

(i): si el pico era un artefacto o era realmente un péptido. El análisis confirmó que ninguno de los picos era artifactual;

(ii): si el pico contenía más de un péptido? el análisis confirmó que, en algunos casos, los picos representaban mezclas de péptidos; y

(iii): si la masa calculada mediante la LDMS era comparable a la masa predicha, la cual se derivó ade la secuencia de aminoácidos predicha y codificada por el ARN viral. En todos los casos, la masa del péptido fue equivalente a la masa predicha, con excepción del pico 65, el cual parecía estar bloqueado.

También, este análisis permite la determinación fácil se cualesquiera modificaciones posteriores a la traducción.

Para realizar la LDMS, alícuotas de 3 \mul de péptidos aislados a través de HPLC de fase reversa se añadieron sobre 1 \mul de una solución de matriz ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinnámico (alfa-CHCA), la cual se moteó sobre una diana nueva. El mezclado de la matriz se consiguió aspirando y expulsando la muestra repetidamente del extremo de una micropipeta. Las muestras se dejaron entonces secar al aire a temperatura ambiente. Para evitar contaminación cruzada, todas las dianas se usaron sólo una vez. La solución de matriz de alfa-CHCA se preparó a una concentración de 10-20 mg/ml en 40% de CH_{3}CN/0,1% de TFA (ácido trifluoroacético), y se usó después de agitarla con formación de vórtice y dejarla reposar durante unos pocos minutos. Las soluciones de matriz se almacenaron durante un máximo de 2 días a -20ºC. Los calibres usados para la calibración externa de los péptidos fueron: gramicidina S (m/z = 1142,5) e insulina (m/z = 5734,5). Ambos calibres se almacenaron a -20ºC como preparaciones de reserva de 10 pmoles/\mul, bien en 50% de CH_{3}CN, 0,1% de TFA, o en 0,1% de TFA. La LDMS se realizó en un espectrómetro de masas VG/Fisons TofSpec (VG Organics, Manchester, R.U.) que se operó en el modo de ion lineal +ve con un voltaje de aceleración de 25 kV, y estaba equipado con un láser de nitrógeno (337 nm) y un tubo de vuelo lineal de 0,65 m.

Rutinariamente, se promediaron 30 disparos por cada espectro, con 3-6 adquiridos por cada muestra. Las masas predichas se basaban en la masa isotípica promedio, protonada de forma sencilla, y la exactitud esperada de la masa esperada era de \pm 0,25%.

La secuenciación atenuada posterior a la fuente se realizó en el modo "reflecton", con la escalera de secuenciación calibrada con una secuencia de 2 pmoles del fragmento de corte 18-39 de la hormona adrenocorticotrópica, ACTH.

Los picos 65, 73, 101 y 115 parecían ser apropiados para la secuenciación directa, puesto que los resultados de la LDMS indicaban la presencia de sólo una especie mayoritaria. Los picos 45, 50, 62 y 82 también se secuenciaron. Aunque los picos parecían ser mezclas que óptimamente requerirían la purificación de nuevo mediante HPLC antes de la secuenciación individual, se decidió secuenciar directamente estas mezclas en vista de la información de masa conocida y de la secuencia de aminoácidos predicha.

E. Análisis de las secuencias de los péptidos de la LDMS

El péptido 65 no rindió una secuencia interpretable. A partir de un examen adicional, la masa observada mediante LDMS fue consistente con los residuos N-terminales de la proteína 62-kDa, con la adición de un grupo acetilo N-terminal (1786,9 daltones predichos respecto 1785,5 daltones observados; correspondiente a un error del 0,03%). La evaluación de los datos de un péptido tríptico en base a la secuencia predicha de la proteína 62-kDa reveló que sólo otro péptido tenía un peso molecular parecido (residuos 408-423). El análisis de la atenuación posterior a la fuente reveló que el Pico 62 era el péptido tríptico amino-terminal predicho.

El análisis de la secuencia de los péptidos correspondientes a los Picos 45, 50, 62, 73, 82, 101 y 116 confirmó que la secuencia interna de la proteína 62K predicha estaba intacta. En resumen, el Pico 73 se emparejaba con los residuos 327-355 de la secuencia conocida. El Pico 101 se emparejaba con los residuos 123-139 de la secuencia conocida. El Pico 116 se emparejaba con los residuos 424-431 de la secuencia conocida. El Pico 45 se emparejaba con los residuos 412-423 de la secuencia del ORF-2, con una masa predicha de 1396,49 daltones. El Pico 50 se emparejaba con los residuos 334-348 de la secuencia del ORF-2. El Pico 62 contenía un péptido corto de 6 residuos, con una masa predicha de 749,84 daltones, el cual se emparejaba con los residuos 513-518 de la secuencia del ORF-2. El Pico 82 era una mezcla de tres péptidos que se emparejaban con los residuos 424-437 (secuencia principal), los residuos 438-466 (secuencia secundaria), y los residuos 555-578 (secuencia terciaria). Tomados conjuntamente, estos resultados indican que las secuencias internas del polipéptido de 62K predicho parecían estar intactas y ser colineales con la secuencia predicha.

F. LC-MS y análisis de la secuencia carboxi terminal

Con objeto de evaluar la naturaleza del doblete de la proteína 62-kDa observado mediante SDS-PAGE, la proteína 62-kDa se cromatografió en un columna capilar de fase inversa Vydac C18 (Hesperin, CA), evaluándose el pico eluido mediante espectrometría de masas por electrospray (ES-MS). La proteína 62-kDa purificada se cromatografió en un columna de fase inversa Vydac C18, fundida en forma de capilar, usando bombas de jeringa ABI Model 410 a una velocidad de flujo de 50 ml por minuto. La proteína se cromatografió en un sistema de solvente desde 0,1% de TFA en agua (v/v) hasta 0,1% de TFA en acetonitrilo. Se usó un separador de flujo en línea para desviar los picos a una velocidad de flujo de 10 ml por minuto hacia un espectrómetro de masas VG BioQ triple quadrupolar (VG Organics, Manchester, R.U.) operando en el modo de ionización por electrospray de iones positivos. La proteína 62-kDa se resolvió mediante ES-MS en dos picos principales, correspondientes a 56,1-kDa y
58,6-kDa.

La masa molecular predicha de la proteína 62-kDa usando la secuencia codificante desde el residuo 112 hasta el residuo 660 de la región ORF-2 es de 59,1 kDa. Estos datos sugieren que ocurría una supresión en la molécula, y que la supresión ocurría lo más probablemente en el extremo carboxi terminal. Mediante ambos, oxidación con peryodato y análisis con GC-MS, no se halló que la proteína estuviera glicosilada.

La determinación de la masa molecular mediante ES-MS es típicamente del 0,01% (Scoble, et al., 1993). Con la confirmación del extremo amino terminal, los datos de ES-MS sugieren que el extremo carboxi terminal podría estar cortado entre los residuos 551-552 y los residuos 536-537. Se realizó la secuenciación automatizada del extremo carboxi terminal usando 62-kDa intacta para confirmar el procesamiento carboxi terminal putativo.

Para el análisis automatizado de la secuencia C-terminal, se aplicaron muestras de proteína a membranas Zitex (Norton Performance Plastics, Wayne, NJ) tratadas previamente con isopropanol, y se insertaron en columnas inertes de Kel-F (Norton Performance Plastics, Wayne, NJ). La columna de secuenciación se instaló en un secuenciador G1009A de Hewlett Packard (Palo Alto, cA) para el acoplamiento químico y formación de anillo. La peptidiltiohidantoína acoplada y el producto en forma de anillo se cortaron entre el residuo aminoácido-tiohidantoína C-terminal y el péptido acortado usando una sal alcalina de trimetilsilanolato (KO-TMS). La muestra derivatizada se analizó usando una columna especial de HPLC analítica PTH de fase inversa (2,1 mm \times 25 cm) de Hewlett Packard.

Se empleó un gradiente binario de 39 minutos (Solvente A: tampones fosfato, pH 2,9; Solvente B: acetonitrilo) utilizando alquilsulfonato como agente de emparejamiento iónico. Se usaron estándares de tiohidantoína-aminoácido a 100 pmoles para estandarizar el análisis. El ciclo de secuenciación inicia dio origen a dos nuevos picos muy intensos correspondientes a glutamina y lisina, ninguna de las cuales está ubicada en el extremo carboxi terminal predicho de la proteína 62-kDa.

El segundo ciclo reveló un pico de leucina muy intenso (> 200 pmoles), indicando la presencia de más de una leucina en la mezcla de polipéptidos. El tercer ciclo fue algo ambiguo debido al creciente ruido de fondo. No obstante, la arginina estaba claramente presente en el tercer ciclo, junto con un residuo de uno de los dos, ácido glutámico o lisina. Los datos de secuenciación carboxílica apoyan la existencia de una proteína heterogénea,
truncada.

Ejemplo 10 La vacuna del antígeno del HEV de 62 kDa confiere protección total contra el HEV del tipo salvaje heterólogo en animales A. Valoración de la reserva para el desafío

Se ha descrito previamente que una suspensión al 10% de la deposición (Mex #14) procedente de una persona infectada durante una epidemia de HEV en Telixtac, México (Velazquez, et al., 1990) causa la hepatitis E en cinos infectados experimentalmente (Purdy, et al., 1993). Para la valoración de la reserva para el desafío, se inyectaron I.V. cuatro pares de cinos con diluciones de una suspensión al 10% de deposiciones México 14 preparadas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Cada grupo de dos recibió 1 ml de una de las diluciones a 10^{-2}, 10^{-5}, 10^{-6}
o 10^{-7}.

Los animales se monitorizaron en busca de evidencia de infección mediante: 1) niveles en suero de ALT y SICD, 2) desarrollo de anticuerpo contra el HEV, 3) restos de HEV en las heces, 4) detección de antígeno del HEV en el hígado, y 5) cambios histopatológicos (Tabla 5).

Los datos en la Tabla 5 demuestran la valoración del inóculo de HEV de México 14. El anti-HEV se ensayó mediante ELISA. El antígeno del HEV en el hígado se detectó mediante ensayo inmunofluorescente de especímenes de biopsia del hígado. La biopsias del hígado se examinaron bajo código en busca de cambios necroinflamatorios. Los niveles de ALT se ensayaron mediante procedimientos estándares (Purdy, et al., 1993).

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TABLA 5 Valoración del inóculo del HEV - cepa México

7

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TABLA 5 (continuación)

8

Semanalmente se ensayaron mediante ELISA la aminotransferasa de alanina (ALT) y los anticuerpos anti-HEV de los especímenes de suero. Ambos animales inoculados (cinos #9218, #9219) con una dilución 10^{-2} tenían ALT elevadas, y se habían seroconvertido para el anti-HEV dentro de las tres semanas posteriores a la infección. Sólo uno (50%) de los dos cinos incoculados con la dilución 10^{-5} tenía la ALT elevada. Este animal, cino #9220, se seroconvirtió el día 35 posterior a la infección. Mientras que ambos animales inoculados con la dilución 10^{-6} presentaban sólo elevaciones transitorias y mínimas de la ALT, estos monos (cinos #9213 y #9215), no obstante, si que se seroconviertieron en los días 35 y 49. No hubo incrementos de la ATl o seroconversión de anticuerpo en ninguno de los animales inoculados con la dilución 10^{-7}. Semanalmente, se evaluaron especímenes de biopsia del hígado histopatológicamente, y mediante análisis inmunofluorescente para detectar la presencia de antígeno del HEV. Los hallazgos de antígeno del HEV en el hígado y los cambios histopatológicos concordaron con la elevación de la ATL y se observaron sólo en los cinos #9218, 9219 y 9220. El ARN del HEV en deposiciones de cino se ensayó mediante RT-PCR.

La valoración de la reserva (CID_{50}) se definió como la concentración de HEV que se observó era infecciosa en el 50% de los cinos ensayados. El valor del CID_{50} del inóculo Mex #14 se estimó en 10^{-5}/ml en base a la evidencia bioquímica e histológica de hepatitis en uno de los dos cinos inoculados con una dilución al 10^{-5} de la suspensión al 10% p/v de deposición humana. Se usó una suspensión diluida para contener 1000 dosis de infección de cinomolgus (CID_{50}) para el desafío I.V. de los cinos vacunados y control.

B. Infección de animales de ensayo controles y vacunados 1. Inmunización y desafío de los animales

En el presente estudio se usaron catorce macacos cinomolgus (cinos). Ocho cinos se inyectaron I.V. con diluciones de una suspensión de deposiciones al 10% de la suspensión México 14 del HEV para la valoración de la preparación de reserva de desafío (ver más arriba). Seis cinos, tres vacunados y tres no vacunados, se usaron para ensayar la eficacia in vivo del antígeno r62K (Ejemplos 4 y 6B). Los monos se albergaron en la contención de riesgos biológicos BSL-2 del "Center for Disease Control and Prevention" (Atlanta, GA) durante la duración del estudio.

Los animales estuvieron en cuarentena durante seis semanas, y semanalmente se recolectaron especímenes de suero durante las seis semanas siguientes para establecer los volúmenes basales de la ALT y SICD. Antes de la inoculación del virus y de la vacunación, todos los sueros de cinos se ensayaron mediante ELISA (Ejemplos 1 y 8) en busca de la presencia de anticuerpos reactivos con las proteínas del ORF2 y ORF3 del HEV. Todos los animales fueron negativos para anticuerpos contra el HEV antes de la inoculación.

La r62K (purificada como se ha descrito más arriba, Ejemplos 4 y 6) se precipitó con alum siguiendo protocolos estándares. El complejo proteína-alum se almacenó a 4ºC antes de la inmunización. Tres monos cinomolgus (cinos #9338, 9339, 9340) sirvieron como animales control. Cada uno de los animales recibió inyecciones I.M. de alum el día 0 y el día 31. Tres monos cinomolgus (cinos #9327, 9330, 9331) se inmunizaron mediante inyección I.M. con 20 \mug de proteína r62K, precipitada con alum en 0,5 ml de tampón, el día 0 y el día 31.

La totalidad de los seis animales fueron desafiados con una dilución 10^{-2} de una suspensión al 10% de deposiciones humanas que contenían 1000 CID_{50} del HEV de México del tipo salvaje (Mex #14) el día 74, 6 semanas después de la inmunización final.

2. Recolección de especímenes

En el caso de los ocho animales usados para la valoración de la preparación de reserva de desafío de México 14, se tomaron muestras de sangre de 1,5 ml dos veces por semana. En el caso de los seis animales usados para la fase de vacunación del estudio, se tomaron muestras de sangre semanalmente. Las recogidas de sangre continuaron durante al menos 120 días. En cada espécimen se ensayó la alanina aminotransferasa (ALT), la deshidrogenasa de isocitrato en suero (SICD), y el anticuerpo IgG anti-HEV. Usando los valores pre-inoculación se estableció el valor basal y el límite de confianza del 99% para la actividad de la ATL y SICD para cada animal.

Semanalmente se recolectaron especímenes de biopsia con aguja de hígado. Los especímenes se dividieron para su histopatología e identificación de antígeno. Las biopsias se tomaron durante al menos 30 días después de que los enzimas volvieran a los niveles basales.

Los especímenes de deposiciones se recolectaron diariamente, durante al menos 90 días después del desafío, y se almacenaron a -70ºC hasta el análisis del contenido en ARN viral.

C. Evaluación de los especímenes recolectados 1. ELISA para el anti-HEV

El ELISA anti-HEV se modificó respecto un protocolo EIA previamente descrito (Ejemplo 8). Las proteínas usadas como antígenos para recubrir placas de ELISA de poliestireno incluían: la SG3 del ORF2 (Yarbough, et al., 1994), la 4-2M del ORF2 (Yarbough, et al., 1991), y la r62K del ORF2. Los sueros de ensayo se incubaron en pocillos recubiertos de antígeno, seguida por IgG anti-humana de cabra, específica para la cadena gamma, conjugada con HRP (Zymed, South San Francisco, CA). El valor de la proporción de señal a ruido (S/N) para cada espécimen posterior a la inoculación se calculó como la absorbancia a 490 nm dividida por la absorbancia a 490 nm de la preparación de sueros procedente del mismo animal. Los valores anti-HEV basales se establecieron para cada uno de los monos usando sus cinco especímenes de suero pre-inoculación semanales.

El valor de corte de la reactividad anti-HEV se definió como una OD_{490} de 0,200, la cual se correlaciona con un valor de S/N de 3,39, y es superior a 30 desviaciones estándares por encima de la media del valor de O.D. pre-inoculación. Los títulos de los anticuerpos se determinaron mediante dilución en serie a la mitad, calculándose los títulos de punto final como la mayor dilución de suero que una muestra diluida a la mitad que todavía rendía una O.D. de la menos OD_{490} = 0,200.

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se usó un procedimiento de transcriptasa inversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) (Kawasaki, et al.; Wang, et al., 1990) para ensayar el ARN de HEV en deposiciones de cinos. Los ensayos se realizaron usando cebadores específicos para el HEV derivados de secuencias del HEV publicadas (Tam, et al., 1991a, 1991b; McCaustland, et al., 1991).

3. Ensayo inmunofluorescente

Los ensayos inmunofluorescentes en busca de antígeno del virus de la hepatitis E en tejido de biopsias de hígado se realizaron de acuerdo con Krawczynski y Bradley (1989).

D. La hepatitis E en animales no inmunizados

La evidencia bioquímica e histológica de la hepatitis se observó en dos cinos (cinos #9218, 9219) inoculados con una dilución 10^{-2} de la preparación de reserva de desafío en el estudio de valoración. La elevaciones de la ALT se observaron a las dos a tres semanas posteriores a la inoculación. Los cambios necroinflamatorios coincidieron con evidencia bioquímica de lesión hepatocelular. El antígeno del HEV se detectó en los hígados de los monos a las dos o tres semanas después de la inoculación. Los restos del virus en las deposiciones se observaron mediante RT-PCR.

El día 20 pudo medirse el anticuerpo contra el ORF2 del HEV. Hacia el día 65 los niveles de ALT habían empezado a declinar, seguidos por la eliminación del virus y la conclusión de la enfermedad.

La evidencia bioquímica e histológica de la hepatitis se observó en tres animales control (cinos #9338, 9339, 9340) inoculados con una dilución 10^{-2} de la preparación de reserva de desafío en el estudio de la eficacia in vivo con la r62K (Tabla 6).

Los datos presentados en la Tabla 6 muestran el curso de la hepatitis E en cinos inmunizados y no inmunizados. Tres cinos se inmunizaron mediante inyección I.M. con 0,5 ml de 20 \mug de proteína r62K precipitada con alum, en los días 0 y 31. Seis cinos fueron desafiados con 1000 CID_{50} de HEV México del tipo salvaje (Mex #14) en el día 74. El anti-HEV se ensayó mediante ELISA. El antígeno del HEV en hígado se detectó mediante ensayo inmunofluorescente de especímenes de biopsia del hígado. La biopsias del hígado se examinaron bajo código para cambios necroinflamatorios. Los niveles de ALT se ensayaron mediante procedimientos estándares. El ARN de HEV se detectó mediante RT-PCR (Purdy, et al., 1993; Kawasaki, et al.; Wang, et al., 1990).

TABLA 6 Experimento de vacuna del HEV: desafío con HEV méxico

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Las elevaciones de la ALT en exceso de las proporciones 2,5 señal/valor de corte se presentaron en las semanas dos a tres después del desafío en cada uno de los monos control. Los cambios necroinflamatorios coincidieron con la evidencia bioquímica de lesión hepatocelular.

El antígeno del HEV se detectó en los hígados de los tres animales dentro de las dos semanas posteriores al desafío. La aparición de virus en las deposiciones se observó mediante RT-PCR tan pronto como una semana después del desafío en los tres animales control. La aparición de virus se mantuvo durante tanto como tres semanas. Los niveles de la ALT volvieron a los valores basales hacia el día 38 después del desafío para cada uno de los animales no vacunados. El anticuerpo contra el ORF2 del HEV pudo medirse durante las tres semanas posteriores al desafío con el tipo salvaje para cada uno de los animales control. Un animal, el cino #9340, también presentó una respuesta de anticuerpo contra el ORF3 coincidente.

De forma concomitante con la conclusión de la enfermedad, el anticuerpo contra el ORF2 del HEV presentó un pico hacia los días 36-41, y persistió durante al menos 12 semanas después del desafío. El anticuerpo contra el ORF2 tuvo una vida corta, y los niveles de anticuerpo declinaron hacia la semana 12 después del desafío. Un animal control, el cino #9340, murió entre las semanas 15-16 posteriores al desafío. La causa de la muerte estuvo esencialmente no relacionada con la infección por HEV. Los dos animales restantes, cinos #9338 y 9339, tenían el anticuerpo anti-HEV en disminución, pero todavía medible después de 21 semanas después del desafío.

E. Protección completa frente a la hepatitis E en cinos vacunados

Tres cinos (#9327, 9331 y 9330) se inmunizaron dos veces con dosis de 20 \mug de r62K de ORF2 precipitada con alum (Tabla 6). El anticuerpo contra el ORF2 se detectó inicialmente de 1-2 semanas después de la inmunización inicial. Se consiguió un título de anticuerpo anti-HEV, dirigido contra el ORF2, tan elevado como 1:2000 en todos los cinos inmunizados. Los títulos de anti-HEV continuaron creciendo después de la inmunización de impulsión en los cinos 9327 y 9331. El anti-HEV era medible todavía en el cino #9330, pero los niveles de anticuerpo habían caído durante el período de 6 semanas entre la impulsión final y el desafío con el tipo salvaje. Los cinos 9327 y 9331 tenían títulos estimados de 1:5000; el cino 9300 tenía un título inferior de 1:2500 (Tabla 7).

TABLA 7 Títulos inversos de anti-HEV en suero: animales vacunados

10

Después del desafío con 1000 CID_{50} del HEV del tipo salvaje heterólogo, los niveles medibles de anticuerpo dirigido contra el ORF2 fueron estables en los cinos 9327 y 9331. Sin embargo, en el cino 9330 hubo una respuesta anamnéstica aparente observada a las seis semanas después del desafío; los títulos de los puntos finales incrementaron aproximadamente en 10 veces, hasta 1:20.000 (Tabla 7). De forma concomitante con el incremento en anti-ORF2 del HEV, el cino 9330 mostró una respuesta de anticuerpo dirigida contra el ORF3.

Aunque los niveles de anticuerpo continuaron creciendo durante las cuatro semanas siguientes, esto fue seguido abruptamente por una disminución continuada en el anticuerpo contra el HEV. Hacia las 12 semanas después del desafío, los títulos de anti-HEV habían caído significativamente en el cino 9330; los títulos anti-HEV permanecieron constantes en los cino 9327 y 9331. Un animal vacunado, el cino #9331, murió entre las semanas 16-21 posteriores al desafío. La causa de la muerte estuvo esencialmente no relacionada con la infección por HEV. A las 21 semanas después del desafío, el cino #9327 mostró un anticuerpo dirigido contra el ORF2 que declinaba lentamente; los títulos del punto final habían variado sólo 2 veces. A las 21 semanas después del desafío, el #9330 no tenía un anticuerpo medible contra el ORF3, y el título del anticuerpo contra el ORF2 había caído más de 20 veces.

Para todos los animales vacunados, los niveles de ALT fueron prácticamente basales durante la duración del estudio. No hubo detección de antígeno en el hígado, no se observaron cambios necroinflamatorios algunos (Tabla 6). En dos de los cinos inmunizados, no se detector el virus en las heces mediante RT-PCR; en uno de los cinos inmunizados, la aparición de virus se retrasó y fue de corta duración. Puesto que no hubo evidencia bioquímica o histopatológica de lesión hepatocelular en ninguno de los tres animales inmunizados, la vacunación parece haber conferido protección frente a la enfermedad en la totalidad de los cinos inmunizados con la r62K.

F. Evidencia del avance de la infección de hepatitis E sin enfermedad

La aparición de anticuerpo dirigido contra el ORF3 del HEV en el cino #9330, a las seis semanas después del desafío, sugirió que el animal había sido infectado por el virus del desafío. Esta observación fue comprobada por la respuesta de anticuerpos amnéstica contra el ORF2. La emisión viral en las deposiciones del cino 9330 se detectó mediante RT-PCR, pero se retrasó en su aparición y fue de duración más corta en relación a la de los animales control (Tabla 6). En conjunto, estos resultados son consistentes con el progreso de la infección: replicación viral limitada y retrasada en ausencia de enfermedad.

La protección parcial frente a la infección en el cino 9330 podría explicarse por el hecho de que el animal tuviera niveles bajos de anti-HEV antes del desafío. Sin embargo, en ausencia de cambios necroinflamatorios o de evidencia bioquímica de hepatitis, parece ser que la lesión hepatocelular y la hepatitis fueron prevenidas mediante la inmunización.

Ejemplo 11 Infección por HEV in vitro y neutralización A. Cultivo celular y preparación del anticuerpo

Los sueros procedentes de cinos no vacunados y vacunados (descritos en el Ejemplo 10) se ensayaron en busca de anticuerpo neutralizante potencial usando ensayos de neutralización in vitro (ver más abajo). Las muestras de suero recogidas durante 5 semanas antes de la vacunación se combinaron para obtener una mezcla de sueros previos al sangrado. Las muestras de suero se recolectaron el día del desafío antes de la inoculación de los animales con el HEV.

Los sueros procedentes del grupo control de tres animales (cinos #9338, 9339, 9340) se juntaron antes de la purificación por afinidad de las inmunoglobulinas totales (Ig) mediante cromatografía en columna de Proteína G (Perspective Biosystems, Cambridge, MA). Los sueros procedentes de los animales #9327 y 9330 se purificaron individualmente en busca de Ig.

Las muestras de IgG purificadas se concentraron mediante centrifugación con Speedvac antes de su uso en el ensayo de neutralización in vitro. Se aproximaron cantidades equivalentes del anticuerpo reactivo contra el ORF2, procedentes de cada mezcla de 1 g, mediante normalización de acuerdo con el título de punto final de ELISA frente a la proteína SG3 del ORF2.

Se aislaron hepatocitos primarios normales de cino a partir de biopsias de porción de hígado. Los hepatocitos se sembraron a una densidad de 1 \times 10^{6} células por ml en cada pocillo de placas de 6 pocillos recubiertos de colágeno. El cultivo in vitro de los hepatocitos en una formulación de medio libre de suero (SFM), suplementada con factores de crecimiento y hormonas, fue tal como se ha descrito (Ejemplo 2). Las células del hígado sembradas se inocularon seis días después de su aislamiento, bien con un inóculo de HEV infeccioso conocido, o con una mezcla pre-incubada de anticuerpos de ensayo y reserva de virus.

El inóculo usado para el desafío con HEV de los hepatocitos fue bilis infecciosa obtenida del cino 11708. Este animal había sido infectado experimentalmente con una suspensión al 10% de deposiciones procedentes de una deposición de tercer pasaje, cino #73 (cepa Burma del HEV, Bradley, et al., 1987; Purdy, et al., 1993).

Las Ig procedentes de cada mezcla previa al sangrado y de cada mezcla de desafío se incubaron separadamente con el inóculo del virus, durante 1 hora a 37ºC, con agitación suave. Los cambios de medio completo se realizaron después de 24 horas y a intervalos de 48 horas. Los pocillos duplicados de los cultivos de hepatocitos se usaron para examinar la actividad neutralizante potencial de cada una de las preparaciones de anticuerpo a lo largo del experimento.

El ARN preparado a partir de medio y de células del cultivo celular se analizó en busca de la presencia de ARN del HEV, de las hebras positiva y negativa, mediante el uso de un ensayo de RT-PCR específico para la hebra.

B. Neutralización in vitro del virus de la hepatitis E mediante anticuerpos del suero procedentes de animales vacunados

Las IgG totales purificadas a partir de cinos no vacunados y vacunados se examinaron en busca de la presencia de anticuerpos potencialmente neutralizantes contra el HEV, tal como se acaba de describir. Los datos presentados en la Figura 15 muestran la neutralización in vitro del Virus de la Hepatitis E por parte de anticuerpos del suero procedentes de animales vacunados.

Los sueros del grupo control de los animales no vacunados se juntaron. El ARN preparado a partir del medio y células del cultivo celular recolectados el día 14 después de la infección se analizó en busca de la presencia de ARN del HEV de la hebra positiva y negativa mediante el uso de un ensayo de RT-PCR específico para las hebras.

Las IgG (antes del sangrado) obtenidas antes de la vacunación para todos los cinos fueron incapaces de bloquear la infección in vitro con HEV (Figura 15, "cinos pre-NV (no vacunados)", "pre-CY9327" y "pre-CY9330"), tal como se determinó mediante ensayo de PCR con la hebra positiva. El producto de la PCR observado se correlaciona con la cantidad de producto observado en controles con cultivos infectados que se realizaron en ausencia de cualesquiera IgG.

Las IgG juntas obtenidas de cinos no vacunados (9338, 9339, 9340) en el momento del desafío no bloqueaban la infección in vitro de los hepatocitos cultivados (Figura 15, "cinos NV desafiados"). Una vez más, los productos de la PCR observados se correlacionaban con la cantidad de producto observado en controles de cultivos control que se realizaron en ausencia de cualesquiera IgG.

Las IgG obtenidas en el momento del desafío de los dos cinos vacunados (cinos 9327, 9330) parecían tener una respuesta inmune neutralizante aumentada, capaz de bloquear completamente la infección por el virus in vitro (Figura 15, "desafío del CY9327" y "desafío del CY9330". Según la lectura obtenida de la RT-PCR de la hebra positiva, no hubo productos detectable, verificándose de ese modo la ausencia de ARN viral del HEV, y validándose la actividad neutralizante de estos anticuerpos de cino.

En la Figura 15, los carriles identificados con "N" no contenían muestra; se muestran dos carriles de control de hepatocitos, uno procedente de un cultivo celular "control no infectado", y el otro procedente de un cultivo celular "control infectado"; el carril denominado "pico" es un control positivo para mostrar la máxima señal posible que podía obtenerse a partir del propio inóculo; y los carriles "control de ARN" se usaron para la cuantificación y evaluación de las reacciones de RT-PCR -1 fg de ARN de la hebra positiva, 10 fg de ARN de la hebra positiva, y 100 fg de ARN de la hebra negativa.

Estas observaciones refuerzan la evidencia bioquímica e histopatológica de que los anticuerpos aumentaron, en respuesta a la vacunación con la preparación de antígeno 62K, para neutralizar los virus HEV y conferir protección frente a la infección y enfermedad subsiguiente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Genelabs Technologies, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): DIRECCIÓN: 505 Penobscot Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Redwood City

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F): (ZIP): 94063-4738

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTÍGENOS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E Y SUS USOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Dehlinger & Associates

\vskip0.500000\baselineskip

(B): DIRECCIÓN: P.O. Box 60850

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Palo Alto

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F): (ZIP): 94306-0850

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0,

\hskip5,1cm

Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Fabian, Gary R.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.875

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 4600-0293.41

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (415) 324-0880

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (415) 324-0960

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2049 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ORF-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2058 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ORF-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 2:

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1647 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma), Figura 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 3:

15

150

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1647 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa México), Figura 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 4:

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 984 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región SG3 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

18

180

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 984 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región SG3 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

19

190

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: 406.3-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: 406.3-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región del ORF-3 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región del ORF-3 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 99 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región 406.4-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 99 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región 406.4-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 660 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ORF-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 13:

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 660 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ORF-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 549 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma), Figura 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 15:

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 549 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa México), Figura 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 16:

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 327 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 327 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: 406.4-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asn Pro Pro Asp His Ser Ala Pro Leu Gly Vel Thr Arg Pro ser}

\sac{Ala Pro Pro Leu Pro His Val Val Asp leu Pro Gln Leu Gly Pro Arg}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: 406.4-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asn Gln Pro Gly His Leu Ala Pro Leu Gly Glu Ile Arg Pro Ser}

\sac{Ala Pro Pro Leu Pro Pro Val Ala Asp Leu Pro Gln Pro Gly Leu Arg}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ORF-3 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: ORF-3 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 22:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: 406.3-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr leu Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp Asp Phe Cys Pro}

\sac{Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe Gln Ser Thr Val}

\sac{Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys Thr Arg Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Región 406.3-2 del Virus de la Hepatitis E (cepa México)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trh Phe Asp Tyr Pro Gly Arg Ala His Thr Phe Asp Asp Phe Cys Pro}

\sac{Glu Cys Arg Ala Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe Gln Ser Thr val}

\sac{Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Val Lys Val Gly Lys Thr Arg Glu leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma), 58,1 kDa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa México), 58,1 kDa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 26:

39

40

41

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa Burma), 56,5 kDa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

44

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: r62kDa del Virus de la Hepatitis E (cepa México), 56,5 kDa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Cebador 5' del HEV

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGGGATC CATATGGCGG TCGCTCCGGC CCATGACACC CCG

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: Cebador 3' del HEV

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTAGAAGCT TCCGTGGCCA TTATATG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): AISLADO INDIVIDUAL: secuencia consistente internamente de dos antígenos 406.4-2 del HEV

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es Q o P"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es G o D"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es L o S"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es E o V"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es I o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es P o H"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es A o V"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 29

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es P o L"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 31

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es L o P"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asn Xaa Pro Xaa His Xaa Ala Pro Leu Gly Xaa Xaa Arg Pro Ser}

\sac{Ala Pro Pro Leu Pro Xaa Val Xaa Asp Leu Pro Gln Xaa Gly Xaa Arg}

\sac{Arg}

Claims

1. Composición de polipéptido del Virus de la Hepatitis E (HEV), que comprende al menos un polipéptido consistente en los 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta (ORF) 2 del HEV, con al menos un aminoácido suprimido del extremo carboxi terminal de los 549 aminoácidos.

2. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde al menos un polipéptido contiene una supresión carboxi terminal de hasta aproximadamente 24 aminoácidos carboxi terminales de dicho polipéptido de 549 aminoácidos del ORF2 del HEV.

3. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dichos 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta (ORF) 2 del HEV tiene la secuencia presentada como SEC. Nº ID.: 15 o SEC. Nº ID.: 16.

4. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dichos 549 aminoácidos carboxi terminales del marco de lectura abierta (ORF) 2 del HEV tiene la secuencia que es una variación consistente internamente entre la SEC. Nº ID.: 15 y la SEC. Nº ID.: 16.

5. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha composición contiene un polipéptido que tiene la secuencia presentada como SEC. Nº ID.: 25 o SEC. Nº ID.: 26.

6. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha composición contiene un polipéptido que tiene una secuencia que es una variación consistente internamente entre la SEC. Nº ID.: 25 y la SEC. Nº ID.: 26.

7. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha composición contiene un polipéptido que tiene la secuencia presentada como SEC. Nº ID.: 27 o SEC. Nº ID.: 28.

8. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha composición contiene un polipéptido que tiene una secuencia que es una variación consistente internamente entre la SEC. Nº ID.: 27 y la SEC. Nº ID.: 28.

9. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha composición contiene dos polipéptidos que tienen las secuencias presentadas como SEC. Nº ID.: 25 y SEC. Nº ID.: 27 o SEC. Nº ID.: 26 y SEC. Nº ID.: 28.

10. Composición de polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicha composición contiene dos polipéptidos que tienen secuencias que son variaciones consistentes internamente entre la SEC. Nº ID.: 25 y la SEC. Nº ID.: 26, y entre la SEC. Nº ID.: 27 y la SEC. Nº ID.: 28.

11. Secuencia de ácido nucleico sustancialmente aislada que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. Vector de expresión para producir una composición de antígeno polipeptídico del Virus de la Hepatitis E, que comprende,

: una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, insertándose dicha secuencia de ácido nucleico en un vector de expresión, en donde dicha secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula hospedadora seleccionada.

13. Sistema de expresión para producir una composición de antígeno polipeptídico del Virus de la Hepatitis E, que comprende,

: una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, insertándose dicha secuencia de ácido nucleico en un vector de expresión, en donde dicha secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula hospedadora seleccionada, y

: dicho vector de expresión se halla dentro de la célula hospedadora.

14. Sistema de expresión de la reivindicación 13, en donde dicho vector de expresión es un vector de expresión baculovirus y dicha célula hospedadora es una célula de insecto.

15. Composición de polipéptido del Virus de la Hepatitis E (HEV) producido mediante un proceso que comprende,

: cultivar una célula de insecto, que contiene un vector de expresión de la reivindicación 12, en condiciones suficientes para expresar un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

16. Composición de la reivindicación 15, en donde al menos un polipéptido de la composición tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en la SEC. Nº ID.: 15, la SEC. Nº ID.: 16, la SEC. Nº ID.: 25, la SEC. Nº ID.: 26, la SEC. Nº ID.: 27, la SEC. Nº ID.: 28, y secuencias homólogas de las mismas.

17. Procedimiento para producir una composición de polipéptido del Virus de la Hepatitis E (HEV), que comprende las etapas de:

: cultivar una célula, que contiene el vector de expresión de la reivindicación 12, en condiciones suficientes para expresar una secuencia polipeptídica codificada por dicho ácido nucleico.

18. Procedimiento in vitro para detectar la infección por Virus de la Hepatitis E en un individuo, que comprende:

a): hacer reaccionar una muestra de suero obtenible del individuo con la composición del polipéptido del Virus de la Hepatitis E (HEV) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y

b): examinar un polipéptido de la composición en busca de la presencia de anticuerpo unido.

19. Procedimiento de la reivindicación 18, en donde los polipéptidos de la composición de polipéptido del HEV están unidos sobre un soporte sólido, dicha reacción incluye poner en contacto tal suero con el soporte, y dicho examen incluye hacer reaccionar el soporte y anticuerpo unido con un anticuerpo anti-humano marcado informador.

20. Equipo para indagar la presencia de anticuerpos contra el HEV en una muestra de suero obtenida de un individuo, que comprende:

: un soporte sólido con antígenos unidos sobre su superficie, en donde los antígenos unidos sobre la superficie son polipéptidos de la composición de polipéptido del HEV de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

21. Composición de vacuna para su utilización en la inmunización de un individuo contra el Virus de la Hepatitis E (HEV) que comprende,

: una composición de polipéptido del HEV de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en un portador farmacológicamente aceptable.

22. Composición de vacuna de la reivindicación 21, en donde al menos un polipéptido de la composición tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en la SEC. Nº ID.: 15, la SEC. Nº ID.: 16, la SEC. Nº ID.: 25, la SEC. Nº ID.: 26, la SEC. Nº ID.: 27, la SEC. Nº ID.: 28, y secuencias homólogas de las mismas.

23. Utilización de una composición de polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, reivindicación 15 o reivindicación 16, en la preparación de una composición de vacuna destnada a la inmunización de un individuo contra el HEV.