TWI788309B

TWI788309B - 抗豬小病毒及豬生殖與呼吸道症候群病毒之疫苗及其製造方法

Info

Publication number: TWI788309B
Application number: TW106137854A
Authority: TW
Inventors: 松洽克洛柯; 羅伯多瑪士庫爾; 庫提斯羅伯愛德華斯; 浮德托費哈達汀; 桂格瑞布萊恩海威克; 特洛伊詹姆士凱瑟; 傑洛米克洛爾; 索妮亞雷吉娜坎提薩諾摩柏格; 賽拉特瑪塔諾揆拉; 梅利爾林恩莎佛; 安德地亞Ｊ海利克史塔克; 麥可蘭登史都華; 艾利克馬丁范恩; 國頌趙
Original assignee: 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2023-01-01
Also published as: MY191895A; US11730806B2; CN109922825B; US10660952B2; US20180147278A1; WO2018083156A1; FI3534939T3; HUE061972T2; CL2019001200A1; JP2020500843A; MX2021002989A; DK3534939T3; TW201828982A; KR20190080921A; MX2019005136A; ES2942749T3; BR112019009131A2; CA3042584A1; JP6941171B2; US20200345834A1

Abstract

本發明係關於一種豬小病毒及豬生殖與呼吸道症候群病毒疫苗，其用於保護個體、較佳地豬，以抵抗與豬小病毒及豬生殖與呼吸道症候群病毒有關之疾病。本發明另外關於製造展現減小殺病毒活性之免疫原性組合物之方法以及該等免疫原性組合物。

Description

抗豬小病毒及豬生殖與呼吸道症候群病毒之疫苗及其製造方法

在第一考慮中，本發明係關於能夠減小由豬小病毒及/或豬生殖與呼吸道症候群病毒引起之疾病之臨床體徵之分離物的特異性豬小病毒及豬生殖與呼吸道症候群病毒疫苗。在第二考慮中，本發明另外係關於製造免疫原性組合物之方法以及展現減小之殺病毒活性之該等免疫原性組合物。

豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)係動脈病毒科(Arteriviridae )之成員且與冠狀病毒科(Coronaviridae )一起屬網巢病毒目(Nidovirale )。PRRSV係具有單鏈、正義RNA基因體之套膜病毒，該RNA基因體具有約15千鹼基且包括9個開放閱讀框(ORF)，亦即ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF 2ab及ORF 3至ORF7。ORF 1a及1ab編碼藉由病毒蛋白酶nsp1、nsp2及nsp4之自裂解及反式裂解處理成病毒非結構蛋白(nsp)之較大多蛋白(Snijder及Meulenberg, 1998)。ORF4編碼緊靠主要醣蛋白(GP5)及兩種其他次要醣蛋白(GP2a及GP3)且發現於病毒套膜中之次要醣蛋白(GP4)，其中所有該等醣蛋白皆對於感染性病毒之製造較為重要。 PRRSV可視為豬中引起母豬晚期生殖障礙及成長豬呼吸疾病之經濟上最重要傳染原之一。通常，PRRSV感染併發有歸因於病毒之免疫阻抑性質之二級細菌感染。另外，PRRSV病毒血症會持續數週，且病毒然後仍可在數月內於淋巴樣器官中檢測到，從而證實宿主免疫反應難以或不能清除病毒(Allende等人，2000)。存在兩種引起類似臨床症狀之關於核苷酸序列濃度相差約40%之不同病毒PRRSV基因型，亦即基因型I (EU)及基因型II (US)。北美(US)原型毒株係VR-2332，而歐洲(EU)原型毒株係萊利斯塔德病毒(Lelystad virus)。豬小病毒係小病毒科(Parvoviridae )內原小病毒(Protoparvovirus )屬之小病毒亞科(Parvovirinae )之自主複製病毒，其含有約5100個核苷酸之單鏈DNA分子(Cotmore等人，2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247；Molitor等人，1984: Virology: 137(2):241-54。)。僅DNA之負鏈包裝至病毒體中。病毒基因體編碼三種衣殼蛋白(VP1、VP2、VP3)及一種非結構蛋白(NS1)。小病毒之衣殼之直徑約為22-25奈米且包括VP1及VP2亞單元。該等蛋白質係衍生自相同RNA分子之交替剪接形式且由此序列重疊。另外，豬小病毒與貓泛白細胞減少症病毒、犬小病毒及齧齒類動物小病毒展現較高序列類似性程度(Ranz等人，1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553)。儘管豬小病毒株存在差異(一些株極具病原性且其他株具有較小病原性或完全無病原性)，但在病毒在某一國家得以確立或流行時，病原性株傳播於群體中。豬小病毒(PPV)感染係全世界豬繁殖中之生殖障礙之常見病因。血清學研究展示，豬小病毒流行於世界上所有產豬區域，且最高80%之動物展示血清轉化。豬小病毒(PPV)引起豬之生殖障礙，從而產生死亡及胎兒木乃伊化、死胎及懷孕母豬之其他生殖障礙。(Joo & Johnson. 1976. Veterinary Bulletin 46, 653-660；Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294)。在易感(非免疫)女豬及母豬在懷孕期間發生感染時，PPV會誘導生殖障礙。此係病毒引起疾病之唯一時刻。豬感染發生於攝入或吸入病毒之後。PPV然後循環於血流中且在懷孕豬中穿過胎盤並感染發育中之胚胎及胎兒。在天然感染後，產生很可能在豬中持續一生之活性免疫性。若活性免疫性產生於懷孕之前，則發育中仔豬不受影響。在出生時，仔豬自母豬接受初乳中之母體免疫性且此母體免疫性持續至最多20週齡。母豬中之活性免疫性程度愈大，則其傳遞至其仔豬之母體免疫性愈大。此後，可發生天然PPV感染。豬中由PPV引起之疾病通常稱為SMEDI (死胎、木乃伊化、胚胎死亡及不育(s tillbirth,m ummification,e mbryonicd eath, andi nfertility)之首字母縮寫)。若感染發生於懷孕第0-30天，可發生胚胎死亡，從而降低窩仔數。在懷孕30-70天時感染後之最明顯特徵係產生木乃伊化仔豬。木乃伊化係在骨骼開始固結之後死於子宮中之仔豬之組織的無菌消解過程。PPV感染亦與死胎及先天虛弱豬(若感染發生於懷孕晚期)有關。流產亦可為PPV感染之結果，但其並非此疾病之常見臨床體徵。總而言之，PPV感染降低了每年每頭母豬所生育之豬數。當前可用之PPV疫苗係藉由在豬起源原代細胞中或在所確立細胞系中生長天然病毒所製造。然後，分離感染性病毒且使用化學藥劑使其不活化以最終產生全細胞死病毒疫苗。然而，生長天然感染性病毒之該等製程對於生物安全及安全性考慮而言成問題。基於重組蛋白之亞單元疫苗可具有較差免疫原性，此乃因靶蛋白發生不正確摺疊或至免疫系統之呈遞較差。另外，全細胞死疫苗呈現天然病毒之所有抗原，而在亞單元疫苗中則限於特異性胺基酸序列。重組PPV疫苗已闡述於先前技術中。然而，迄今為止，僅全細胞死疫苗市面有售。因此，似乎迄今為止尚未研發展示為有效及安全之適當重組PPV亞單元疫苗。迄今為止所闡述之重組PPV亞單元疫苗尚未在受控實驗室攻擊實驗中進行測試。已評估之重組PPV亞單元疫苗之效果仍比不上全細胞死PPV疫苗，或重組PPV亞單元疫苗尚不安全(展示不良反應)。已鑑別出在基因上及抗原性上不同於疫苗毒株之PPV野外分離物。PPV基因型2病毒PPV-27a在實驗感染之後之懷孕女豬中具有高度毒性，如由感染PPV-27a之母豬中胎兒之死亡率(85%)高於感染其他PPV株(例如PPV-NADL-2)之母豬所證實。然而，抵抗PPV之當前可用商業疫苗係基於在約30年以前分離之PPV基因型1毒株之不活化全病毒製劑(Jozwik等人，2009；Journal of General Virology；90；2437-2441)。其他先前技術如下： Adriaan F.G. Antonis. 「A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure」 Vaccine 24 (2006) 5481-5490。 Chen Y. Guo W. 「A novel recombinant pseudorabies virus expressing parvovirus VP2 gene: Immunogenicity and protective efficacy in swine」 Virology Journal 2011, 8:307。 Merenga等人，「Large scale production and downstream processing of a recombinant porcine parvovirus vaccine」 Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Jun;59(1):45-50． Epub 2002 Apr 16。 A. Jozwik, J. Manteufel, H.-J. Selbitz及U. Truyen. Vaccination against porcine parvovirus protects against disease, but does not prevent infection and virus shedding after challenge infection with a heterologous virus strain. Journal of General Virology (2009), 90, 2437–2441。中國專利申請案CN 102 488 895 A揭示由豬環狀構象病、豬小病毒及PRRSV組成之三元病毒樣顆粒疫苗。此三元VLP疫苗含有PCV-2主要結構蛋白CAP蛋白、PPV VP2蛋白表位及PRRSV GP5蛋白表位。俄羅斯專利申請案RU 2004108484 A揭示抵抗PRRSV及PPV之不活化疫苗。此不活化疫苗含有來自PRRS病毒株(繁殖於傳代細胞培養物Marc-145中且經胺基乙基次乙亞胺(AEEI)不活化)之抗原性材料及來自PPV株(繁殖於傳代YPK細胞培養物中且經AEEI不活化)之抗原性材料。中國專利申請案CN 104 288 760 A揭示一種疫苗組合物，其包括免疫量之豬環狀構象病2型抗原、免疫量之PRRSV抗原及PPV抗原。中國專利申請案CN 102 727 881 A揭示高度病原性PRRS JXAI-R毒株及PPV二聯活疫苗。 Puig等人 (http://info.hipra.com/DOCS/UNISTRAIN/PUBLICATIONS/ESPHM-2015/1-Clinical-protection.pdf)係關於混合投與由Hipra製造之不活化ERYSENG Parvo及不活化UNISTRAIN PRRS疫苗之接種疫苗。 Zeew EJL等人(Journal of General Virology 2007, 88(2): 420-427)闡述最新小病毒野外分離物及疫苗病毒在實驗性感染懷孕女豬中之毒性及交叉中和能力之研究。美國專利申請案US 2014/0322267 A1係關於用於交叉保護之PCV2亞型A (PCV2A)之ORF2蛋白。歐洲專利申請案EP 2 460 818 A2係關於PCV2免疫原性組合物及製造該等組合物之方法。美國專利US 7,700,285 B1係關於PCV2免疫原性組合物及製造該等組合物之方法。 PCT專利申請案WO 2013/024113係關於流行性感冒H5疫苗。美國專利申請案US 2015/0283229 A1係關於豬流行性腹瀉病毒疫苗。先前技術之缺點在於(例如)：(i)擔心習用死疫苗中之PPV組分並未完全不活化(此將然後將活PPV引入畜群中)；(ii)缺乏針對PPV之異源毒株之交叉保護；缺乏保護育種年齡女豬及母豬及胎兒免於PPV及PRRSV相關生殖疾病之接種疫苗方案。需要可成功用於抵抗PRRSV及/或PPV感染之PRRSV及PPV疫苗之新組合及/或相關應用。亦需要減小通常展現一定殺病毒活性程度之組合物之殺病毒活性之新穎方法；以及具有減小之殺病毒活性或並無殺病毒活性之免疫原性組合物。

藉由說明及申請專利範圍中所描述之實施例以及本文所揭示之條款來達成上述技術問題之解決方案。因此，根據本文所揭示之申請專利範圍及條款來實施不同態樣中之本發明。本發明之第一考慮 在第一考慮中，本發明係關於包括以下之免疫原性組合物或組合疫苗或組合： a) 至少一種豬小病毒(PPV)抗原，其中至少一種PPV抗原係任一含於PPV中之抗原，及 b) 至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原，其中至少一種PRRS病毒抗原係任一含於PRRS病毒中之抗原。本發明另外係關於一種套組，其包括如本文所闡述及/或主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。本發明另外係關於如本文所闡述及/或主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合或如本文所闡述及/或主張之套組之用途，其用於製備藥劑、較佳地疫苗。有利的是，由本發明提供之實驗數據揭示，本發明之PPV VP2亞單元疫苗組分可安全且有效地預防胎兒之病毒血症及PPV感染。另外，由本發明提供之實驗數據揭示，本發明之PPV VP2亞單元疫苗組分具有寬保護範圍，此乃因該疫苗可抵抗異源北美以及異源歐洲攻擊毒株。有利的是，由本發明提供之實驗數據揭示，本發明之PPV VP2亞單元疫苗組分與完整死病毒同等有效。可藉由利用包括PPV VP2之重組亞單元疫苗來避免深度不活化製程(其係在生成完整死病毒疫苗時使天然PPV不活化所需)。本發明之其他優點在於(例如)：(i)減小投與動物之疫苗注射數量，由此增加動物幸福感且減小動物壓力；(ii)減小人力；(iii)與單一投與具有相同效能；(iv)打疫苗時機，此乃因二種組分皆解決懷孕豬之生殖疾病；(v)預防在使用異源PPV株攻擊後經接種疫苗女豬之PPV病毒血症；(vi)減小在PPV攻擊之後接種疫苗組中死胎及木乃伊化仔豬之數量；(vii)增加PPV接種疫苗母豬中之胎兒之總數量；(viii)在PPV攻擊之後保護100%之PPV接種疫苗仔豬；(ix)免疫性持續時間(DOI)：6個月；(x)基於攻擊後減小之病毒負荷及病毒血比例，ReproCyc® PRRS EU及混合ReproCyc® PRRS EU + PPV VP2皆有效；(xi)已證實，不干擾針對PRRSV接種疫苗之效能；(xii)可針對ReproCyc® PRRS EU確立4週免疫性開始；(xiii)組合疫苗(PPV VP2 10 µg + Ery)以及Ingelvac® PRRS MLV顯示可有效預防在懷孕之後40天(40 dG)胎兒之病毒血症及PPV感染。本發明之第二考慮 在第二考慮中，本發明係關於製造包括重組蛋白之免疫原性組合物之方法，其中該方法按以下順序包括下列步驟： (i) 提供/獲得包括以下之混合物： - 第一液體， - 重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，及 - 包括編碼該重組蛋白之核酸序列之載體； (ii) 將第二液體添加至步驟(i)之混合物中，其中第二液體與第一液體不同； (iii) 藉由向源自步驟(ii)之混合物中進一步添加另外第二液體且自該組合混合物去除一部分第一及/或第二液體來洗滌混合物中之重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構且視情況最後濃縮； (iv) 藉由向源自步驟(iii)之混合物中添加不活化劑來使載體不活化； (v) 藉由向源自步驟(iv)之混合物中添加中和劑來中和不活化劑。本發明另外係關於如本文所闡述及/或主張之方法，其中上文步驟(i)之混合物可藉由包括以下步驟之程序獲得： (a) 允許使用包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之核酸序列之載體感染培養物中的易感細胞，其中該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係由該載體表現， (b) 然後自細胞培養物回收重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，其中較佳地經由分離步驟(較佳地包含經由至少一個過濾器、更佳地兩個過濾器進行微過濾)來分離細胞碎屑與重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，其中至少一個過濾器之孔徑較佳地大於重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，特定而言，孔徑為約0.1 µm至約4 µm。對於PPV抗原製劑而言，在淨化之後且在滲濾之前實施37℃下桿狀病毒不活化時，觀察到重度沈澱(聚集)。此聚集儘管與PPV抗原不相關，但其可視為干擾不活化動力學及殺病毒測試。初步數據表明，在培養物淨化之後且在桿狀病毒不活化之前之滲濾過程大大減小了在不活化製程期間PPV病毒樣顆粒(VLP)收穫物之聚集程度。數據展示，聚集程度在較高溫度(37℃.)下有所加強，且在較低溫度(27℃.或4℃.)下隨時間達到最小化：在桿狀病毒不活化之前於37℃.下之滲濾過程另外消除了不活化劑(中和劑)硫代硫酸鈉及ExCell 420培養基反應液之殺病毒活性。驗證過程證實，不活化桿狀病毒表現之PPV VLP產物始終對PRRSV疫苗無殺毒性。特定而言，基於消失之殺病毒效應，該PPV VLP疫苗在與PRRSV混合之後擁有有利長期穩定性，由此使得可在投與之前混合新鮮PPV及 PRRSV組分及/或使即用投與形(例如組合疫苗或套組)商業化。

序列表本申請案含有根據37 C.F.R. 1.821 - 1.825之序列表。伴隨本申請案之序列表之全部內容以引用方式併入本文中。在闡述本發明之態樣之前，必須注意，如本文中且如在隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個指示物。因此，舉例而言，在提及「抗原」時包含複數個該抗原，且在提及「病毒」時包含提及熟習此項技術者已知之一或多種病毒及其等效物，等等。除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之含義。儘管任何類似或等效於本文所闡述者之方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但目前所述者係較佳之方法、裝置及材料。出於闡述及揭示如結合本發明使用之出版物中所報告之細胞系、載體及方法之目的，本文所提及之所有出版物皆以引用方式併入本文中。本文中沒有什麼內容應解釋為承認本發明沒有資格早於根據先前發明之此類揭示內容。本發明之第一考慮 在一態樣中，本發明係關於一種免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其包括 (a) 至少一種豬小病毒(PPV)抗原，其中至少一種PPV抗原係任一含於PPV中之抗原，及 (b) 至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原，其中至少一種PRRS病毒抗原係任一含於PRRS病毒中之抗原。術語「豬小病毒」或「PPV」為熟習此項技術者所熟知。然而，「豬小病毒」係小病毒科內小病毒屬之含有單鏈DNA分子之自主複製病毒。病毒基因體編碼三種衣殼蛋白(VP1、VP2、VP3)及一種非結構蛋白(NS1)。豬中由PPV引起之疾病通常稱為SMEDI (死胎、木乃伊化、胚胎死亡及不育(s tillbirth,m ummification,e mbryonicd eath, andi nfertility)之首字母縮寫)。本發明範圍內之術語「豬小病毒」涵蓋豬小病毒以及小病毒科內原小病毒屬之小病毒亞科之所有毒株、基因型及血清型。術語「豬生殖與呼吸道症候群病毒」或「PRRS病毒」或「PRRSV」為熟習此項技術者所熟知。「豬生殖與呼吸道症候群病毒」係動脈病毒科之成員，而動脈病毒科與冠狀病毒科一起屬網巢病毒目，且係具有單鏈、正義RNA基因體之套膜病毒，該RNA基因體具有約15千鹼基且包括9個開放閱讀框(ORF)，亦即ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF 2ab及ORF 3至ORF7。ORF 1a及1ab編碼藉由病毒蛋白酶nsp1、nsp2及nsp4之自裂解及反式裂解處理成病毒非結構蛋白(nsp)之較大多蛋白(Snijder及Meulenberg, 1998)。ORF4編碼緊靠主要醣蛋白(GP5)及兩種其他次要醣蛋白(GP2a及GP3)且發現於病毒套膜中之次要醣蛋白(GP4)，其中所有該等醣蛋白皆對於感染性病毒之製造較為重要。存在兩種引起類似臨床症狀之關於核苷酸序列濃度相差約40%之不同病毒PRRSV基因型，亦即基因型I (EU)及基因型II (US)。北美(US)原型毒株係VR-2332，而歐洲(EU)原型毒株係萊利斯塔德病毒。本發明範圍內之術語「豬生殖與呼吸道症候群病毒」涵蓋PRRSV之所有毒株、基因型及血清型。就PRRSV而言，應理解，術語「基因型I」及「基因型II」等效於術語「基因型1」及「基因型2」或等效於術語「1型」及「2型」，如在PRRSV背景之文獻中通常所使用。本發明範圍中之術語「至少一種豬小病毒(PPV)抗原」及「至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原」涵蓋自單一PPV及/或PRRSV抗原至包括多種抗原之全病毒之每一抗原。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV係選自由以下組成之群：活減毒/經修飾活PPV病毒、殺死/不活化PPV病毒、殺死/不活化PPV株014、豬小病毒PPV-27a及PPV-143a之德國野外分離物及豬小病毒疫苗病毒PPV-NADL-2及PPV-IDT (MSV)。術語「活減毒」及「經修飾活」在本發明過程中可互換使用且尤其係關於減小PPV及/或PRRSV、尤其野生型PPV及/或PRRS病毒之毒力，此係藉由PPV及/或PRRSV之習用多細胞系傳代來達成及/或藉由基因改造達成，其中「毒力」應理解為病原性程度，且其中「病原性」係關於病毒誘導宿主或宿主後代之臨床體徵(例如生殖障礙)之能力。本發明範圍內之術語「殺死」或「不活化」係關於不能感染適當個體(與活病毒相比)及/或與天然病毒相比不給予感染性之PPV及/或PRRSV。特定而言，殺死/不活化病毒不能感染其天然宿主細胞(不再)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種PPV抗原係一或多種PPV亞單元。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種PPV亞單元係PPV病毒蛋白2 (VP2)，其中較佳地PPV VP2係唯一PPV抗原。術語「病毒蛋白2」或「VP2」係關於豬小病毒之衣殼蛋白VP2。術語「病毒蛋白2」或「VP2」為熟習此項技術者所熟知。術語「蛋白質」、「胺基酸」及「多肽」可互換使用。術語「蛋白質」係指由天然胺基酸構成之胺基酸殘基序列以及其衍生物。天然胺基酸在業內已眾所周知且闡述於生物化學之標準教科書中。在胺基酸序列內，胺基酸殘基由肽鍵連結。另外，胺基酸序列之兩端稱為羧基末端(C-末端)及胺基末端(N-末端)。術語「蛋白質」涵蓋基本上純化之蛋白質或另外包括其他蛋白質之蛋白質製劑。另外，該術語亦係關於蛋白質片段。此外，其包含以化學方式修飾之蛋白質。該等修飾可為人工修飾或天然修飾，例如磷酸化、醣基化、十四烷基化及諸如此類。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2 - 在胺基酸位置228具有麩胺酸殘基或麩胺酸酯殘基，及/或 - 在胺基酸位置414具有絲胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置419具有麩醯胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置436具有蘇胺酸殘基，其中胺基酸位置之編號涉及野生型PPV VP2之胺基酸序列。術語「其中胺基酸位置之編號涉及野生型PPV VP2之胺基酸序列」係關於，胺基酸位置之編號涉及全長野生型PPV VP2蛋白之胺基酸序列。較佳地，如本文所提及胺基位置之編號係參照具有579個胺基酸殘基(包含在(N-末端)胺基酸位置1之甲硫胺酸殘基)之野生型PPV VP2蛋白序列。術語「其中胺基酸位置之編號涉及野生型PPV VP2之胺基酸序列」涵蓋如在SEQ ID NO:1中以實例方式給出之野生型PPV VP2 (PPV 27a VP2)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2另外 - 在胺基酸位置25具有異白胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置36具有絲胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置37具有異白胺酸殘基，其中胺基酸位置之編號涉及野生型PPV VP2之胺基酸序列。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中胺基酸位置之編號涉及如SEQ ID NO:1中所展示之胺基酸序列。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係重組PPV VP2。本文所用之術語「重組體」特定而言係指自重組DNA分子表現之蛋白質分子，例如藉由重組DNA技術製得之多肽。該等技術之一實例包含以下情形：將編碼所表現蛋白(例如PPV VP2)之DNA插入適宜表現載體、較佳地桿狀病毒表現載體中，繼而使用該桿狀病毒表現載體轉染(或在桿狀病毒表現載體之情形中用其感染)宿主細胞，以製造由該DNA編碼之蛋白質或多肽。本文所用之術語「重組PPV VP2」由此特定而言係指自重組DNA分子表現之蛋白質分子。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係重組桿狀病毒表現之PPV VP2。術語「桿狀病毒」為熟習此項技術者所熟知。本文所用之「桿狀病毒」特定而言意指用於在昆蟲細胞中使用經設計以表現期望蛋白質之重組桿狀病毒載體來製造該蛋白質之系統。桿狀病毒表現系統通常包括在昆蟲細胞中達成重組蛋白表現所需之所有要素，且通常涉及以下過程：改造桿狀病毒載體以表現期望蛋白質，將經改造桿狀病毒載體引入昆蟲細胞中，在適宜生長培養基中培養含有經改造桿狀病毒載體之昆蟲細胞以便表現期望蛋白質，且回收該蛋白質。通常，桿狀病毒載體之改造涉及構築及分離重組桿狀病毒，其中將所選基因之編碼序列插入非必需病毒基因之啟動子後面，且其中當前使用之大部分桿狀病毒表現系統係基於苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcMNPV)之序列((Virology 202 (2), 586-605 (1994), NCBI登錄號：NC_001623)。桿狀病毒表現系統在業內已眾所周知且已闡述於(例如)以下文獻中：「Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual」，David R. O'Reilly, Lois Miller, Verne Luckow，由Oxford Univ. Press公開(1994)；「The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide」，Linda A. King, R. D. Possee，由Chapman & Hall公開(1992)。用於製造重組蛋白之桿狀病毒系統之一實例性非限制性實例(例如)闡述於WO 2006/072065 A2中。較佳桿狀病毒載體包含諸如BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.)或DiamondBac (Sigma Aldrich)等桿狀病毒，特定而言，條件係製造細胞係昆蟲細胞。儘管桿狀病毒表現系統較佳，但熟習此項技術者應理解藉，其他表現系統可用於本發明目的，亦即在細胞培養物之上清液中表現PPV VP2。該等其他表現系統可需要使用信號序列以使PPV VP2表現於培養基中。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列或由其組成。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性之胺基酸序列或由其組成。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列或由其組成，或包括任一具有至少210、至少250或至少300個來自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之鄰接胺基酸殘基之片段或由其組成。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列或由其組成。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係由編碼與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列之核苷酸序列編碼。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係由編碼與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性之核苷酸序列編碼。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係由編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列之核苷酸序列編碼。 SEQ ID NO:4係密碼子最佳化PPV 27a VP2核苷酸序列，其經進一步修飾以擁有兩個ClaI限制酶位點(胺基酸位置25係異白胺酸殘基，胺基酸位置36係絲胺酸殘基，胺基酸位置37係異白胺酸殘基)，從而側接包括甘胺酸重複之VP2編碼區。以不破壞VP2編碼區之方式引入ClaI位點。SEQ ID NO:2係對應於SEQ ID NO:4之蛋白質序列。SEQ ID NO:3係密碼子最佳化PPV 27a VP2核苷酸序列(不含ClaI限制酶位點)。SEQ ID NO:1係對應於SEQ ID NO:3之蛋白質序列。術語「核酸」或「核酸序列」或「核苷酸序列」或「多核苷酸」可在本文中互換使用且係指包含DNA分子、RNA分子、cDNA分子或衍生物之多核苷酸。該術語涵蓋單鏈以及雙鏈多核苷酸。本發明核酸涵蓋經分離多核苷酸(亦即自其天然背景分離)及基因修飾形式。此外，亦包括經化學修飾之多核苷酸，包含天然修飾之多核苷酸(例如醣基化或甲基化多核苷酸)或人工修飾者(例如生物素化多核苷酸)。另外，術語「核酸」及「多核苷酸」可互換使用且係指任一核酸。術語「核酸」及「多核苷酸」亦具體而言包含由除5個生物鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外之鹼基構成之核酸。術語「一致性」或「序列一致性」已為業內所習知且係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列、亦即參考序列與擬與參考序列進行比較之給定序列之間之關係。藉由在將序列最佳地比對以得到最高序列相似性程度之後比較給定序列與參考序列來測定序列一致性，如藉由該等序列串之間之匹配所測定。在該比對時，基於逐個位置來確定序列一致性，舉例而言，若在一個位置處核苷酸或胺基酸殘基一致，則該等序列在該位置處「一致」。然後將該等位置一致性之總數除以參考序列中之核苷酸或殘基之總數以得到序列一致性%。序列一致性可易於藉由已知方法來計算，包含(但不限於)彼等闡述於以下文獻中之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編輯，Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編輯，Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data，部分I，Griffin, A.M.及Griffin, H. G.編輯， Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯，M. Stockton Press, New York (1991)；及Carillo, H.,及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)，其教示內容以引用方式併入本文中。設計用於測定序列一致性之較佳方法以得到所測試序列之間之最大匹配。將測定序列一致性之方法編成測定給定序列間之序列一致性之公開獲得之電腦程式。該等程式之實例包含(但不限於) GCG程式包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)，其教示內容以引用方式併入本文中)。該等程式最佳地使用預設空位權重比對序列以在給定序列與參考序列之間製造最高序列一致性程度。作為闡釋，對於多核苷酸具有與參考核苷酸序列具有至少(例如) 85%、較佳地90%、甚至更佳地95% 「序列一致性」之核苷酸序列而言，預計給定多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，只是給定多核苷酸序列可包含最高15、較佳地最高10、甚至更佳地最高5個點突變/參考核苷酸序列之100個核苷酸。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳地90%、甚至更佳地95%一致性之核苷酸序列之多核苷酸中，參考序列中最高15%、較佳地10%、甚至更佳地5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中全部核苷酸中最高15%、較佳地10%、甚至更佳地5%數量之核苷酸可插入參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5’-或3’-末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各核苷酸之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。類似地，對於多肽具有與參考胺基酸序列具有至少(例如) 85%、較佳地90%、甚至更佳地95%序列一致性之給定胺基酸序列而言，預計多肽之給定胺基酸序列與參考序列一致，只是給定多肽序列可包含最高15、較佳地最高10、甚至更佳地最高5個胺基酸改變/參考胺基酸序列之100個胺基酸。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳地90%、甚至更佳地95%序列一致性之給定多肽序列，參考序列中之最高15%、較佳地最高10%、甚至更佳地最高5%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或可將參考序列中最高15%、較佳地最高10%、甚至更佳地最高5%總胺基酸殘基數量之諸多胺基酸插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基-或羧基-末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。然而，在測定序列一致性時，並不包含保守取代作為匹配。術語「一致性」、「序列一致性」及「一致性百分比」可在本文中互換使用。出於本發明目的，本文定義，為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，比對序列以用於最佳對比目的(舉例而言，可將空位引入第一胺基酸或核酸之序列中以用於與第二胺基或核酸序列進行最佳比對)。然後比較相應胺基酸或核苷酸位置之胺基酸或核苷酸殘基。在第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同之胺基酸或核苷酸殘基佔據時，則該等分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性百分比係該等序列所共用之一致位置數之函數(亦即，一致性% =一致位置數/總位置(亦即重疊位置)數乘以100)。較佳地，兩個序列具有相同長度。可對所比較兩個序列之整個長度或兩個序列之片段實施序列對比。通常，對所比較兩個序列之全長實施對比。然而，可在(例如) 20、50、100或更多個鄰接胺基酸殘基之區域中實施序列一致性對比。熟習此項技術者應知曉，實際上，可利用若干不同電腦程式來測定兩個序列之間之同源性。舉例而言，兩個序列之間之序列對比及一致性百分比之測定可使用數學算法來達成。在一較佳實施例中，使用Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))算法(其已納入Accelrys GCG軟體包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/處獲得)中之GAP程式中)、使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6)來測定兩個胺基酸或核酸序列之間之一致性百分比。熟習此項技術者應瞭解，所有該等不同參數將產生略微不同之結果，但在使用不同算法時兩個序列之整體百分比一致性並不顯著改變。可進一步使用本發明之蛋白質序列及核酸序列作為「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索以(例如)鑒定其他家族成員或相關序列。可使用Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10之BLASTN及BLASTP程式(2.0版)實施該等檢索。可使用BLASTP程式、評分=50、字長=3實施BLAST蛋白質檢索以獲得本發明之蛋白質分子之同源胺基酸序列。為獲得用於對比目的之空位比對，可如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402中所闡述來利用空位BLAST。在利用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如BLASTP及BLASTN)之預設參數。參見國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/處之主頁。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PRRS病毒係選自由PRRS病毒基因型1、PRRS病毒基因型2組成之群，PRRS病毒基因型1包括由與SEQ ID NO:17之核酸序列(萊利斯塔德野生型序列)具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%一致性之核苷酸序列編碼之基因體，PRRS病毒基因型2包括由與SEQ ID NO:18之核酸序列(VR2332野生型序列)具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%一致性之核苷酸序列編碼之基因體。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PRRS病毒係選自由以下組成之群：活減毒/經修飾活PRRS病毒、活減毒/經修飾活PRRS病毒類型1基因型(例如Porcilis PRRS、Unistrain PRRS、Amervac PRRS等)、活減毒/經修飾活PRRS病毒類型2基因型(例如Ingelvac® PRRS MLV、Fostera PRRS等)、活減毒/經修飾活PRRS病毒株94881 [(基因型1)、ReproCyc® PRRS EU]、殺死/不活化PRRS病毒、殺死/不活化PRRS病毒類型1基因型(例如Progressis)、殺死/不活化PRRS病毒類型2基因型、萊利斯塔德病毒株(CDI-NL-2.91，Institut Pasteur, Paris, France，寄存號I-1102)、PRRS病毒亞單元或其他株(例如以登錄號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登錄號I-1140、CNCM登錄號I-1387、CNCM登錄號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108、北美PRRS病毒pT7P129A (ATCC登錄號203488)、ATCC登錄號VR-2332、ATCC登錄號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402寄存者)。術語「免疫原性組合物」或「組合疫苗」或「組合」係指包括至少一種抗原、在「組合疫苗」或「組合」之情形下包括至少兩種抗原之組合物，該(等)抗原在投與「免疫原性組合物」或「組合疫苗」或「組合」之宿主中誘發免疫學反應。該免疫學反應可為對本發明之「免疫原性組合物」或「組合疫苗」或「組合」之細胞及/或抗體調介之免疫反應。較佳地，「免疫原性組合物」或「組合疫苗」或「組合」誘導免疫反應且更佳地賦予抵抗PPV及/或PRRSV感染之一或多種臨床體徵之保護性免疫性。宿主亦闡述為「個體」。較佳地，本文所闡述或提及之任一宿主或個體係豬。通常，「免疫反應」包含(但不限於)一或多種下列效應：製造或活化特異性地針對本發明之「免疫原性組合物」或「組合疫苗」或「組合」中所包含之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、阻抑性T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞。較佳地，宿主顯示保護性免疫學反應或治療反應。「保護性免疫學反應」或「保護性免疫性」顯示為減少或缺乏通常由受感染宿主顯示之臨床體徵、較快恢復時間及/或較低感染性持續時間或受感染宿主之組織或體液或排泄物中之較低病原體效價。若宿主顯示保護性免疫學反應以便對新感染之抗性得以增強及/或疾病之臨床嚴重程度有所減小，則將「免疫原性組合物」或「組合」闡述為「疫苗」。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合經調配用於單一劑量投與。用於單一劑量投與之體積已定義於本文其他處。如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合較佳地係經局部或全身性投與。常用之適宜投與途徑係經口或非經腸投與，例如鼻內、靜脈內、肌內、腹膜腔內、皮下以及吸入。然而，端視化合物之性質及作用模式，如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合亦可藉由其他途徑投與。最佳地，經肌內投與如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中經肌內投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於在懷孕及哺乳期間之女豬及/或母豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕30天、較佳地懷孕40天之女豬及/或母豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合進一步包括至少一種醫藥上可接受之載劑。術語「醫藥上可接受之載劑」包含任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑、佐劑、免疫刺激劑及其組合。「稀釋劑」可包含水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油、磷酸鹽緩衝鹽水及諸如此類。等滲劑可包含氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。穩定劑包含白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽等。在本發明之一態樣中，醫藥上可接受之載劑係卡波姆(carbomer)。較佳地，免疫原性組合物可進一步包含一或多種其他免疫調節劑，例如介白素、干擾素或其他細胞介素。可用於本發明背景中之佐劑及添加劑之量及濃度可易於由熟習此項技術者測定。在一些態樣中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。本文所用之「佐劑」可包含氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素(例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)型)；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(特定而言異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；酸或含有直鏈烷基之醇之酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，特定而言異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子表面活性劑，特定而言係以下之酯：山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸(其視情況經乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Stewart-Tull編輯，D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY，第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。實例性佐劑係由M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液及同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸尤其與醣或多元醇之聚烯基醚交聯之聚合物。該等化合物以術語卡波姆為人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，其闡述與具有至少3個、較佳地不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團代替。較佳基團係含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團可自身含有其他取代基，例如甲基。以名稱Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA)銷售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳係使用Carbopol 971P。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，尤其係共聚物EMA (Monsanto)，其係馬來酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物在水中之溶解產生酸溶液，其將被中和、較佳地中和至生理學pH以產生將引入免疫原性、免疫學或疫苗組合物本身之佐劑溶液。其他適宜佐劑包含(但不限於)尤其RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組或其他)之熱不穩定腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽或其天然或重組細胞介素或其類似物或內源細胞介素釋放之刺激劑等。預計佐劑可以每劑量約100 μg至約10 mg之量、較佳地以每劑量約100 μg至約10 mg之量、更佳地以每劑量約500 μg至約5 mg之量、甚至更佳地以每劑量約750 µg至約2.5 mg之劑量及最佳地以每劑量約1 mg之量添加。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01%至50%之濃度，較佳為約2%至30%之濃度，更佳為約5%至25%之濃度，仍更佳為約7%至22%之濃度，且最佳為10%至20%之濃度。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種醫藥上可接受之載劑係卡波姆。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合包括0.1 µg至50 µg PPV VP2抗原、較佳地0.5 µg至10µg PPV VP2抗原、更佳地1.0 µg至10 µg PPV VP2抗原及/或3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ PRRS病毒。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其包括介於約0.1 µg與50µg之間之PPV VP2抗原。較佳地，免疫原性組合物包括介於約0.2 µg與40 µg之間、更佳地介於約0.3 µg與30 µg之間、更佳地介於約0.4 µg與20 µg之間及甚至更佳地介於約0.5 µg與10 µg之間及甚至更佳地介於約1.0 µg與10 µg之間之PPV VP2抗原，其中0.5 µg、0.75 µg、1 µg、1.25 µg、1.5 µg、2 µg、2.5 µg、3 µg、3.5 µg、4 µg、4.5 µg、5 µg、5.5 µg、6 µg、6.5 µg、7 µg、7.5 µg、8 µg、8.5 µg、9 µg、9.5 µg或10 µg抗原之量最佳。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其包括介於約3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ 之間之PRRS病毒。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合，其中該免疫原性組合物或組合係疫苗。術語「疫苗」已闡述於本文中其他處。然而，若宿主顯示保護性免疫學反應以便對新感染之抗性得以增強及/或疾病之臨床嚴重程度有所減小，則將免疫原性組合物或組合闡述為「疫苗」。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其可抵抗同源及/或異源攻擊。有利的是，由本發明提供之實驗數據揭示，本發明之免疫原性組合物或組合疫苗或組合具有寬保護範圍，此乃因其可抵抗異源北美及/或異源歐洲攻擊毒株。術語「保護」及「預防(prophylaxis及preventing)」在本申請案中可互換使用。該等術語已定義於其他處。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其可抵抗北美及/或歐洲分離物之攻擊。術語「北美及/或歐洲分離物」為熟習此項技術者所熟知。術語「北美及/或歐洲分離物」涵蓋已或將在北美及歐洲分離之所有分離物。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其可交叉抵抗北美及/或歐洲分離物。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其可有效治療及/或預防有需要之個體中由PPV及/或PRRSV感染引起之臨床體徵。術語「治療及/或預防」、「臨床體徵」及「有需要」已定義於其他處。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗PPV之同源及/或異源攻擊及/或同源及/或PRRS病毒之異源攻擊。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗北美及/或歐洲PPV分離物之攻擊及/或北美及/或歐洲PRRS病毒分離物之攻擊。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可交叉抵抗北美及/或歐洲PPV分離物及/或可交叉抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可有效治療及/或預防有需要之個體中由PPV感染及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵。另外，本發明提供包括如本文所闡述及主張之PPV VP2之病毒樣顆粒。術語「病毒樣顆粒」 (VLP)涵蓋來自病毒之非複製性空病毒殼體。VLP通常由一或多種病毒蛋白(例如(但不限於)彼等稱為衣殼蛋白、包衣蛋白、殼體蛋白、表面蛋白及/或套膜蛋白之蛋白質)或衍生自該等蛋白質之形成顆粒之多肽構成。VLP可在於適當表現系統中重組表現蛋白質後自發形成。可使用業內已知之習用技術(例如藉由電子顯微術、X射線結晶術及諸如此類)來檢測在重組表現病毒蛋白後VLP之存在。例如參見Baker等人，Biophys. J. (1991) 60: 1445-1456；Hagensee等人，J. Virol. (1994) 68: 4503-4505。舉例而言，可對所論述VLP製劑之玻璃化水性試樣實施低溫電子顯微術，且在適當暴露條件下記錄影像。術語「病毒樣顆粒」 (VLP)亦涵蓋由複數個PPV VP2構成之VLP。在本發明之另一態樣中，病毒樣顆粒係由複數個如本文所闡述及主張之PPV VP2構成。另外，本發明提供包括如本文所闡述之多核苷酸或載體之細胞。較佳地，載體係桿狀病毒。術語「細胞」為熟習此項技術者所熟知。術語「細胞」涵蓋真核細胞，例如動物細胞、原生生物細胞、植物細胞或真菌細胞。較佳地，真核細胞係哺乳動物細胞(例如CHO、BHK或COS)或真菌細胞(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或昆蟲細胞(例如Sf9)。在本發明之另一態樣中，細胞係昆蟲細胞。本文所用之「昆蟲細胞」意指衍生自昆蟲物種之細胞或細胞培養物。本發明尤其關注衍生自物種草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)及粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)之昆蟲細胞。較佳地，本文所提及之昆蟲細胞係草地貪夜蛾(Sf)細胞或來自衍生自草地貪夜蛾之細胞系之細胞，且更佳地選自由Sf9細胞及Sf+細胞組成之群。分別地，如本文所提及之昆蟲細胞較佳係草地貪夜蛾(Sf)細胞或來自衍生自草地貪夜蛾之細胞系之細胞，且更佳地選自由Sf9細胞及Sf+細胞組成之群。在本發明之另一態樣中，昆蟲細胞係選自由Sf9細胞及Sf+細胞組成之群。另外，本發明提供製造如本文所闡述及主張之PPV VP2之方法，其包括使用如本文所闡述之載體轉染細胞。術語「載體」為熟習此項技術者所熟知。如業內已知之術語「載體」係指用於將基因材料傳遞至宿主細胞之多核苷酸構築體、通常質體或病毒。載體可為(例如)病毒、質體、黏粒或噬菌體。本文所用之載體可由DNA或RNA構成。在一些實施例中，載體係由DNA構成。「表現載體」係在存在於適當環境中時能夠引導表現由藉由載體攜載之一或多種基因編碼之蛋白質之載體。載體較佳地能夠自主複製。通常，表現載體包括轉錄啟動子、基因及轉錄終止子。基因表現通常係在啟動子之控制下，且基因可視為「可操作地連接至」啟動子。如本文中所使用，術語「可操作地連接」用於闡述調控元件與基因或其編碼區之間之連結。通常，基因表現係在一或多種調控元件(例如(但不限於)組成型或可誘導啟動子、組織特異性調控元件及增強子)之控制下進行。基因或編碼區可視為與調控元件「可操作地連接」或「可操作地連接」或「可操作地締合」，此意味著該基因或編碼區由調控元件控制或影響。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。載體及製備載體及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可尤其由以下文獻揭示或類似於以下文獻中所揭示之方法：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, 」PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,」 PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165頁；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406頁；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申請之美國申請案第920,197號；歐洲專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,」 PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,」 PNAS USA 93: 11313-11318，1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340，1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,」 PNAS USA 93: 11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；1996年7月3日提出申請之允許美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992, 「Adenovirus as cloning vectors,」 Seminars in Virology (第3卷)，第237-52頁，1993；Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，第3861-65頁，Graham, Tibtech 8, 85-87，1990年4月；Prevec等人，J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420，1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號以及WO 90/11092、WO 93/19183、WO 94/21797、WO 95/11307、WO 95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry (關於DNA表現載體)。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbachet等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，第271-283頁(1997), (DNA載體系統)；Szoka等人，美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(致細胞病變病毒之使用)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文所引用之其他文件。術語「調控元件」及「表現控制元件」可互換使用且係指可影響可操作地連接之編碼序列在特定宿主生物體中之表現之核酸分子。該等術語可廣泛使用且涵蓋促進或調控轉錄之所有元件，包含啟動子、RNA聚合酶與轉錄因子之鹼性相互作用之核心元件、上游元件、增強子及反應元件。原核生物中之實例性調控元件包含啟動子、操縱子序列及核糖體結合位點。用於真核細胞中之調控元件可包含(但不限於)提供及/或調控宿主細胞中編碼序列之表現及/或編碼多肽之產生的轉錄及轉譯控制序列，例如啟動子、增強子、剪接信號、多聚腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內部核糖體進入元件(IRES)、2A序列及諸如此類。如本文中所使用，術語「啟動子」係允許結合RNA聚合酶且引導轉錄基因之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因中鄰近基因之轉錄開始位點之5'非編碼區中。啟動子內用於引發轉錄之序列元件之特徵通常在於共有核苷酸序列。啟動子之實例包含(但不限於)來自細菌、酵母、植物、病毒及哺乳動物(包含人類)之啟動子。啟動子可為誘導型、抑制型及/或組成型。誘導型啟動子引發在其控制下因應於培養條件之一定變化(例如溫度變化)增加來自DNA之轉錄程度。如本文中所使用，術語「增強子」係指可增加轉錄效率之一類調控元件，不論增強子相對於轉錄起始位點之距離或定向如何。可使用業內熟知之任何適宜基因改造技術來生成病毒載體，包含(但不限於)細胞培養物中之限制性內核酸酶消解、連接、轉變、質體純化及DNA測序，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))中所闡述。另外，本發明提供製造如本文所闡述之PPV VP2之方法，包括使用如本文所闡述之桿狀病毒感染細胞、較佳地昆蟲細胞。若期望，組合物可提供於可包含含有活性成分之一或多種單位劑型的包裝或分配器裝置中。包裝可(例如)包含金屬或塑膠箔，例如泡罩包。包裝或分配器裝置可帶有用於投與、較佳地投與動物、尤其豬之說明書。該(等)容器可附帶有監管醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告顯示該機構已批准用於人類投與之製造、使用或銷售。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原一起含於一個單一容器中或在空間上彼此分開、較佳地含有於兩個或更多個各別容器中。在另一態樣中，本發明係關於一種套組，其包括如本文所揭示及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之套組，其中至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原彼此分開地含於兩個或更多個各別容器中，較佳地二者彼此獨立地呈凍乾或冷凍形式，且其中該套組進一步包括用於混合在空間上分開之至少一種PPV抗原及至少一種PRRS病毒抗原之說明書手冊，其中較佳地該說明書手冊含有組合含有至少一種PPV抗原之容器之內容物與含有至少一種PPRS病毒抗原之容器之內容物的指導，其中更佳地該說明書手冊含有將至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原同時、更佳地在相同或不同投與位點同時、依序(以任一順序)及/或以按時間順序交錯方式分開投與個體的指導。在另一態樣中，本發明係關於如本文所揭示及主張之套組，其中該套組進一步包括治療及/或預防豬疾病之指導及/或進一步包括治療及/或預防PPV感染及/或PRRS病毒感染之指導，較佳地該套組進一步包括聯合使用如本文所揭示及主張且含於該套組中之免疫原性組合物或組合疫苗或組合之PPV組分(較佳地以分開套組組分形式)及PRRSV組分(較佳地以分開套組組分形式)的指導。本發明範圍內之術語「聯合使用」係關於藉由在一個注射位點投與之前混合兩種疫苗或在不同投與位點同時投與兩種疫苗來使用兩種疫苗或疫苗組分PRRSV及PPV (各自彼此獨立地亦在本文中稱為「分開套組組分」)。較佳地，同時投與該兩種疫苗，更佳地在相同或不同投與位點同時、依序(以任一順序)及/或以按時間順序交錯方式分開投與。在本發明之另一態樣中，本發明之PPV及/或PRRSV已不活化，從而產生如本文所闡述之具有病毒蛋白2 (VP2)之全不活化病毒。任一習用不活化方法皆可用於本發明目的。因此，可藉由熟習此項技術者已知之化學及/或物理處理來實施不活化。較佳不活化方法包含添加環化次乙亞胺(BEI)，其包含添加2-溴乙烯胺氫溴酸鹽(BEA) (環化成二乙烯亞胺(BEI))之溶液。較佳其他化學不活化劑包括(但不限於) Triton X-100、去氧膽酸鈉、鯨蠟基三甲基溴化銨、β-丙內酯、硫柳汞、酚及甲醛(福馬林(Formalin))。然而，不活化亦可包括中和步驟。較佳中和劑包含(但不限於)硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及諸如此類。較佳福馬林不活化條件包含福馬林濃度介於約0.02% (v/v) - 2.0% (v/v)、更佳地約0.1% (v/v) - 1.0% (v/v)、仍更佳地約0.15% (v/v) - 0.8% (v/v)、甚至更佳地約0.16% (v/v) - 0.6% (v/v)及最佳地約0.2% (v/v) - 0.4% (v/v) 之間。培育時間取決於PPV及/或PRRSV之抗性。一般而言，實施不活化製程直至可在適宜培養系統中檢測到PPV及/或PRRSV不再生長為止。較佳地，本發明之不活化PPV及/或PRRSV係福馬林不活化，其較佳使用如上文所闡述之濃度。較佳地，本發明之不活化PPV及/或PRRSV係環化二乙烯亞胺(BEI)不活化，其包含添加2-溴乙烯胺鹽酸鹽(BEA) (其環化成二乙烯亞胺(BEI))之溶液。可使用已知技術(例如闡述於Nature, 1974, 252, 252-254或Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-1113中者)將本發明之不活化PPV及/或PRRSV納入脂質體中。在本發明之另一實施例中，本發明之不活化PPV可偶聯至適宜生物化合物(例如多醣、肽、蛋白質或諸如此類或其組合)。術語「實施免疫」係關於藉由以下主動免疫：向欲實施免疫之個體投與免疫原性組合物，由此引起針對該免疫原性組合物中所包含抗原之免疫學反應。較佳地，免疫作用使得畜群中特定PPV及/或PRRSV感染之發病率減小或特定PPV及/或PRRSV感染所引起或有關之臨床體徵之嚴重程度減小。此外，使用如本文所提供之免疫原性組合物對有需要之個體進行免疫可預防個體由PPV及/或PRRSV感染。甚至更佳地，免疫針對PPV及/或PRRSV感染產生有效長久免疫學反應。應理解，該時間段將持續大於1個月、較佳地大於2個月、較佳地大於3個月、更佳地大於4個月、更佳地大於5個月、更佳地大於6個月。應理解，免疫作用不可能在實施免疫之所有個體中皆有效。然而，該術語需要畜群之大部分個體有效地免疫。較佳地，在此設想之畜群個體通常(亦即未免疫)會發生PPV及/或PRRSV感染所引起或有關之臨床體徵。熟習此項技術者可輕易地測定畜群之個體是否有效地免疫。較佳地，若與未實施免疫或使用在本發明之前可得之免疫原性組合物實施免疫但隨後感染特定PPV之個體相比，特定畜群中至少33%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、仍更佳地至少95%及最佳地100%個體之臨床體徵之發生率或嚴重程度減弱至少10%、更佳地至少20%、仍更佳地至少30%、甚至更佳地至少40%、仍更佳地至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、仍更佳地至少90%、仍更佳地至少95%及最佳地100%，則免疫作用應有效。在另一態樣中，本發明係關於如本文所述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合或套組之用途，其用於製備藥劑、較佳地疫苗。在另一態樣中，本發明係關於如本文所述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合或套組之用途，其用於治療及/或預防PPV及/或PRRS病毒感染，減少、預防或治療由PPV及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵，或治療及/或預防由PPV及/或PRRS病毒感染引起之疾病。在另一態樣中，本發明係關於對個體實施免疫之方法，其包括向該個體投與如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於治療及/或預防有需要之個體、較佳地豬中由PPV感染及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵、較佳地豬生殖與呼吸道症候群之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之生殖障礙的方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之胚胎及胎兒死亡之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於主動免疫化種豬(母豬及女豬)以用於保護胚胎及胎兒免受豬小病毒感染之方法，該方法包括向該等豬(母豬及女豬)投與治療有效量之如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中個體係選自由以下組成之群：豬、牛、貓及狗，較佳係豬，更佳係母豬及/或女豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中一次性或以兩個或更多個劑量來投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中經肌內投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中將免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)投與女豬及/或母豬，較佳地投與至少3週齡之女豬及/或母豬，更佳地投與懷孕之前之女豬及/或母豬，甚至更佳地投與懷孕及哺乳期間之母豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可安全用於懷孕及哺乳期間之女豬及/或母豬及懷孕之前之女豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可安全用於懷孕30天、較佳地懷孕40天之母豬及/或女豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)包括0.1 µg至50 µg PPV VP2抗原、較佳地0.5 µg至10 µg PPV VP2抗原、更佳地1.0 µg至10 µg PPV VP2抗原及/或3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ PRRS病毒。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可抵抗PPV之同源及/或異源攻擊及/或PRRS病毒之同源及/或異源攻擊。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可抵抗北美及/或歐洲PPV分離物之攻擊及/或北美及/或歐洲PRRS病毒分離物之攻擊。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可交叉抵抗北美及/或歐洲PPV分離物及/或可交叉抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中該方法使得與相同物種之未免疫對照組之個體相比改良至少一種選自由以下組成之群之效能參數：暫時性白血球減少症及特徵在於胚胎及/或胎兒感染及死亡之生殖障礙減少或其組合。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於對個體實施免疫之方法中，該方法包括向該個體投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於治療及/或預防有需要之個體、較佳地豬中由PPV感染及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵、較佳地豬生殖與呼吸道症候群之方法中，該方法包括向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之生殖障礙的方法中，該方法包括向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之胚胎及胎兒死亡的方法中，該方法包括向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於主動免疫化種豬(母豬及女豬)以用於保護胚胎及胎兒免受豬小病毒感染之方法中，該方法包括向該等豬(母豬及女豬)投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中該個體係選自由以下組成之群：豬、牛、貓及狗，較佳係豬，更佳係母豬及/或女豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中一次性或以兩個或更多個劑量來投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中經肌內投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中將免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)投與女豬及/或母豬，較佳地投與至少3週齡之母豬，更佳地投與懷孕之前之母豬，甚至更佳地投與懷孕及哺乳期間之母豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可安全用於懷孕及哺乳期間之女豬及/或母豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可安全用於懷孕30天、較佳地懷孕40天之女豬及/或母豬。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)包括0.1 µg至50 µg PPV VP2抗原、較佳地0.5 µg至10 µg PPV VP2抗原、更佳地1.0 µg至10 µg PPV VP2抗原及/或3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ PRRS病毒。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可抵抗PPV之同源及/或異源攻擊及/或可抵抗PRRS病毒之同源及/或異源攻擊。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可抵抗北美及/或歐洲PPV分離物之攻擊及/或可抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物之攻擊。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)可交叉抵抗北美及/或歐洲PPV分離物及/或可交叉抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)，其用於如本文所闡述及主張之用途，其中該方法使得與相同物種之未免疫對照組之個體相比改良至少一種選自由以下組成之群之效能參數：暫時性白血球減少症及特徵在於胚胎及/或胎兒感染及死亡之生殖障礙減少或其組合。術語「治療及/或預防」係指減小畜群中特定PPV及/或PRRSV感染之發病率或減小由特定PPV及/或PRRSV感染引起或與其有關之臨床體徵之嚴重程度。因此，術語「治療及/或預防」亦係指與動物尚未接受如本文所提供之免疫原性組合物或組合疫苗或組合之動物群相比，在動物已接受有效量之該等免疫原性組合物或組合疫苗或組合之動物群中，減小畜群中感染特定PPV及/或PRRSV之動物數量(=減小特定PPV及/或PRRSV感染之發病率)或減小通常與PPV及/或PRRSV感染有關或由其引起之臨床體徵之嚴重程度。「治療及/或預防」通常涉及將有效量之本發明之免疫原性組合物或組合疫苗或組合投與需要此一治療/預防或可自其獲益之個體或個體畜群。術語「治療」係指在個體或畜群之至少一些動物已感染該PPV及/或PRRSV且其中該等動物已展示一些由該PPV及/或PRRSV感染引起或與其有關之臨床體徵後，投與有效量之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。術語「預防」係指在患有PPV及/或PRRSV之該個體之任一感染或至少該動物或動物群中沒有動物並不展示任一由該PPV及/或PRRSV感染引起或與其有關之臨床體徵之前，投與個體。術語「預防(prophylaxis及preventing)」在本申請案中可互換使用。本文所用之術語「有效量」意指(但不限於)誘發或能夠誘發個體中之免疫反應之抗原量。該有效量能夠減小畜群中特定PPV及/或PRRSV感染之發病率或減小特定PPV及/或PRRSV感染之臨床體徵之嚴重程度。較佳地，與未治療或使用可在本發明之前獲得之免疫原性組合物或組合疫苗或組合治療但隨後感染特定PPV及/或PRRSV之個體相比，臨床體徵之發生率或嚴重程度減弱至少10%、更佳地至少20%、仍更佳地至少30%、甚至更佳地至少40%、仍更佳地至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、仍更佳地至少90%、仍更佳地至少95%及最佳地100%。本文所用之術語「臨床體徵」係指個體中來自PPV及/或PRRSV之感染體徵。感染之臨床體徵取決於所選病原體。該等臨床體徵實例包含(但不限於)暫時性白血球減少症及特徵在於胚胎及/或胎兒感染及死亡之生殖障礙減少或其組合。直接可觀察之臨床體徵之實例包含窩仔數減小、每窩之胚胎或胎兒木乃伊化增加、胚胎或胎兒自溶、胚胎或胎兒之大小減小、胚胎或胎兒之體重減小及諸如此類或其組合。該等臨床體徵之其他實例包含(但不限於)病毒血症增加、靶組織及血液內之病毒負荷增加、PPV對同舍動物之傳播/棚舍擴散增加及諸如此類或其組合。較佳地，經治療個體中發生或嚴重程度減弱(與未治療或使用可在本發明之前獲得之免疫原性組合物治療但隨後感染特定PPV及/或PRRSV之個體相比)之臨床體徵係指暫時性白血球減少症及特徵在於胚胎及/或胎兒感染及死亡之生殖障礙或其組合。本文所用之術語「有需要(in need或of need)」意指，投與/治療涉及加強或改良健康或臨床體徵或對於接受本發明之免疫原性組合物之動物(包含其胚胎或胎兒)之健康的任一其他陽性醫學效應。術語「減少(reducing或reduced或reduction)」或「降低」可在本申請案中互換使用。術語「減少」意指，與未治療(未實施免疫)但隨後感染特定PPV及/或PRRSV之個體相比，臨床體徵減少至少10%、更佳地至少20%、仍更佳地至少30%、甚至更佳地至少40%、仍更佳地至少50%、甚至更佳地至少60%、仍更佳地至少70%、甚至更佳地至少80%、甚至更佳地至少90%、仍更佳地至少95%、最佳地100%。在本發明之一態樣中，一次性投與如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。應理解，單一劑量僅投與一次。每一個體之劑量體積取決於接種疫苗途徑及個體年齡。較佳地，單一劑量之總體積介於約0.2 ml與2.5 ml之間、更佳地介於約0.2 ml與2.0 ml之間、甚至更佳地介於約0.2 ml與1.75 ml之間、仍更佳地介於約0.2 ml與1.5 ml之間、甚至更佳地介於約0.4 ml與1.25 ml之間、甚至更佳地介於約0.4 ml與1.0 ml之間，其中單一0.5 ml劑量或1.0 ml劑量最佳。最佳地，單一劑量具有0.5 ml、1 ml、1.5 ml或2 ml之總體積。在本發明之一態樣中，以兩個或更多個劑量來投與如本文所闡述及主張之免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。然而，可以兩個或更多個劑量投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中第一劑量係在投與第二(加強)劑量之前投與。較佳地，在第一劑量之後至少15天投與第二劑量。更佳地，在第一劑量之後15天與40天之間投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後至少17天投與第二劑量。仍更佳地，在第一劑量之後17天與30天之間投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後至少19天投與第二劑量。仍更佳地，在第一劑量之後19天與25天之間投與第二劑量。最佳地，在第一劑量之後至少21天投與第二劑量。甚至更佳地，在第一劑量之後約21天或在第一劑量之後21天投與第二劑量。在兩次投與方案之一較佳態樣中，免疫原性組合物之第一劑量及第二劑量皆以相同量投與。較佳地，每一劑量係以上文指定之較佳量，其中1 ml或2 ml之第一劑量及第二劑量最佳。除第一劑量及第二劑量方案外，替代實施例包括其他後續劑量。舉例而言，可在該等態樣中投與第三、第四或第五劑量。較佳地，以與第一劑量相同之量投與後續第三、第四及第五劑量方案，其中各劑量之間之時間範圍與上文所提及第一及第二劑量之間之時間一致。將上述投與方案較佳地僅應用於女豬。較佳地，僅以單一投與/單一注射形式向母豬投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合。在本發明之一態樣中，個體係選自由豬、牛、貓及狗組成之群。較佳地，個體係豬。必須理解，豬包括雌性動物及雄性動物。精液可含有PPV且出於該原因，詞語「豬」涵蓋雌性及雄性育種動物。因此，詞語「豬」包括雄性動物(例如公豬)以及雌性動物(例如女豬及母豬)。本文所用之術語「女豬」係指在首次懷孕/妊娠之前及期間之豬類、較佳地豬。與之相比，本文所用之術語「母豬」係指在首次分娩(作為其首次懷孕/妊娠之陽性結果)之後之豬類、較佳地豬。每一個體之劑量體積取決於接種疫苗途徑及個體年齡。較佳地，總體積介於約0.2 ml與5 ml之間、更佳地介於約0.5 ml與3.0 ml之間、甚至更佳地介於約1.0 ml與2.5 ml之間、甚至更佳地介於約1.0 ml與2.0 ml之間。最佳體積為1 ml、1.5 ml、2 ml或2.5 ml/劑量。較佳地，經局部或全身性投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合(或分開之套組組分)。常用之適宜投與途徑係經口或非經腸投與，例如鼻內、靜脈內、真皮內、經皮、肌內、腹膜腔內、皮下以及吸入。然而，端視化合物之性質及作用模式，亦可藉由其他途徑投與免疫原性組合物。舉例而言，該等其他途徑包含經皮內、經靜脈內、經血管內、經動脈內、經腹膜腔內、經鞘內、經氣管內、經皮內、經心臟內、經肺葉內(intralobally、intralobarly)、經髓內、經肺內、經直腸內及經陰道內。然而，更佳地，經皮下或經肌內投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合。最佳地，經肌內投與免疫原性組合物或組合疫苗或組合。本文闡述下列條款： 1. 一種免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其包括 (a) 至少一種豬小病毒(PPV)抗原，其中至少一種PPV抗原係任一含於PPV中之抗原，及 (b) 至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原，其中至少一種PRRS病毒抗原係任一含於PRRS病毒中之抗原。 2. 如條款1之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該PPV係選自由以下組成之群：活減毒/經修飾活PPV病毒、殺死/不活化PPV病毒(例如Porcilis Parvo)、殺死/不活化PPV株014、豬小病毒PPV-27a及PPV-143a之德國野外分離物及豬小病毒疫苗病毒PPV-NADL-2及PPV-IDT (MSV)。 3. 如條款1至2中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種PPV抗原係一或多種PPV亞單元。 4. 如條款1至3中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種PPV亞單元係PPV病毒蛋白2 (VP2)。 5. 如條款4之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係唯一PPV抗原。 6. 如條款4至5中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2 - 在胺基酸位置228具有麩胺酸殘基或麩胺酸酯殘基，及/或 - 在胺基酸位置414具有絲胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置419具有麩醯胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置436具有蘇胺酸殘基，其中胺基酸位置之編號涉及野生型PPV VP2之胺基酸序列。 7. 如條款6之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2另外具有 - 在胺基酸位置25具有異白胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置36具有絲胺酸殘基，及/或 - 在胺基酸位置37具有異白胺酸殘基。 8. 如條款6至7中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中胺基酸位置之編號涉及如SEQ ID NO:1中所展示之胺基酸序列。 9. 如條款4至8中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係重組PPV VP2。 10. 如條款9之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係重組桿狀病毒表現之PPV VP2。 11. 如條款4至10中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列或由其組成。 12. 如條款11之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性之胺基酸序列或由其組成。 13. 如條款12之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列或由其組成或包括任一具有至少210、至少250或至少300個來自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之鄰接胺基酸殘基之片段或由其組成。 14. 如條款13之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列或由其組成。 15. 如條款4至14中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係由編碼與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列之核苷酸序列編碼。 16. 如條款15之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係由編碼與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性之胺基酸序列之核苷酸序列編碼。 17. 如條款16之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PPV VP2係由編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16之胺基酸序列之核苷酸序列編碼。 18. 如條款1至16中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PRRS病毒係選自由PRRS病毒基因型1、PRRS病毒基因型2組成之群，PRRS病毒基因型1包括由與SEQ ID NO:17之核酸序列(萊利斯塔德(Lelystad)野生型序列)具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%一致性之核苷酸序列編碼之基因體，PRRS病毒基因型2包括由與SEQ ID NO:18之核酸序列(VR2332野生型序列)具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%一致性之核苷酸序列編碼之基因體。 19. 如條款18之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中PRRS病毒係選自由以下組成之群：活減毒/經修飾活PRRS病毒、活減毒/經修飾活PRRS病毒類型1基因型(例如Porcilis PRRS、Unistrain PRRS、Amervac PRRS)、活減毒/經修飾活PRRS病毒類型2基因型(例如Ingelvac® PRRS MLV、Fostera PRRS)、活減毒/經修飾活PRRS病毒株94881 [(基因型1)、ReproCyc® PRRS EU]、殺死/不活化PRRS病毒、殺死/不活化PRRS病毒類型1基因型(例如Progressis)、殺死/不活化PRRS病毒類型2基因型、萊利斯塔德病毒株(CDI-NL-2.91，Institut Pasteur, Paris, France，寄存號I-1102)、PRRS病毒亞單元或其他株(例如以登錄號ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登錄號I-1140、CNCM登錄號I-1387、CNCM登錄號I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108、北美PRRS病毒pT7P129A (ATCC登錄號203488)、ATCC登錄號VR-2332、ATCC登錄號VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402寄存者)。 20. 如條款1至19中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種PPV抗原係一或多種PPV亞單元，較佳地其中至少一種PPV抗原係PPV病毒蛋白2 (VP2)，其中更佳地PPV VP2係唯一PPV抗原，且其中至少一種PRRS病毒抗原係活減毒/經修飾活PRRS病毒、較佳地活減毒/經修飾活PRRS病毒類型1基因型(例如Porcilis PRRS、Unistrain PRRS、Amervac PRRS)、更佳地活減毒/經修飾活PRRS病毒株94881 [(基因型1)、ReproCyc® PRRS EU]及活減毒/經修飾活PRRS病毒類型2基因型(例如Ingelvac® PRRS MLV、Fostera PRRS)。 21. 如條款1至20中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合經調配用於單一劑量投與或兩劑量投與。 22. 如條款1至21中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中經肌內投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 23. 如條款1至22中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕及哺乳期間之女豬及/或母豬。 24. 如條款23之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕30天、較佳地懷孕40天之女豬及/或母豬。 25. 如條款1至24中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合進一步包括至少一種醫藥上可接受之載劑。 26. 如條款25之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該至少一種醫藥上可接受之載劑係卡波姆。 27. 如條款4至26中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合包括0.1 µg至50 µg PPV VP2抗原、較佳地0.5 µg至10 µg PPV VP2抗原、更佳地1.0 µg至10 µg PPV VP2抗原及/或3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ PRRS病毒。 28. 如條款1至27中任一項之免疫原性組合物或組合，其中該免疫原性組合物或組合係疫苗。 29. 如條款1至28中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗PPV之同源及/或異源攻擊及/或PRRS病毒之同源及/或異源攻擊。 30. 如條款1至29中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗北美及/或歐洲PPV分離物之攻擊及/或北美及/或歐洲PRRS病毒分離物之攻擊。 31. 如條款1至30中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可交叉抵抗北美及/或歐洲PPV分離物及/或可交叉抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物。 32. 如條款1至31中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可有效治療及/或預防有需要之個體中由PPV感染及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵。 33. 如條款1至31中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原一起含於一個單一容器中或在空間上彼此分開、較佳地含於兩個或更多個各別容器中。 34. 一種套組，其包括如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 35. 如條款34之套組，其中至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原彼此分開地含於兩個或更多個各別容器中，較佳地二者彼此獨立地呈凍乾或冷凍形式，且其中該套組進一步包括用於混合在空間上分開之至少一種PPV抗原及至少一種PRRS病毒抗原之說明書手冊，其中較佳地該說明書手冊含有組合含有至少一種PPV抗原之容器之內容物與含有至少一種PPRS病毒抗原之容器之內容物的指導，其中更佳地使用含有至少一種PPV抗原之容器之液體內容物作為含有至少一種PPRS病毒抗原之容器之凍乾內容物的稀釋劑。 36. 如條款34至35中任一項之套組，其中該套組進一步包括治療及/或預防豬疾病之指導及/或進一步包括治療及/或預防PPV感染及/或PRRS病毒感染之指導，較佳地該套組進一步包括聯合使用如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合之PPV組分及PRRSV組分之指導。 37. 一種如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合或如條款34至36中任一項之套組之用途，其用於製備藥劑、較佳地疫苗。 38. 如條款37之用途，其用以製備用於以下藥劑：治療及/或預防PPV及/或PRRS病毒感染，減少、預防或治療由PPV及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵，或治療及/或預防由PPV及/或PRRS病毒感染引起之疾病。 39. 一種對個體實施免疫之方法，其包括向該個體投與如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 40. 一種治療及/或預防有需要之個體、較佳地豬中由PPV感染及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵、較佳地豬生殖與呼吸道症候群之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 41. 一種與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之生殖障礙之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 42. 一種與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之胚胎或胎兒死亡之方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 43. 如條款39至42中任一項之方法，其中該個體係選自由以下組成之群：豬、牛、貓及狗，較佳係豬，更佳係母豬及/或女豬。 44. 如條款39至43中任一項之方法，其中一次性或以兩個或更多個劑量投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 45. 如條款39至44中任一項之方法，其中經肌內投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 46. 如條款39至45中任一項之方法，其中將該免疫原性組合物或組合疫苗或組合投與女豬及/或母豬，較佳地投與至少3週齡之母豬，更佳地投與懷孕之前之母豬，甚至更佳地投與懷孕及哺乳期間之母豬。 47. 如條款39至46中任一項之方法，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕及哺乳期間之女豬及/或母豬。 48. 如條款39至47中任一項之方法，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕30天、較佳地懷孕40天之母豬及/或女豬。 49. 如條款39至48中任一項之方法，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合包括0.1 µg至50 µg PPV VP2抗原、較佳地0.5 µg至10 µg PPV VP2抗原、更佳地1.0 µg至10 µg PPV VP2抗原及/或3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ PRRS病毒。 50. 如條款39至49中任一項之方法，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗PPV之同源及/或異源攻擊及/或PRRS病毒之同源及/或異源攻擊。 51. 如條款39至50中任一項之方法，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗北美及/或歐洲PPV分離物之攻擊及/或北美及/或歐洲PRRS病毒分離物之攻擊。 52. 如條款39至51中任一項之方法，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可交叉抵抗北美及/或歐洲PPV分離物及/或可交叉抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物。 53. 如條款39至52中任一項之方法，其中該方法使得與相同物種之未免疫對照組之個體相比改良至少一種選自由以下組成之群之效能參數：暫時性白血球減少症及特徵在於胚胎及/或胎兒感染及死亡之生殖障礙減少或其組合。 54. 如條款39至53中任一項之方法，其中向該個體同時、較佳地在相同或不同投與位點同時、依序(以任一順序)及/或以按時間順序交錯方式分開投與至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原。 55. 如條款39至54中任一項之方法，其用於主動免疫化種豬(母豬及女豬)以用於保護胚胎及胎兒免受豬小病毒感染，該方法包括向該等豬(母豬及女豬)投與如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 56. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於對個體實施免疫之方法中，該方法包括向該個體投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 57. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於治療及/或預防有需要之個體、較佳地豬中由PPV感染及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵、較佳地豬生殖與呼吸道症候群之方法中，該方法包括向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 58. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體之生殖障礙之方法中，該方法包括向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 59. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於與相同物種之未免疫對照組之個體相比減少個體中之胚胎及胎兒死亡之方法中，該方法包括向該個體投與治療有效量之該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 60. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至59中任一項之用途，其中該個體係選自由以下組成之群：豬、牛、貓及狗，較佳係豬，更佳係母豬及/或女豬。 61. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至60中任一項之用途，其中一次性或以兩個或更多個劑量投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 62. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至61中任一項之用途，其中經肌內投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。 63. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至62中任一項之用途，其中將該免疫原性組合物或組合疫苗或組合投與女豬及/或母豬，較佳地投與至少3週齡之母豬，更佳地投與懷孕之前之母豬，甚至更佳地投與懷孕及哺乳期間之母豬。 64. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至63中任一項之用途，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕及哺乳期間之女豬及/或母豬。 65. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至64中任一項之用途，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可安全用於懷孕30天、較佳地懷孕40天之女豬及/或母豬。 66. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至65中任一項之用途，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合包括0.1 µg至50 µg PPV VP2抗原、較佳地0.5 µg至10 µg PPV VP2抗原、更佳地1.0 µg至10 µg PPV VP2抗原及/或3.9至7.0 log₁₀ TCID₅₀ PRRS病毒。 67. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至66中任一項之用途，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗PPV之同源及/或異源攻擊及/或可抵抗PRRS病毒之同源及/或異源攻擊。 68. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至67中任一項之用途，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可抵抗北美及/或歐洲PPV分離物之攻擊及/或可抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物之攻擊。 69. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至68中任一項之用途，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合可交叉抵抗北美及/或歐洲PPV分離物及/或可交叉抵抗北美及/或歐洲PRRS病毒分離物。 70. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至69中任一項之用途，其中該方法使得與相同物種之未免疫對照組之個體相比改良至少一種選自由以下組成之群之效能參數：暫時性白血球減少症及特徵在於胚胎及/或胎兒感染及死亡之生殖障礙或其組合。 71. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於如條款56至70中任一項之用途，其中向該個體同時、較佳地在相同或不同投與位點同時、依序(以任一順序)及/或以按時間順序交錯方式分開投與至少一種豬小病毒(PPV)抗原及至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原。 72. 如條款1至33中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其用於主動免疫化種豬(母豬及女豬)以用於保護胚胎及胎兒免受豬小病毒感染之方法中，該方法包括向該等豬(母豬及女豬)投與該免疫原性組合物或組合疫苗或組合。本發明之第二考慮 在一態樣中，本發明係關於製造包括重組蛋白之免疫原性組合物之方法，其中該方法按以下順序包括下列步驟： (i) 提供/獲得包括以下之混合物： - 第一液體， - 重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，及 - 包括編碼該重組蛋白之核酸序列之載體； (ii) 將第二液體添加至步驟(i)之混合物中，其中第二液體與第一液體不同； (iii) 藉由向源自步驟(ii)之混合物中進一步添加另外第二液體且自該組合混合物去除一部分第一及/或第二液體來洗滌混合物中之重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構且視情況最後濃縮； (iv) 藉由向源自步驟(iii)之混合物中添加不活化劑來使載體不活化； (v) 藉由向源自步驟(iv)之混合物中添加中和劑來中和不活化劑。出於本發明目的，「第一液體」係指通常與細胞、抗原、免疫原性組合物、疫苗及諸如此類組合使用之液體、水性或流體培養基。較佳地，第一液體包括來自抗原性組合物之培養基；更佳地，第一液體包括用於在所培養宿主細胞中製造重組蛋白之細胞培養基或較佳地由其組成。該等經培養宿主細胞可為細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞及哺乳動物細胞，其中昆蟲及哺乳動物細胞尤佳。因此，第一液體可包括用於培養細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或哺乳動物細胞之培養基或由其組成。較佳地，細胞培養基係血清游離細胞培養基，且最佳地，在使用昆蟲細胞時，培養基係Excell 420無血清培養基。出於本發明目的，「第二液體」係指通常與細胞、抗原、免疫原性組合物、疫苗及諸如此類組合使用之任何液體，其不同於第一液體。較佳地，第二液體係水溶液、甚至更佳地醫藥上可接受之溶液及甚至更佳地緩衝液，例如鹽水或磷酸鹽緩衝液及諸如此類。最佳地，第二液體之特徵在於，在將活病毒或活細菌培養或儲存於此一液體中時，該液體對任一活病毒或活細菌無殺病毒性。出於本發明目的，「部分」係指不涵蓋全部量之任一量。舉例而言，一部分液體為小於100體積%液體之任一者(例如90%液體、80%液體、70%液體)及大於0%且小於100%之間之所有量。出於本發明目的，「重組蛋白」係指任一重組蛋白，較佳地係指PPV VP2蛋白，更佳地包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NOS 5至16之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%序列一致性之序列或其由組成。出於本發明目的，「四級結構」以及「由複數個該重組蛋白構成之四級結構」係指複數個該重組蛋白之三維配置，例如病毒樣顆粒及/或同源三聚體。出於本發明目的，「載體」以及「包括編碼該重組蛋白之核酸序列之載體」係指適宜表現載體、較佳地桿狀病毒表現載體，其繼而用於轉染或在桿狀病毒表現載體之情形下感染宿主細胞以製造由DNA編碼之蛋白質或多肽。載體及製備載體及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可尤其由以下文獻揭示或類似於以下文獻中所揭示之方法：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, 」PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,」 PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165頁；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406頁；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申請之美國申請案第920,197號；歐洲專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,」 PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,」 PNAS USA 93: 11313-11318，1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340，1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,」 PNAS USA 93: 11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；1996年7月3日提出申請之允許美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992, 「Adenovirus as cloning vectors,」 Seminars in Virology (第3卷)，第237-52頁，1993；Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，第3861-65頁，Graham, Tibtech 8, 85-87，1990年4月；Prevec等人，J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420，1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry (關於DNA表現載體)。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbachet等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，第271-283頁(1997), (DNA載體系統)；Szoka等人，美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(致細胞病變病毒之使用)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文所引用之其他文件。較佳細胞係易於感染含有重組蛋白DNA且表現重組蛋白之適當重組病毒載體者。較佳地，細胞係昆蟲細胞，且更佳地，其包含以商標SF+昆蟲細胞(Protein Sciences Corporation, Meriden, CT)出售之昆蟲細胞。較佳細胞培養物具有介於約0.3 - 2.0 × 10⁶ 個細胞/mL、更佳地約0.35 - 1.9 × 10⁶ 個細胞/mL、仍更佳地約0.4 - 1.8 × 10⁶ 個細胞/mL、甚至更佳地約0.45 - 1.7 × 10⁶ 個細胞/mL及最佳地約0.5 - 1.5 × 10⁶ 個細胞/mL之間之細胞計數。較佳病毒載體包含諸如BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)等桿狀病毒，特定而言，條件係製造細胞係昆蟲細胞。儘管桿狀病毒表現系統較佳，但熟習此項技術者應理解，其他表現系統(包含上文所闡述者)可用於本發明目的，亦即表現重組蛋白。適當生長培養基亦可由熟習此項技術者來確定，其中較佳生長培養基係無血清昆蟲細胞培養基，例如Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS)及諸如此類。在用於感染易感細胞時，含有重組蛋白DNA序列之重組病毒載體之較佳感染複數(MOI)介於約0.03 - 1.5之間、更佳地約0.05 - 1.3、仍更佳地約0.09 - 1.1及最佳地約0.1 - 1.0。較佳地，上文所提及之MOI係關於1 mL細胞培養流體。較佳地，本文所闡述之方法包括使用含有重組蛋白DNA且表現重組蛋白之重組病毒載體感染0.35 - 1.9 × 10⁶ 個細胞/mL、仍更佳約0.4 - 1.8 × 10⁶ 個細胞/mL、甚至更佳地約0.45 - 1.7 × 10⁶ 個細胞/mL及最佳地約0.5 - 1.5 × 10⁶ 個細胞/mL，其中MOI (感染複數)介於約0.03 - 1.5之間、更佳地約0.05 - 1.3、仍更佳地約0.09 - 1.1及最佳地約0.1 - 1.0。可藉由過濾步驟利用過濾器自步驟(iii)中包括重組蛋白之組合混合物去除第一液體之部分。然而，可使用熟習此項技術者已知之任一其他方法來去除任何液體之部分，包含來自步驟(iii)之組合混合物之第一液體及(在適應時)一部分第二液體。該方法(例如)包含(但不限於)離心及/或層析。然而，過濾係最佳方法。去除該部分之第一液體或任何其他液體(在適應時)之較佳過濾方法包括超濾及/或滲濾。超濾及滲濾係熟習此項技術者已知之標準方法，其詳細闡述於(例如)Protein Purification Methods - A Practical Approach – 編者： E.L.V. Harris 及 S. Angel, Oxford University Press 1995 (其內容及教示內容以引用方式併入本文中)中。特定而言，在該教科書之第3章中，闡述若干方法及設備類型，其皆可藉由熟習此項技術者以實例性方式用於本發明目的。出於本發明目的，「不活化劑」係指任一可用於任一習用不活化方法中之試劑。可藉由熟習此項技術者已知之化學及/或物理處理來實施不活化。較佳不活化劑包含環化二乙烯亞胺(BEI)，包含2-溴乙烯胺氫溴酸鹽(BEA) (環化成二乙烯亞胺(BEI))之溶液。較佳其他化學不活化劑包括(但不限於) Triton X-100、去氧膽酸鈉、鯨蠟基三甲基溴化銨、β-丙內酯、硫柳汞、酚及甲醛(福馬林)。出於本發明目的，「中和劑」係指任一能夠中和如本文所闡述之不活化劑以便不活化劑不再能夠使載體不活化之試劑。中和不活化劑之試劑較佳係硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及諸如此類。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中步驟(i)之混合物可藉由包括以下步驟之程序來獲得： (a) 允許使用包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之核酸序列之載體感染培養物中的易感細胞，其中該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係由該載體表現， (b) 然後自細胞培養物回收重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，其中較佳地經由分離步驟(較佳地包含經由至少一個過濾器、更佳地兩個過濾器進行微過濾)來分離細胞碎屑與重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，其中至少一個過濾器之孔徑較佳地大於重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，特定而言，孔徑為約0.1 µm至約4 µm。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中將步驟(a)中之細胞培養物維持於27±2℃下，較佳地同時重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構由該載體表現，及/或其中在使用載體接種細胞之後步驟(b)中之回收發生6至8天、較佳地8天。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中分離步驟包含以下部分或由其組成： - 經由至少一個孔徑為約2 µm至約4 µm之過濾器進行微過濾，及/或 - 經由至少一個孔徑為約0.1 µm至約0.8 µm之過濾器進行微過濾。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中該第一液體包括一部分細胞培養基或由細胞培養基組成，且其中細胞培養基較佳係昆蟲細胞培養基。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中該重組蛋白係選自由以下組成之群： - PPV VP2蛋白，其較佳地包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NOS: 5至16之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99,1%、至少99,2%、至少99,3%、至少99,4%、至少99,5%、至少99,6%、至少99,7%、至少99,8%、至少99,9%或100%序列一致性之序列或由其組成。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係病毒樣顆粒或其中由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係同源三聚體。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中載體係重組病毒、較佳地桿狀病毒，及/或其中核酸序列係DNA序列。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之核酸之載體係重組桿狀病毒，其中該桿狀病毒包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之DNA序列。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中在步驟(iii)中，使用與步驟(i)之混合物中之該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構的原始體積相比，至少2×、較佳地2×至3×之第二液體洗滌該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構，且視情況最後濃縮。更佳地，在步驟(iii)中，在低於37℃之溫度下、更佳地在低於30℃之溫度下、甚至更佳地在低於20℃之溫度下、甚至更佳地在低於10℃之溫度下(例如在介於4℃與29℃之間之溫度下，例如27℃或4℃)實施該(等)洗滌步驟(亦即滲濾過程)。因此，沈澱(聚集)程度顯著減小。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中在步驟(iii)中，藉由過濾自混合物去除第一及/或第二液體之部分，其中較佳利用包括半滲透膜之過濾器或空心過濾器，該半滲透膜之平均孔徑小於該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構及/或防止大部分、較佳地實質上所有20 kDa至500 kDa大小之蛋白質通過半滲透膜。過濾器可為業內之任一習用過濾器。較佳地，該過濾器包含半滲透膜。在另一較佳形式中，該半滲透膜之平均孔徑小於重組蛋白以由此防止至少90%之該重組蛋白通過該等半滲透膜孔隙且藉助過濾器保留重組蛋白。在另一態樣中，該過濾器具有防止通過至少90%之20 kDa至500 kDa大小蛋白質之平均孔徑；更佳地，該過濾器具有防止通過至少90%之50 kDa至400 kDa大小蛋白質之平均孔徑；且最佳地，該過濾器具有防止通過至少90%之75 kDa至300 kDa大小蛋白質之平均孔徑。在重組蛋白以全病毒或全病毒樣顆粒形式製得時，此孔徑較佳。在另一態樣中，該半滲透膜包含選自由以下組成之群之材料：聚碸、聚醚碸及再生纖維素。然而，可使用任一使得自重組蛋白去除第一液體之部分及在多製程步驟情形下去除第一流體及第二液體之混合物之其他材料。該過濾器可選自由以下組成之群：空心纖維膜超濾柱、平板或盒，其中空心纖維膜超濾柱尤佳。擬用於任一所闡述方法中之較佳第二液體係緩衝液，較佳係生理上可接受之緩衝液，其中鹽水尤佳。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中第二液體係緩衝溶液，較佳係洗滌性磷酸鹽緩衝鹽水(WPBS)。可實質上同時實施如本文所闡述之方法之濃縮步驟及液體添加步驟，或替代地，依序實施濃縮步驟及液體添加步驟。在依序實施濃縮步驟及液體添加步驟時，步驟順序無關緊要。舉例而言，在另一態樣中，液體添加步驟發生於該濃縮步驟之前，且在替代態樣中，濃縮步驟發生於該液體添加步驟之前。不論實施順序如何，液體添加步驟及濃縮步驟可實施多次。舉例而言，該等各別步驟中之每一者可視需要實施至少兩次、至少三次、至少4次、至少5次、至少10次、直至更多次。在一態樣中，濃縮步驟及液體添加步驟各自實施至少兩次。在另一態樣中，濃縮步驟及液體添加步驟各自實施至少三次。可實施本文所提供之方法之濃縮步驟，從而與該第一液體之體積相比將重組蛋白濃縮3倍至50倍。更佳地，可進行該濃縮步驟，從而與該第一液體之體積相比將重組蛋白濃縮4倍至20倍。最佳地，可進行該濃縮步驟，從而與該第一液體之體積相比將重組蛋白濃縮7倍至10倍。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中在步驟(ii)中添加之第二液體之體積約為在步驟(iii)中去除之第一及/或第二液體之體積。換言之，並不實施及/或需要濃縮步驟。在使用病毒載體(例如重組痘病毒、腺病毒或桿狀病毒)製造重組蛋白之情形下，推薦藉由適當不活化處理來使病毒核酸不活化。該不活化可發生於純化重組蛋白期間之任一時間。因此，不活化可發生於收穫包括重組蛋白之細胞培養流體之後或微濾重組蛋白(若進行微濾)之後即刻，發生於純化步驟之前或之後(例如在凝膠過濾之前或之後及在陰離子交換層析之前或之後，若進行此步驟)。任一習用不活化方法皆可用於本發明目的。因此，可藉由化學及/或物理處理實施不活化。在較佳形式中，測定收穫流體之體積且使溫度介於約32℃ - 42℃之間、更佳地介於約34℃ - 40℃之間及最佳地介於約35℃ - 39℃之間。較佳不活化方法包含以較佳地約1 mM至約20 mM、較佳地約2 mM至約10 mM、仍更佳地約2 mM至約8 mM、仍更佳地約3 mM至約7 mM、最佳地約5 mM之濃度添加環化二乙烯亞胺(BEI)。舉例而言，不活化包含將較佳地約0.4 M 2-溴乙烯胺鹽酸鹽(BEA) (其環化至0.2 M二乙烯亞胺(BEI))於0.3 N NaOH中之溶液添加至流體中以得到約5 mM BEI之最終濃度。較佳地，然後將流體連續攪拌2 - 96小時且可將不活化收穫流體冷凍儲存於- 40℃或更低溫度或約1℃ - 7℃下。在完成不活化之後，添加硫代硫酸鈉溶液(較佳地以1.0M)以中和任何殘餘BEI。較佳地，以等於在不活化之前所添加BEI之量的量添加硫代硫酸鈉。舉例而言，在添加BEI直至最終濃度為5mM之情形下，添加1.0M硫代硫酸鈉溶液以得到最終5 mM之最小濃度，從而中和任何殘餘BEI。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中不活化劑係氮丙啶化合物、較佳地二乙烯亞胺(BEI)，及/或其中相對於載體添加莫耳過量之不活化劑。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中中和劑係硫代硫酸鈉及/或其中相對於不活化劑添加莫耳過量之中和劑。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中該方法進一步包括以下步驟：混合在步驟(v)之後剩餘之混合物與另一選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群之組分。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中源自該方法之混合物與未經歷該方法之混合物相比殺病毒活性減小至少10%，及/或其中在將活病毒與藉由該方法製得之免疫原性組合物混合兩小時或兩小時以上，該免疫原性組合物使得每mL活病毒損失小於1 log TCID₅₀ 。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中活病毒係豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中該方法進一步包括收穫在步驟(v)之後剩餘之重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構之步驟(vi)，且特定而言進一步包括藉由層析程序、較佳地粒徑篩析層析來純化包括重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構之收穫物之步驟。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中該方法進一步包括組合(經純化)所收穫重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構與至少一種其他抗原之步驟。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之方法，其中至少一種其他抗原係豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒。在另一態樣中，該方法進一步包括以下步驟：收穫在自該重組蛋白去除至少一部分該第一液體之後所獲得之重組蛋白。如本文中所使用，「收穫(harvesting或harvest)」係指收集或回收重組蛋白。在製造重組蛋白以與本發明之方法及組合物一起使用時或在重組蛋白經歷本文所闡述之方法時，可使用業內已知之任一習用方法來回收重組蛋白。在尤佳收穫方式中，經由過濾步驟自該重組蛋白去除該第一液體之部分且自過濾滯留物回收或收穫重組蛋白。在更佳形式中，自具有本文所闡述孔徑之半滲透膜之滯留物收穫或收集或回收重組蛋白。將在經歷本文所提供之方法之後、較佳地在自過濾滯留物收穫之後剩餘之重組蛋白與另一選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群之組分混合。較佳地，該另一組分係佐劑，甚至更佳地，該佐劑係丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且仍更佳地，該佐劑係卡波姆。在本申請案之另一態樣中，上述方法進一步包括以下步驟：混合在不活化及中和步驟之後獲得之重組蛋白與另一選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的組分。在混合經純化重組蛋白與佐劑之前，亦推薦使用pH 7.4磷酸鹽緩衝鹽水或任一其他生理學緩衝劑透析經純化重組蛋白。如本文中所使用，「醫藥可接受之載劑」及「獸醫可接受之載劑」包含任何及所有之溶劑、分散介質、塗層、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。本文所用之「佐劑」可包含氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素(例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)型)；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(特定而言異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；酸或含有直鏈烷基之醇之酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，特定而言異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子表面活性劑，特定而言係以下之酯：山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸(其視情況經乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Stewart-Tull編輯，D. E. S.)。JohnWiley and Sons, NY，第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。舉例而言，可使用由M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液及同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。其他適宜佐劑尤其包含(但不限於) RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組或其他)之熱不穩定腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽等。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，尤其包含共聚物EMA (Monsanto)，其係馬來酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物在水中之溶解產生酸溶液，其將被中和、較佳地中和至生理學pH以產生將引入免疫原性、免疫學或疫苗組合物本身之佐劑溶液。佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸尤其與醣或多元醇之聚烯基醚交聯之聚合物。該等化合物以術語卡波姆為人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，其闡述與具有至少3個、較佳地不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團代替。較佳基團係含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團可自身含有其他取代基，例如甲基。以名稱Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA)銷售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳係使用Carbopol 971P。「稀釋劑」可包含水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可包含氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。穩定劑包含白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽等。本文所用之「防腐劑」係指抗微生物活性劑，例如慶大黴素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)及諸如此類。特別地，添加防腐劑最佳用於製備多劑量組合物。以有效防止所關注組合物為任何微生物污染或抑制所關注組合物內任何微生物生長之濃度添加該等抗微生物活性劑。可使用層析程序、較佳地兩步驟層析程序來進一步純化重組蛋白。若將重組蛋白組裝成病毒樣顆粒(VLP)，則一個步驟、較佳地第一步驟較佳係粒徑篩析(凝膠過濾)層析，其可例如由使用Sephacryl S300基質來進行。在實驗室規模中，最佳使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟習此項技術者已知之任何其他粒徑篩析層析基質，該等基質容許自培養濾液或上清液分離重組蛋白VLPs。適宜基質闡述於例如E.L.V. Harris及S. Angel (編者), Protein purification methods – a practical approach, IRL Press Oxford 1995)中。例如，可藉由以1.0 ml/min之流速向管柱加載包括重組蛋白之粗製劑且使用1.5管柱體積包括20 mM Tris (pH 6.5)、5 mM DTT之緩衝液洗脫管柱來實施凝膠過濾層析。然而，亦可藉由使用親和力層析，例如經由選擇性結合至經固定重組蛋白特異性抗體，或熟習此項技術者已知之任何其他方法來純化重組蛋白。為獲得較高純度等級，可進行第二層析步驟，然而第二層析步驟不同於第一步驟。舉例而言，若第一純化步驟/層析步驟係粒徑篩析(凝膠過濾)，則第二步驟應與該步驟不同，例如親和力層析、離子交換層析等。較佳地，若純化重組蛋白之第一步驟係粒徑篩析(凝膠過濾)層析，則第二步驟可為離子交換層析、較佳地陰離子交換層析(AIEX)。用於純化重組蛋白之較佳陰離子交換層析基質係Q瓊脂糖凝膠(Sepharose)。在約50 ml之小規模中，最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。本申請案不僅提供製造含有重組蛋白之免疫原性組合物之方法，其亦關於含有重組蛋白之免疫原性組合物。在另一態樣中，本發明係關於可藉由如本文所闡述及主張之方法獲得之免疫原性組合物。在另一態樣中，與未經歷本文製造方法之含有重組蛋白之免疫原性組合物相比，藉由該方法製得之含有重組蛋白之免疫原性組合物之殺病毒活性減小至少10%。更佳地，與未經歷該製造方法之含有重組蛋白之免疫原性組合物相比，含有重組蛋白之免疫原性組合物之殺病毒活性減小至少50%。仍感更佳地，與未經歷該製造方法之含有重組蛋白之免疫原性組合物相比，含有重組蛋白之免疫原性組合物之殺病毒活性減小至少70%。甚至仍感更佳地，與未經歷該製造方法之含有重組蛋白之免疫原性組合物相比，含有重組蛋白之免疫原性組合物之殺病毒活性減小至少90%。出於本發明目的，發明術語「殺病毒活性」意指，在將液體、流體、溶液、組合物或諸如此類與活病毒或活細菌混合時，該液體、流體、溶液、組合物或諸如此類使該等活病毒或活細菌不活化或殺死至一定某些程度。因此，液體、流體、溶液、組合物或諸如此類之殺病毒活性減小10%意指，與未經歷該等製造方法中之任一者之液體、流體、溶液、組合物或諸如此類相比，經歷本文所闡述製造方法中之任一者之液體、流體、溶液、組合物或諸如此類活中之病毒或活細菌之存活率高90%。在將活病毒或活細菌與重組蛋白免疫原性組合物混合且一起培育2個或更多個小時、較佳地大於4小時、甚至更佳地大於12小時、甚至更佳地大於24小時、甚至更佳地大於2天、甚至更佳地大於4天、甚至更佳地大於7天、甚至更佳地大於2週、甚至更佳地大於4週、甚至更佳地大於2個月、甚至更佳地大於3個月、甚至更佳地大於4個月、甚至更佳地大於6個月、甚至更佳地大於9個月、甚至更佳地大於12個月、甚至更佳地大於18個月、最佳地大於2年時，藉由本文所闡述方法製得之重組蛋白免疫原性組合物使得損失小於1 log TCID₅₀ 之活病毒或小於1 log CFU/ml活細菌。更佳地，在將活病毒或活細菌與重組蛋白免疫原性組合物混合且一起培育2個或更多個小時、較佳地大於4小時、甚至更佳地大於12小時、甚至更佳地大於24小時、甚至更佳地大於2天、甚至更佳地大於4天、甚至更佳地大於7天、甚至更佳地大於2週、甚至更佳地大於4週、甚至更佳地大於2個月、甚至更佳地大於3個月、甚至更佳地大於4個月、甚至更佳地大於6個月、甚至更佳地大於9個月、甚至更佳地大於12個月、甚至更佳地大於18個月、最佳地大於2年時，藉由本文所闡述方法製得之重組蛋白免疫原性組合物使得損失小於0.9 log TCID₅₀ /ml活病毒或小於0.9 log CFU/ml活細菌。甚至更佳地，在將活病毒或活細菌與重組蛋白免疫原性組合物混合且一起培育2個或更多個小時、較佳地大於4小時、甚至更佳地大於12小時、甚至更佳地大於24小時、甚至更佳地大於2天、甚至更佳地大於4天、甚至更佳地大於7天、甚至更佳地大於2週、甚至更佳地大於4週、甚至更佳地大於2個月、甚至更佳地大於3個月、甚至更佳地大於4個月、甚至更佳地大於6個月、甚至更佳地大於9個月、甚至更佳地大於12個月、甚至更佳地大於18個月、最佳地大於2年時，藉由本文所闡述方法製得之重組蛋白免疫原性組合物使得損失小於0.7 log TCID₅₀ /ml活病毒或小於0.7 log CFU/ml活細菌。仍更佳地，在將活病毒或活細菌與重組蛋白免疫原性組合物混合且一起培育2個或更多個小時、較佳地大於4小時、甚至更佳地大於12小時、甚至更佳地大於24小時、甚至更佳地大於2天、甚至更佳地大於4天、甚至更佳地大於7天、甚至更佳地大於2週、甚至更佳地大於4週、甚至更佳地大於2個月、甚至更佳地大於3個月、甚至更佳地大於4個月、甚至更佳地大於6個月、甚至更佳地大於9個月、甚至更佳地大於12個月、甚至更佳地大於18個月、最佳地大於2年時，藉由本文所闡述方法步驟製得之重組蛋白免疫原性組合物使得損失小於0.5 log TCID₅₀ /ml活病毒或小於0.5 log CFU/ml活細菌。甚至更佳地，在將活病毒或活細菌與重組蛋白免疫原性組合物混合且一起培育2個或更多個小時、較佳地大於4小時、甚至更佳地大於12小時、甚至更佳地大於24小時、甚至更佳地大於2天、甚至更佳地大於4天、甚至更佳地大於7天、甚至更佳地大於2週、甚至更佳地大於4週、甚至更佳地大於2個月、甚至更佳地大於3個月、甚至更佳地大於4個月、甚至更佳地大於6個月、甚至更佳地大於9個月、甚至更佳地大於12個月、甚至更佳地大於18個月、最佳地大於2年時，藉由本文所闡述方法製得之重組蛋白免疫原性組合物使得損失小於0.3 log TCID₅₀ /ml活病毒或小於0.3 log CFU/ml活細菌。可藉由標準活體外滴定分析來估計TCID₅₀ /ml，該分析使得可估計活病毒量。亦可藉由標準活體外滴定分析來測定CFU/ml，該分析使得可估計活細菌量。術語「每ml」較佳地係指1 ml流體。與如本文所定義之未純化重組蛋白相比，該經純化重組蛋白不僅展示減小之殺病毒活性(如本文所定義)，其亦展示增加之免疫原性，較佳地，與由包括未純化重組蛋白之參考免疫原性組合物所誘發之細胞及/或抗體調介之免疫反應相比，該重組蛋白將細胞及/或抗體調介之免疫反應增加至少10%、較佳地至少20%、更佳地至少30%、甚至更佳地至少40%、甚至更佳地至少50%、甚至更佳地至少75%、最佳地至少100%。經純化重組蛋白之免疫原性組合物包括、較佳地可藉由本文所闡述方法獲得者之特徵在於其免疫原性大於未包括此一純化重組蛋白之免疫原性組合物。另外，本文所用之術語「增加之免疫原性或改良之免疫原性」意指，由包括所關注抗原之免疫原性組合物引起之免疫反應大於包括不同抗原或不同純度等級抗原之參考免疫原性組合物，不論此免疫反應係細胞調介及/或抗體調介之免疫反應。根據一較佳實施例，術語增加之免疫原性或改良之免疫原性意指，由包括所關注抗原之免疫原性組合物誘發之抗體調介之免疫反應大於包括不同抗原或不同純度等級抗原的參考免疫原性組合物。就此而言，抗體調介之免疫反應意指，與由包括不同抗原或不同純度等級抗原之參考免疫原性組合物誘發之抗體製造相比，所關注抗原之特異性抗體之製造有所增加。術語「增加」意指，與由包括重組蛋白或不同純度等級重組蛋白之參考免疫原性組合物誘發之細胞及/或抗體調介之免疫反應相比，細胞及/或抗體調介之免疫反應增加至少10%、較佳地至少20%、更佳地至少30%、甚至更佳地至少40%、甚至更佳地至少50%、甚至更佳地至少75%、最佳地至少100%。熟習此項技術者熟知如何量測細胞及/或抗體調介之免疫反應。特定而言，熟習此項技術者熟知如何比較所關注免疫原性組合物之細胞調介之免疫反應與參考之細胞調介之免疫反應，或比較所關注免疫原性組合物與參考組合物之抗體調介之免疫反應，但並不比較所關注免疫原性組合物之細胞調介之免疫反應與參考之抗體調介之免疫反應或反之亦然。此外，舉例而言，可藉由量測所關注免疫原性組合物/抗原對細胞毒性T細胞之活化來量測細胞調介之免疫反應。舉例而言，可藉由量測因向動物投與包括該抗原之免疫原性組合物所生成抗原特異性抗體之量來量測抗體調介之免疫反應。舉例而言，可藉由使用小鼠模型來量測細胞及/或抗體調介之免疫反應。根據本發明，使用小鼠模型作為參考方法。術語「免疫原性組合物」意指(但不限於)包括至少一種抗原之物質組合物，該抗原在宿主中誘發針對所關注抗原之細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，「免疫反應」包含(但不限於)一或多種下列效應：製造或活化特異性地針對所論述組合物或疫苗中所包含之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、阻抑性T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞。較佳地，宿主將顯示治療或保護性免疫反應，從而新感染抗性得以增強及/或疾病之臨床嚴重程度有所減小。在此一情形下，免疫原性組合物係「疫苗」。該保護將顯示為減少或缺乏通常由感染宿主顯示之症狀、恢復時間變快及/或感染宿主中之病毒效價降低。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包括減毒活病毒、較佳地減毒豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒或減毒活細菌。出於本發明目的，「活」病毒或細菌係指能夠在宿主中複製之病毒或細菌。本發明之較佳活病毒及較佳活細菌分別係PRRS病毒及豬感染黴漿體(Mycoplasma hyopneumonia )細菌。然而，術語活病毒或活細菌並不分別限於PRRS及豬感染黴漿體。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物，其中減毒活病毒係豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對病原體、較佳地如本文所闡述及主張包括重組蛋白之病原體之保護性免疫反應。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對PRRS病毒之保護性免疫反應。可組合根據上述方法獲得之重組蛋白免疫原性組合物或上述方法之步驟i)中所使用之重組蛋白與至少一種其他抗原、較佳地病毒或細菌抗原及甚至更佳地來自豬中至少一種其他病原生物體之病毒或細菌抗原。其他抗原可為任一揭示於國際專利申請案WO2007/094893 (其內容及教示內容以引用方式併入本文中)中者。簡言之，其他抗原可為豬之任一其他病原生物體之抗原。較佳地，豬之「另一病原生物體」係選自由以下組成之群：胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonia) (1)；腺病毒(2)；甲病毒屬(Alphavirus)，例如東方馬腦脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis viruse) (3)；支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica) (4)；短螺螺菌屬(Brachyspira spp.) (5)；較佳地，豬赤痢短螺旋菌(B. hyodyentheriae) (6)；大腸柔毛短螺旋菌(B. piosicoli) (7)；豬布氏桿菌(Brucella suis)，較佳係生物變型1、2及3 (8)；經典豬熱病毒(9)；梭菌屬(Clostridium spp.) (10)；較佳地難養芽胞梭菌(Cl. difficile) (11)；產氣莢膜梭菌(Cl. perfringens)類型A、B及C (12)；諾非氏梭菌(Cl. novyi) (13)；腐敗梭菌(Cl.septicum) (14)；破傷風梭菌(Cl. tetani) (15)；冠狀病毒(Coronavirus) (16)；較佳地豬呼吸道冠狀病毒(Porcine Respiratory Corona virus) (17)；豬附紅細胞體(Eperythrozoonosis suis) (18)；豚丹毒菌(Erysipelothrix rhsiopathiae) (19)；大腸桿菌(20)；副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)，較佳係亞型1、7及14 (21)；血凝性腦脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus) (22)；日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus) (23)；胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis) (24)鉤端螺旋體屬(Leptospira spp.) (25)；較佳地澳洲鉤端螺旋體(Leptospira australis) (26)；犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola) (27)；感冒傷寒型鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa) (28)；出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagicae) (29)；及問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans) (30)；波摩那鉤端螺旋體(Leptospira pomona) (31)；塔拉索夫鉤端螺旋體(Leptospira tarassovi) (32)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.) (33)；較佳地，鳥分枝桿菌(M. avium) (34)；細胞內分枝桿菌(M. intracellulare) (35)；及牛分枝桿菌(M.bovis) (36)；豬感染黴漿體(37)；出血敗血性巴斯德菌(Pasteurella multocida) (38)；豬巨細胞病毒(39)；豬小病毒(40)；豬生殖與呼吸道症候群病毒(41)；假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus) (42)；輪狀病毒屬(Rotavirus) (43)；沙門桿菌屬(Salmonella spp.) (44)；較佳地鼠傷寒沙門桿菌(S. thyhimurium) (45)；及豬霍亂沙門桿菌(S. choleraesuis) (46)；豬葡萄球菌(Staph. hyicus) (47)；葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.) (48)；較佳地鏈球菌屬(Streptococcus spp.) (49)；較佳地豬鏈球菌(Strep. suis) (50)；豬疱疹病毒(51)；豬流行性感冒病毒(52)；豬痘病毒(53)；豬痘病毒(54)；水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus) (55)；豬水疱疹病毒(56)；哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira Hardjo) (57)；及/或豬關節滑膜黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae) (58)。在另一態樣中，本發明係關於一種套組，其包括含有如本文所闡述及主張之免疫原性組合物之容器。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之套組，其進一步包括至少一個含有至少一種選自由減毒活病毒、較佳地減毒PRRS病毒及減毒活細菌組成之群之其他抗原之其他容器。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物，其用作藥劑，較佳地用作疫苗。在另一態樣中，本發明係關於如本文所闡述及主張之免疫原性組合物及/或如本文所闡述及主張之套組，其用於與不接受該免疫原性組合物之動物相比減少動物之病原體感染之一或多種臨床症狀的方法中。術語「減小臨床體徵之發生率或嚴重程度」應意指，與「對照組」之動物相比，接受投與疫苗之動物中該等體徵中之任一者之發生率或嚴重程度有所減小，其中兩種動物皆感染衍生疫苗中之免疫學活性組分之病原體或由該病原體攻擊且對照組未接受投與該疫苗或免疫原性組合物。在此背景下，術語「降低」或「減小」意指與未接種疫苗之對照組相比在接種疫苗之組中減小至少10%、較佳地25%、甚至更佳地50%、最佳地大於100%。如本文中所使用，「臨床症狀」或「臨床體徵」應係指自活動物直接可觀察之來自病原體之感染之體徵，例如症狀。代表性實例取決於所選病原體，但可包含(例如)流鼻涕、嗜睡、咳嗽、高熱、增重或減重、脫水、腹瀉、腫脹、跛行及諸如此類。如本文中所使用，「保護性免疫反應」係指減小來自所關注病原體之感染之臨床、病理學或組織病理學體徵或症狀之發生率或減小其嚴重程度，最多且包含完全預防該等體徵或症狀。術語「病理學體徵」應指可在微觀或分子層面上經由生物化學測試或在驗屍時使用肉眼觀察到之感染體徵。術語「組織病理學體徵」應指源自感染之組織變化體徵。術語「臨床症狀」或「臨床體徵」定義於上文中。本文闡述下列條款： 1. 一種製造包括重組蛋白之免疫原性組合物之方法，其中該方法按以下順序包括下列步驟： (i) 提供/獲得包括以下之混合物： - 第一液體， - 重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，及 - 包括編碼該重組蛋白之核酸序列之載體； (ii) 將第二液體添加至步驟(i)之混合物中，其中第二液體與第一液體不同； (iii) 藉由向源自步驟(ii)之混合物中進一步添加另外第二液體且自該組合混合物去除一部分第一及/或第二液體來洗滌混合物中之重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構且視情況最後濃縮； (iv) 藉由向源自步驟(iii)之混合物中添加不活化劑來使載體不活化； (v) 藉由向源自步驟(iv)之混合物中添加中和劑來中和不活化劑。 2. 如條款1之方法，其中步驟(i)之該混合物可藉由包括以下步驟之程序獲得： (a) 允許使用包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之核酸序列之載體感染培養物中的易感細胞，其中該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係由該載體表現， (b) 然後自細胞培養物回收重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，其中較佳地經由分離步驟(較佳地包含經由至少一個過濾器、較佳地兩個過濾器進行微過濾)來分離細胞碎屑與重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，其中至少一個過濾器之孔徑較佳地大於重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構，特定而言，孔徑為約0.1 µm至約4 µm。 3. 如條款2之方法，其中將步驟(a)中之該細胞培養物維持於27±2℃下，較佳地同時重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構由該載體表現，及/或其中在使用載體接種細胞之後步驟(b)中之回收發生6至8天、較佳地8天。 4. 如條款2或3之方法，其中該分離步驟包含以下過程或由其組成： - 經由至少一個孔徑為約2 µm至約4 µm之過濾器進行微過濾，及/或 - 經由至少一個孔徑為約0.1 µm至約0.8 µm之過濾器進行微過濾。 5. 如條款1至4中任一項之方法，其中該第一液體包括一部分細胞培養基或由細胞培養基組成，且其中該細胞培養基較佳係昆蟲細胞培養基。 6. 如條款1至5中任一項之方法，其中該重組蛋白係選自由以下組成之群： - PPV VP2蛋白，其較佳地包括與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及/或SEQ ID NOS: 5至16之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%序列一致性之序列或由其組成。 7. 如條款1至6中任一項之方法，其中由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係病毒樣顆粒或其中由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構係同源三聚體。 8. 如條款1至7中任一項之方法，其中該載體係重組病毒、較佳地桿狀病毒，及/或其中該核酸序列係DNA序列。 9. 如條款1至8中任一項之方法，其中包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之核酸之該載體係重組桿狀病毒，其中該桿狀病毒包括編碼該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構之DNA序列。 10. 如條款1至9中任一項之方法，其中在步驟(iii)中，使用與步驟(i)之混合物中之該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構的原始體積相比，至少2×、較佳地2×至3×之第二液體洗滌該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構，且視情況最後濃縮。 11. 如條款1至10中任一項之方法，其中在步驟(iii)中，在低於37℃之溫度下、更佳地在低於30℃之溫度下、甚至更佳地在低於20℃之溫度下、甚至更佳地在低於10℃之溫度下(例如在介於4℃與29℃之間之溫度下，例如27℃或4℃)實施該(等)洗滌步驟(亦即滲濾過程)。 12. 如條款1至11中任一項之方法，其中在步驟(iii)中，藉由過濾自混合物去除第一及/或第二液體之部分，其中較佳利用包括半滲透膜之過濾器或空心過濾器，該半滲透膜之平均孔徑小於該重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之該等四級結構及/或防止大部分、較佳地實質上所有20 kDa至500 kDa大小之蛋白質通過半滲透膜。 13. 如條款1至12中任一項之方法，其中該第二液體係緩衝溶液，較佳係洗滌磷酸鹽緩衝鹽水(WPBS)。 14. 如條款1至13中任一項之方法，其中在步驟(ii)中所添加第二液體之體積約為在步驟(iii)中去除之第一及/或第二液體體積，亦即並不實施及/或無需濃縮步驟。 15. 如條款1至14中任一項之方法，其中該不活化劑係氮丙啶化合物、較佳地二乙烯亞胺(BEI)，及/或其中相對於該載體添加莫耳過量之該不活化劑。 16. 如條款1至15中任一項之方法，其中該中和劑係硫代硫酸鈉及/或其中相對於該不活化劑添加莫耳過量之該中和劑。 17. 如條款1至16中任一項之方法，其中該方法進一步包括以下步驟：混合在步驟(v)之後剩餘之混合物與另一選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群之組分。 18. 如條款1至17中任一項之方法，其中源自該方法之混合物與未經歷該方法之混合物相比殺病毒活性減小至少10%，及/或其中在將活病毒與由該方法製得之免疫原性組合物混合兩小時或兩小時以上，該免疫原性組合物使得每mL活病毒損失小於1 log TCID₅₀ 。 19. 如條款18之方法，其中該活病毒係豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒。 20. 如條款1至19中任一項之方法，其中該方法進一步包括收穫在步驟(v)之後剩餘之重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構之步驟(vi)，且特定而言進一步包括藉由層析程序、較佳地粒徑篩析層析來純化包括重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構之收穫物之步驟。 21. 如條款1至20中任一項之方法，其中該方法進一步包括組合(經純化)所收穫重組蛋白及/或由複數個該重組蛋白構成之四級結構與至少一種其他抗原之步驟。 22. 如條款21之方法，其中該至少一種其他抗原係豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒。 23. 一種免疫原性組合物，其可藉由如條款1至22中任一項之方法獲得。 24. 如條款23之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包括減毒活病毒、較佳地減毒豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒或減毒活細菌。 25. 如條款23或24之免疫原性組合物，其中該減毒活病毒係豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒。 26. 如條款23至25中任一項之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對病原體、較佳地包括如條款6之重組蛋白之病原體之保護性免疫反應。 27. 如條款23至26中任一項之免疫原性組合物，其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後，該免疫原性組合物誘導針對PRRS病毒之保護性免疫反應。 28. 一種套組，其包括含有如條款23至27中任一項之免疫原性組合物之容器。 29. 如條款28之套組，其進一步包括至少一個含有至少一種選自由減毒活病毒、較佳地減毒PRRS病毒及減毒活細菌組成之群之其他抗原之其他容器。 30. 如條款23至29中任一項之免疫原性組合物，其用作藥劑，較佳地用作疫苗。 31. 如條款23至29中任一項之免疫原性組合物及/或如條款28或29中任一項之套組，其用於與未接受該免疫原性組合物之動物相比減小動物中病原體感染之一或多種臨床症狀之方法中。實例下文陳述下列實例以闡釋本發明之具體實施例。該等實例僅為闡釋性且應理解為並不限制本發明之範圍或基本原理。實例1：豬小病毒 (PPV) 27a VP2 之製造 - 上游處理 在經桿狀病毒感染之SF+細胞中製造PPV 27a VP2，且在略微類似於PCV2 ORF2 (WO 2006/072065；實例1至3)之製程中實施BEI不活化。然而，PPV 27a VP2使用稱為「DiamondBac」之不同桿狀病毒骨架(Sigma Aldrich, D6192) (代替用於PCV2 ORF2之較早BaculoGold骨架)。自基因庫登錄號AY684871.1獲得豬小病毒(PPV) 27a VP2核苷酸序列。反轉譯PPV 27a VP2編碼區且使用由Integrated DNA Technologies提供之SciTools^® Web Tools軟體針對果蠅屬(Drosophila)實施密碼子最佳化。進一步修飾經密碼子最佳化之PPV 27a VP2基因以將兩個ClaI限制酶位點插入VP2編碼區中，且將BamHI及NotI限制酶位點分別添加至5‘-端及 3‘-端。以不破壞VP2編碼區之方式來插入ClaI位點。插入ClaI位點可在所預測27a VP2胺基酸序列中引入三個次要胺基酸變化。源自ClaI插入之胺基酸變化位於位置25 (甘胺酸Þ異白胺酸)、36 (丙胺酸Þ絲胺酸)及37 (甘胺酸Þ異白胺酸)。在Integrated DNA Technologies處，以化學方式合成經密碼子最佳化之PPV 27a-ClaI VP2基因且隨後選殖至標準選殖質體pUC57中(PPV27a-ClaI 38320377)。然後藉由使用BamHI及NotI限制酶進行消解自Integrated DNA Technologies所提供pUC57質體切除PPV 27a-ClaI基因，且將PPV 27a-ClaI基因亞選殖至桿狀病毒轉移載體pVL1393 (BD Pharmingen, 21486P)之各別酶位點中。在DH5(大腸桿菌(Invitrogen™ MAX Efficiency™)中擴增含有PPV 27a-ClaI基因之pVL1393質體且隨後提取，並使用商業質體純化套組(QIAprep Spin Miniprep套組，Qiagen)純化。使用Escort™轉染試劑(Sigma Aldrich, E9770)將含有PPV 27a-ClaI基因之經純化pVL1393質體及線性化桿狀病毒DiamondBac®骨架共轉染至Sf9昆蟲細胞中以生成重組桿狀病毒。實施限制性稀釋以獲得含有在多角體蛋白啟動子控制下之PPV 27a-ClaI VP2基因之經純化重組桿狀病毒儲備液。利用桿狀病毒表現載體系統(BEVS)來使懸浮昆蟲細胞培養物(SF+)製造包括PPV 27a VP2蛋白之重組抗原。對於此產物而言，以間歇模式培養經感染SF+細胞大約7天且然後加以處理以去除細胞碎屑及培養基組分。實例2：豬小病毒 (PPV) 27a VP2 之製造 - 下游處理 實施兩個連續步驟以構成下游處理。在稱為「淨化」之製程中去除細胞碎屑，而經由兩個體積之洗滌磷酸鹽緩衝鹽水(WPBS) 去除培養基組分(稱為「滲濾」)。在生物反應器中製造PPV 27a VP2桿狀病毒載體。將培養基以預滅菌或無菌過濾方式添加至生物反應器中。與培養基一起添加源自擴增培養物之SF+細胞。在使用PPV 27a VP2桿狀病毒晶種接種時，同時接種細胞(並行感染)。在整個病毒傳播中，將溫度維持於27±2℃下且監測pH。藉由吹掃清潔-壓縮空氣及氧(O₂ )來控制溶解氧(DO)。收穫窗口出現於病毒感染之後6至8天且達成≤ 20%細胞存活率之收穫準則。在收穫時，使用兩組過濾器淨化PPV 27a VP2抗原流體，預過濾器具有2.0-4.0 µm孔徑且最終過濾器具有0.1-0.8 µm孔徑。將所過濾收穫流體收集於罐中。然後使用≥兩體積(2×-2.5×) WPBS [使用300,000-500,000千道爾頓(kDa)標稱截留分子量(NMWC)空心纖維過濾器]在介於4℃與29℃之間之溫度下「滲濾」經淨化PPV 27a VP2抗原流體。在滲濾之後，將PPV 27a VP2抗原溫度增加至37±2℃.以藉由添加二乙烯亞胺(BEI)至最終濃度為5mM來達成不活化。在37±2℃.下培育抗原且混合72-96小時。使用鈉莫耳過量之硫代硫酸鹽溶液將殘餘BEI中和至少30分鐘。將PPV 27a VP2抗原流體轉移至袋中以儲存於4±3℃.下直至疫苗摻和為止。下表1A及1B中之數據展示，在一起混合長達8小時(一個工作日)時，PPV 27a VP2疫苗分別對ReproCyc^® PRRS EU疫苗及Ingelvac^® PRRS MLV疫苗無殺毒性。表 1A ：將兩個(2)系列之ReproCyc PRRS EU^® (批號為3910003A (10個劑量)及3910004A (50個劑量))在5℃ ± 3℃下儲存於包裝材料中直至用於研究。使用兩個(2)系列之PPV 27a VP2 (批號為7600016A (10個劑量)及7600018B (50個劑量))分別作為Ingelvac ReproCyc^® PRRS EU之批次3910003A (10個劑量)及3910004A (50個劑量)之稀釋劑。將該兩個批次在5℃ ± 3℃下儲存於包裝材料中直至用於研究。將ReproCyc^® PRRS EU疫苗在重構(在組1中重構於含Carbopol稀釋劑中或在組2中重構於液體疫苗PPV 27a VP2中)之後在室溫下(15-25℃)儲存最長8小時時段且在0、2、4及8小時時測試效價。下表1A中在T0、T2、T4及T8時之組1之病毒滴定結果(Log10 TCID50/2mL劑量)顯示最長8h時之病毒穩定性。組2之相關產物在T0、T2、T4及T8時之病毒滴定結果(Log10 TCID50/2mL劑量)顯示，PPV 27a VP2疫苗在最長8h時並無針對ReproCyc® PPRS EU之殺病毒活性。表 1A

表 1B ：將兩個(2)系列之Ingelvac PRRS MLV (批號為2451189A (10個劑量)及2451188A (50個劑量))在5℃ ± 3℃下儲存於包裝材料中直至用於研究。使用兩個(2)系列之PPV 27a VP2 (批號為7600016A (10個劑量)及7600018B (50個劑量))分別作為Ingelvac^® PRRS MLV之批次2451189A (10個劑量)及2451188A (50個劑量)之稀釋劑。將該兩個批次在5℃ ± 3℃下儲存於包裝材料中直至用於研究。將Ingelvac^® PRRS MLV疫苗在重構(在組1中重構於含Carbopol稀釋劑中或在組2中重構於液體疫苗PPV 27a VP2中)之後在室溫下(15-25℃)儲存最長8小時時段且在0、2、4及8小時時測試效價(TCID50/2mL劑量)。下表1B中在T0、T2、T4及T8時之組1之病毒滴定結果(Log10 TCID50/2mL劑量)顯示最長8h時之病毒穩定性。組2之相關產物在T0、T2、T4及T8時之病毒滴定結果(Log10 TCID50/2mL劑量)顯示，PPV 27a VP2疫苗在最長8h時並無針對Ingelvac^® PRRS MLV之殺病毒活性。表 1B

實例3：在混合 PRRSV-EU 疫苗與 PPV VP2 疫苗時之 PRRSV-EU 疫苗有效性 將三十六(36)頭未懷孕、育種年齡之女豬隨機化至三個治療組中，每一組包括12頭女豬。組T01在第0及21天(D0、D21)接受WPBS (洗滌磷酸鹽緩衝鹽水)之對照產品(對照 )。組T02在D0接受ReproCyc® PRRS EU (PRRS毒株94881，3.9 log10 TCID₅₀ /劑量)及豬小病毒疫苗PPV-27a VP2 (10 µg/劑量) (混合 )且在D21僅接受PPV-27a VP2 (10 µg/劑量)。使用液體PPV-27a VP2重構呈凍乾餅形式之ReproCyc® PRRS EU。組T03在D0接受ReproCyc® PRRS EU (單獨 )。調配治療劑，從而女豬接受最小免疫化劑量之ReproCyc® PRRS EU及最大相對功效之PPV-27a VP2。使用5.5 log₁₀ TCID₅₀ /6 mL總劑量(2 mL經肌內及每一鼻孔2 mL)之異源PRRSV EU分離物190136在初始接種疫苗之後4週(D28)攻擊女豬，且在下列日期收集血清試樣：D31、D35、D38、D42及D49。藉由定量PCR (qPCR)測試PRRSV病毒血症[Sandra Revilla-Fernández等人，Journal of Virological Methods 126 (2005) 21-30]。攻擊病毒歐洲PRRS病毒分離物190136最始係自來自農場之新生仔豬之肺組織獲得，該新生仔豬展示在2004年4月爆發於德國Lower Saxony期間之PRRSV之典型生殖體徵(母豬流產且新生仔豬虛弱)。主治獸醫將肺試樣呈遞至BioScreen (試樣於2004年4月21日到達)用於診斷測試。攻擊病毒傳播於AK-MA104細胞中且在攻擊之前傳代兩次。在攻擊後，兩個組(混合及單獨)皆展示可有效抵抗毒性PRRSV，其中混合組在D28至D49之定量病毒負荷曲線下面積(AUC)為24.36 GE/mL (GE =基因體等效物) (p=0.0002)且單獨組為32.54 GE/mL (p=0.0045)，與之相比，在對照中為50.85 GE/mL。此代表混合組之豬中之全身性循環病毒隨時間減少大約50%且在ReproCyc® PRRS EU單獨組中大約減小40% (圖1)，從而證實了混合組及單獨組之重大保護效應。另外，定量平均PRRSV qPCR分析證實，與對照相比，混合組在D35 (p＜0.0001)及D38 (p=0.0052)以及單獨組在D35 (p＜0.0001)之PRRSV病毒負荷顯著減小，從而證實了混合組及單獨組之重大保護效應。qPCR分析展示，與對照相比，混合組(p=0.0013)及單獨組(p=0.0046)在D35以及混合組在D38 (p=0.0137)之陽性女豬比例顯著減小。儘管並非統計學顯著，但在混合組中於D42及D49觀察到平均病毒負荷及PRRSV qPCR陽性比例之數值減小趨勢。類似趨勢可見於單獨組中，其中D49之平均病毒負荷及D42及D49之qPCR陽性比例有所減小。可證實，使用單獨ReproCyc® PRRS EU疫苗或在與PPV-27a VP2疫苗混合時皆可有效抵抗毒性PRRSV-EU攻擊毒株，從而證實4週免疫性開始。自圖1及圖2中之數據顯而易見，混合ReproCyc® PRRS EU疫苗與PPV-27a VP2可改良效能。結果展示，混合組中之PRRSV組分與PPV組分之間並無干擾，從而證實可有利地經由混合來聯合使用。實例4：在混合 PRRSV-EU 疫苗與 PPV VP2 疫苗時之 PPV VP2 疫苗有效性 組合疫苗之有效性評價 ：針對PPV實驗感染來評估聯合使用兩種疫苗[ReproCyc® PRRS EU (PRRS毒株94881)及PPV-27a VP2]之效能。針對使用 PPV 野生毒株之實驗攻擊之效能 ：基於胎兒之PPV感染來評估組合疫苗針對PPV之效能。若每一治療組中≥ 80%之胎兒關於PPV為血清陰性，則疫苗可視為有效。動物護理 ：動物處於良好健康中且開始研究之前之營養狀態。在納入及隨機化程序之前，實施健康檢驗。在研究之整個持續時間中使用不含藥進食。根據設施標準操作程序，日量適用於針對測試動物之年齡、病狀及物種。在整個研究中隨意提供水。在使用異源PPV株攻擊之後聯合使用PPV及PRRSV疫苗之效能評價：在D0，將5-6個月齡之習用未懷孕女豬等分隨機化至三個治療組中。組T01在第0及21天(D0、D21)接受2mL (肌內)對照產品(PBS-Carbopol稀釋劑(Impran FLEX^® )。組T02在D0接受2mL (肌內) ReproCyc^® PRRS EU (PRRS毒株94881)及豬小病毒疫苗PPV-27a VP2且在D21僅接受PPV-27a VP2。對於組T02而言，使用PPV-27a VP2疫苗溶液重構呈凍乾餅形式之ReproCyc^® PRRS EU。組T03在D0及D21接受2mL (肌內)豬小病毒疫苗PPV-27a VP2 (1 µg/劑量)。每天觀察女豬之一般健康狀況。在懷孕39天與42天之間使用自BioScreen (Münster, Germany)所獲得來自於2004年6月15日木乃伊化且發送至Leipzig University, Germany之仔豬之組織之異源PPV株401/09 (198669)攻擊動物(將攻擊病毒解凍且稀釋於DMEM (1×, Gibco，參考號11966-025，批號1632505)中直至靶劑量為6.0 log10 TCID₅₀ /6-mL劑量)。在懷孕約90天收穫胎兒(標準程序)且藉由PCR (Molitor TW等人，Journal of Virological Methods 1991, 32: 201-211)自其器官或組織流體試樣評估PPV之存在且評估其病狀、大小及體重。調配治療劑，從而女豬接受ReproCyc^® PRRS EU (PRRS毒株94881)及豬小病毒疫苗PPV-27a VP2，其中接受最大ReproCyc^® PRRS EU免疫化劑量(10^7.0 TCID₅₀ /2-mL劑量；幾何平均值)及最小相對功效之豬小病毒疫苗PPV-27a VP2 (1 µg/劑量)。根據Ph.Eur. Monograph 8.0 04/2013:0965，研究係有效的，此乃因該疫苗提供95.7% (T03組)及94.3% (T02組)之保護，而T01組(對照)具有91.4%之陽性胎兒(參見表2)。可推斷出，在交配之前三週完成接種疫苗時，使用PPV疫苗(單獨或與ReproCyc^® PRRS EU混合)接種疫苗較為安全及有效。表2 -每組之陽性胎兒百分比

¹ 陽性PPV胎兒數/每組胎兒數。實例5：亞單元PPV疫苗之製備選擇將PPV VP2抗原表現於基於German PPV 27a分離物之感染桿狀病毒之昆蟲細胞中。自基因庫登錄號AY684871.1獲得豬小病毒(PPV) 27a VP2核苷酸序列。反轉譯PPV 27a VP2編碼區且針對果蠅屬(SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3)實施密碼子最佳化。在Integrated DNA Technologies處以化學方式合成密碼子最佳化PPV 27a VP2基因。然後將PPV 27a基因亞選殖至桿狀病毒轉移載體pVL1393中，且使用線性化桿狀病毒DiamondBac®骨架共轉染至Sf9昆蟲細胞中以生成含有在多角體蛋白啟動子之控制下之PPV 27a VP2基因之重組桿狀病毒。在表現於Sf9昆蟲細胞中時，PPV VP2自組裝成非包膜VLP (數據未展示)。使用卡波姆(Carbopol)將PPV VP2抗原佐劑化。實例6： PPV疫苗之概念驗證研究在所有動物研究中，動物皆處於良好健康中且開始研究之前之營養狀態。在隨機化程序之前，實施健康檢驗。在研究之整個持續時間中使用不含藥進食。根據設施標準操作程序，日量適用於針對測試動物之年齡、病狀及物種。在整個研究中隨意提供水。此接種疫苗-攻擊研究之目標在於確立育種前亞單元豬小病毒(PPV)疫苗之概念驗證劑量測定效能(參見實例5)。對女豬接種疫苗且在使用活毒性PPV分離物(PPV 002346-5；北美毒株)於大約懷孕40天(dG)時攻擊之前進行育種。在大約90 dG時評估胎兒之PPV感染。研究設計闡述於表3中。表3：研究設計

NTX =未治療/未攻擊對照；IN =鼻內；IM =肌內；dG =懷孕天數。使用67頭源自先前測試為PPV陰性且並無先前生殖疾病或PPV接種疫苗史之畜群之女豬。將女豬隨機化至6個n=9之治療組(T)中，混合至3個畜舍中，使其在D0接受接種疫苗且在D21進行加強：T1 NC (陰性對照，注射用水)；T2 ， 10µg PPV，T3 PC (陽性對照；全不活化豬小病毒(PPV) 、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體(L. icterohaemorrhagiae )及波摩那鉤端螺旋體；市面有售；根據製造商手冊使用)。包含三頭未治療對照(NTX )女豬，每個畜舍一頭。在接種疫苗後，使女豬同步化(經由投與Matrix®；烯丙孕素(altrenogest)，Intervet Schering-Plough Animal Health；每一標記連續14天，D18至D31)且然後在D35與D42之間育種。67頭女豬中之54頭變得懷孕。在D80 (大約40dG)，對NTX女豬進行驗屍，且以4.25log₁₀ TCID₅₀ /劑量向剩餘女豬接種6 mL PPV株PPV002346-5 (北美毒株) (2 mL經肌內且2mL於每一鼻孔經鼻內)。每週對女豬放血，在同步化及育種期間(D35 - D70)除外。自D0、D7、D14、D21、D28及D73對血清實施血清學研究；自D80、D87、D94、D101、D108、D115、D122及D128針對病毒血症對血清實施血清學及聚合酶鏈反應(PCR)研究(如Jozwik等人，2009；Journal of General Virology, 90, 2437-2441中所闡述)。在D129或D130 (大約90dG)對女豬進行驗屍。在驗屍時，去除每一生殖道，且記錄子宮中之胎兒位置、胎兒狀況、大小及體重。收集來自每一胎兒之胸腔洗滌液及肺之試樣。自每一胎兒無菌收集胸腔洗滌試樣。簡言之，使用無菌針及注射器將3 ml無菌PBS注射至胸腔中。將流體抽吸回注射器中且注射至適宜大小之適當無菌SST (血清分離管)中。藉由PCR測試胸腔洗滌液中之PPV之存在且藉由血球凝集抑制(HI)測試PPV抗體之存在。將肺組織冷凍儲存。女豬病毒血症 (PPV) 在D0、D73 (數據未展示)及D80 (表4)攻擊之前，所有女豬皆為PPV病毒血症陰性。所有陰性對照在D87皆係病毒血性，且4/7在D94係病毒血性。在接種疫苗後，T3女豬在加強接種疫苗後發生血清轉化。T2對初始接種疫苗具有血清學反應且在加強接種疫苗之後保持血清陽性。T1對照女豬保持血清學PPV陰直至攻擊。在攻擊後，所有陰性對照女豬在D87皆係病毒血性(在攻擊之後7天)。一頭T3女豬在D87係病毒血性。所有其他女豬在該等時間點皆非病毒血性(參見表4)。 NTX女豬保持血清陰性且其胎兒皆係PPV陰性(藉由胸腔洗滌試樣之PCR)。表4：在D80於懷孕40天(dG)使用PPV攻擊時PPV陽性(PCR)女豬之頻率分佈。

胎兒結果 所有NTX胎兒在D80驗屍時皆視為正常(表5)。在D129及D130進行最終驗屍時，22.5%之T1 (陰性對照)胎兒正常，而98.39%之T3胎兒及97.62%之T2胎兒正常。T1 (陰性對照)胎兒之平均大小及體重分別為11.5 cm及168.8 g，而T2胎兒之平均大小及體重分別為17.5 cm及590.1 g。藉由PCR針對胸腔洗滌試樣測得，所有T4 (NTX)胎兒皆係PPV陰性(參見表3)。可證實，在67/80之T1陰性對照胎兒中患有PPV感染(83.75%)。67個證實為PPV感染之陰性對照胎兒中之62個為木乃伊化胎兒。與之相比，僅在0.79%之T2胎兒中證實有PPV感染。藉由用於確立效能之結論參數(如歐洲藥典(European Pharmacopoeia) (monograph 01/2008:0965)中所陳述)，所有疫苗(包含陽性對照(全細胞不活化PPV))皆滿足抵抗感染之準則(＞80%之胎兒為PPV陰性)。表5：窩仔細節：胎兒之數量、大小、體重及狀況及PPV感染之實驗室證實(針對胸腔洗滌試樣之PCR)。

結論：在毒性異源PPV攻擊之後，本發明PPV疫苗展示胎兒保護性。研究結果展示，疫苗在育種前投與時係安全的且可有效地顯著減少胎兒之病毒血症及經胎盤感染。另外，已展示，該疫苗可抵抗異源北美PPV攻擊毒株。另外，已展示，亞單元PPV VP2蛋白與完整死病毒同等有效。實例7：抵抗異源US PPV株之PPV疫苗之最小免疫化劑量之確立此接種疫苗-攻擊研究之目標在於確立豬小病毒(PPV)疫苗之最小免疫化劑量(MID)。使用活毒性PPV血清型1分離物(PPV 002346-5)在大約懷孕40天(dG)時攻擊女豬。若接種疫苗組中≥80%之胎兒在攻擊之後為PPV陰性，則疫苗可視為有效。支持性參數包含胎兒之大小、體重及狀況、女豬攻擊後病毒血症狀態及女豬血清學狀態。將女豬(無先前生殖疾病或PPV接種疫苗史)隨機化至以下治療組中：T01陰性對照(產品匹配安慰劑(PMP))及T02 = 1.0 µg PPV/2 mL劑量)。將未治療/未攻擊(NTX)女豬隨機分配至畜舍中作為一般健康狀態之對照。在D0及D21經肌內給予女豬2 mL適當治療劑。在接種疫苗後，在D37與D50之間將女豬育種，且然後在D74評估懷孕狀態。在D81，使用6.77 log₁₀ TCID₅₀ /6 mL PPV血清型1經肌內及經鼻內攻擊懷孕女豬。每週對女豬放血，在動情期同步化及育種期間(D36 - D73)除外。自D7、D14、D21、D28及D35對血清實施血球凝集抑制(HI)分析；自D-3、D74、D80、D88、D95、D102及D127針對病毒血症對血清實施HI及聚合酶鏈反應(PCR)研究(參見實例6)。在D128及D129 (大約90 dG)將女豬驗屍。在驗屍時，去除每一母豬之生殖道，且記錄每一子宮中之胎兒位置、胎兒狀況、大小及體重。自每一胎兒收集胸腔洗滌試樣(參見實例6)且藉由PCR測試PPV之存在。女豬病毒血症 (PPV) 疫苗可視為安全，此乃因動物在接種疫苗後24小時或48小時並不展示異常體溫，不展示可歸因於疫苗之異常局部反應且不展示與接種疫苗相關之臨床體徵(數據未展示)。在接種疫苗之前、在攻擊之前於D74及在D80，所有女豬皆係PPV病毒血症陰性。因此，在接種疫苗後，並未觀察到與疫苗投與相關之臨床體徵。在D88，所有10頭T01女豬皆係病毒血性，且所有接種疫苗之女豬皆係陰性。所有治療組之所有其他血樣在D95、D102及D127皆係PPV病毒血症陰性(表6)。表6：在D81於約懷孕40天(dG)使用PPV攻擊時PPV陽性(PCR)女豬之頻率分佈。

* 2頭女豬已診斷為不懷孕且由此自組去除胎兒結果 在D128及D129進行最終驗屍時，38%之T01 (陰性對照)胎兒處於正常狀況下，而95%之疫苗組胎兒處於正常狀況下。T01 (陰性對照)胎兒之平均大小及體重分別為14.4 cm及245.9 g，而接種疫苗之母獸之胎兒之平均大小及體重分別為19.3 cm及550 g (表7)。因此，疫苗組滿足抵抗PPV感染之準則，此乃因由Ph. Eur. 01/2008:0965確立之PPV效能結論參數為，治療組中＞80%之胎兒必須為PPV陰性。在113/146之陰性對照(T01)胎兒(77%)中證實有PPV感染。然而，接種疫苗組(T02)中之PPV感染僅為10%。表7 窩仔細節：胎兒之數量、大小、體重及狀況及PPV感染之實驗室證實(針對胸腔洗滌試樣之PCR)。

結論：本發明之PPV VP2亞單元疫苗展示可在使用毒性異源PPV攻擊之後保護胎兒。此研究結果揭示，在使用僅1 µg PPV VP2亞單元疫苗時，該疫苗可安全且有效地預防女豬之病毒血症及胎兒之PPV感染。另外展示，該疫苗可抵抗異源北美攻擊毒株。實例8：抵抗異源EU PPV株之PPV疫苗之最小免疫化劑量之確立此研究之目標在於評估豬小病毒疫苗(PPV VP2，自此處始稱為PPV疫苗)之免疫性開始。另外，使用隨機化、盲式、陰性對照之接種疫苗 -攻擊研究設計來評估安全性及效能。將女豬隨機分配至三組中。在組1及2中，使用三週間隔(在D0及D21)對女豬接種疫苗兩次。在交配之前三週給予第二劑量。藉由肌內(IM)途徑以2 mL體積來投與所有治療劑。組2接受PPV疫苗，而組1係接受無菌稀釋劑作為對照產品之安慰劑組且組3用作不進行任何治療之嚴格控制。將女豬動情期同步化且在第二接種疫苗之後三週對其人工授精。在懷孕第39天與第42天之間於D84使用毒性、異源PPV株攻擊懷孕動物。在D132-135 (約懷孕第90天)，對女豬實施安樂死，驗屍且評估胎兒。表8：研究設計

藉由 PCR 評估攻擊前及攻擊後女豬之 PPV 病毒血症 ：在接種疫苗之前D-6及D-1，藉由PCR測得所有動物皆係PPV陰性，從而滿足納入準則。在接種疫苗後，嚴格對照及對照產品組中之所有動物皆係PPV抗原陰性直至攻擊為止，因此，可排除攻擊之前之PPV感染。在攻擊後7 (D90)、14 (D97)及21 (D104)天及在驗屍之日探究病毒血症。在攻擊之後，在接種疫苗之動物中並未檢測到病毒血症，病毒血症僅發生於未接種疫苗之對照動物中。在D90 (攻擊後7天)，95%之未接種疫苗之對照動物已為PPV陽性。在D97，仍有60%之該等動物具有陽性結果，而在D104所有動物皆測試係PPV陰性。與之相比，在接種疫苗之組中，所測試所有動物在第D90、D97或D104天皆係PPV陰性。表9：在攻擊之後患有病毒血症之動物數

胎兒結果 對照組中之PPV感染胎兒之百分比為91.4%，但在PPV組中僅為4.3% (參見表10)。表10 每組之陽性胎兒百分比及窩仔數

¹ 每一組之陽性PPV胎兒數/胎兒數。N為總數胎兒狀況之評估 評估所有胎兒之狀況且分配為以下三類：正常、木乃伊化及自溶。大部分木乃伊化及自溶胎兒發現於對照組中。僅39.8%之此組胎兒處於正常狀況下，而在接種疫苗之組中97.4% (PPV組)之胎兒具有正常病狀(參見表11)。表11：胎兒狀況

結論：本發明PPV疫苗展示可在毒性異源PPV攻擊之後保護胎兒，從而指示在僅使用1 µg疫苗時該疫苗可安全且有效地預防胎兒之病毒血症及PPV感染。另外展示，該疫苗亦可抵抗PPV之異源歐洲攻擊毒株。因此，該疫苗具有寬保護範圍，此乃因該疫苗可抵抗異源北美以及異源歐洲攻擊毒株。根據本發明，本文所揭示及主張之所有組合物及方法皆可在無需過度實驗之情形下進行及執行。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可改變該等組合物及方法及本文所闡述方法之步驟或步驟順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，某些在化學及生理上皆相關之試劑可代替本文所闡述試劑且同時可達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改皆視為涵蓋於由隨附申請專利範圍所界定之本發明精神、範圍及概念內。實例9： PPV亞單元與豬丹毒桿菌及/或豬生殖與呼吸道症候群病毒之組合疫苗在育種年齡女豬豬小病毒(PPV)概念驗證/疫苗劑量測定此接種疫苗-攻擊研究之目標在於提供關於聯合使用Ingelvac^® PRRSV MLV以及實驗亞單元豬小病毒(PPV)與豬丹毒桿菌(Ery)菌苗之組合疫苗之數據，且在5至6個月齡女豬中確立PPV與Ery菌苗之組合疫苗之效能之概念驗證劑量測定。 67頭女豬係源自先前測試為PPV陰性且並無先前PPV疾病或接種疫苗史之畜群。將女豬隨機化至6個治療組中(n=9)，混合至3個畜舍中，使其在D0接受接種疫苗且在D21進行加強：T1 ，陰性對照；T2 ， 10µgPPV；T3 ； 0.1 µg PPV + 10 log Ery，T4 ； 1.0 µg PPV + 10 log Ery；T5 ， 10 µg PPV + 10 log Ery；T6 ，陽性對照(FarrowSure^® GOLD)。包含三頭未治療對照(NTX )女豬，每個畜舍一頭。另外，將10頭女豬飼養於單獨房屋中，使其接受T7 10 µg PPV + 10 log Ery (用於再水合Ingelvac^® PRRSV MLV)以評價在與市售豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)疫苗組合時之PPV效能。T7 係用於此實例 9 之所關注組。 向女豬接種疫苗且使其交配；67頭女豬中之54頭變得懷孕。在大約懷孕40天(dG)，對NTX女豬進行驗屍，且以4.25log₁₀ TCID₅₀ /劑量向剩餘女豬接種6 mL PPV株PPV002346-5 (2 mL經肌內且經鼻內每一鼻孔2mL)。每週對女豬放血，在同步化及育種期間(D35 - D70)除外，且如表12中所闡述來測試血清。表 12 試樣及實驗室測試、女豬

在D129或D130 (約90dG)對女豬進行驗屍。在驗屍時，去除每一生殖道，且記錄子宮中之胎兒位置、胎兒狀況、大小及體重。收集來自每一胎兒之胸腔洗滌液及肺之試樣。藉由PCR測試胸腔洗滌液中之PPV之存在且藉由血球凝集抑制(HI)測試PPV抗體之存在。將肺組織冷凍儲存。 T7女豬對接種疫苗具有血清學反應且攻擊後並無病毒血性。在驗屍時，97.37% (111/114)之T7胎兒處於正常狀況下，且僅一個胎兒測試為PPV陽性。與之相比，所有T1女豬在接種疫苗期期間皆為血清陰性並發生血清轉化，且在攻擊後變得具有病毒血性。在驗屍時，僅22.50% (18/80)之T1胎兒處於正常狀況下，且83.75% (67/80)藉由胸腔洗滌流體之PCR測試為PPV感染陽性。總而言之，組合疫苗(PPV 10 µg + Ery)以及Ingelvac PRRS MLV可有效預防在40dG胎兒之病毒血症及PPV感染。研究設計：表 13 -研究設計

# =數量；NTX =未治療/未攻擊對照；IN =鼻內；IM =肌內；dG =懷孕天數材料：對照產品：投與陰性對照(T1)動物之對照產品為使用來自純化水之注射用水(WFI)在BIVI, St. Joseph MO, USA製得之無菌稀釋劑(批號240)。以呈遞於塑膠瓶中之100-mL填充體積來供應對照產品。將2-mL劑量在D0施加於右頸肌且將2-mL加強劑量在D21施加於左頸肌。疫苗：T7之所關注組合疫苗係實驗亞單元PPV組合疫苗，其中使用Ery 菌苗作為稀釋劑來再水合Ingelvac^® PRRS MLV。311-171號系列為10 µg/劑量PPV與10 log/劑量死Ery菌苗之組合之靶，該死Ery菌苗係由實驗室科學家提供於含有20 mL之塑膠瓶中(10個劑量)。使用單瓶311-171號系列再水合單瓶商業系列之Ingelvac® PRRS MLV (由研究探究者獲得，系列號245-B53)。將2-mL劑量在D0施加於右頸肌且將2-mL加強劑量在D21施加於左頸肌。攻擊材料：攻擊材料係由BIVI-R&D, Ames IA之實驗室科學家在攻擊事件之前來製備。PPV株002346-5在5log¹⁰ TCID₅₀ /劑量、6 mL劑量(分配批號354-021)下為靶且在攻擊事件期間保持於冰上。藉由TCID₅₀ 分析針對保持於4℃下之保留攻擊後材料來測定攻擊效價。攻擊材料之最終效價為3.47 log/mL或4.25 log/6 mL劑量。在D80，除在右頸經肌內接種2 mL外，經每一鼻孔向所有女豬接種2 mL攻擊材料。方法：驗屍及胎兒評估：在D79，藉由靜脈內巴比妥酸鹽注射對所有NTX女豬實施安樂死，且在D129及D130，對所有剩餘女豬實施安樂死。對於每一驗屍而言，去除生殖道，且經由剖腹產無菌遞送胎兒。藉由胎兒ID來標識胎兒，該胎兒ID由女豬ID、及之後的字母(R為「右角」或L為左角)、及之後自子宮分支遇到該胎兒時之編號構成。記錄胎兒狀況(正常或木乃伊)、大小及體重。胎兒試樣收集：為防止試樣之交叉污染，在驗屍時及在實驗室中，在處置每一胎兒及每一試樣期間使用所有適當技術來滅菌或清洗工作區域及器具。使用胎兒ID、試樣類型、研究日期及收集日期來標記試樣。在收集之日之最早可能時間，將試樣於冰上傳輸至實驗室科學家。實驗室科學家或設計者使用適當技術處理每一試樣以防止交叉污染，而將每一試樣等分至適當大小及適當標記之管中。將一種等分試樣呈遞至ISU-VDL。藉由PCR量測每一試樣中之病毒之存在。將剩餘等分試樣在BIVI-R&D - Ames儲存於-70℃.下。胸腔洗滌液收集：由研究探究者自每一胎兒儘可能無菌地收集胸腔洗滌液。簡言之，使用無菌針及注射器將3 mL無菌PBS注射至胸腔中。將儘可能多之流體抽吸回注射器中且然後注射至適當大小之SST中。統計學方法：實驗單元：女豬係T1-T6之實驗單元。倘若與T7進行對比，則屋子係實驗單元，且應理解，T7之房屋應與其他治療組分開。動物數量驗證：歐洲藥典需要攻擊至少7頭接種疫苗之女豬及5頭對照女豬(EPh 01/2008:0965)。最初將9或10頭女豬用於每一治療中以補償不能懷孕之女豬。隨機化：在開始研究之前，向統計學家提供女豬ID編號且完全隨機地將女豬隨機化至畜舍及治療中。將三頭女豬隨機化至NTX組中，將10頭女豬隨機化至T7組中且將剩餘女豬等量隨機化至T1、T2、T3、T4、T5及T6組中。將T1-6女豬及NTX女豬等分至棚1之三個畜舍中。將T7女豬個別地飼養於棚2之圈中。盲化準則：在整個研究中，任一涉及收集數據或實施實驗室分析之人員在蒙面下將女豬分配至治療組T1、T2、T3、T4、T5及T6中。因T7及NTX女豬係單獨飼養且針對PRRSV抗體來測試血清，故工作人員不能盲化至該兩個組中。由不涉及數據收集之個體投與治療劑。數據管理：由統計學家實施數據之統計學分析。將所有數據輸入SAS 9.2版(Cary, USA/North Carolina, SAS Institute Inc.)中用於管理及分析。結果：在此研究匯總中僅呈現陰性對照(T1)與PPV 10 µg + 10 log Ery (用於再水合Ingelvac^® PRRSV MLV)組(T7)之對比，且呈現T1、T7及NTX組之數據。女豬結果：在D0，藉由ELISA獲知，所有女豬對於PRRSV皆係血清學陰性。在D21、D80及D128，所有T7女豬皆係PRRSV血清陽性。在D73，所有T7女豬皆係血清陽性，且所有其他治療組中之女豬皆係血清陰性。在D21加強接種疫苗之後，T7之幾何平均PPV HI效價變為且保持於血清陽性，而T1及NTX治療之幾何平均PPV HI效價在接種疫苗期期間保持於血清陰性(＜100)。在D80之後，在使用PPV攻擊T1及T7女豬時，兩個組皆係血清陽性。在D0、D73 (數據未展示)及D80 (0)攻擊之前，所有女豬對於PPV病毒血症皆係陰性。所有陰性對照在D87皆係病毒血性，且4/7在D94係病毒血性。表 14 在D80於懷孕40天(dG)使用PPV攻擊時PPV陽性(PCR)女豬之頻率分佈。

胎兒結果：所有NTX胎兒在D80驗屍時皆可視為正常([00430])。在D129及D130最終驗屍時，22.5%之T1 (陰性對照)胎兒正常，而99.12%之T7胎兒正常。T1 (陰性對照)胎兒之平均大小及體重分別為11.5 cm及168.8 g，而T7胎兒之平均大小及體重分別為17.8 cm及576.3 g。藉由PCR針對胸腔洗滌試樣測得所有NTX胎兒皆係PPV陰性。在67/80之T1陰性對照胎兒(83.75%)中證實有PPV感染。67個證實為感染PPV之陰性對照胎兒中之62個係木乃伊胎兒。18個正常表現胎兒皆係來自同一窩，且該18個胎兒中之僅5個證實為PPV陽性。對於T7而言，僅一個豬感染且感染率＜1%。表 15 窩仔細節：胎兒之數量、大小、體重及狀況及PPV感染之實驗室證實(針對胸腔洗滌試樣之PCR)。

論述/結論 NTX女豬保持血清陰性，且藉由PCR針對胸腔洗滌試樣測得其胎兒皆係PPV陰性。投與T7 (10 µg PPV+Ery+PRRSV)之女豬對初始接種疫苗具有血清學反應且在加強接種疫苗之後保持血清陽性。並無T7女豬在攻擊後於每週採樣點時具有病毒血性。在驗屍時，97.37% (111/114)之T7胎兒處於正常狀況下，且藉由胸腔洗滌流體之PCR僅一個胎兒測試為PPV感染陽性。與之相比，投與T1 (陰性對照)之女豬在接種疫苗期期間係血清陰性，且在攻擊後，所有女豬皆發生血清轉化且變得具有病毒血性。T1胎兒之平均大小及平均體重實質上小於T7之平均值。在驗屍時，僅22.50% (18/80)之T1胎兒處於正常狀況下，且83.75% (67/80)藉由胸腔洗滌流體之PCR測試為PPV感染陽性。總而言之，組合疫苗(10 µg PPV + Ery + PRRS MLV)可有效預防40dG胎兒之病毒血症及PPV感染。序列表 SEQ ID NO:4係密碼子最佳化之PPV 27a VP2核苷酸序列，其經進一步修飾以具有兩個ClaI限制酶位點(胺基酸位置25係異白胺酸殘基，胺基酸位置36係絲胺酸殘基，胺基酸位置37係異白胺酸殘基)以側接包括甘胺酸重複之VP2編碼區。然而，以不破壞VP2編碼區之方式引入ClaI位點。SEQ ID NO:2係對應於SEQ ID NO:4之蛋白質序列。SEQ ID NO:3係密碼子最佳化PPV 27a VP2核苷酸序列(不含ClaI限制酶位點)。SEQ ID NO:1係對應於SEQ ID NO:3之蛋白質序列。SEQ ID NO: 5至16揭示具有(SEQ ID NO: 5至10)或不具有(SEQ ID NO: 11至16) ClaI位點之其他PPV VP2蛋白序列。SEQ ID NO:17對應於PRRSV萊利斯塔德野生型序列且SEQ ID NO:18對應於PRRSV VR2332野生型序列。

下列圖式形成本說明書之一部分且經包含以進一步顯示本發明之某些態樣。可藉由參照該等圖式中之一或多者與所本文呈現具體實施例之詳述闡述之組合來較佳地理解本發明。圖1展示按組及天之PRRSV病毒血症(qPCR, log10 GE/mL)。圖2展示按組之PRRSV病毒血症(qPCR, log₁₀ GE/mL)之曲線下面積(AUC)。圖3展示按組及天之幾何平均PPV HI效價。

<110> 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)

<120> 抗豬小病毒及豬生殖與呼吸道症候群病毒之疫苗及其製造方法

<130> 01-3229

<150> EP 16197089.2

<151> 2016-11-03

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 579

<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 579

<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 1760

<212> DNA

<213> 豬小病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 1760

<212> DNA

<213> 豬小病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 579

<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 5

<210> 6

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<212> PRT

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<400> 6

<210> 7

<211> 579

<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 7

<210> 8

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<212> PRT

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<400> 8

<210> 9

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<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 9

<210> 10

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<213> 豬小病毒

<400> 10

<210> 11

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<400> 11

<210> 12

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<400> 12

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<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 13

<210> 14

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<212> PRT

<213> 豬小病毒

<400> 14

<210> 15

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<400> 15

<210> 16

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<213> 豬小病毒

<400> 16

<210> 17

<211> 15111

<212> DNA

<213> 豬生殖與呼吸道症候群病毒

<400> 17

<210> 18

<211> 15182

<212> DNA

<213> 豬生殖與呼吸道症候群病毒

<400> 18

Claims

一種免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其包括a)至少一種豬小病毒(PPV)抗原，其中該至少一種PPV抗原係PPV病毒蛋白2(VP2)，其在胺基酸位置25包含異白胺酸殘基，在胺基酸位置36包含絲胺酸殘基，在胺基酸位置37包含異白胺酸殘基，在胺基酸位置228包含麩胺酸殘基或麩胺酸酯殘基，在胺基酸位置414包含絲胺酸殘基，在胺基酸位置419包含麩醯胺酸殘基，及在胺基酸位置436包含蘇胺酸殘基，其中該等胺基酸位置之編號係指野生型PPV VP2之胺基酸序列，及b)至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原，其中該至少一種PRRS病毒抗原係任何含於活減毒/經修飾活PRRS病毒中之抗原。
如請求項1之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該PPV係選自由以下組成之群：活減毒/經修飾活PPV病毒、殺死/不活化PPV病毒、殺死/不活化PPV株014、豬小病毒PPV-27a及PPV-143a之德國野外分離物及豬小病毒疫苗病毒PPV-NADL-2及PPV-IDT(MSV)。
如請求項1之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該至少一種PPV VP2係唯一PPV抗原。
如請求項3之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該PPV VP2包括與SEQ ID NO：2及/或SEQ ID NO：5至10具有至少99.6%序列一致性之胺基酸序列或由其組成。
如請求項1之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該等胺基酸位置之編號係指如SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列。
如請求項1之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該PRRS病毒係選自由以下組成之群：活減毒/經修飾活PRRS病毒、活減毒/經修飾活PRRS病毒類型1基因型、活減毒/經修飾活PRRS病毒類型2基因型、活減毒/經修飾活PRRS病毒株94881及ATCCVR-2332。
如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合經調配用於單一劑量投與或兩劑量投與。
如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合進一步包括至少一種醫藥上可接受之載劑。
如請求項1之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該免疫原性組合物或組合疫苗或組合包括0.1μg至50μg之PPV VP2抗原及/或3.9至7.0log₁₀TCID₅₀之活減毒/經修飾活PRRS病毒。
如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合，其中該至少一種豬小病毒(PPV)抗原及該至少一種豬生殖與呼吸道症候群 (PRRS)病毒抗原一起含於單一容器中或在空間上彼此分開，或含於兩個或更多個各別容器中。
一種套組，其包括如請求項1至10中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合。
如請求項11之套組，其中該至少一種豬小病毒(PPV)抗原及該至少一種豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒抗原彼此分開地含於兩個或更多個各別容器中，且其中該套組進一步包括用於混合在空間上分開之至少一種PPV抗原及至少一種PRRS病毒抗原之說明書手冊。
如請求項11或12之套組，其中該套組進一步包括治療及/或預防豬疾病之指導及/或進一步包括治療及/或預防PPV感染及/或PRRS病毒感染之指導。
一種如請求項1至10中任一項之免疫原性組合物或組合疫苗或組合或如請求項11至13中任一項之套組之用途，其用於製備藥劑。
如請求項14之用途，其用以製備用於以下之藥劑：治療及/或預防PPV及/或PRRS病毒感染，減少、預防或治療由PPV及/或PRRS病毒感染引起之臨床體徵，或治療及/或預防由PPV及/或PRRS病毒感染引起之疾病。