CN109803678B - 抗猪细小病毒的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其是关于在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基、和/或在氨基酸位置414具有丝氨酸残基、和/或在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基、和/或在氨基酸位置436具有苏氨酸残基的猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)。此外，本发明是关于包含该PPV病毒蛋白2(VP2)的免疫原性组合物。此外，本发明是关于对个体进行免疫的方法，其包含向该个体施用本发明的免疫原性组合物。此外，本发明是关于治疗或预防有需要的个体由PPV感染所引起的临床体征的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物。

Description

抗猪细小病毒的疫苗
本申请包含根据37CFR1821-1.825的序列表。此序列表援引加入本申请。
背景技术
猪细小病毒是含有约5100个核苷酸的单链DNA分子的细小病毒科(Parvoviridae)内的细小病毒亚科(Parvovirinae)的原细小病毒属(Protoparvovirus)的自主复制病毒(Cotmore等人，2014:Arch Virol.:159(5):1239-1247；Molitor等人，1984:Virology:137(2):241-54)。仅DNA的负链包装成病毒粒子。病毒的基因体编码三种衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)及一种非结构蛋白(NS1)。小病毒的衣壳的直径约为22-25纳米，且由VP1和VP2亚单位组成。该等蛋白质源自相同RNA分子的选择式剪接型式，且因此在序列上重叠。此外，猪细小病毒展现与猫泛白血球症病毒、犬小病毒及啮齿类动物小病毒高程度的序列相似性(Ranz等人，1989:J.gen.Virol:70:2541-2553)。
尽管猪细小病毒毒株存在差异(一些极具致病性且另一些致病性较小或完全无致病性)，但当病毒在一个国家确立或流行时，致病毒株似乎在群体中循环。
猪细小病毒(PPV)感染系全世界育种猪繁殖失败的常见原因。血清学研究显示，猪细小病毒在世界所有产猪区广泛传播，且高达80％的动物显示血清转化。
猪细小病毒(PPV)引起猪的繁殖失败，导致怀孕经产母猪的死亡及胎儿干尸化、死胎及其他繁殖失败。(Joo及Johnson.1976.Veterinary Bulletin 46,653-660；Mengeling.1978.J.Am.Vet.Med.Assoc.172,1291-1294)。
当易感(非免疫)后备母猪及经产母猪在怀孕期间感染时，PPV诱导繁殖失败。此系唯一一次病毒引起疾病。猪的感染发生在摄入或吸入病毒之后。PPV随后在血液中循环，并且在怀孕的猪中穿过胎盘并感染发育中的胚胎及胎儿。自然感染后，主动免疫性可能持续猪的生命。若在怀孕前发生主动免疫性，则发育中的仔猪不受影响。出生时，仔猪在经产母猪的初乳中接受母源免疫性，且此母源免疫性持续高达20周龄。经产母猪的主动免疫性程度越大，则其传递至仔猪的母源免疫性越大。此后，可发生PPV自然感染。
猪中由PPV引起的疾病通常称为SMEDI(死产、干尸化、胚胎死亡及不孕症的缩写字)。若在怀孕第0-30天发生感染，则可能发生胚胎死亡率，导致窝仔数减少。在怀孕第30-70天感染后最明显的特征系干尸化仔猪的出生。干尸化系骨骼开始固化后在子宫内死亡的仔猪的组织无菌消化的过程。若感染在怀孕的后期发生，则PPV感染亦与死产和弱出生的猪相关。流产亦可为PPV感染的结果，但并非此疾病的常见临床体征。总的，PPV感染减少了每头经产母猪每年出生的猪数量。
目前可获得的PPV疫苗系藉由在猪类源原代细胞上或在已确立细胞系中生长天然病毒来产生。此后，分离传染性病毒并用化学试剂灭活，最终得到全细胞杀死的病毒疫苗。然而，该等生长天然传染性病毒的过程对于生物安全性及安全性考虑系有问题的。因此，需要重组PPV疫苗。
基于重组蛋白的亚单位疫苗由于靶蛋白的不正确折叠或对免疫系统的较差呈递而可能具有较差的免疫原性。此外，全细胞杀死的疫苗呈递天然病毒的所有抗原，而在亚单位疫苗中，对特定氨基酸序列有限制。
先前技术中已阐述重组PPV疫苗，然而，直至现在，仅全细胞杀死的疫苗有市售。因此，迄今为止，似乎没有适当的重组PPV亚单位疫苗被研发出来并被显示是有效且安全的。迄今为止阐述的重组PPV亚单位疫苗尚未在受控的实验室攻击实验中进行测试。已经评估过并未像全细胞杀死的PPV疫苗或重组PPV亚单位疫苗一样工作良好的重组PPV亚单位疫苗尚不安全(显示不良反应)。因此，仍需要高度有效且安全的重组PPV亚单位疫苗。
已鉴别出猪细小病毒(PPV)的野外分离株，其与疫苗毒株在遗传及抗原性上不同。PPV基因型2病毒PPV-27a在实验性感染后在怀孕后备母猪中系高毒力的，如与感染其他PPV毒株(例如PPV-NADL-2)的经产母猪相比，感染PPV-27a的经产母猪的胎儿死亡率较高(85％)。然而，目前可用的抗PPV的商业疫苗系基于约30年前分离的PPV基因型1毒株的灭活全病毒制剂(Jozwik等人，2009；Journal of General Virology；90；2437-2441)。因此，需要在实际应用中更好地匹配PPV的新的疫苗来防止新的高毒力PPV致病毒株。
进一步先前技术系如下：
EP 0 551 449 A1揭示产生抗猪细小病毒的VP2亚单位疫苗的方法。
Cadar D等人(Infection,Genetics and Evolution 2012,12:1163-1171)阐述猪细小病毒在野猪中的系统发育及进化遗传学。
Streck AF等人(Journal of General Virology 2011,92:2628-2636)阐述猪细小病毒的衣壳蛋白中病毒进化的高速率。
WO 88/02026系关于空病毒衣壳疫苗。
Martinez C等人(Vaccine 1992,10(10):684-690)揭示具有高免疫原性活性的猪细小病毒空衣壳的产生。
Xu F等人(Applied and Environmental Microbiology 2007,73(21):7041-7047)阐述在胃内施用产生猪细小病毒VP2蛋白的酪蛋白乳杆菌后小鼠中免疫反应的诱导。
此外，需要抗极其致病的PPV毒株的新的且更优选的疫苗，从而对PPV的不同(异源)毒株提供更广泛的保护(交叉保护)。
具体实施方式
在阐述本发明的实施方式之前，必须注意，如本文中且如在随附申请专利范围中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该(the)”包括复数个指示物。因此，举例而言，在提及“抗原”时包括复数个该等抗原，在提及”病毒”时提及彼等本领域技术人员已知的一或多种病毒及其等效物，等等。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与熟习本发明所属领域技术者通常所理解相同的含义。尽管任何类似或等效于彼等本文所述者的方法及材料可用于本发明的实践或测试中，但目前所述者系优选的方法、装置及材料。出于阐述及揭示如结合本发明使用的出版物中所报告的细胞系、载体及方法的目的，本文所提及的所有出版物以引用方式并入本文中。本文中没有什么内容应解释为承认本发明没有资格早于根据先前发明的此类揭示内容。
本发明解决先前技术中固有的问题且在现有技术中提供明显进步。通常，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列。
有利地，由本发明提供的实验数据揭示，本发明的PPV VP2亚单位疫苗在预防胎儿中的病毒血症及PPV感染中安全且有效。此外，由本发明提供的实验数据揭示，本发明的疫苗具有广泛保护谱，此乃因疫苗提供保护以抵抗异源北美以及异源欧洲PPV攻击毒株。
有利地，由本发明提供的实验数据揭示本发明的PPV VP2亚单位疫苗与整个杀死的病毒一样有效，此系惊人的效应。然而，藉由利用由PPV VP2组成的重组亚单位疫苗可避免广泛的灭活过程(其在产生整个杀死的病毒疫苗时使天然PPV灭活系必需的)。
术语“猪细小病毒”或“PPV”为本领域技术人员所熟知。然而，“猪细小病毒”系含有单链DNA分子的细小病毒科内的小病毒属的自主复制病毒。病毒的基因体编码三种衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)及一种非结构蛋白(NS1)。猪中由PPV引起的疾病通常称为SMEDI(死产、干尸化、胚胎死亡及不孕症(stillbirth,mummification,embryonic death及infertility)的缩写字)。术语“猪细小病毒”涵盖猪细小病毒的所有可能的毒株、基因型、表型及血清型。
术语“病毒蛋白2”或“VP2”系关于猪细小病毒的衣壳蛋白VP2。术语“病毒蛋白2”或“VP2”为本领域技术人员熟知。
术语“蛋白质”、“氨基酸”及“多肽”可互换使用。术语“蛋白质”系指由天然氨基酸以及其衍生物构成的氨基酸序列。天然氨基酸在业内已众所周知且阐述于生物化学的标准教科书中。在氨基酸序列内，氨基酸残基由肽键连结。此外，氨基酸序列的两端称为羧基末端(C-末端)及氨基末端(N-末端)。术语“蛋白质”涵盖基本上纯化蛋白或另外包含其他蛋白的蛋白制剂。此外，该术语亦系关于蛋白片段。此外，其包括化学修饰的蛋白。该等修饰形式可为人工修饰形式或天然修饰形式，例如磷酸化、糖基化、肉豆蔻基化及诸如此类。
术语“其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列”系关于氨基酸位置的编号参考全长野生型PPV VP2蛋白的氨基酸序列。优选地，如本文提及的氨基位置的编号系关于具有579个氨基酸残基(包括(N-末端)氨基酸位置1的甲硫氨酸残基)的野生型PPVVP2蛋白质序列。术语“其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列”涵盖如SEQ ID NO:1中例示性给出的野生型PPV VP2(PPV 27a VP2)。
在本发明的一个实施方式中，PPV VP2进一步
-在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基。
因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且其中PPV VP2进一步
-在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基。
在本发明的一个实施方式中，氨基酸位置的编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且其中氨基酸位置的编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，PPV VP2系重组PPV VP2。
如本文所用术语“重组体”具体而言系指自重组DNA分子表达的蛋白质分子，例如藉由重组DNA技术产生的多肽。该等技术的实例包括在编码表达蛋白(例如PPV VP2)的DNA插入适宜表达载体、优选杆状病毒表达载体的情形，其进而用于转染、或在杆状病毒表达载体的情形下用于感染宿主细胞以产生由DNA编码的蛋白质或多肽。因此，如本文所用术语“重组PPV VP2”具体而言系指自重组DNA分子表达的蛋白质分子。
在本发明的一个实施方式中，PPV VP2系重组杆状病毒表达的PPV VP2。
术语“杆状病毒”或“杆状病毒系统”为本领域技术人员熟知。此外，下文进一步说明术语“杆状病毒”。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且
其中该PPV VP2包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成，或包含具有至少210、至少250或至少300个来自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的连续氨基酸残基的任一片段或由其组成。因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且
其中该PPV VP2包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成，或包含具有至少210、至少250或至少300个来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的连续氨基酸残基的任一片段或由其组成。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:5至16的氨基酸序列或由其组成。因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且
其中该PPV VP2包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且
其中该PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
在本发明的一个实施方式中，该PPV VP2系由编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列的核苷酸序列编码。因此，本发明提供猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列，且
其中该PPV VP2系由编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
SEQ ID NO:4系密码子优化的PPV 27a VP2核苷酸序列，其进一步经修饰以具有两个ClaI限制酶位点(氨基酸位置25系异亮氨酸残基，氨基酸位置36系丝氨酸残基，氨基酸位置37系异亮氨酸残基)以侧接由甘氨酸重复组成的VP2编码区。然而，ClaI限制酶位点系以不破坏VP2编码区的方式引入。SEQ ID NO:2系对应于SEQ ID NO:4的蛋白质序列。SEQ IDNO:3系密码子优化的PPV 27a VP2核苷酸序列(无ClaI限制酶位点)。SEQ ID NO:1系对应于SEQ ID NO:3的蛋白质序列。SEQ ID NO:5至16揭示具有(SEQ ID NO:5至10)或无(SEQ IDNO:11至16)ClaI限制酶位点的其他PPV VP2蛋白质序列。
术语“核酸”或“核酸序列”或“核苷酸序列”或“多核苷酸”在本文中可互换使用且系指多核苷酸，包括DNA分子、RNA分子、cDNA分子或衍生物。该术语涵盖单链以及双链多核苷酸。本发明核酸涵盖经分离多核苷酸(亦即自其天然背景分离)及遗传修饰形式。此外，亦包括化学修饰的多核苷酸，包括天然修饰的多核苷酸(例如糖基化或甲基化多核苷酸)或人工修饰者(例如生物素化多核苷酸)。此外，术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且系指任一核酸。术语“核酸”及“多核苷酸”亦具体而言包括由除5个生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。
术语“相同性”或“序列相同性”已为业内所习知且系指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参考序列与欲与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。藉由在将序列最优选地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性，如藉由该等序列串之间的匹配所测定。在该比对时，基于逐个位置来确定序列相同性，举例而言，若在一个特定位置处核苷酸或氨基酸残基一致，则该等序列在该位置处“一致”。然后将该等位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可藉由已知方法容易地计算，该等方法包括但不限于以下中所述的彼等：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford UniversityPress,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教示以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。该等程序的实例包括(但不限于)GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVINLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示以引用方式并入本文中)。该等程序最优选地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间产生最高序列相同性程度。作为阐释，对于具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％“序列相同性”的核苷酸序列的多核苷酸而言，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列一致，只是给定多核苷酸序列可包括最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言的，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高15％、优选地10％、甚至更优选地5％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或参考序列中全部核苷酸中最高15％、优选地10％、甚至更优选地5％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的该等突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置，其系个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列相同性的给定氨基酸序列的多肽而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列一致，只是给定多肽序列可包括最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言的，为了获得与参照氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％序列相同性的给定多肽序列，参照序列中高达15％、优选高达10％、甚至更优选高达5％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或占参照序列中氨基酸残基的总数的高达15％、优选高达10％、甚至更优选高达5％、4％、3％、2％、1％的数目的氨基酸可插入参照序列中。参考序列的该等改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置，其系个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列相同性时，并不包括保守取代作为匹配。
术语“相同性”、“序列相同性”及“相同性％”在本文中可互换使用。出于本发明目的，此处定义为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性％，将序列进行比对以达到最优选比较目的(例如，可在第一氨基酸或核酸的序列中引入空位，用于与第二氨基酸或核酸序列进行最优选比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置一致。两个序列之间的相同性％随该等序列所共享的一致位置数变化[即，相同性％＝一致位置数/总位置(即重叠位置)数x 100]。优选地，两个序列的长度相同。
序列比较可在比较的两个序列的整个长度上实施，或在两个序列的片段上实施。通常，比较将在所比较的两个序列的整个长度上实施。然而，序列相同性可在(例如)20、50、100或更多个连续氨基酸残基的区上实施。
本领域技术人员将明了以下事实：若干不同计算机程序可用于测定两个序列之间的同源性。举例而言，两个序列之间的序列比较及相同性％的测定可使用数学算法来完成。在优选实施例中，使用Needleman及Wunsch[J.Mol.Biol.(48):444-453(1970)]算法测定两个氨基酸或核酸序列之间的相同性％，该算法纳入Accelrys GCG软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)中的GAP程序中，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵、及16、14、12、10、8、6或4的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域技术人员应了解，所有该等不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时，两个序列的总体相同性％并不显著改变。
可使用本发明的蛋白质序列或核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索，以例如鉴别其他家族成员或相关序列。该等搜索可使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN及BLASTP程序(2.0版)来实施。BLAST蛋白搜索可利用BLASTP程序、评分＝50、字长＝3来实施，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位化比对，可如以下中所述利用空位化BLAST：Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402。在利用BLAST及空位化BLAST程序时，可使用各别程序(例如，BLASTP及BLASTN)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
此外，本发明提供包含如本文所述的PPV VP2的免疫原性组合物。因此，本发明提供包含猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)的免疫原性组合物，该猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列。
术语“免疫原性组合物”系指包含至少一种在施用免疫原性组合物的宿主中诱发免疫学反应的抗原的组合物。该免疫学反应可为对本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫反应。优选地，免疫原性组合物诱导免疫反应且更优选地赋予抵抗PPV感染的一或多种临床体征的保护免疫性。宿主亦阐述为“个体”。优选地，本文所阐述或提及的任一宿主或个体系猪。
通常，“免疫学反应”包括但不限于一或多种下列效应：产生或活化特异性地针对本发明免疫原性组合物中所包括的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主显示保护免疫学反应或治疗反应。
“保护免疫学反应”或“保护免疫性”展现为减少或缺乏通常由受感染宿主显示的临床体征、较快恢复时间和/或较低感染性持续时间或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的较低病原体效价。
若宿主显示保护免疫学反应以便对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度有所减小，则将免疫原性组合物阐述为“疫苗”。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物经调配用于单一剂量施用。
本文中别处定义单一剂量的体积。
优选地，局部或全身性施用免疫原性组合物。常用的适宜施用途径系经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，视化合物的性质及作用模式而定，亦可藉由其他途径施用免疫原性组合物。然而，最优选地，经肌内施用免疫原性组合物。
在本发明的一个实施方式中，经肌内施用免疫原性组合物。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物对于怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪系安全的。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物对于妊娠30天、优选妊娠40天的后备母猪和/或经产母猪系安全的。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂。
术语“医药上可接受的载剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
在本发明的一个实施方式中，医药上可接受的载剂系卡波姆(carbomer)。
优选地，免疫原性组合物可进一步包括一或多种其他免疫调节剂，例如白介素、干扰素或其他细胞因子。可用于本发明背景中的佐剂及添加剂的量及浓度可易于由本领域技术人员测定。
在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂素，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。具体而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(具体而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更具体而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，具体而言异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选系非离子表面活性剂，具体而言以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如，无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其视情况经乙氧基化)，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具体而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application ofAdjuvants(编辑Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley and Sons,NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。实例性佐剂系由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press,1995的第147页上阐述的SPT乳液、及同一本书第183页上阐述的乳液MF59。
佐剂的另一实例系选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物系丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。该等化合物以术语卡波姆(carbomer)为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述与具有至少3个、优选不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团替代。优选基团系含有2至4个碳原子者，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团。该等不饱和基团本身可含有其他取代基，例如甲基。以名称卡波普(Carbopol)(BFGoodrich,Ohio,USA)销售的产品特别适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。其中，可以提及卡波普974P、934P及971P。最优选使用卡波普971P。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中系共聚物EMA(Monsanto)，其系马来酸酐与乙烯的共聚物。该等聚合物在水中溶解产生酸溶液，其将被中和、优选至生理pH，以产生佐剂溶液，其中将引入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身。
其他适宜佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽、或天然或重组细胞因子或其类似物，或内源细胞因子释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量、优选以每剂量约100μg至约10mg的量、更优选以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量、且最优选以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选约2％至30％的浓度，更优选约5％至25％的浓度，仍更优选约7％至22％的浓度，且最优选10％至20％的浓度。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物包含介于约0.1μg与50μg之间的PPVVP2抗原。优选地，免疫原性组合物包含介于约0.2μg与40μg之间、更优选介于约0.3μg与30μg之间、更优选介于约0.4μg与20μg之间且甚至更优选介于约0.5μg与10μg之间且最优选地0.5μg、0.75μg、1μg、1.25μg、1.5μg、2μg、2.5μg、3μg、3.5μg、4μg、4.5μg、5μg、5.5μg、6μg、6.5μg、7μg、7.5μg、8μg、8.5μg、9μg、9.5μg或10μg的量的PPV VP2抗原。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物系疫苗。
术语“疫苗”已经在本文中别处阐述。然而，若宿主显示保护免疫学反应以便对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度有所减小，则将免疫原性组合物阐述为“疫苗”。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。有利地，由本发明提供的实验数据揭示本发明疫苗具有宽保护谱，此乃因该疫苗提供保护以抵抗异源北美以及异源欧洲攻击毒株。
术语“保护”及“预防”及“防止”在本申请案中可互换使用。在别处定义该等术语。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株攻击。
术语“北美及欧洲分离株”为本领域技术人员熟知。术语“北美和/或欧洲分离株”涵盖已在或将在北美及欧洲分离出的所有分离株。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物交叉提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物有效治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染引起的临床体征。术语“治疗和/或预防”、“临床体征”及“有需要”在别处定义。
此外，本发明提供包含编码如本文所述的PPV VP2的核苷酸序列的多核苷酸。
此外，本发明提供包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸。
此外，本发明提供包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列或由其组成的多核苷酸。
此外，本发明提供包含如本文所述的多核苷酸的载体。
在本发明的一个实施方式中，载体系表达载体。
在本发明的一个实施方式中，载体系杆状病毒。
术语“载体”为本领域技术人员熟知。术语“载体”如业内已知系指用于将遗传物质传递至宿主细胞的多核苷酸构建体，通常为质粒或病毒。载体可为(例如)病毒、质粒、黏粒或噬菌体。如本文所用载体可由DNA或RNA构成。在一些实施例中，载体由DNA构成。“表达载体”是当其存在于适当环境中时能引导由载体所携带的一或多个基因编码的蛋白质表达的载体。载体优选能自主复制。通常，表达载体包含转录启动子、基因及转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制下，且据称基因“可操作连接至”启动子。
如本文所用术语“可操作连接”用于阐述调节组件与基因或其编码区之间的连结。通常，基因表达置于一或多个调节组件(例如但不限于组成型或可诱导型启动子、组织特异性调节组件及增强子)控制下。据称基因或编码区“可操作连接至”或“以可操作方式连接至”或“可操作缔合至”调节组件意指基因或编码区由调节组件控制或影响。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作连接至编码序列。
载体及制备和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可藉由或类似于以下中揭示的方法来达成：尤其美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO96/39491、WO 95/30018；Paoletti，“Applications of pox virus vectors tovaccination:An update”，PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss，“Geneticallyengineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,andsafety”，PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编辑),Methods in Molecular Biology39,“BaculovirusExpression Protocols”(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of HumanBeta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector“，Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression of Escherichia coli BGalactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector“，Molecular andCellular Biology 1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370573；于1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号；欧洲专利公开案第0 265 785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman，“The function of herpes simplex virus genes:A primerfor genetic engineering of novel vectors”，PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineered herpes simplexviruses to the treatment of experimental brain tumors“，PNAS USA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors for gene deliveryto B lymphocytes”，PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications”，PNAS USA 93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；于1996年7月3日提出申请的允许的美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus as cloningvectors”，Seminars in Virology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham,Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccines encodingglycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,induces protectiveimmunity in animal models of herpes simplex virus-2disease“，PNAS USA 93:11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号，以及WO 90/11092、WO 93/19183、WO 94/21797、WO 95/11307、WO 95/20660；Tang等人，Nature，及Furth等人，Analytical Biochemistry，其系关于DNA表达载体。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars inImmunology，第9卷，第271-283页(1997)(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文引用的其他文件。
术语“调节组件”及“表达控制组件”可互换使用且系指可影响可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中表达的核酸分子。该等术语广泛地用于并涵盖促进或调节转录的所有组件，包括启动子、RNA聚合酶及转录因子的基本相互作用所需的核心组件、上游组件、增强子及反应元件。原核生物中的实例性调节组件包括启动子、操纵子序列及核糖体结合位点。用于真核细胞的调节组件可包括(但不限于)转录及翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号、内部核糖体进入组件(IRES)、2A序列及诸如此类，其提供和/或调节编码序列的表达和/或编码多肽在宿主细胞中的产生。
如本文所用术语“启动子”系允许RNA聚合酶结合并引导基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'-非编码区，靠近基因的转录起始位点。启动子内用于起始转录的序列组件通常特征在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及哺乳动物(包括人类)的启动子。启动子可为可诱导型、可阻抑型和/或组成型。可诱导型启动子因应培养条件的一些变化(例如温度变化)而起始在其控制下自DNA的高程度转录。
如本文所用术语“增强子”系指可增加转录效率、而与增强子相对于转录起始位点的距离或取向无关的一类调节组件。
病毒载体的生成可使用业内熟知的任何适宜基因工程技术来完成，该等技术包括但不限于限制内核酸酶消化、接合、转化、质粒纯化及DNA测序的标准技术，例如如以下中所述：Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1989))。
术语“杆状病毒”为本领域技术人员熟知。然而，如本文所用“杆状病毒”具体而言意指使用经设计以表达期望蛋白的重组杆状病毒载体在昆虫细胞中产生该蛋白质的系统。杆状病毒表达系统通常包含在昆虫细胞中实现重组蛋白表达所必需的所有组件，并且通常涉及杆状病毒载体的工程化以表达期望蛋白，将工程化杆状病毒载体引入昆虫细胞中，在适宜生长培养基中培养含有工程化杆状病毒载体的昆虫细胞从而表达所需蛋白质，并回收蛋白质。通常，工程化杆状病毒载体涉及重组杆状病毒的构建及分离，其中所选基因的编码序列插入非必需病毒基因的启动子之后，其中目前使用的大部分杆状病毒表达系统系基于加州苜蓿夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)的序列((Virology 202(2),586-605(1994)，NCBI登录号：NC_001623)。杆状病毒表达系统为业内熟知且已阐述于以下中：例如“Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual”，David R.O'Reilly,Lois Miller,Verne Luckow，由OxfordUniv.Press(1994)公开，“The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide”，Linda A.King,R.D.Possee，由Chapman&Hall(1992)公开。用于产生重组蛋白的杆状病毒系统的实例性非限制性实例阐述于(例如)WO 2006/072065 A2中。
优选杆状病毒载体包括杆状病毒，例如BaculoGold(BD BiosciencesPharmingen,San Diego,Calif.)或DiamondBac(Sigma Aldrich)，具体而言条件系产生细胞系昆虫细胞。尽管杆状病毒表达系统优选，但本领域技术人员应理解，其他表达系统将用于本发明的目的。
此外，本发明提供包含如本文所述的多核苷酸或载体的细胞。优选地，载体系杆状病毒。
术语“细胞”为本领域技术人员熟知。术语“细胞”涵盖真核细胞，例如动物细胞、原生生物细胞、植物细胞或真菌细胞。优选地，真核细胞系哺乳动物细胞(例如CHO、BHK或COS)或真菌细胞(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或昆虫细胞(例如Sf9)。
在本发明的一个实施方式中，细胞系昆虫细胞。
如本文所用“昆虫细胞”意指源自昆虫物种的细胞或细胞培养。关于本发明尤其感兴趣的是源自物种草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的昆虫细胞。
优选地，如本文提及的昆虫细胞系草地贪夜蛾(Sf)细胞或来自源自草地贪夜蛾的细胞系的细胞，并且更优选选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。分别地，如本文提及的昆虫细胞优选系草地贪夜蛾(Sf)细胞或来自源自草地贪夜蛾的细胞系的细胞，且更优选选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。
在本发明的一个实施方式中，昆虫细胞选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。
此外，本发明提供包含如本文所述的PPV VP2的病毒样颗粒。
术语“病毒样颗粒”(VLP)涵盖来自病毒的非复制的空病毒壳。VLP通常由一或多种病毒蛋白构成，例如但不限于称为衣壳、壳体、壳、表面和/或包膜蛋白的彼等蛋白或源自该等蛋白的颗粒形成多肽。VLP可在蛋白质重组表达后在适当表达系统中自发形成。可以使用业内已知的习用技术、例如藉由电子显微镜、X射线结晶学及诸如此类来检测病毒蛋白重组表达后VLP的存在。参见(例如)Baker等人，Biophys.J.(1991)60:1445-1456；Hagensee等人，J.Virol.(1994)68:4503-4505。例如，可在所讨论的VLP制剂的玻璃化水性样品上实施冷冻电子显微镜检查，并且在适当暴露条件下记录影像。
术语“病毒样颗粒”(VLP)亦涵盖由复数种PPV VP2构成的VLP。
在本发明的一个实施方式中，病毒样颗粒由复数种如本文所述的PPV VP2构成。
此外，本发明提供产生如本文所述的PPV VP2的方法，其包含用如本文所述的载体转染细胞。
此外，本发明提供产生如本文所述的PPV VP2的方法，其包含用如本文所述的杆状病毒感染细胞、优选昆虫细胞。
若期望，组合物可在包或分配器装置中呈递，该包或分配器装置可含有一或多个含有活性成分的单位剂型。包可(例如)包含金属或塑料箔，例如泡罩包。该包或分配器装置可伴有施用说明书，优选施用动物、尤其猪。该(等)容器可附带有监管医药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告显示该机构已批准用于人类施用的制造、使用或销售。
因此，本发明提供包含如本文所述的PPV VP2或免疫原性组合物的试剂盒。
在本发明的一个实施方式中，试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防猪的疾病的说明书。
在本发明的一个实施方式中，试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防PPV感染的说明书。
在本发明的另一实施方式中，本发明的PPV病毒已被灭活，从而产生具有如本文所述的病毒蛋白2(VP2)的整个灭活病毒。
因此，本发明亦系指具有病毒蛋白2(VP2)的灭活的猪细小病毒(PPV)，该病毒蛋白2(VP2)
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列。
此外，本发明亦系指具有病毒蛋白2(VP2)的灭活的猪细小病毒(PPV)，该病毒蛋白2(VP2)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。
此外，本发明亦系指包含具有如本文所述的病毒蛋白2(VP2)的灭活的猪细小病毒(PPV)的免疫原性组合物。
因此，本发明亦系指包含具有病毒蛋白2(VP2)的灭活的猪细小病毒(PPV)的免疫原性组合物，该病毒蛋白2(VP2)
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列。
因此，本发明亦系指包含具有病毒蛋白2(VP2)的灭活的猪细小病毒(PPV)的免疫原性组合物，该病毒蛋白2(VP2)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。
任一习用灭活方法皆可用于本发明目的。因此，可藉由本领域技术人员已知的化学和/或物理处理来实施灭活。优选灭活方法包括添加环化二元乙烯亚胺(BEI)，其包括添加2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(其经环化成二元乙烯亚胺(BEI))的溶液。优选的其他化学灭活剂包括(但不限于)Triton X-100、脱氧胆酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、酚及甲醛(福尔马林(Formalin))。然而，灭活亦可包含中和步骤。优选中和剂包括(但不限于)硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠及诸如此类。
优选的福尔马林灭活条件包括介于约0.02％(v/v)-2.0％(v/v)、更优选约0.1％(v/v)-1.0％(v/v)、仍更优选约0.15％(v/v)-0.8％(v/v)、甚至更优选约0.16％(v/v)-0.6％(v/v)且最优选约0.2％(v/v)-0.4％(v/v)之间的福尔马林浓度。培育时间取决于PPV的抗性。一般而言，实施灭活过程直至在适宜培养系统中可不检测到PPV生长为止。
优选地，本发明灭活的PPV系优选使用如上文所述的浓度的福马林的灭活。
可使用已知技术(例如阐述于Nature,1974,252,252-254或Journal ofImmunology,1978,120,1109-13中者)将本发明的灭活PPV纳入脂质体中。在本发明的另一实施例中，本发明的灭活PPV可偶联至适宜生物化合物(例如多醣、肽、蛋白质或诸如此类或其组合)。
本发明亦系指以下的用途：
-如本文所述的PPV VP2，
-如本文所述的免疫原性组合物，
-如本文所述的多核苷酸，
-如本文所述的载体，
-如本文所述的细胞，
-如本文所述的杆状病毒，和/或
-如本文所述的病毒样颗粒其用于制备药剂、优选疫苗。
本发明亦系指如本文所述的PPV VP2或如本文所述的免疫原性组合物的用途，其用于制备用于治疗和/或预防PPV感染、减轻、预防和/或治疗由PPV感染引起的临床体征和/或治疗和/或预防由PPV感染引起的疾病的药剂。
此外，本发明提供对个体进行免疫的方法，其包含向该个体施用如本文所述的免疫原性组合物。
术语“免疫”系关于藉由以下方式达成的主动免疫：向欲进行免疫的个体施用免疫原性组合物，藉此引起针对该免疫原性组合物中所包括的抗原的免疫学反应。
优选地，免疫使得减小畜群中特定PPV感染的发病率和/或降低由特定PPV感染引起或与其相关的临床体征的严重程度。
此外，使用如本文所提供的免疫原性组合物对有需要的个体进行免疫使得可预防由PPV感染的个体的感染。甚至更优选地，免疫针对PPV感染产生有效、长效、免疫学反应。应理解，该时间段将持续1个月以上、优选2个月以上、优选3个月以上、更优选4个月以上、更优选5个月以上、更优选6个月以上。应理解，免疫不能在进行免疫的所有个体中皆有效。然而，该术语对需要畜群的大部分个体进行有效免疫。
优选地，在此上下文中设计通常(亦即未进行免疫)将发生由PPV感染引起或与其相关的临床体征的个体畜群。本领域技术人员可确定畜群个体是否经有效免疫而无需赘言。优选地，若与未进行免疫或利用在本发明之前获得的免疫原性组合物免疫，但随后由特定PPV感染的个体相比，至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、仍更优选至少95％且最优选100％的给定畜群个体的临床体征在发病率或严重程度方面减轻至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、仍更优选至少90％、仍更优选至少95％且最优选100％，则免疫将有效。
此外，本发明提供治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染引起的临床体征的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
有利地，如本文实例部分中所示，已证明如本文提供的免疫原性组合物可有效治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染引起的临床体征。
术语“治疗和/或预防”系指减小畜群中特定PPV感染的发病率或降低由特定PPV感染引起或与其相关的临床体征的严重程度。因此，术语“治疗和/或预防”亦系指与动物尚未接受如本文所提供的免疫原性组合物的动物群相比，在动物已接受有效量的该等免疫原性组合物的动物群中，减小畜群中感染特定PPV的动物数量(＝减小特定PPV感染的发病率)和/或降低通常与PPV感染相关或由其引起的临床体征的严重程度。
“治疗和/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用需要此一治疗/预防或可自其获益的个体或个体畜群。术语“治疗”系指在个体或畜群的至少一些动物已感染该PPV且其中该等动物已显示由该PPV感染引起或与其相关的一些临床体征后，施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”系指在该个体经PPV任何感染之前或至少在该动物或动物群中没有动物不显示由该PPV感染引起或与其相关的任一临床体征之前，向个体施用。术语“预防”及“防止”在本申请案中可互换使用。
本文所用的术语“有效量”意指但不限于诱发或能够诱发个体中的免疫反应的抗原量。该有效量能够减小畜群中特定PPV感染的发病率和/或降低特定PPV感染的临床体征的严重程度。
优选地，与未经治疗或利用在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后由特定PPV感染的个体相比，临床体征在发病率或严重程度方面减轻至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、仍更优选至少90％、仍更优选至少95％且最优选100％。
如本文所用术语“临床体征”系指个体感染PPV的体征。感染的临床体征取决于所选病原体。该等临床体征的实例包括(但不限于)暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。可直接观察到的临床症状的实例包括窝仔数减少、每窝胚胎或胎儿干尸化增加、胚胎或胎儿自溶、胚胎或胎儿大小减小、胚胎或胎儿重量减轻及诸如此类或其组合。该等临床体征的其他实例包括(但不限于)病毒血症增加、靶向组织及血液内的病毒负荷增加、PPV向同舍动物(penmate)的传播/棚舍扩散(shed spread)增加及诸如此类或其组合。
优选地，与未经治疗或利用在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后由特定PPV感染的个体相比，经治疗个体的发病率或严重程度减轻的临床体征系指暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
本文所用的术语“有需要(in need或of need)”意指，施用/治疗与加强或改良健康或临床体征或对于接受本发明的免疫原性组合物的动物(包括其胚胎或胎儿)的健康的任一其他正性医学效应。
术语“减少”(“reducing”或“reduced”或“reduction”)或“降低”(“lower”)在本申请案中可互换使用。术语“减少”意指与未经治疗(或免疫)但随后由特定PPV感染的个体相比，临床体征减少至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、仍更优选至少95％、最优选100％。
此外，本发明提供与相同物种的非免疫对照组的个体相比，减少个体的生殖失败的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
有利地，如实例部分中所示，已证明如本文提供的免疫原性组合物可有效减少生殖失败。
此外，本发明提供与相同物种的非免疫对照组的个体相比，减少个体的胚胎及胎儿死亡的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
有利地，如实例部分中所示，已证明如本文提供的免疫原性组合物可有效减少胚胎及胎儿死亡。
此外，本发明提供对育种猪(经产母猪及后备母猪)进行主动免疫用于保护胚胎及胎儿抵抗猪细小病毒感染的方法，该方法包含向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
在本发明的一个实施方式中，该个体系选自由猪、牛、猫及狗组成的群。
优选地，该个体系猪。必须了解，猪包含雌性及雄性动物。精液可含有PPV，且出于该原因，词语“猪”涵盖雌性及雄性育种动物。因此，词语“猪”包含雄性动物(例如公猪)以及雌性动物(例如后备母猪及经产母猪)。
如本文所用术语“后备母猪”系指在首次妊娠/怀孕之前及期间的猪类、优选猪。相反，如本文所用术语“经产母猪”系指在首次产小猪(作为其首次妊娠/怀孕的阳性结果)之后的猪类、优选猪。
在本发明的一个实施方式中，该个体系猪、优选后备母猪和/或经产母猪。
在本发明的一个实施方式中，施用免疫原性组合物一次。
应理解，单一剂量仅施用一次。
每一个体的剂量体积取决于疫苗接种的途径及个体的年龄。优选地，单一剂量的总体积介于约0.2ml与2.5ml之间，更优选介于约0.2ml与2.0ml之间，甚至更优选介于约0.2ml与1.75ml之间，仍更优选介于约0.2ml与1.5ml之间，甚至更优选介于约0.4ml与1.25ml之间，甚至更优选介于约0.4ml与1.0ml之间，其中单一0.5ml剂量或1.0ml剂量最优选。最优选地，单一剂量的总体积为0.5ml、1ml、1.5ml或2ml。
在本发明的一个实施方式中，以两个或更多个剂量施用免疫原性组合物。
如本文实例部分中所示，已证实如本文所提供的免疫原性组合物在向有需要的个体施用两个剂量之后有效。
然而，免疫原性组合物可以两个或更多个剂量施用，其中第一剂量系在施用第二(追加)剂量之前施用。优选地，第二剂量系在第一剂量之后至少15天施用。更优选地，第二剂量系在第一剂量之后15天与40天之间施用。甚至更优选地，第二剂量系在第一剂量之后至少17天施用。仍更优选地，第二剂量系在第一剂量后17天与30天之间施用。甚至更优选地，第二剂量系在第一剂量之后至少19天施用。仍更优选地，第二剂量系在第一剂量后19天与25天之间施用。最优选地，第二剂量系在第一剂量之后至少21天施用。甚至更优选地，第二剂量系在第一剂量后约21天或第一剂量后21天施用。在两次施用方案的优选实施方式中，免疫原性组合物的第一及第二剂量二者系以相同量施用。优选地，每一剂量系以上文指定的优选量，第一及第二剂量以1ml或2ml的剂量最优选。除第一及第二剂量方案外，替代实施例包含其他后续剂量。举例而言，在该等实施方式中可施用第三、第四或第五剂量。优选地，以与第一剂量相同的量施用后续第三、第四及第五剂量方案，其中各剂量之间的时间范围与上文所提及第一及第二剂量之间的时间一致。
每一个体的剂量体积取决于疫苗接种的途径及个体的年龄。优选地，总体积介于约0.2ml与5ml之间，更优选介于约0.5ml与3.0ml之间，甚至更优选介于约1.0ml与2.5ml之间，甚至更优选介于约1.0ml与2.0ml之间。最优选地，每剂量的体积系1ml、1.5ml、2ml或2.5ml。
优选地，局部或全身性施用免疫原性组合物。常用的适宜施用途径系经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、皮内、经皮、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，视化合物的性质及作用模式而定，亦可藉由其他途径施用免疫原性组合物。举例而言，该等其他途径包括皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、贲门内、小叶内、叶内、髓内、肺内、直肠内及阴道内。然而，更优选地，经皮下或肌内施用免疫原性组合物。最优选地，经肌内施用免疫原性组合物。
在本发明的一实施方式中，经肌内施用该免疫原性组合物。
在本发明的一个实施方式中，将该免疫原性组合物施用后备母猪和/或经产母猪。
优选地，将免疫原性组合物施用至少3月龄、更优选至少4月龄、最优选至少5月龄之后备母猪和/或经产母猪。
在本发明的一个实施方式中，将免疫原性组合物施用至少3月龄之后备母猪和/或经产母猪。
在本发明的一个实施方式中，将该免疫原性组合物施用怀孕之前之后备母猪和/或经产母猪。
在2注射方案中，优选在配种/授精之前2、3、4或5周、最优选在配种/授精之前约3周将该免疫原性组合物的第二剂量施用后备母猪和/或经产母猪。优选地，在施用第二剂量之前2、3、4、5或6周、最优选在施用第二剂量之前约3周将该免疫原性组合物的第一剂量施用后备母猪和/或经产母猪。然而，在施加2注射方案后，优选地，每3、4、5、6、7或8个月、最优选约每6个月对后备母猪和/或经产母猪重新疫苗接种。
在本发明的一个实施方式中，将该免疫原性组合物施用怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物对于怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物对于妊娠30天、优选妊娠40天之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
优选地，本发明的免疫原性组合物包含介于0.1μg与50μg之间、优选介于0.25μg与25μg之间、更优选介于0.5μg与12.5μg之间、甚至更优选介于0.5μg与5μg之间、最优选介于0.5μg与2μg之间的PPV VP2抗原。更优选地，本发明的免疫原性组合物包含约0.25μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.25μg、1.5μg、1.75μg、2μg、2.25μg、2.5μg、2.75μg、3μg、3.5μg、4μg、4.5μg或5μg的量的本发明的PPV VP2抗原。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物包含介于0.1μg与50μg之间的PPVVP2抗原、优选介于0.5μg与10μg之间的PPV VP2抗原。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株攻击。
在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物交叉提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株。
在本发明的一个实施方式中，与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，该方法引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
在本发明的一个实施方式中，与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，该方法引起选自由以下组成的群的效能参数改良：窝仔数减少、每窝胚胎或胎儿干尸化增加、胚胎或胎儿自溶、胚胎或胎儿大小减小、胚胎或胎儿重量减轻、病毒血症增加、靶向组织及血液内的病毒负荷增加、PPV向同舍动物的传播/棚舍扩散增加或其组合。
实施方案
本文中亦阐述以下方案：
1.一种猪细小病毒(PPV)病毒蛋白2(VP2)，其
-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或
-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或
-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，
其中该等氨基酸位置的编号参考野生型PPV VP2的氨基酸序列。
2.如方案1的PPV VP2，其中该PPV VP2进一步
-在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和/或
-在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基。
3.如方案1或2的PPV VP2，其中该等氨基酸位置的编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
4.如方案1至3中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2系重组PPV VP2。
5.如方案1至4中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2系重组杆状病毒表达的PPVVP2。
6.如方案1至5中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。
7.如方案1至6中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。
8.如方案1至6中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成，或包含具有至少210、至少250或至少300个来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的连续氨基酸残基的任一片段或由其组成。
9.如方案1至6中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成。
10.如方案1至9中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
11.如方案1至10中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
12.如方案1至11中任一方案的PPV VP2，其中该PPV VP2系由编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
13.一种免疫原性组合物，其包含如方案1至12中任一方案的PPV VP2。
14.如方案13的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物经调配用于单一剂量施用。
15.如方案13或14的免疫原性组合物，其中经肌内施用该免疫原性组合物。
16.如方案13至15中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于在怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
17.如方案13至16中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于妊娠30天、优选妊娠40天之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
18.如方案13至17中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂。
19.如方案18的免疫原性组合物，其中该医药上可接受的载剂系卡波姆。
20.如方案13至19中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含介于0.1μg与50μg之间的PPV VP2抗原、优选介于0.5μ与10μg之间的PPV VP2抗原。
21.如方案13至20中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物系疫苗。
22.如方案13至21中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
23.如方案13至22中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株攻击。
24.如方案13至23中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物交叉提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株。
25.如方案13至24中任一方案的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物有效治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染引起的临床体征。
26.一种多核苷酸，其包含编码如方案1至12中任一方案的PPV VP2的序列。
27.一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的核苷酸序列。
28.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列或由其组成。
29.一种载体，其包含如方案26至28中任一方案的多核苷酸。
30.如方案29的载体，其中该载体系表达载体。
31.如方案29或30的载体，其中该载体系杆状病毒。
32.一种细胞，其包含如方案26至28中任一方案的多核苷酸或如方案29至31中任一方案的载体。
33.如方案32的细胞，其中该细胞系昆虫细胞。
34.如方案33的昆虫细胞，其中该昆虫细胞是选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。
35.一种病毒样颗粒，其包含如方案1至12中任一方案的PPV VP2。
36.如方案35的病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒由复数种如方案1至12中任一方案的PPV VP2构成。
37.一种产生如方案1至12中任一方案的PPV VP2的方法，其包含用如方案29至31中任一方案的载体转染细胞。
38.一种产生如方案1至12中任一方案的PPV VP2的方法，其包含用如方案31的杆状病毒感染细胞、优选昆虫细胞。
39.一种试剂盒，其包含如方案1至25中任一方案的PPV VP2或免疫原性组合物。
40.如方案39的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防猪的疾病的说明书。
41.如方案39的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防PPV感染的说明书。
42.一种以下各项的用途，
-如方案1至12中任一方案的PPV VP2，
-如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物，
-如方案26至28中任一方案的多核苷酸，
-如方案29至31中任一方案的载体，
-如方案32至34中任一方案的细胞，
-如方案31的杆状病毒，和/或
-如方案35或36的病毒样颗粒
其用于制备药剂、优选疫苗。
43.一种如方案1至12中任一方案的PPV VP2或如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物的用途，其用于制备用于治疗和/或预防PPV感染、减轻、预防和/或治疗由PPV感染引起的临床体征和/或治疗和/或防由PPV感染引起的疾病的药剂。
44.一种对个体进行免疫的方法，其包含向该个体施用如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物。
45.一种治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染引起的临床体征的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物。
46.一种与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，减少个体的生殖失败的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物。
47.一种与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，减少个体的胚胎及胎儿死亡的方法，该方法包含向该个体施用治疗有效量的如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物。
48.如方案44至47中任一方案的方法，其中该个体系选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
49.如方案44至48中任一方案的方法，其中该个体系猪、优选后备母猪和/或经产母猪。
50.如方案44至49中任一方案的方法，其中施用该免疫原性组合物一次。
51.如方案44至49中任一方案的方法，其中以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物。
52.如方案44至51中任一方案的方法，其中经肌内施用该免疫原性组合物。
53.如方案44至52中任一方案的方法，其中将该免疫原性组合物施用后备母猪和/或经产母猪。
54.如方案44至53中任一方案的方法，其中将该免疫原性组合物施用至少3月龄之后备母猪和/或经产母猪。
55.如方案44至54中任一方案的方法，其中将该免疫原性组合物施用怀孕之前之后备母猪和/或经产母猪。
56.如方案44至54中任一方案的方法，其中将该免疫原性组合物施用在怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪。
57.如方案44至56中任一方案的方法，其中该免疫原性组合物对于怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
58.如方案44至57中任一方案的方法，其中该免疫原性组合物对于妊娠30天、优选妊娠40天之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
59.如方案44至58中任一方案的方法，其中该免疫原性组合物包含介于0.1μg与50μg之间的PPV VP2抗原、优选介于0.5μg与10μg之间的PPV VP2抗原。
60.如方案44至59中任一方案的方法，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
61.如方案44至60中任一方案的方法，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株攻击。
62.如方案44至61中任一方案的方法，其中该免疫原性组合物交叉提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株。
63.如方案44至62中任一方案的方法，其中与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，该方法引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
64.一种如方案44至63中任一方案使用的免疫原性组合物，其中与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，该方法引起选自由以下组成的群的效能参数改良：窝仔数减少、每窝胚胎或胎儿干尸化增加、胚胎或胎儿自溶、胚胎或胎儿大小减小、胚胎或胎儿重量减轻、病毒血症增加、靶向组织及血液内的病毒负荷增加、PPV向同舍动物的传播/棚舍扩散增加或其组合。
65.如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物，其用于对个体进行免疫的方法中，该方法包含向该个体施用该免疫原性组合物。
66.如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的个体中由PPV感染引起的临床体征的方法中，该方法包含向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
67.如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物，其用于与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，减少个体的生殖失败的方法中，该方法包含向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
68.如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物，其用于与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，减少个体的胚胎及胎儿死亡的方法中，该方法包含向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
69.如方案65至68中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该个体系选自由猪、牛、猫及狗组成的列表。
70.如方案65至69中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该个体系猪、优选后备母猪和/或经产母猪。
71.如方案65至70中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中施用该免疫原性组合物一次。
72.如方案65至70中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物。
73.如方案65至72中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中经肌内施用该免疫原性组合物。
74.如方案65至73中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用后备母猪和/或经产母猪。
75.如方案65至74中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中将免疫原性组合物施用至少3月龄之后备母猪和/或经产母猪。
76.如方案65至75中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用怀孕之前之后备母猪和/或经产母猪。
77.如方案65至75中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中将该免疫原性组合物施用怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪。
78.如方案65至77中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于怀孕及哺乳期间之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
79.如方案65至78中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物对于妊娠30天、优选妊娠40天之后备母猪和/或经产母猪系安全的。
80.如方案65至78中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含介于0.1μg与50μg之间的PPV VP2抗原、优选介于0.5μg与10μg之间的PPV VP2抗原。
81.如方案65至80中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
82.如方案65至81中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株攻击。
83.如方案65至82中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物交叉提供保护以抵抗北美和/或欧洲分离株。
84.如方案65至83中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，该方法引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
85.如方案65至84中任一方案所使用的免疫原性组合物，其中与相同物种的未经免疫的对照组的个体相比，该方法引起选自由以下组成的群的效能参数改良：窝仔数减少、每窝胚胎或胎儿干尸化增加、胚胎或胎儿自溶、胚胎或胎儿大小减小、胚胎或胎儿重量减轻、病毒血症增加、靶向组织及血液内的病毒负荷增加、PPV向同舍动物的传播/棚舍扩散增加或其组合。
86.一种对育种猪(经产母猪及后备母猪)进行主动免疫用于保护胚胎及胎儿抵抗猪细小病毒感染的方法，该方法包含向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用治疗有效量的如方案13至25的免疫原性组合物。
87.如方案13至25中任一方案的免疫原性组合物，其用于对育种猪(经产母猪及后备母猪)进行主动免疫用于保护胚胎及胎儿抵抗猪细小病毒感染的方法中，该方法包含向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用治疗有效量的该免疫原性组合物。
实施例
下文阐述以下实施例以阐释本发明的具体实施例。该等实施例仅具有阐释性且不应理解为限制本发明的范围或基本原理。
实施例1：
亚单位PPV疫苗的制备
基于德国PPV 27a分离株，选择PPV VP2抗原以在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。自基因库登录号AY684871.1获得猪细小病毒(PPV)27aVP2核苷酸序列。将PPV 27a VP2编码区逆翻译并针对果蝇属(Drosophila)进行密码子优化(SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3)。密码子优化的PPV 27a VP2基因系在Integrated DNA Technologies化学合成。随后将PPV27a基因亚克隆至杆状病毒转移载体pVL1393中，并与线性化杆状病毒主链共转染至Sf9昆虫细胞中以在多角体蛋白启动子控制下产生含有PPV27a VP2基因的重组杆状病毒。
当在Sf9昆虫细胞中表达时，PPV VP2自装配成无包膜的VLP(数据未显示)。
将PPV VP2抗原用卡波姆(卡波普)佐剂化。
实施例2：
PPV疫苗的概念性验证研究
在所有动物研究中，动物在研究开始之前处于良好健康及营养状态。在随机化程序之前执行健康检查。在研究持续期间使用未加药饲料。根据设施标准操作程序，饲料口粮适合测试动物的年龄、状况及物种。在整个研究过程中随意提供水。
此疫苗接种-攻击研究的目的系为育种前亚单位猪细小病毒(PPV)疫苗确立概念性验证剂量测定效能(参见实施例1)。在大约妊娠40天(dG)，对后备母猪进行疫苗接种及育种，之后用活的毒力PPV分离株(PPV 002346-5；北美毒株)进行攻击。在大约90dG评估胎儿的PPV感染。
研究设计阐述于表1中。
表1：研究设计
NTX＝未经治疗/未经攻击的对照；IN＝鼻内；IM＝肌内；dG＝妊娠天数。
使用67头源自先前经测试为PPV阴性且无生殖疾病的既往史或针对PPV进行疫苗接种的畜群的后备母猪。将后备母猪随机分成6个治疗组(T)，n＝9，混合至3个畜舍中，在D0接受疫苗接种并在D21加强：T1NC(注射用水的阴性对照)、T2PPV 10μg、T3PC(阳性对照；整个灭活的猪细小病毒(PPV)、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(L.grippotyphosa)、哈德焦钩端螺旋体(L.hardjo)、黄疸出血型钩端螺旋体(L.icterohaemorrhagiae)及波摩那钩端螺旋体(L.Pomona)；有市售；根据制造手册使用)。包括三头未经治疗的对照(NTX)后备母猪，每个畜舍一头。疫苗接种后，使后备母猪同步(经由施用烯丙孕素，IntervetSchering-Plough Animal Health；每个标记持续连续14天，D18至D31)且随后在D35与D42之间育种。67头后备母猪中有54头怀孕。在D80(约40dG)，对NTX后备母猪进行验尸，并以4.25log10TCID50/剂量(2mL经肌内及2mL/鼻孔经鼻内)向其余后备母猪接种6mL PPV毒株PPV002346-5(北美毒株)。除了在同步化及育种期间(D35-D70)，每周皆使后备母猪出血。对D0、D7、D14、D21、D28及D73的血清实施血清学分析；对D80、D87、D94、D101、D108、D115、D122及D128的血清实施针对病毒血症的血清学及聚合酶链式反应(PCR)(如Jozwik等人2009；Journal of General Virology,90,2437-2441中所述)。在D129或D130(约90dG)对后备母猪进行验尸。在验尸时，将每一生殖道移除，并记录胎儿在子宫中的位置、胎儿状况、大小及重量。收集每一胎儿的胸廓洗涤及肺样品。自每一胎儿无菌地收集胸廓洗涤样品。简言的，用无菌针及注射器将3ml无菌PBS注射至胸腔中。将流体吸回注射器中并注射至适宜大小的适当无菌SST(血清分离管)中。藉由PCR测试胸廓洗涤物是否存在PPV，并藉由血球凝集抑制(HI)测试是否存在PPV抗体。将肺组织冷冻保存。
后备母猪病毒血症(PPV)
在D0、D73(数据未显示)及D80(表2)攻击之前，所有后备母猪对PPV病毒血症皆系阴性的。所有阴性对照在D87皆具有病毒血症，且4/7在D94具有病毒血症。
在加强疫苗接种后，疫苗接种后T3后备母猪血清转化。T2对初始疫苗接种具有血清学反应，并在加强疫苗接种后保持血清阳性。T1对照后备母猪对于PPV保持血清学阴性直至攻击。攻击后，所有阴性对照后备母猪在D87(攻击后7天)皆具有病毒血症。一头T3后备母猪在D87具有病毒血症。所有其他后备母猪在该等时间点皆非病毒血症(参见表2)。
藉由对胸廓洗涤样品的PCR，NTX后备母猪保持血清阴性且其胎儿皆系PPV阴性。
表2：在D80妊娠40天(dG)用PPV攻击时PPV阳性(PCR)后备母猪的频率分布。
胎儿结果
在D80验尸时，认为所有NTX胎儿皆正常(表3)。在D129及D130最终验尸时，22.5％的T1(阴性对照)胎儿正常，而T3中98.39％的胎儿及T2中97.62％的胎儿正常。T1(阴性对照)胎儿的平均大小及重量分别系11.5cm及168.8g，而T2中的胎儿的平均大小及重量分别系17.5cm及590.1g。
藉由对胸廓洗涤样品进行PCR测定所有T4(NTX)胎儿皆系PPV阴性(参见表3)。在67/80T1阴性对照胎儿(83.75％)中确认PPV感染。确认感染PPV的67名阴性对照胎儿中有62名系干尸。相反，T2胎儿中仅0.79％确认PPV感染。
基于如欧洲药典(专论01/2008：0965)中所述确立效能的结论参数，所有疫苗[包括阳性对照(全细胞灭活的PPV)]符合防止感染的准则(>80％胎儿系PPV阴性)。
表3：窝仔详情：胎儿的数量、大小、重量及状况以及PPV感染的实验室确认(对胸廓洗涤样品进行PCR)。
结论：
本发明的PPV疫苗显示在毒力异源PPV攻击后对胎儿的保护。研究结果显示，该疫苗在育种前施用时系安全的并可有效地显著减轻胎儿中的病毒血症及经胎盘感染。此外，已显示疫苗提供保护以抵抗异源北美PPV攻击毒株。此外，已显示亚单位PPV VP2蛋白与全病毒灭活苗一样有效。
实施例3：
确立PPV疫苗的最小免疫剂量-提供保护以抵抗异源北美PPV毒株：
此疫苗接种-攻击研究的目的系确立猪细小病毒(PPV)疫苗的最小免疫剂量(MID)。在大约妊娠40天(dG)，用活的毒力PPV血清型1分离株(PPV002346-5)攻击后备母猪。若在攻击后疫苗接种组中≥80％的胎儿对于PPV呈阴性，则认为疫苗系有效的。支持性参数包括胎儿大小、重量及状况、攻击后的后备母猪病毒血症状态及后备母猪血清学状态。
将后备母猪(无生殖疾病或针对PPV疫苗接种的既往史)随机分成治疗组：T01阴性对照(产品匹配的安慰剂(PMP))及T02＝1.0μg PPV/2mL剂量)。将未经治疗/未经攻击(NTX)的后备母猪随机分配至畜舍作为一般健康状况的对照。
在D0及D21向后备母猪肌肉给予2mL适当的治疗。疫苗接种后，在D37与D50之间对后备母猪进行育种，且随后在D74评估怀孕状态。在D81，用6.77log10TCID50/6mL PPV血清型1经肌内及鼻内攻击正妊娠的后备母猪。除了在动情期同步化及育种期间(D36-D73)，每周皆使后备母猪出血。对D7、D14、D21、D28及D35的血清实施血球凝集抑制(HI)分析；对D-3、D74、D80、D88、D95、D102及D127的血清实施针对病毒血症的HI及聚合酶链式反应(PCR)(参见实施例2)。在D128及D129(约90dG)对后备母猪进行尸检。在验尸时，将每一经产母猪的生殖道移除，并记录每一胎儿在子宫中的位置、胎儿状况、大小及重量。自每一胎儿收集胸廓洗涤样品(参见实施例2)并藉由PCR测试PPV的存在。
后备母猪病毒血症(PPV)
认为疫苗系安全的，此乃因动物在疫苗接种后24小时或48小时不显示异常体温，无归因于疫苗的异常局部反应并且无与疫苗接种有关的临床体征(数据未显示)。
在疫苗接种之前、在D74及D80攻击之前，所有后备母猪对于PPV病毒血症皆系阴性的。因此，疫苗接种后，未观察到与疫苗有关的临床体征。在D88，所有10头T01后备母猪皆具有病毒血症，且所有疫苗接种的后备母猪皆系阴性。对于所有治疗组而言，D95、D102及D127的所有其他血样皆呈PPV病毒血症阴性(表4)。
表4：在D81妊娠约40天(dG)用PPV攻击时PPV阳性(PCR)后备母猪的频率分布。
*2头后备母猪已被诊断为未怀孕，且因此自组中移除
胎儿结果
在D128及D129最终验尸时，38％的T01(阴性对照)胎儿系正常状况，而疫苗组中95％的胎儿系正常状况。T01(阴性对照)胎儿的平均大小及重量分别系14.4cm及245.9g，而来自经疫苗接种的母畜的胎儿的平均大小及重量分别系19.3cm及550g(表5)。因此，疫苗组符合防止PPV感染的准则，此乃因由Ph.Eur.01/2008:0965确立的PPV效能的结论参数系治疗组中的>80％胎儿必须呈PPV阴性。
在113/146阴性对照(T01)胎儿(77％)中确认PPV感染。然而，疫苗接种组(T02)中的PPV感染仅为10％。
表5窝仔详情：胎儿的数量、大小、重量及状况以及PPV感染的实验室确认(对胸廓洗涤样品进行PCR)。
结论：
本发明PPV VP2亚单位疫苗显示在用毒力异源PPV攻击后对胎儿的保护。此研究结果揭示，在仅使用1μg PPV VP2亚单位疫苗时，该疫苗安全有效地预防后备母猪中的病毒血症及胎儿中的PPV感染。此外，显示疫苗提供保护以抵抗异源北美攻击毒株。
实施例4：
确立PPV疫苗的最小免疫剂量-提供保护以抵抗异源EU PPV毒株
此研究的目的系评估猪细小病毒疫苗(在本文中亦称为PPV或PPV VP2疫苗)的免疫性发作。另外，使用随机化、盲化、阴性对照疫苗接种-攻击研究设计评估安全性及效能。
将后备母猪随机分配至三个组。在组1及2中，对后备母猪进行两次疫苗接种，其中间隔三周(在D0及D21)。在配种之前三周给予第二剂量。所有治疗皆系藉由肌内(IM)途径以2mL体积施用。组2接受PPV疫苗，而组1系接受无菌稀释剂作为对照产品的安慰剂组，且组3用作严格对照，无任何治疗。
使后备母猪动情期同步化，且第二疫苗接种后三周，对其进行人工授精。在D84在妊娠第39天与第42天之间用毒力异源PPV毒株攻击怀孕的动物。
在D132-135，在约妊娠第90天，将后备母猪安乐死，验尸，并评估胎儿。
表6：研究设计
藉由PCR评估攻击之前及之后的后备母猪的PPV病毒血症：
在疫苗接种之前，在D-6及D-1藉由PCR所有动物皆呈PPV阴性，从而满足纳入准则。疫苗接种后，严格对照及对照产品组中的所有动物在攻击之前皆呈PPV抗原阴性的，因此可以排除攻击前的PPV感染。
在攻击后7天(D90)、14天(D97)及21天(D104)及验尸当天研究病毒血症。攻击后，在疫苗接种的动物中未检测到病毒血症，仅在未疫苗接种的对照动物中出现病毒血症。
在D90(攻击后7天)，95％的未疫苗接种的对照动物已经呈PPV阳性。在D97，60％的该等动物仍具有阳性结果，而在D104，所有动物经测试皆呈PPV阴性。相反，在疫苗接种组中，在D90、D97或D104天测试的所有动物皆呈PPV阴性。
表7：攻击后具有病毒血症的动物数
胎儿结果
PPV感染胎儿的百分比在对照组中系91.4％，但在PPV组中仅系4.3％(参见表8)。
表8：每组的阳性胎儿的百分比及窝仔数
1阳性PPV胎儿数量/每组的胎儿数量。N总数
胎儿状况的评估
评估所有胎儿的状况并将其分为三类：正常、干尸化及自溶。
在对照组中发现大多数干尸化及自溶的胎儿。此组中仅39.8％的胎儿具有正常状况，而在疫苗接种组中，97.4％(PPV组)的胎儿具有正常状况(参见表9)。
表9：胎儿状况
结论：
本发明的PPV疫苗显示在毒力异源PPV攻击后对胎儿的保护，指示当仅使用1μg疫苗时，疫苗对预防胎儿中的病毒血症及PPV感染系安全且有效的。此外，显示疫苗亦提供保护以抵抗PPV的异源欧洲攻击毒株。因此，疫苗具有宽的保护谱，此乃因疫苗提供保护以抵抗异源北美以及异源欧洲攻击毒株。
根据本发明，本文中所揭示及所主张的所有组合物及方法皆可在无需过度实验的情形下进行及执行。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施例予以阐述，但本领域技术人员应明了，可改变该等组合物及方法及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，此并不背离本发明的概念、精神及范畴。更特定而言，应明了，某些在化学及生理上皆相关的试剂可代替本文所述试剂且同时可达成相同或相似结果。本领域技术人员显而易见的所有该等相似替代物及修改皆被视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明精神、范围及概念内。
序列表
<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司
<120> 抗猪细小病毒的疫苗
<130> 01-3228
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (34)

1.一种猪细小病毒病毒蛋白2，其在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，在氨基酸位置414具有丝氨酸残基， 在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基， 在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基， 在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基，其中所述氨基酸位置的编号参考如SEQ ID NO:1中所示的猪细小病毒病毒蛋白2的氨基酸序列，其中所述猪细小病毒病毒蛋白2提供保护以抵抗异源北美以及异源欧洲猪细小病毒攻击毒株。
2.如权利要求1的猪细小病毒病毒蛋白2，其中该猪细小病毒病毒蛋白2：由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至10任一项的氨基酸序列组成，或由编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至10任一项的氨基酸序列的核苷酸序列编码。
3.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2。
4.如权利要求3的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂，其中该医药上可接受的载剂为卡波姆。
5.如权利要求3或4的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物是疫苗。
6.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2的序列。
7.一种载体，其包含如权利要求6的多核苷酸，其中该载体是杆状病毒。
8.一种细胞，其包含如权利要求6的多核苷酸或如权利要求7的载体。
9.一种病毒样颗粒，其包含如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2。
10.一种产生如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2的方法，其包含用如权利要求7的载体转染细胞。
11.如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2在制备用于免疫猪的免疫原性组合物中的用途。
12.如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2在制备用于治疗和/或预防有需要的猪由猪细小病毒感染所引起的临床体征的免疫原性组合物中的用途。
13.如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2在制备用于与相同种的未经免疫的对照组猪相比，减少猪的生殖失败的免疫原性组合物中的用途。
14.如权利要求1至2中任一项的猪细小病毒病毒蛋白2在制备用于与相同种的未经免疫的对照组猪相比，使猪减少胚胎及胎儿死亡的免疫原性组合物中的用途。
15.如权利要求11的用途，其中该免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂，其中该医药上可接受的载剂为卡波姆。
16.如权利要求12的用途，其中该免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂，其中该医药上可接受的载剂为卡波姆。
17.如权利要求13的用途，其中该免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂，其中该医药上可接受的载剂为卡波姆。
18.如权利要求14的用途，其中该免疫原性组合物进一步包含医药上可接受的载剂，其中该医药上可接受的载剂为卡波姆。
19.如权利要求11的用途，其中该免疫原性组合物是疫苗。
20.如权利要求12的用途，其中该免疫原性组合物是疫苗。
21.如权利要求13的用途，其中该免疫原性组合物是疫苗。
22.如权利要求14的用途，其中该免疫原性组合物是疫苗。
23.如权利要求11的用途，其中所述猪为后备母猪和/或经产母猪。
24.如权利要求12的用途，其中所述猪为后备母猪和/或经产母猪。
25.如权利要求13的用途，其中所述猪为后备母猪和/或经产母猪。
26.如权利要求14的用途，其中所述猪为后备母猪和/或经产母猪。
27.如权利要求11的用途，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
28.如权利要求12的用途，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
29.如权利要求13的用途，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
30.如权利要求14的用途，其中该免疫原性组合物提供保护以抵抗同源和/或异源攻击。
31.如权利要求11的用途，其中与相同种未经免疫的对照组的猪相比，所述免疫原性组合物引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
32.如权利要求12的用途，其中与相同种未经免疫的对照组的猪相比，所述免疫原性组合物引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
33.如权利要求13的用途，其中与相同种未经免疫的对照组的猪相比，所述免疫原性组合物引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
34.如权利要求14的用途，其中与相同种未经免疫的对照组的猪相比，所述免疫原性组合物引起选自由以下组成的群的效能参数改良：减少的暂时性白细胞减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖失败或其组合。
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