ES2928061T3 - Vacuna contra el VHE - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una vacuna que comprende la proteína Open Reading Frame 2 (ORF2) del virus de la hepatitis E porcina (HEV) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para usar en la protección de lechones positivos para MDA anti-HEV contra la excreción fecal del HEV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna contra el VHE

[0001] La presente invención se refiere a una vacuna que comprende la proteína de marco de lectura abierta 2 (ORF2, por sus siglas en inglés) del virus de la hepatitis E (VHE) porcino y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en la protección de lechones positivos en MDA contra la excreción del VHE porcino.

[0002] En la última década se ha observado un fuerte aumento de infección por hepatitis E en humanos en todo el mundo. Actualmente, se producen alrededor de 20 millones de infecciones por VHE al año, más de tres millones de casos graves de hepatitis y 57000 muertes relacionadas con el VHE.

[0003] El virus de la hepatitis E, agente causante de la hepatitis E pertenece al género Hepevirus, el único miembro de la Hepeviridae. Se trata de un virus sin envoltura con un diámetro de alrededor de 27-34 nm. El genoma, un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo, presenta una longitud de alrededor de 7,2 kb.

[0004] El genoma comprende tres marcos de lectura abierta (ORF) diferentes; ORF1, que codifica una proteína no estructural, ORF2, que codifica el polipéptido de la cápside vírica y ORF3, que codifica una pequeña fosfoproteína asociada al citoesqueleto.

[0005] Sólo existe un único serotipo. Sin embargo, dado el alto nivel de diversidad genómica entre los distintos aislados, se hace una subdivisión en cuatro genotipos principales (genotipos 1-4).

[0006] El VHE es la causa principal de hepatitis no A, no B en los humanos. Los principales brotes se observan en los países en vías de desarrollo, especialmente en zonas tropicales y subtropicales. En los países industrializados, las infecciones por VHE se observan en regiones en las que el VHE no es endémico, incluso en los casos en que los pacientes podrían no estar vinculados con individuos infectados por VHE.

[0007] La infección por el genotipo 1 y 2 del VHE se observa con más frecuencia en individuos de entre 15 y 35 años de edad. La infección por el genotipo 3 y 4 del VHE se observa con más frecuencia en humanos con inmunidad comprometida o inmunodeprimidos, así como en receptores de trasplantes de órganos. Parece que la mayoría de infecciones 3 y 4 del VHE en personas sanas son subclínicas. (Ling Lu et al., Rev. Med. Virol. 16: 5-36 (2006)).

[0008] Hace ya muchos años que se están desarrollando vacunas contra la infección por el VHE en humanos. En la mayoría de los casos, dichas vacunas se basan en la proteína ORF2 del VHE o en fragmentos de la misma, expresada en, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus y sistemas de expresión bacterianos. Se ha informado de que estas vacunas tienen éxito. (Kamili, S., Virus Research 161: 93-100 (2011), Amini-Bavil-Olyaee, S. et al., Future Virol. 4: 143-154 (2009), Feng-Cai Zhu et al., The Lancet, publicado en línea el 23 de agosto de 2010 DOI:10.1016/S0140-6736(10)61030-6). Saleem K et al., Virus Research, 161: 93-100 (2011), da a conocer vacunas para el VHE elaboradas mediante la expresión de fragmentos de ORF2 del VHE en vectores de baculovirus. Una de las vacunas expuestas es la proteína r62-kDa, que corresponde a los aminoácidos 112-660 del ORF2 del VHE. Dicha vacuna protegió contra la infección por VHE tras una provocación viral heteróloga en macacos cynomolgus, redujo los títulos contra el VHE y retrasó la excreción fecal del VHE, que se produjo tras la provocación.

[0009] Ahora se acepta comúnmente que existe una relación zoonótica entre (al menos) el genotipo 3 y 4 del VHE porcino y la enfermedad humana.

[0010] Especialmente los cerdos son un reservorio principal de los genotipos 3 y 4 del VHE. (Pavio, N. et al., Curr. Opin. En Virology 10: 34-41 (2015), Purcell, R.H. y Emerson, S.U., J. Inf. Dis. 202: 819-821 (2010), Meng, X.J. et al., P.N.A.S.

94: 9860-9865 (1997), WU, J.C. et al., J. Med. Virol. 60: 166-171 (2000), Matsuda, H. et al., J. Inf. Dis. 188, 944 (2003), Matsubayashi, K. et al., Transfusion 48: 1368-1375 (2008), Mishiro, S., Uirusu 54: 243-248 (2004), Dalton, H.R. et al., Lancet Inf. Dis. 8: 698-709 (2008)).

[0011] La infección de humanos con el genotipo 3 y 4 del VHE se produce en la mayoría de los casos por alimentos contaminados (por ejemplo, carne de cerdo poco cocinada o cruda), por la exposición directa a cerdos y heces porcinas o por la contaminación ambiental.

[0012] Dada esta clara ilustración del carácter zoonótico del VHE, parecería útil vacunar a los cerdos (además de a los humanos, o incluso en lugar de los humanos) contra el VHE porcino, para evitar que el VHE porcino sea una fuente de infección humana.

[0013] Existen unas pocas solicitudes de patentes relacionadas con la proteína ORF2 del virus de la hepatitis E porcino y su uso en la detección del virus y como vacuna. La solicitud de patente PCT WO 02/089733 y la solicitud de patente europea EP1000168 tienen como objetivo básicamente vacunar a los humanos contra el VHE porcino utilizando el virus del VHE completo o vacunas de subunidad basadas en el VHE porcino. EP1000168 propone utilizar el VHE porcino como un virus vivo atenuado para la vacunación de humanos. La vacunación de cerdos se propone principalmente como medio para obtener anticuerpos del VHE antiporcinos para fines de diagnóstico, es decir, para comprobar si los órganos de cerdo para su uso en xenotrasplantes no tienen el VHE. Se divulga cómo, para obtener anticuerpos del VHE antiporcinos, se infectan lechones de dos semanas de vida sin gérmenes patógenos específicos con el VHE porcino para aumentar los anticuerpos contra esa infección. Dichos lechones no tienen i.a. anticuerpos contra el VHE procedentes de la madre.

[0014] No obstante, estas solicitudes de patente no presentan ningún ejemplo de vacunación porcina, y mucho menos abordan la edad del animal que se ha de vacunar.

[0015] En general, puede parecer tentador vacunar animales contra una enfermedad lo antes posible tras su nacimiento. En la práctica, sin embargo, y especialmente en el caso del VHE, los expertos en la materia no considerarían este enfoque como adecuado.

[0016] La razón es la siguiente: la prevalencia de anticuerpos contra el VHE en los cerdos es extremadamente alta. En todo el mundo, se calcula que la prevalencia media global es del 50 % (Vasickova, P, et al., Veterinarni Medicina 52: 365­ 384 (2007)), pero puede ser considerablemente superior en muchos países. Por ejemplo, en 2013, la prevalencia de anticuerpos contra el VHE en cerdos en el Reino Unido fue del 92,8 % (Grierson, S., et al, CDC EID Journal 21 número 8, agosto de 2005). Por lo tanto, puede llegarse a la conclusión de que la mayoría de explotaciones de ganado porcino están infectadas con VHE, por mucho, y que la presión de infección es muy alta.

[0017] Por consiguiente, por diferencia, la mayoría de los cerdos habrán sufrido una infección por VHE y habrán desarrollado anticuerpos contra el VHE en el momento de su primera gestación. A su vez, esto significa que, por mucho, la mayoría de los lechones nacidos tendrán anticuerpos procedentes de la madre (MDA, por sus siglas en inglés) contra el VHE, es decir, la mayoría de los lechones nacidos son positivos en MDA contra el VHE. Estos anticuerpos procedentes de la madre protegerán a los lechones durante los primeros meses de vida. Más adelante, los MDA desaparecerán lentamente, por lo que, debido a la elevada presión de infección, en un determinado momento los lechones son susceptibles y, por consiguiente, sufrirán una infección por VHE y, en consecuencia, pueden empezar a excretar el virus del VHE en el ambiente antes de desarrollar su propia defensa contra el VHE, i.a. en forma de anticuerpos contra el VHE.

[0018] En consecuencia, la presión de infección por VHE en las explotaciones de ganado porcino seguirá siendo alta.

[0019] En el sector del ganado porcino, a los lechones se les desteta entre las 3 y las 4 semanas tras el nacimiento. Esto significa que presentan títulos de MDA muy altos a las tres o cuatro semanas de edad. Más adelante, se observa una descomposición lenta del título de MDA.

[0020] En promedio, si el destete se hace a las 3 semanas del nacimiento, normalmente como pronto después de alrededor de 7 a 13 semanas, se observa un aumento en el número lechones que se infectan de ^v H^e y desarrollan su propia reacción inmunitaria contra dicha infección por VHE. Frecuentemente, se necesitan entre 10 y 25 semanas antes de que el MDA de los lechones disminuya hasta un nivel que no impida la infección por VHE en el 90 % de los animales (véase la sección de ejemplo ej. 3 y i.a. Andraud, M. et al., PLOS one 9: e105527 (2014)). Antes de este periodo de 10­ 25 semanas, los MDA protegen a un determinado porcentaje de los animales contra infecciones, ya que los MDA se unen al virus y lo eliminan antes de que pueda infectar a las células y estimular el sistema inmunitario.

[0021] En consecuencia, los expertos en la materia asumirán que la vacunación de una piara de lechones antes de las 10-25 semanas no tendría, en un alto porcentaje de los lechones, ningún efecto por el sencillo motivo de que muchos de los lechones de la piara todavía tendrían títulos de MDA suficientemente altos para interferir con los componentes inmunogénicos de una vacuna contra el VHE antes de que pudiera estimular el sistema inmunitario. La inhibición de la vacunación por parte de los MDA es un fenómeno común, tanto para las vacunas para los seres humanos como para las vacunas veterinarias (Stefan Niewiesk en Frontiers in Immunology, artículo revisado, 16 de septiembre de 2014; doi:10.3389/fimmu.2014.00446). Por lo tanto, la vacunación en este periodo no se consideraría útil para estos lechones. No obstante, por otro lado, los lechones de la piara que ya tienen un nivel de MDA menor son susceptibles de infectarse de VHE y, por lo tanto, deberían ser vacunados.

[0022] Es prácticamente/económicamente imposible determinar el nivel de MDA en cada lechón a diario y decidir cada día qué lechones deben ser vacunados.

[0023] Esta larga pero variable vida de los MDA contra el VHE es un fenómeno bien conocido, y desde el punto de vista de la vacunación es un problema bien conocido. Este problema no sólo existe en relación con los MDA contra el VHE, sino que es un problema para la vacunación a una edad temprana en general. (Andraud, M. (vide supra), Niewiesk, S., Frontiers in Immunology 5, artículo 446 (2014), Pastoret, P.P., Journal of Comparative Pathology volumen 137, suplemento 1, páginas S2-S3 (2007)).

[0024] Andraud, M. (vide supra) describe la cuestión de los MDA y el problema de la manera siguiente: «Aunque la vacunación podría superar este problema (riesgo de infección durante la disminución de los MDA) diversos estudios pusieron de manifiesto efectos antagonistas entre la inmunidad producida por la vacuna y los anticuerpos procedentes de la madre a través de la inhibición de la protección de la vacuna, lo que podría empeorar potencialmente la dinámica de la infección». Niewiesk, S., (vide supra) incluso describe para 11 vacunas para seres humanos diferentes y 17 vacunas veterinarias diferentes que son inhibidas por los anticuerpos procedentes de la madre.

[0025] Un objetivo de la presente invención consiste en superar el problema de la presencia de MDA cuando se vacuna a los lechones contra el VHE.

[0026] Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que una vacuna que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un fragmento de la proteína ORF2 del VHE que abarca al menos la región del aminoácido 125 al 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al 660, es capaz de romper la inmunidad materna y estimular el sistema inmunitario de los lechones positivos en MDA contra el VHE, en particular, los lechones positivos en MDA contra el VHE antes de las 10 semanas de edad.

[0027] En la figura 3, se hace una comparación entre la respuesta inmunitaria contra el VHE en lechones de 3 semanas de edad positivos en MDA (fig. 3C) y en lechones de 10 semanas de edad negativos en MDA (fig. 3D), medida a las cuatro semanas de la vacunación con un fragmento ORF2 del VHE según la invención.

[0028] Como se deduce de la figura, sorprendentemente el título contra el VHE inducido en los lechones positivos en MDA a las cuatro semanas de la vacunación es estadísticamente similar al título contra el VHE en los lechones negativos en MDA a las cuatro semanas de la vacunación.

[0029] Incluso a las 9 semanas de la vacunación, el título contra el VHE en lechones positivos en MDA es sólo ligeramente inferior al título contra el VHE en lechones negativos en MDA (figura 3E, 3F).

[0030] La proteína codificada por el ORF2 del VHE es la proteína de la cápside del VHE de 72 kDa. Una comparación entre 11 secuencias diferentes del ORF2 del VHE muestra que, aunque la identidad de secuencia no es en todos los casos del 100 %, la longitud de las diferentes secuencias del ORF2 es prácticamente idéntica en todos los casos. (Meng, X-J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 94: 9860-9865 (1997).

[0031] El ORF2 del VHE comienza en el nucleótido (nt) 5147, se extiende 1980 bases antes de terminar en el nt 7127, y codifica la principal proteína estructural de 660 aminoácidos (88 kDa) que se expresa tanto intracelularmente como en la superficie celular. Se sintetiza como precursor y se procesa a través de la escisión de la secuencia señal en la proteína madura, que es capaz de autoasociarse y glicosilarse. La expresión de la secuencia codificadora de ORF2 en células de insecto Sf9 mediante el sistema de baculovirus da lugar a productos de proteína estables con masas moleculares estimadas de 72 kDa y 59-62 kDa. Las proteínas de longitud completa de las células de insecto son insolubles, mientras que las proteínas truncadas que comprenden aminoácidos entre la posición 112-607 y la posición 112-660 se agrupan en partículas similares a los virus.

[0032] Se sabe que el requisito mínimo para la formación de partículas similares a los virus (VLP, por sus siglas en inglés) es la presencia de los aminoácidos de la posición 125 a la 601. (Surjit, M. et al. Journ. Virol, 78: 320-328 (2004), Li, T-C. et al., Journ. Virol. 79, 12999-13006 (2005)). Sin embargo, el dominio neutralizador mínimo del ORF2 del ^v H^e se ha mapeado en los residuos de aminoácidos 458-607 (Zhou, Y.H. et al., Vaccine 22: 2578-2585 (2004), Ahmad, I. et al., Virus Res. 161: 47-58 (201)).

[0033] Por este motivo, una vacuna según la invención debería comprender al menos un fragmento de proteína ORF2 del VHE que incluye los residuos de aminoácidos C-terminales de la posición 458-607.

[0034] Al mismo tiempo, dicho fragmento de proteína ORF2 del VHE debería comprender los residuos de aminoácidos N-terminales de la posición 125-457 para poder formar VLP.

[0035] Por consiguiente, el fragmento ORF2 del VHE en una vacuna para su uso de acuerdo con la invención debería comprender al menos residuos de aminoácidos desde la posición 125-607. No obstante, al mismo tiempo el fragmento ORF2 del VHE debería no comprender aminoácidos adicionales N-terminales de la región entre 1 y 111, puesto que dichos fragmentos de proteína serían menos solubles, especialmente cuando se hacen en un sistema de expresión de células de insecto.

[0036] Por lo tanto, preferiblemente el tamaño mínimo de ese fragmento comprende residuos de aminoácidos desde la posición 112-607, mientras que al mismo tiempo el tamaño máximo de ese fragmento comprende residuos de aminoácidos desde la posición 112-660.

[0037] Un ejemplo de la región entre el aminoácido 112 y 607 de una secuencia de proteína ORF2 del VHE se presenta en la figura 5 (SEQ ID NO: 1).

[0038] El término «cantidad inmunogénicamente eficaz», tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la cantidad de fragmento de proteína ORF2 del VHE necesaria para inducir una respuesta inmunitaria en los lechones en la medida en que disminuye los efectos provocados por la infección con un VHE de tipo salvaje, en comparación con los efectos provocados por la infección con un VHE de tipo salvaje en lechones no inmunizados.

[0039] Hay que tener en cuenta que el objetivo principal de la vacunación de los lechones jóvenes contra el VHE no es tanto la protección de los lechones contra los síntomas clínicos, sino la reducción de la cantidad de virus excretado por los lechones infectados. Esto se debe a que, por un lado, los signos clínicos en los lechones infectados por el VHE son entre moderados y ausentes y, por otro, el objetivo final es proteger a los humanos de la infección por el VHE a través del contacto con las heces de los cerdos infectados (es decir, los ganaderos) o la carne de cerdo infectada. Por lo tanto, el objetivo básico de la vacunación de los lechones es disminuir la presión de infección en las explotaciones de ganado porcino. Por este motivo, está claro para el experto en la materia que, básicamente, «una cantidad inmunogénicamente eficaz», tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad de fragmento de proteína ORF2 del VHE necesaria para inducir una respuesta inmunitaria en los lechones para protegerlos contra la infección sistémica. Esta protección contra la infección sistémica, a su vez, disminuye la cantidad de virus excretado por los lechones vacunados después de sufrir una infección por VHE, en comparación con la cantidad de virus excretado por los lechones no vacunados después de sufrir una infección por VHE.

[0040] El experto en la materia puede determinar fácilmente si un tratamiento es inmunológicamente eficaz (es decir, si se administra una cantidad de vacuna inmunogénicamente eficaz), por ejemplo, administrando una infección experimental de provocación tanto a los animales vacunados como a los no vacunados y, a continuación, determinando los parámetros serológicos del animal objetivo y midiendo la cantidad de virus excretado, por ejemplo, tomando hisopos rectales, seguido de la comparación de estos resultados en los dos grupos de provocación.

[0041] La cantidad de fragmento de proteína ORF2 administrada dependerá de la vía de administración, la presencia de un adyuvante, el número de vacunas y el momento de la administración.

[0042] Simplemente como ejemplo; dependiendo del adyuvante utilizado, una cantidad de aproximadamente 5 microgramos de proteína ORF2 del VHE/dosis administrada como una única vacunación intramuscular es muy capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora en lechones de tres semanas de edad que tienen un título elevado de MDA contra el VHE.

[0043] Preferiblemente, una vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención se caracteriza por que dicha vacuna comprende al menos 10 microgramos/dosis de dicho fragmento de proteína.

[0044] Más preferiblemente, una vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención comprende al menos 20 microgramos/dosis de dicho fragmento de proteína.

[0045] Preferiblemente, se administra una cantidad de aproximadamente 15 microgramos de proteína ORF2 del VHE/dosis, más preferiblemente incluso 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o incluso 100 microgramos/dosis, en ese orden de preferencia. Cantidades de más de 100 microgramos/dosis, aunque son factibles, no añadirían mucho al nivel de protección, ni serían atractivas desde el punto de vista de los costes.

[0046] A efectos de la presente invención, una vacunación única es una vacunación que tiene lugar una sola vez (en contraposición a un régimen de vacunación de refuerzo).

[0047] A los efectos de la presente invención, los lechones positivos en MDA son lechones que tienen un título de anticuerpos MDA que tiene una densidad óptica igual o superior a OD(⁴⁵⁰ nm) 0,25 cuando se mide según el método ELISA descrito en el ejemplo 4.

[0048] Por lo tanto, una primera realización de la presente invención se refiere a vacunas que comprenden una cantidad inmunogénicamente eficaz de un fragmento de proteína del marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E (ORF2 del VHE) que abarca al menos la región del aminoácido 125 al aminoácido 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al aminoácido 660, y un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en la protección de lechones positivos en MDA contra la excreción del VHE.

[0049] La vacuna de acuerdo con la invención ya puede utilizarse con éxito en lechones de 2-4 semanas de edad. Esto es ventajoso desde un punto de vista económico y de bienestar animal, ya que a esta edad los lechones suelen ser vacunados con una vacuna contra otras enfermedades porcinas. Por lo tanto, las vacunas pueden administrarse en el mismo momento o alrededor de él.

[0050] En la técnica, son bien conocidos ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables que son adecuados para su uso en una vacuna según la invención y comprenden, por ejemplo, agua estéril, solución salina, tampones acuosos como PBS y similares.

[0051] Además, una vacuna para uso según la invención puede comprender otros aditivos como adyuvantes, estabilizadores, antioxidantes y otros, como se describe a continuación.

[0052] En la figura 3, se muestra que una única vacunación con una composición según la invención ya proporciona una buena protección contra el VHE en los lechones, especialmente contra la excreción del virus de la progenie, por lo que en principio no se requiere una vacunación de refuerzo (véase también el ejemplo 7, tablas A y B).

[0053] Sin embargo, lo que es aún más sorprendente es que si el grupo vacunado con lechones positivos en MDA y el grupo vacunado con lechones negativos en MDA reciben una segunda vacunación (una vacunación de refuerzo) varias semanas después de una primera vacunación, el título en ambos grupos es aún más alto y se nivela prácticamente al mismo título en ambos grupos. Esto demuestra que cuando los lechones son cebados y reforzados con fragmentos de la proteína ORF2 del VHE como se describe en la invención, están aún mejor protegidos contra la excreción del VHE.

[0054] Por lo tanto, para obtener un nivel de protección aún mayor y más duradero, se puede administrar una dosis de refuerzo. En principio, dicha vacuna de refuerzo sería más eficaz si se administrara entre 3 y 15 semanas, preferiblemente entre 3 y 10 semanas después de la primera vacunación. Más preferiblemente, una dosis de refuerzo se administraría unas cinco semanas después de la primera vacunación.

[0055] Una vacuna de refuerzo también comprendería una cantidad de al menos 10 microgramos de proteína ORF2 del VHE/dosis. Preferiblemente, se administra una cantidad de unos 15 microgramos de proteína ORF2 del VHE/dosis, más preferiblemente incluso 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o incluso 100 microgramos/dosis, en ese orden de preferencia.

[0056] Por lo tanto, otra realización se refiere a vacunas que comprenden al menos 10 microgramos/dosis de un fragmento de proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E (ORF2 del VHE) que abarca al menos la región del aminoácido 125 al aminoácido 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al aminoácido 660, y un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso como vacuna de refuerzo para la protección de los lechones positivos en MDA que han sido vacunados con una vacuna primaria contra la excreción del VHE no más de 15 semanas antes de ser vacunados con la vacuna de refuerzo.

[0057] En una forma más preferida de esta realización, la vacuna primaria es una vacuna que comprende al menos 10 microgramos/dosis de un fragmento de la proteína ORF-2 del VHE que abarca al menos la región del aminoácido 125 al aminoácido 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al aminoácido 660, y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0058] Los fragmentos de la proteína ORF2 del VHE descritos en la invención pueden obtenerse fácilmente mediante la expresión de un fragmento de ADN que codifica estos fragmentos. Los sistemas de expresión adecuados conocidos en la técnica son, por ejemplo, sistemas de expresión bacterianos, basados en baculovirus, basados en levadura y basados en células eucariotas. Dichos sistemas de expresión están ampliamente descritos en la técnica y están disponibles comercialmente. Kamili (vide supra) se refiere, por ejemplo, a ejemplos de expresión del ORF2 del VHE tanto en sistemas de expresión bacterianos y basados en baculovirus.

[0059] Los sistemas de expresión bacterianos y basados en baculovirus serían los sistemas preferidos en vista de su facilidad de uso y su rendimiento relativamente grande. De estos dos, el sistema de expresión basado en baculovirus sería ligeramente más preferido.

[0060] La sección de ejemplos proporciona ejemplos de la expresión de fragmentos de la proteína ORF2 del VHE que abarcan al menos la región del aminoácido 112 al aminoácido 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al aminoácido 660 en un sistema de expresión basado en baculovirus.

[0061] Una vacuna para su uso según la invención comprende, preferiblemente, un adyuvante. Los adyuvantes convencionales, bien conocidos en la técnica para su uso en vacunas para cerdos son, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund, la vitamina E, los polímeros en bloque no iónicos, los dipéptidos de muramil, Quill A(R), el aceite mineral, por ejemplo, Bayol(R) o Markol(R), el aceite vegetal, y Carbopol(R) (un homopolímero), o Diluvac(R) Forte.

[0062] Preferiblemente, una vacuna para su uso según la presente invención comprende un adyuvante de agua en aceite o de aceite en agua. De entre estos, los adyuvantes de aceite en agua son ligeramente preferidos. El componente de aceite de los adyuvantes de agua en aceite y de aceite en agua puede ser un aceite mineral. No obstante, actualmente existe una tendencia a sustituir los aceites minerales por aceites biodegradables, como el escualano, el escualeno y el tocoferol.

[0063] Por consiguiente, una vacuna para su uso según la invención comprende, más preferiblemente, un adyuvante de aceite en agua.

[0064] La vacuna puede comprender también un «vehículo». Un vehículo es un compuesto al que se adhiere el polipéptido, sin estar unido de forma covalente al mismo. Algunos compuestos de vehículo utilizados son, por ejemplo, el hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, el sílice, el caolín y la bentonita.

[0065] En la práctica de las explotaciones de ganado porcino, los cerdos se vacunan contra una serie de virus o microorganismos patógenos.

[0066] Por lo tanto, es muy atractivo, tanto por razones prácticas como económicas, combinar una vacuna según la invención para cerdos con, por ejemplo, un inmunógeno adicional de un virus o microorganismo patógeno para los cerdos, o material genético (ARN/ADN) que codifica un inmunógeno de dicho virus o microorganismo.

[0067] Por lo tanto, una forma preferida de esta realización se refiere a una vacuna para su uso según la invención, donde dicha vacuna comprende al menos otro microorganismo patógeno para los cerdos o virus patógeno para los cerdos y/o al menos otro componente inmunógeno y/o material genético que codifica dicho otro componente inmunógeno, de dicho microorganismo patógeno para los cerdos o virus patógeno para los cerdos. Un inmunógeno o componente inmunógeno es un componente que induce una respuesta inmunitaria en un animal. Puede ser, por ejemplo, un virus entero vivo atenuado o muerto, una bacteria o un parásito, o una proteína o una fracción de azúcar de ese virus, bacteria o parásito.

[0068] Los virus y microorganismos patógenos más comunes para el ganado porcino son Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la peste porcina africana, el virus Nipah, el circovirus porcino, el virus de la torsión porcina, el virus de la pseudorrabia, el virus de la gripe porcina, el parvovirus porcino, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS, por sus siglas en inglés), el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV, por sus siglas en inglés), el virus de la fiebre aftosa, el virus de la gastroenteritis transmisible, el rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.

[0069] Por lo tanto, una forma más preferida de esta realización se refiere a una vacuna para su uso según la invención, donde el virus o microorganismo patógeno para los cerdos se selecciona del grupo que consiste en Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la peste porcina africana, el virus Nipah, el circovirus porcino, el virus de la torsión porcina, el virus de la pseudorrabia, el virus de la gripe porcina, el parvovirus porcino, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), el virus de la fiebre aftosa, el virus de la gastroenteritis transmisible, el rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.

[0070] La vía de administración preferida es la vía intramuscular o intradérmica. Para la administración intradérmica, un dispositivo sin agujas como el IDAL® (MSD AH) sería el dispositivo preferido.

Leyenda de las figuras

[0071] Figura 1: Expresión de proteína VHE 112-607 en sobrenadante de cultivo SF9 y en células SF9 en diferentes momentos de recolección después de la infección por baculovirus:

A) Resultados de Western Blot tras la tinción de la transferencia con el anticuerpo aHIS. Tras transferir el gel de SDS-PAGE, la membrana se tiñó durante 1 hora con aHIS-MCA diluido a 1:500 en tampón de bloqueo. A continuación, se lavó la membrana con tampón de lavado y se incubó durante 1 hora con el anticuerpo secundario GAM/IgG(H+L)/PO diluido a 1:1000 en tampón de bloqueo. La membrana se lavó de nuevo con tampón de lavado y se incubó con sustrato Vector SG diluido en 15 ml de acetato de sodio 3M.

B) Tinción de proteína con Instant blue en el gel de SDS-PAGE. Para la tinción con instant blue, el gel de SDS-PAGE se incubó durante 2 horas en 10 ml de tinción de proteína InstantBlue.

[0072] El marcador de peso molecular con el tamaño de proteína en kDa se carga en el carril izquierdo. Se indica el marcador de tamaño de 50 kDa. El tamaño esperado de VHE 112-607 es de 55 kD.

[0073] La carga de las muestras se indica con los números:

1. Recolección 3 días de medio

2. Recolección 3 días de célula

3. Recolección 4 días de célula

4. Recolección 4 días de medio

5. Recolección 5 días de célula

6. Recolección 5 días de medio

7. Recolección 6 días de célula

8. Recolección 6 días de medio

[0074] Figura 2: Tinción con Instant blue en gel de SDS-PAGE de las fracciones eluidas 1-14 de VHE 112-607 tras la purificación con AKTA Avant de la proteína recogida del sobrenadante de cultivo. El eluido se recogió en fracciones de 2 ml. Los carriles 15, 16 corresponden a las fracciones no unidas y de lavado, respectivamente. Para la tinción con instant blue, el gel de SDS-PAGE se incubó durante 2 horas en 10 ml de tinción de proteína InstantBlue.

[0075] El marcador de peso molecular con el tamaño de proteína en kDa se carga en los carriles del extremo izquierdo y derecho. El tamaño esperado de VHE 112-607 es de 55 kD.

[0076] Los eluidos 1 a 7 fueron agrupados tras la purificación.

[0077] Figura 3: Anticuerpos específicos contra el VHE medidos en varios momentos del estudio de vacunación, determinados mediante ELISA. Los datos se presentan con barras de error (error estándar de la media, EEM)

A: Los lechones de 3 semanas de edad al inicio del experimento presentaban títulos significativos de anticuerpos maternos contra el VHE

B: Los cerdos de 10 semanas de edad al inicio del experimento presentaban títulos reducidos de anticuerpos (maternos) contra el VHE, lo que concuerda con una inmunidad materna reducida a esta edad.

C: La vacunación con la vacuna 112-607 SUP y 112-607 AKTA dio lugar a la seroconversión con anticuerpos específicos contra el ORF2 del VHE en los grupos de edad de «3 semanas» a las T=4 semanas de la vacunación. Los anticuerpos maternos no han desaparecido por completo.

D: La vacunación con la vacuna 112-607 SUP y 112-607 AKTA dio lugar a la seroconversión con anticuerpos específicos contra el ORF2 del VHE en los grupos de edad de «10 semanas» a las T=4 semanas de la vacunación.

E: La vacunación con la vacuna 112-607 SUP y 112-607 AKTA dio lugar a la seroconversión con anticuerpos específicos contra el ORF2 del VHE en los grupos de edad de «3 semanas» a las T=9 semanas de la vacunación (subgrupos marcados con A). Una vacunación de refuerzo a las 5 semanas de la vacunación primaria dio lugar a títulos de anticuerpo mayores a las T=9 semanas después de la vacunación primaria (subgrupos marcados con B) en comparación con la vacunación primaria únicamente. Los anticuerpos maternos han caído por debajo del nivel de detección.

F: La vacunación con la vacuna 112-607 SUP y 112-607 AKTA dio lugar a la seroconversión con anticuerpos específicos contra el ORF2 del VHE en los grupos de edad de «10 semanas» a las T=9 semanas de la vacunación (subgrupos marcados con A). Una vacunación de refuerzo a las 5 semanas de la vacunación primaria dio lugar a títulos de anticuerpo mayores a las T=9 semanas después de la vacunación primaria (subgrupos marcados con B) en comparación con la vacunación primaria únicamente.

[0078] Figura 4: Anticuerpos específicos contra el VHE medidos en varios momentos del experimento de vacunaciónprovocación, determinados mediante ELISA. Los datos se presentan con barras de error (error estándar de la media, EEM).

[0079] Figura 5: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de ORF 2 de la secuencia a.a. 112-607 (SEQ ID NO: 1).

[0080] Figura 6: esta figura muestra la secuencia de ADN optimizada para codón que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura 5 (SEQ ID NO: 2).

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión del ORF2 del VHE en el sistema de expresión BAC to BAC baculo

[0081] Un dominio de la proteína de la cápside del ORF2 del genotipo 3 del VHE [virus de la hepatitis E porcina, basado en GenBank: AFJ06417.1), como se muestra en la figura 5 (SEQ ID NO: 1) fue expresado en el sistema de expresión BAC to BAC baculo (Invitrogen). La proteína fue diseñada con una marca HIS C-terminal para su purificación.

[0082] El fragmento de proteína expresado contiene el dominio estructural central (aminoácido 112-367) y el epítopo neutralizante previsto (aminoácido 456-607), pero carece del dominio de unión al ARN del ORF2, los 111 aminoácidos N-terminales del ORF2 del VHE.

[0083] La secuencia de codificación de la proteína marcada con HIS, tal como se representa en la figura 6 (SEQ ID NO: 2) se clonó en el plásmido pFastbac1 (Invitrogen). La secuencia de codificación se diseñó con un sitio de restricción 5' BamHI flanqueante, un codón de inicio, la secuencia nucleotídica optimizada para el codón de la proteína, una marca HIS, un codón de parada y un sitio de restricción 3' EcoRI. Esta información se envió a Genscript (Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.), donde se sintetizó la secuencia nucleotídica, se digirió con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI y se clonó en el plásmido pFastbac1, que se digirió con las mismas enzimas de restricción.

[0084] Posteriormente, la proteína fue expresada mediante la utilización del sistema de expresión Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System de acuerdo con el manual de instrucciones correspondiente del sistema de expresión Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System de Invitrogen. An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins. Invitrogen. Números de catálogo 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024. Número de parte de documento 10359, número de publicación MAN0000414).

[0085] Brevemente, se transformaron células competentes de E.coli DH10Bac con ADN plasmídico que contenía la secuencia nucleotídica descrita anteriormente. Posteriormente, la secuencia insertada se transpuso en la secuencia de bacmid presente en las células DH10Bac. A continuación, las bacterias se extendieron en placas de agar que contenían antibióticos e IPTG. La selección se realizó mediante un cribado blanco-azul, ya que las colonias blancas contienen el recombinante Bacmid. A partir de una colonia blanca se preparó un cultivo líquido. A continuación, se realizó un aislamiento mediante miniprep para aislar el ADN de Bacmid de las células E.coli. Se transfectaron células de insecto SF9 (Cellfectin, Invitrogen) con este ADN de Bacmid recombinante, lo que dio lugar a la formación de partículas de baculovirus recombinante. Estas partículas se recolectaron y se utilizaron para infectar monocapas frescas de células de insecto SF9. La infección induce la expresión genética recombinante y la producción de la proteína ORF2 del VHE marcada con HIS 112-607.

[0086] Para determinar el momento de rendimiento de proteína óptimo, se recolectó la proteína en diferentes momentos; 3, 4, 5 y 6 días después de la infección. En todos estos experimentos de infección se utilizó el MOI optimizado de 0,1.

[0087] Se recolectó la proteína recombinante que se expresó en el medio de cultivo de células SF9 o en las células SF9. Las células se liberaron del matraz de cultivo dando ligeros golpecitos y la suspensión celular se centrifugó a 3000 x g durante 10 minutos. Se recolectó el medio y se almacenó hasta su análisis a -70 °C. Se almacenaron sedimentos celulares hasta su análisis a -20 °C. Tanto el sobrenadante como la recolección de células se analizaron para la expresión de proteínas. Las células sedimentadas fueron resuspendidas en PBS antes del análisis de expresión de proteínas. Las muestras de ambas recolecciones se aplicaron en un SDS-PAGE junto con un marcador de proteína preteñida all blue (Biorad) y analizadas mediante tinción con Instant Blue (Expedeon) y Western Blot (aHIS-MCA).

[0088] Para la tinción con instant blue, el gel de SDS-PAGE se incubó durante 2 horas en 10 ml de colorante de proteínas InstantBlue.

[0089] Para el Western Blot, se utilizó el Trans Blot Turbo Transfer Pack (Biorad) según el manual de instrucciones correspondiente. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon durante una hora con tampón de bloqueo (1 % de leche desnatada en PBS 0,04 M, Polisorbato 20 0,05 %). Posteriormente, la membrana se tiñó durante 1 hora con aHIS-MCA (MSD Animal o un equivalente disponible en el mercado), diluido a 1:500 en tampón de bloqueo. A continuación, se lavó la membrana con tampón de lavado (PBS 0,04 M, Polisorbato 200,5 %) y se incubó durante 1 hora con el anticuerpo secundario GAM/IgG(H+L)/PO (Nordic) diluido a 1:1000 en tampón de bloqueo. La membrana se lavó de nuevo con tampón de lavado y se incubó brevemente con 3 gotas de sustrato Vector SG (Vector Laboratories) diluido en 15 ml de acetato de sodio 3M.

[0090] La proteína recombinante 112-607 fue secretada en el medio de cultivo como una proteína soluble, pero también estuvo presente en el sedimento celular (figura 1, A: Western blot, B: colorante de proteínas). El mayor rendimiento de proteína se alcanzó tras 5 días de infección en el medio de cultivo. El medio de cultivo que contenía la proteína soluble se utilizó para la preparación de la vacuna tras la inactivación del baculovirus por irradiación gamma = 112-607 SUP (véase: ejemplo 3, preparación de la vacuna). A partir del medio de cultivo, también se preparó una fracción de proteína subunitaria purificada. La proteína marcada con HIS se purificó del medio de cultivo celular utilizando el sistema de purificación de proteínas AKTA Avant = 112-607 AKTA (véase el ejemplo 2, método de purificación AKTA).

Ejemplo 2: Sistema de purificación de proteínas AKTA Avant y método de purificación

[0091] La proteína marcada con HIS 112-607 presente en el medio de cultivo se purificó utilizando el sistema de purificación AKTA Avant (GE Healthcare, Alemania).

[0092] La proteína marcada con HIS en el sobrenadante del cultivo se purificó en un sistema de purificación AKTA Avant (GE Healthcare, Alemania) utilizando una columna HIStrap FF (GE Healthcare art. 17-5255-01 (5 ml). Antes de la purificación, la fracción se filtró en un filtro de 0,45 pM (Millipore).

[0093] Se utilizó el siguiente programa:

[0094] Tampón de lavado AKTA, no desnaturalizante: 300 mM KCl, 50 mM TRIS, 5 mM Imidazol

[0095] Tampón de elución, no desnaturalizante: 300 mM KCl, 50 mM TRIS, 500 mM Imidazol

[0096] El eluido se recogió en fracciones de 2 ml y estas se aplicaron en un gel de SDS-PAGE seguido de tinción con instant blue. El gel de SDS-PAGE fue incubado durante 2 horas en 10 ml de colorante de proteína InstantBlue (Expedeon) (figura 2). Los eluidos 1 a 7 fueron agrupados tras la purificación.

[0097] Tras la purificación, se llevó a cabo la diálisis de la proteína purificada. La proteína purificada se cargó en una membrana de diálisis Spectra Por3, MWCO 3,5 kD (Spectrum Labs) y esta se colocó en una cámara externa con tampón de diálisis (150 mM KCl 150 mM TRIS) de aproximadamente 400 veces el volumen de la proteína purificada. El tampón se agitó constantemente durante 2 días a 4 °C y después de 1 día se cambió el tampón de diálisis.

Ejemplo 3: Formulación de vacunas

[0098] La formulación X-solve es una emulsión de aceite en agua basada en aceite mineral combinada con acetato de vitamina E solubilizado. El tamaño de gota de la emulsión basada en aceite mineral es de aproximadamente 0,5 pm y el tamaño de gota de acetato de vitamina E solubilizado es de aproximadamente 150 nm. La viscosidad de la vacuna final es inferior a 15 mPa.s.

[0099] La concentración de proteína del antígeno se determinó de la siguiente manera: La fase acuosa utilizada para la formulación de la vacuna se aplicó en un SDS-PAGE junto con un marcador de proteína preteñida all blue (Biorad) y un estándar de BSA con concentración de proteína conocida (25-50-100 pg/ml) y se analizó mediante tinción con Instant Blue (Expedeon). Para la tinción con instant blue, el gel de SDS-PAGE se incubó durante 2 horas en 10 ml de colorante de proteína InstantBlue. La densidad de las señales se midió con el software GeneTools, de Syngene. Se calculó la concentración de proteína de la 112-607 AKTA y 112-607 SUP basándose en la regresión lineal de los resultados de estándar de BSA.

[0100] 112-607 AKTA: 40 pg/ml de proteína en la formulación de la vacuna final

[0101] 112-607 SUP: 40 pg/ml de proteína en la formulación de la vacuna final

Ejemplo 4: Determinación de los niveles de anticuerpo (materno) en suero

[0102] Se tomaron muestras individuales de sangre (Vacuolette 8 ml Sep Clot Activator [Greiner-Bio One]) de cerdos. Después de la coagulación a temperatura ambiente y durante la noche a 4 °C, se obtuvo suero de las muestras de sangre. Para ello se centrifugaron los tubos a 2500 x g durante 25 minutos a 4 °C. Las muestras de suero para ELISA se inactivaron por calor durante 30 minutos a 56 °C y finalmente se almacenaron a -20 °C o menos hasta su uso. Los sueros se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos contra el VHE utilizando el kit comercial de prueba HEV ELISA 4.0 de MP Biomedicals, Santa Ana, California, EE. UU. Esto se hizo de acuerdo con el protocolo correspondiente del kit HEV ELISA 4.0.

[0103] El valor de corte del ELISA es la DO (450 nm) 0,2 la media de las muestras de control negativo (0,05). Las muestras con una DO inferior a 0,250 se consideran negativas para el VHE.

Ejemplo 5: Detección del VHE en hisopos rectales, bilis y suero

[0104] Se tomaron muestras individuales de sangre (Vacuolette 8 ml Sep Clot Activator [Greiner-Bio One]) de cerdos. Después de la coagulación a temperatura ambiente y durante la noche a 4 °C, se obtuvo suero de las muestras de sangre.

Para ello se centrifugaron los tubos a 2500 x g durante 25 minutos a 4 °C. Las muestras de suero para PCR no se inactivaron por calor y se almacenaron a -20 °C o menos hasta su análisis.

[0105] La bilis se tomó de la vesícula biliar en la necropsia utilizando una jeringa y se almacenó a -20 °C o menos hasta su análisis.

[0106] Se tomaron hisopos rectales en diferentes momentos del experimento. Los hisopos se colocaron en tubos que contenían 1 ml de PBS y antibióticos. En el laboratorio, los tubos se agitaron en vórtex y se decantaron en criotubos. Las muestras se almacenaron a -20 °C o menos hasta su análisis.

[0107] Los hisopos rectales, la bilis y las muestras de suero se analizaron para detectar la presencia de ARN del VHE mediante q-RT-PCR.

[0108] El ARN se extrajo con el instrumento MagNA Pure 96 (Roche) utilizando el protocolo de lisis externa descrito por el fabricante. Brevemente, se mezclaron 200 pl de muestra sin diluir con 250 pl de tampón de lisis externa (Roche) y se extrajeron ácidos nucleicos según el protocolo relacionado.

[0109] Para la detección cuantitativa del ARN del VHE en estas muestras, se utilizó el kit QuantiTect Probe RT-PCR (Qiagen). Una reacción de qPCR consistía en 4,5 pl de agua libre de RNasa, 12,5 pl de mezcla de reacción QuantiTect Probe RT-PCR mastermix, 400 nm del cebador directo e inverso, 300 nm de la sonda, 0,75 pl de la mezcla QuantiTect Probe RT (enzima) y 5 pl de ARN.

[0110] Se utilizaron los siguientes cebadores y la siguiente sonda:

Cebador directo; GGT TTC TGG GGT GAC (SEQ ID NO: 3)

Cebador inverso; AGG GGT TGG TTG GAT GAA (SEQ ID NO: 4)

Sonda marcada 6FAM TAMRA; TGA TTC TCA GCC CTT CGC (SEQ ID NO: 5)

[0111] La transcripción inversa se realizó a 50 °C durante 30 minutos, seguida de una desnaturalización a 95 °C durante 15 minutos. El ADN se amplificó inmediatamente con 40 ciclos de PCR a 94 °C (15 s), 56 °C (30 s) y 76 °C (30 s). Las reacciones se ejecutaron en el sistema de tiempo real CFX96 (Biorad) y el análisis de software se realizó con CFX manager versión 3.1. Los datos se presentan en copias/ml de muestra. La cuantificación se basó en el análisis de un conjunto de muestras estándar que contenían 101-108 copias del ORF2 del VHE/5pl en cada reacción de q-RT-PCR en el CFX96.

Ejemplo 6: Experimento de vacunación

[0112] En este estudio se utilizó un total de 30 lechones de 3 semanas de edad que eran seropositivos a los anticuerpos maternos contra el VHE. Los lechones fueron seleccionados al azar de diferentes camadas.

[0113] En este estudio se utilizó un total de 30 cerdos de 10 semanas de edad. Los lechones fueron seleccionados al azar. A la edad de 10 semanas, los niveles de anticuerpos maternos contra el VHE se han reducido en comparación con los lechones de 2 semanas (figura 3A, B).

[0114] Los lechones de 3 semanas de edad fueron asignados a 3 grupos de tratamiento de 10 lechones cada uno (grupos 1-2-3). Los lechones del grupo 1 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 3 semanas de edad con la vacuna del ORF2 del VHE 112-607 SUP formulada en X-Solve. Los lechones del grupo 2 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 3 semanas de edad con la vacuna del ORF2 del VHE 112-607 AKTA formulada en X-Solve. Los lechones del grupo 3 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 3 semanas de edad con PBS.

[0115] Los lechones de 10 semanas de edad fueron asignados a 3 grupos de tratamiento de 10 lechones cada uno (grupos 4-5-6). Los lechones del grupo 4 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 10 semanas de edad con la vacuna del ORF2 del VHE 112-607 SUP formulada en X-Solve. Los lechones del grupo 5 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 10 semanas de edad con la vacuna del ORF2 del VHE 112-607 AKTA formulada en X-Solve. Los lechones del grupo 6 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 3 semanas de edad con PBS.

[0116] Cada grupo de 10 lechones se subdividió en grupos A y B a las 5 semanas después de la vacunación primaria (8/15 semanas de edad). 5 lechones no recibieron ninguna vacunación de refuerzo (subgrupo A), mientras que los otros 5 cerdos recibieron una vacunación de refuerzo idéntica a la vacunación primaria (subgrupo B).

[0117] Se recogió suero antes de la vacunación (3/10 semanas de edad), a las 7/14 semanas de edad (4 semanas después de la vacunación) y a las 12/19 semanas de edad (9 semanas después de la vacunación). Los niveles de anticuerpos contra el VHE se determinaron en el suero como se describe en el ejemplo 4. La ausencia de replicación del VHE se confirmó en todas las muestras de suero mediante análisis q-RT-PCR.

[0118] A las 3 semanas de edad, los lechones presentaban títulos de anticuerpos significativos contra el VHE, que habían desaparecido en gran medida en los cerdos de 10 semanas de edad (figura 3A, B). La vacunación con la vacuna 112-607 SUP (grupo 1) y la vacuna 112-607 AKTA (grupo 2) dio lugar a la seroconversión con anticuerpos específicos contra el ORF2 del VHE en ambos grupos de edad a las 4 (figura 3C, D) y 9 semanas después de la vacunación (figura 3E, F; subgrupos A). Una dosis de refuerzo 5 semanas después de la vacunación primaria dio lugar a un aumento de los títulos de anticuerpos a las 9 semanas después de la vacunación primaria. (Figura 3E, F; subgrupos B)

Ejemplo 7: Experimento de vacunación-provocación en lechones

[0119] En este estudio se utilizó un total de 12 lechones de 3 semanas de edad que eran seropositivos a los anticuerpos maternos contra el VHE. Los lechones fueron seleccionados al azar de diferentes camadas y se alojaron juntos en un corral.

[0120] Los lechones fueron asignados a 3 grupos de tratamiento de 4 lechones cada uno (grupos 1-2-3). Los lechones del grupo 1 fueron vacunados (vacunación intramuscular, 1 ml, en el cuello) a las 3 semanas de edad con la vacuna del ORF2 del VHE 112-607 SUP formulada en X-Solve. Se recogió suero antes de la vacunación (3 semanas de edad), a las 7 semanas de edad (4 semanas después de la vacunación) y antes de la provocación experimental (11 semanas de edad, 8 semanas después de la vacunación).

[0121] A las 8 semanas después de la vacunación (11 semanas de edad), los 4 cerdos del grupo 2 fueron sometidos a provocación experimental con un homogeneizado de hígado de un animal positivo al VHE de una granja holandesa. El material de provocación era un 10 % de homogeneizado de hígado en medio E de William 50/50 (vol/vol)/medio Ham F-12. El homogeneizado de hígado de provocación se aplicó mediante una inyección intramuscular (IM) (2 x 2,5 ml, cuello izquierdo y derecho) y una dosis oral de 15 ml aplicada con una jeringa. Para la inyección oral, el homogeneizado se centrifugó a 3200 x g durante 1 hora a 4 °C y el sobrenadante se utilizó para la provocación. El material contenía 2,12 * 106 copias de ARN del VHE/ml. Para la inyección intramuscular, este sobrenadante se centrifugó de nuevo a 10000 x g durante 1 hora a 4 °C, y posteriormente se filtró en un filtro de 0,22 pM (Millipore) y se inyectó. Este material contenía 1,22 * 106 copias de ARN del VHE/ml. El material positivo al VHE utilizado contenía un VHE de genotipo 3i que se determinó a partir del análisis de la secuencia de ARN de la secuencia nucleotídica del virus. El virus mostró la mayor homología con el número de acceso del Genbank: KC618403.1. Los cerdos del grupo 3 sirvieron como centinelas de contacto.

[0122] La excreción del VHE a través de las heces después de la provocación experimental se monitorizó dos veces por semana (12-17 semanas de edad) mediante análisis q-RT-PCR de hisopos rectales. La presencia de virus en el suero se monitorizó semanalmente (13 - 17 semanas de edad) mediante análisis q-RT-PCR. Se realizaron necropsias a las 17 semanas de edad. La bilis y la sangre se recogieron en el momento de la necropsia, a excepción de los animales del grupo 2. La presencia del virus VHE se analizó mediante q-RT-PCR (ejemplo 5) en hisopos rectales, bilis y suero. Los niveles de anticuerpos contra el VHE se determinaron en el suero como se describe en el ejemplo 4. En la figura 4, se muestran los resultados de ELISA. La vacunación de lechones de 3 semanas de edad indujo una seroconversión con anticuerpos específicos contra el VHE en los animales vacunados que fue detectable a partir de las 7 semanas de edad. Los grupos 2 y 3 mostraron una disminución de los títulos de anticuerpos debido a la desaparición de los anticuerpos maternos antes de la provocación experimental del grupo 2 a las 11 semanas de edad. La provocación de los animales del grupo 2 dio lugar a la inducción de anticuerpos específicos contra el VHE en este grupo entre las 13 y 14 semanas de edad, y también el grupo centinela 3 se seroconvirtió como consecuencia de la infección por VHE debido al contacto directo con los cerdos sometidos a provocación experimental. El grupo centinela desarrolló títulos de anticuerpos entre las 15 y 16 semanas de edad, con un retraso de aproximadamente 2 semanas en comparación con el grupo de provocación experimental 2, lo que corresponde al tiempo de incubación del virus. El grupo vacunado 1 reaccionó a la exposición al VHE a través de los cerdos sometidos a provocación experimental (grupo 2) con un aumento de los títulos de anticuerpos específicos contra el VHE a partir de la semana 14 y 15.

[0123] El éxito de la provocación experimental del grupo 2 y la infección de los cerdos centinela del grupo 3 se confirmó mediante la realización de análisis q-RT-PCR en la bilis y el suero de los animales experimentales (tabla A). Tres de los cuatro cerdos sometidos a provocación experimental, y cuatro de los cuatro cerdos centinela mostraron niveles detectables de VHE en suero o bilis. Ninguno de los cerdos vacunados presentaba niveles detectables de VHE en suero o bilis. También se analizaron hisopos rectales mediante análisis q-RT-PCR, que se muestran en la tabla B.

[0124] El presente experimento se estableció para imitar situaciones de campo en las que el VHE infecta a los cerdos durante la fase de acabado. La vacunación protegió a los cerdos de la viremia en sangre y bilis (animales sometidos a provocación, animales centinela), lo que indica que los cerdos vacunados no presentan una infección sistémica con el VHE. Además, los cerdos vacunados contra el ^v H^e reaccionan a la exposición al virus con un aumento de los niveles de anticuerpos séricos. La excreción del VHE en las heces se reduce en los cerdos vacunados en comparación con los cerdos centinela del mismo corral.

[0125] Más específicamente, lo que se puede ver en la tabla B es que los cerdos vacunados, con respecto a los cerdos centinela presentan una excreción fecal sustancialmente reducida en las semanas 13, 14 y 15 (factor 10-50 menor cantidad de material de ADN del VHE presente en las heces). Alrededor de la semana 16, la excreción parece estabilizarse en un nivel bajo, que es esencialmente el mismo para los animales vacunados que para los animales de control. Dado que los animales vacunados no muestran ninguna infección sistémica por el VHE (véase la tabla A), debe tratarse de un virus que se excreta debido a que los lechones comen heces infectadas por el VHE. Aparentemente, el nivel de excreción al que se llega después de la semana 15 se debe a la ingesta de heces infectadas, pero no se debe a una infección real del animal. En resumen, si se combinan los datos de la tabla A con los de la tabla B, queda claro que con la presente vacuna, un lechón positivo en MDA contra el VHE puede estar protegido contra la excreción fecal del VHE, en particular contra la excreción fecal que es resultado de una infección del propio animal.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Vacuna que comprende una cantidad hipnogénicamente eficaz de un fragmento de proteína del marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E (ORF2 del VHE) que abarca al menos la región del aminoácido 125 al aminoácido 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al aminoácido 660, y un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en la protección de lechones positivos en MDA contra el VHE contra la excreción fecal del VHE que es resultado de una infección de los lechones.

2. Vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que dicha vacuna comprende al menos 5 microgramos/dosis de dicho fragmento de proteína.

3. Vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que dicha vacuna comprende al menos 20 microgramos/dosis de dicho fragmento de proteína.

4. Vacuna para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que dicha composición comprende un adyuvante.

5. Vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada por que dicho adyuvante es un adyuvante de aceite en agua.

6. Vacuna según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso como vacuna de refuerzo para la protección de lechones positivos en MDA contra el VHE que han sido vacunados con una vacuna primaria contra la excreción del VHE no más de 15 semanas antes de ser vacunados con la vacuna de refuerzo.

7. Vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha vacuna primaria es una vacuna que comprende al menos 10 microgramos/dosis del fragmento de la proteína ORF-2 del VHE que abarca al menos la región del aminoácido 125 al aminoácido 607 y, como máximo, la región del aminoácido 112 al aminoácido 660, y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Vacuna para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada por que dicha vacuna comprende al menos otro microorganismo patógeno para los cerdos o virus patógeno para los cerdos y/o al menos otro componente inmunógeno y/o material genético que codifica dicho otro componente inmunógeno, de dicho microorganismo patógeno para los cerdos o virus patógeno para los cerdos.

9. Vacuna para su uso según la reivindicación 8, donde el al menos otro virus o microorganismo patógeno para los cerdos se selecciona del grupo que consiste en Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la peste porcina africana, el virus Nipah, el circovirus porcino, el virus de la torsión porcina, el virus de la pseudorrabia, el virus de la gripe porcina, el parvovirus porcino, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), el virus de la fiebre aftosa, el virus de la gastroenteritis transmisible, el rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.