CN109922825B

CN109922825B - 抗猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒的疫苗及其制造方法

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Publication number: CN109922825B
Application number: CN201780064357.8A
Authority: CN
Inventors: S·克洛克; R·T·库尔; C·R·爱德华兹; F·T·哈达丁; G·B·海威克; T·J·凯泽; J·克罗尔; S·R·C·马尔伯格; M·诺格拉塞拉特; M·L·舍费尔; A·J·H·斯塔克斯; M·L·斯图尔特; E·M·沃恩; G·赵
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2024-01-12
Anticipated expiration: 2037-11-02
Also published as: US20200345834A1; CL2019001200A1; EP3534939A1; JP2022000031A; US11730806B2; TWI788309B; RS64144B1; EP3534939B1; MX2019005136A; AU2017353380A1; US20180147278A1; PL3534939T3; HUE061972T2; JP6941171B2; BR112019009131A2; US10660952B2; DK3534939T3; PH12019500989A1; TW201828982A; MY191895A

Abstract

本发明为关于一种猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒疫苗，其用于保护个体、优选地猪，以抵抗与猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒有关的疾病。本发明另外关于制造展现减小杀病毒活性的免疫原性组合物的方法以及该等免疫原性组合物。

Description

抗猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒的疫苗及其制造方法

序列表

本申请案含有根据37C.F.R.1.821-1.825的序列表。伴随本申请案的序列表的全部内容以引用方式并入本文中。

技术领域

在第一关注项中，本发明系关于能够减小由猪细小病毒和/或猪生殖与呼吸道综合征病毒引起的疾病的临床体征的分离物的特异性猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒疫苗。在第二关注项中，本发明另外系关于制造免疫原性组合物的方法以及展现减小的杀病毒活性的该等免疫原性组合物。

背景技术

猪生殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)系动脉病毒科(Arteriviridae)的成员且与冠状病毒科(Coronaviridae)一起属尼多病毒目(Nidovirale)。PRRSV系具有单链、正义RNA基因组的包膜病毒，该RNA基因组具有约15千碱基且包括9个开放阅读框(ORF)，亦即ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF 2ab及ORF 3至ORF7。ORF 1a及1ab编码由病毒蛋白酶nsp1、nsp2及nsp4的自裂解及反式裂解处理成病毒非结构蛋白(nsp)的较大多蛋白(Snijder及Meulenberg,1998)。ORF4编码紧靠主要糖蛋白(GP5)及两种其他次要糖蛋白(GP2a及GP3)且发现于病毒包膜中的次要糖蛋白(GP4)，其中所有该等糖蛋白皆对于感染性病毒的制造较为重要。

PRRSV可视为猪中引起经产母猪晚期生殖障碍及成长猪呼吸疾病的经济上最重要传染原之一。通常，PRRSV感染并发有归因于病毒的免疫阻抑性质的二级细菌感染。另外，PRRSV病毒血症会持续数周，且病毒然后仍可在数月内于淋巴样器官中检测到，从而证实宿主免疫反应难以或不能清除病毒(Allende等人，2000)。

存在两种引起类似临床症状的关于核苷酸序列浓度相差约40％的不同病毒PRRSV基因型，亦即基因型I(EU)及基因型II(US)。北美(US)原型毒株系VR-2332，而欧洲(EU)原型毒株系莱利斯塔德病毒(Lelystad virus)。

猪细小病毒系细小病毒科(Parvoviridae)内原细小病毒(Protoparvovirus)属的细小病毒亚科(Parvovirinae)的自主复制病毒，其含有约5100个核苷酸的单链DNA分子(Cotmore等人，2014:Arch Virol.:159(5):1239-1247；Molitor等人，1984:Virology:137(2):241-54)。仅DNA的负链包装至病毒体中。病毒基因组编码三种衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)及一种非结构蛋白(NS1)。细小病毒的衣壳的直径约为22-25纳米且包括VP1及VP2亚单位。该等蛋白质系衍生自相同RNA分子的交替剪接形式且由此序列重叠。另外，猪细小病毒与猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒及啮齿类动物细小病毒展现较高序列类似性程度(Ranz等人，1989:J.gen.Virol:70:2541-2553)。

尽管猪细小病毒株存在差异(一些株极具病原性且其他株具有较小病原性或完全无病原性)，但在病毒在某一国家得以确立或流行时，病原性株传播于群体中。

猪细小病毒(PPV)感染系全世界猪繁殖中的生殖障碍的常见病因。血清学研究展示，猪细小病毒流行于世界上所有产猪区域，且最高80％的动物展示血清转化。

猪细小病毒(PPV)引起猪的生殖障碍，从而产生死亡及胎儿干尸化、死胎及怀孕经产母猪的其他生殖障碍。(Joo&Johnson.1976.Veterinary Bulletin 46,653-660；Mengeling.1978.J.Am.Vet.Med.Assoc.172,1291-1294)。

在易感(非免疫)后备母猪及经产母猪在怀孕期间发生感染时，PPV会诱导生殖障碍。此系病毒引起疾病的唯一时刻。猪感染发生于摄入或吸入病毒之后。PPV然后循环于血流中且在怀孕猪中穿过胎盘并感染发育中的胚胎及胎儿。在天然感染后，产生很可能在猪中持续一生的活性免疫性。若活性免疫性产生于怀孕之前，则发育中仔猪不受影响。在出生时，仔猪自经产母猪接受初乳中的母体免疫性且此母体免疫性持续至最多20周龄。经产母猪中的活性免疫性程度愈大，则其传递至其仔猪的母体免疫性愈大。此后，可发生天然PPV感染。

猪中由PPV引起的疾病通常称为SMEDI(死胎、干尸化、胚胎死亡及不育(stillbirth,mummification,embryonic death,and infertility)的首字母缩写)。若感染发生于怀孕第0-30天，可发生胚胎死亡，从而降低窝仔数。在怀孕30-70天时感染后的最明显特征系产生干尸化仔猪。干尸化系在骨骼开始固结之后死于子宫中的仔猪的组织的无菌消解过程。PPV感染亦与死胎及先天虚弱猪(若感染发生于怀孕晚期)有关。流产亦可为PPV感染的结果，但其并非此疾病的常见临床体征。总而言的，PPV感染降低了每年每头经产母猪所生育的猪数。

当前可用的PPV疫苗系由在猪起源原代细胞中或在所确立细胞系中生长天然病毒所制造。然后，分离感染性病毒且使用化学药剂使其灭活以最终产生全细胞死病毒疫苗(whole cell killed virus vaccine)。然而，生长天然感染性病毒的该等方法对于生物安全及安全性考虑而言成问题。

基于重组蛋白的亚单位疫苗可具有较差免疫原性，此乃因靶蛋白发生不正确折叠或至免疫系统的呈递较差。另外，全细胞死疫苗呈现天然病毒的所有抗原，而在亚单位疫苗中则限于特异性氨基酸序列。

重组PPV疫苗已阐述于先前技术中。然而，迄今为止，仅全细胞死疫苗市面有售。因此，似乎迄今为止尚未研发展示为有效及安全的适当重组PPV亚单位疫苗。迄今为止所阐述的重组PPV亚单位疫苗尚未在受控实验室攻击实验中进行测试。已评估的重组PPV亚单位疫苗的效果仍比不上全细胞死PPV疫苗，或重组PPV亚单位疫苗尚不安全(展示不良反应)。

已鉴别出在基因上及抗原性上不同于疫苗毒株的PPV野外分离物。PPV基因型2病毒PPV-27a在实验感染之后的怀孕后备母猪中具有高度毒性，如由感染PPV-27a的经产母猪中胎儿的死亡率(85％)高于感染其他PPV株(例如PPV-NADL-2)的经产母猪所证实。然而，抵抗PPV的当前可用商业疫苗系基于在约30年以前分离的PPV基因型1毒株的灭活全病毒制剂(Jozwik等人，2009；Journal of General Virology；90；2437-2441)。

其他先前技术如下：

Adriaan F.G.Antonis.“A novel recombinant virus-like particlevaccinefor prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure”Vaccine 24(2006)5481-5490。

Chen Y.Guo W.“A novel recombinant pseudorabies virus expressingparvovirus VP2 gene:Immunogenicity and protective efficacy in swine”VirologyJournal 2011,8:307。

Merenga等人，“Large scale production and downstream processing of arecombinant porcine parvovirus vaccine“Appl Microbiol Biotechnol.2002Jun；59(1):45-50.Epub 2002Apr 16。

A.Jozwik,J.Manteufel,H.-J.Selbitz及U.Truyen.Vaccination againstporcine parvovirus protects against disease,but doe s not prevent infectionand virus shedding after challenge infection with a heterologous virusstrain.Journal of General Virology(2009),90,2437–2441。

中国专利申请案CN 102 488 895 A揭示由猪圆环病毒、猪细小病毒及PRRSV组成的三元病毒样颗粒疫苗。此三元VLP疫苗含有PCV-2主要结构蛋白CAP蛋白、PPV VP2蛋白表位及PRRSV GP5蛋白表位。

俄罗斯专利申请案RU 2004108484 A揭示抵抗PRRSV及PPV的灭活疫苗。此灭活疫苗含有来自PRRS病毒株(繁殖于传代细胞培养物Marc-145中且经氨基乙基次乙亚胺(AEEI)灭活)的抗原性材料及来自PPV株(繁殖于传代YPK细胞培养物中且经AEEI灭活)的抗原性材料。

中国专利申请案CN 104 288 760 A揭示一种疫苗组合物，其包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的PRRSV抗原及PPV抗原。

中国专利申请案CN 102 727 881 A揭示高度病原性PRRS JXAI-R毒株及PPV二联活疫苗。

Puig等人(http://info.hipra.com/DOCS/UNISTRAIN/PUBLICATIONS/ESPHM-2015/1-Clinical-protection.pdf)系关于混合施用由Hipra制造的灭活ERYSENG Parvo及灭活UNISTRAIN PRRS疫苗的接种疫苗。

Zeew EJL等人(Journal of General Virology 2007,88(2):420-427)阐述最新细小病毒野外分离物及疫苗病毒在实验性感染怀孕后备母猪中的毒性及交叉中和能力的研究。

美国专利申请案US 2014/0322267 A1系关于用于交叉保护的PCV2亚型A(PCV2A)的ORF2蛋白。

欧洲专利申请案EP 2 460 818 A2系关于PCV2免疫原性组合物及制造该等组合物的方法。

美国专利US 7,700,285 B1系关于PCV2免疫原性组合物及制造该等组合物的方法。

PCT专利申请案WO 2013/024113系关于流行性感冒H5疫苗。

美国专利申请案US 2015/0283229 A1系关于猪流行性腹泻病毒疫苗。

先前技术的缺点在于(例如)：(i)担心习用死疫苗中的PPV组分并未完全灭活(此将然后将活PPV引入畜群中)；(ii)缺乏针对PPV的异源毒株的交叉保护；缺乏保护育种年龄后备母猪及经产母猪及胎儿免于PPV及PRRSV相关生殖疾病的接种疫苗方案。

需要可成功用于抵抗PRRSV和/或PPV感染的PRRSV及PPV疫苗的新组合和/或相关应用。亦需要减小通常展现一定杀病毒活性程度的组合物的杀病毒活性的新颖方法；以及具有减小的杀病毒活性或并无杀病毒活性的免疫原性组合物。

发明内容

由说明及申请专利范围中所描述的实施方式以及本文所揭示的方案来达成上述技术问题的解决方案。

因此，根据本文所揭示的申请专利范围及方案来实施不同方面中的本发明。

本发明的第一关注项

在第一关注项中，本发明系关于包括以下的免疫原性组合物或组合疫苗或组合：

a)至少一种猪细小病毒(PPV)抗原，其中至少一种PPV抗原系任一含于PPV中的抗原，及

b)至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原，其中至少一种PRRS病毒抗原系任一含于PRRS病毒中的抗原。

本发明另外系关于一种试剂盒，其包括如本文所阐述和/或主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

本发明另外系关于如本文所阐述和/或主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合或如本文所阐述和/或主张的试剂盒的用途，其用于制备药剂、优选地疫苗。

有利的是，由本发明提供的实验数据揭示，本发明的PPV VP2亚单位疫苗组分可安全且有效地预防胎儿的病毒血症及PPV感染。另外，由本发明提供的实验数据揭示，本发明的PPV VP2亚单位疫苗组分具有宽保护范围，此乃因该疫苗可抵抗异源北美以及异源欧洲攻击毒株。

有利的是，由本发明提供的实验数据揭示，本发明的PPV VP2亚单位疫苗组分与完整死病毒(whole killed virus)同等有效。可由利用包括PPV VP2的重组亚单位疫苗来避免深度灭活方法(其系在生成完整死病毒疫苗时使天然PPV灭活所需)。

本发明的其他优点在于(例如)：(i)减小施用动物的疫苗注射数量，由此增加动物幸福感且减小动物压力；(ii)减小人力；(iii)与单一施用具有相同效能；(iv)打疫苗时机，此乃因二种组分皆解决怀孕猪的生殖疾病；(v)预防在使用异源PPV株攻击后经接种疫苗后备母猪的PPV病毒血症；(vi)减小在PPV攻击之后接种疫苗组中死胎及干尸化仔猪的数量；(vii)增加PPV接种疫苗经产母猪中的胎儿的总数量；(viii)在PPV攻击之后保护100％的PPV接种疫苗仔猪；(ix)免疫性持续时间(DOI)：6个月；(x)基于攻击后减小的病毒负荷及病毒血比例，PRRS EU及混合/>PRRS EU+PPV VP2皆有效；(xi)已证实，不干扰针对PRRSV接种疫苗的效能；(xii)可针对/>PRRS EU确立4周免疫性开始；(xiii)组合疫苗(PPV VP2 10μg+Ery)以及/>PRRS MLV显示可有效预防在怀孕之后40天(40dG)胎儿的病毒血症及PPV感染。

本发明的第二关注项

在第二关注项中，本发明系关于制造包括重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中该方法按以下顺序包括下列步骤：

(i)提供/获得包括以下的混合物：

-第一液体，

-重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，及

-包括编码该重组蛋白的核酸序列的载体；

(ii)将第二液体添加至步骤(i)的混合物中，其中第二液体与第一液体不同；

(iii)由向源自步骤(ii)的混合物中进一步添加另外第二液体且自该组合混合物去除一部分第一和/或第二液体来洗涤混合物中的重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，且视情况最后浓缩；

(iv)由向源自步骤(iii)的混合物中添加灭活剂来使载体灭活；

(v)由向源自步骤(iv)的混合物中添加中和剂来中和灭活剂。

本发明另外系关于如本文所阐述和/或主张的方法，其中上文步骤(i)的混合物可由包括以下步骤的方法获得：

(a)允许使用包括编码该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的核酸序列的载体感染培养物中的易感细胞，其中该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构系由该载体表达，

(b)然后自细胞培养物回收重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，其中优选地经由分离步骤(优选地包含经由至少一个过滤器、更优选地两个过滤器进行微过滤)来分离细胞碎屑与重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，其中至少一个过滤器的孔径优选地大于重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，特定而言，孔径为约0.1μm至约4μm。

对于PPV抗原制剂而言，在净化之后且在渗滤之前实施37℃下杆状病毒灭活时，观察到重度沉淀(聚集)。此聚集尽管与PPV抗原不相关，但其可视为干扰灭活动力学及杀病毒测试。初步数据表明，在培养物净化之后且在杆状病毒灭活之前的渗滤过程大大减小了在灭活方法期间PPV病毒样颗粒(VLP)收获物的聚集程度。数据展示，聚集程度在较高温度(37℃)下有所加强，且在较低温度(27℃或4℃)下随时间达到最小化：在杆状病毒灭活之前于37℃下的渗滤过程另外消除了灭活剂(中和剂)硫代硫酸钠及ExCell 420培养基反应液的杀病毒活性。验证过程证实，灭活杆状病毒表达的PPV VLP产物始终对PRRSV疫苗无杀毒性。特定而言，基于消失的杀病毒效应，该PPV VLP疫苗在与PRRSV混合之后拥有有利长期稳定性，由此使得可在施用之前混合新鲜PPV及PRRSV组分和/或使即用施用形(例如组合疫苗或试剂盒)商业化。

附图说明

下列图式形成本说明书的一部分且经包含以进一步显示本发明的某些方面。可由参照该等图式中的一或多者与所本文呈现具体实施方式的详述阐述的组合来优选地理解本发明。

图1展示按组及天的PRRSV病毒血症(qPCR,log10GE/mL)。

图2展示按组的PRRSV病毒血症(qPCR,log10GE/mL)的曲线下面积(AUC)。

图3展示按组及天的几何平均PPV HI效价。

具体实施方式

在阐述本发明的方面之前，必须注意，如本文中且如在随附申请专利范围中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a、an)”及“该(the)”包含多个指示物。因此，举例而言，在提及“抗原”时包含多个该抗原，且在提及“病毒”时包含提及熟习此项技术者已知的一或多种病毒及其等效物，等等。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与熟习本发明所属领域技术者通常所理解相同的含义。尽管任何类似或等效于本文所阐述者的方法及材料可用于本发明的实践或测试中，但目前所述者系优选的方法、装置及材料。出于阐述及揭示如结合本发明使用的出版物中所报告的细胞系、载体及方法的目的，本文所提及的所有出版物皆以引用方式并入本文中。本文中没有什么内容应解释为承认本发明没有资格早于根据先前发明的此类揭示内容。

本发明的第一关注项

在一方面中，本发明系关于一种免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其包括

(a)至少一种猪细小病毒(PPV)抗原，其中至少一种PPV抗原系任一含于PPV中的抗原，及

(b)至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原，其中至少一种PRRS病毒抗原系任一含于PRRS病毒中的抗原。

术语“猪细小病毒”或“PPV”为熟习此项技术者所熟知。然而，“猪细小病毒”系细小病毒科内细小病毒属的含有单链DNA分子的自主复制病毒。病毒基因组编码三种衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)及一种非结构蛋白(NS1)。猪中由PPV引起的疾病通常称为SMEDI(死胎、干尸化、胚胎死亡及不育(stillbirth,mummification,embryonic death,and infertility)的首字母缩写)。本发明范围内的术语“猪细小病毒”涵盖猪细小病毒以及细小病毒科内原细小病毒属的细小病毒亚科的所有毒株、基因型及血清型。

术语“猪生殖与呼吸道综合征病毒”或“PRRS病毒”或“PRRSV”为熟习此项技术者所熟知。“猪生殖与呼吸道综合征病毒”系动脉病毒科的成员，而动脉病毒科与冠状病毒科一起属尼多病毒目，且系具有单链、正义RNA基因组的包膜病毒，该RNA基因组具有约15千碱基且包括9个开放阅读框(ORF)，亦即ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF 2ab及ORF 3至ORF7。ORF 1a及1ab编码由病毒蛋白酶nsp1、nsp2及nsp4的自裂解及反式裂解处理成病毒非结构蛋白(nsp)的较大多蛋白(Snijder及Meulenberg,1998)。ORF4编码紧靠主要糖蛋白(GP5)及两种其他次要糖蛋白(GP2a及GP3)且发现于病毒包膜中的次要糖蛋白(GP4)，其中所有该等糖蛋白皆对于感染性病毒的制造较为重要。存在两种引起类似临床症状的关于核苷酸序列水平相差约40％的不同病毒PRRSV基因型，亦即基因型I(EU)及基因型II(US)。北美(US)原型毒株系VR-2332，而欧洲(EU)原型毒株系莱利斯塔德病毒。本发明范围内的术语“猪生殖与呼吸道综合征病毒”涵盖PRRSV的所有毒株、基因型及血清型。

就PRRSV而言，应理解，术语“基因型I”及“基因型II”等效于术语“基因型1”及“基因型2”或等效于术语“1型”及“2型”，如在PRRSV背景的文献中通常所使用。

本发明范围中的术语“至少一种猪细小病毒(PPV)抗原”及“至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原”涵盖自单一PPV和/或PRRSV抗原至包括多种抗原的全病毒的每一抗原。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV系选自由以下组成的群：活减毒/经修饰活PPV病毒、杀死/灭活PPV病毒、杀死/灭活PPV株014、猪细小病毒PPV-27a及PPV-143a的德国野外分离物及猪细小病毒疫苗病毒PPV-NADL-2及PPV-IDT(MSV)。

术语“活减毒”及“经修饰活”在本发明过程中可互换使用且尤其系关于减小PPV和/或PRRSV、尤其野生型PPV和/或PRRS病毒的毒力，此系由PPV和/或PRRSV的习用多细胞系传代来达成和/或由基因改造达成，其中“毒力”应理解为病原性程度，且其中“病原性”系关于病毒诱导宿主或宿主后代的临床体征(例如生殖障碍)的能力。

本发明范围内的术语“杀死”或“灭活”系关于不能感染适当个体(与活病毒相比)和/或与天然病毒相比不给予感染性的PPV和/或PRRSV。特定而言，杀死/灭活病毒不能感染其天然宿主细胞(不再)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种PPV抗原系一或多种PPV亚单位。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种PPV亚单位系PPV病毒蛋白2(VP2)，其中优选地PPV VP2系唯一PPV抗原。

术语“病毒蛋白2”或“VP2”系关于猪细小病毒的衣壳蛋白VP2。术语“病毒蛋白2”或“VP2”为熟习此项技术者所熟知。

术语“蛋白质”、“氨基酸”及“多肽”可互换使用。术语“蛋白质”系指由天然氨基酸构成的氨基酸残基序列以及其衍生物。天然氨基酸在业内已众所周知且阐述于生物化学的标准教科书中。在氨基酸序列内，氨基酸残基由肽键连结。另外，氨基酸序列的两端称为羧基末端(C-末端)及氨基末端(N-末端)。术语“蛋白质”涵盖基本上纯化的蛋白质或另外包括其他蛋白质的蛋白质制剂。另外，该术语亦系关于蛋白质片段。此外，其包含以化学方式修饰的蛋白质。该等修饰可为人工修饰或天然修饰，例如磷酸化、糖基化、十四烷基化及诸如此类。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2

-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或

-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或

-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或

-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，

其中氨基酸位置的编号参照野生型PPV VP2的氨基酸序列。

术语“其中氨基酸位置的编号参照野生型PPV VP2的氨基酸序列”系关于，氨基酸位置的编号参照全长野生型PPV VP2蛋白的氨基酸序列。

优选地，如本文所提及氨基位置的编号系参照具有579个氨基酸残基(包含在(N-末端)氨基酸位置1的甲硫氨酸残基)的野生型PPV VP2蛋白序列。术语“其中氨基酸位置的编号参照野生型PPV VP2的氨基酸序列”涵盖如在SEQ ID NO:1中以实例方式给出的野生型PPV VP2(PPV 27a VP2)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2另外

-在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基，和/或

-在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和/或

-在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基，

其中氨基酸位置的编号参照野生型PPV VP2的氨基酸序列。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中氨基酸位置的编号参照如SEQ ID NO:1中所展示的氨基酸序列。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系重组PPV VP2。

本文所用的术语“重组体”特定而言系指自重组DNA分子表达的蛋白质分子，例如由重组DNA技术制得的多肽。该等技术的一实例包含以下情形：将编码所表达蛋白(例如PPVVP2)的DNA插入适宜表达载体、优选地杆状病毒表达载体中，继而使用该杆状病毒表达载体转染(或在杆状病毒表达载体的情形中用其感染)宿主细胞，以制造由该DNA编码的蛋白质或多肽。本文所用的术语“重组PPV VP2”由此特定而言系指自重组DNA分子表达的蛋白质分子。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系重组杆状病毒表达的PPV VP2。

术语“杆状病毒”为熟习此项技术者所熟知。本文所用的“杆状病毒”特定而言意指用于在昆虫细胞中使用经设计以表达期望蛋白质的重组杆状病毒载体来制造该蛋白质的系统。杆状病毒表达系统通常包括在昆虫细胞中达成重组蛋白表达所需的所有要素，且通常涉及以下过程：改造杆状病毒载体以表达期望蛋白质，将经改造杆状病毒载体引入昆虫细胞中，在适宜生长培养基中培养含有经改造杆状病毒载体的昆虫细胞以便表达期望蛋白质，且回收该蛋白质。通常，杆状病毒载体的改造涉及构筑及分离重组杆状病毒，其中将所选基因的编码序列插入非必需病毒基因的启动子后面，且其中当前使用的大部分杆状病毒表达系统系基于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)的序列((Virology 202(2),586-605(1994),NCBI登录号：NC_001623)。杆状病毒表达系统在业内已众所周知且已阐述于(例如)以下文献中：“Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual“，David R.O'Reilly,Lois Miller,Verne Luckow，由OxfordUniv.Press公开(1994)；“The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide”，Linda A.King,R.D.Possee，由Chapman&Hall公开(1992)。用于制造重组蛋白的杆状病毒系统的一实例性非限制性实例(例如)阐述于WO 2006/072065 A2中。

优选杆状病毒载体包含诸如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,Calif.)或DiamondBac(Sigma Aldrich)等杆状病毒，特定而言，条件系制造细胞系昆虫细胞。尽管杆状病毒表达系统优选，但熟习此项技术者应理解藉，其他表达系统可用于本发明目的，亦即在细胞培养物的上清液中表达PPV VP2。该等其他表达系统可需要使用信号序列以使PPV VP2表达于培养基中。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成，或包括任一具有至少210、至少250或至少300个来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的连续(contiguous)氨基酸残基的片段或由其组成。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的核苷酸序列编码。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系由编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列的核苷酸序列编码。

SEQ ID NO:4系密码子优化PPV 27a VP2核苷酸序列，其经进一步修饰以拥有两个ClaI限制酶位点(氨基酸位置25系异亮氨酸残基，氨基酸位置36系丝氨酸残基，氨基酸位置37系异亮氨酸残基)，从而侧接包括甘氨酸重复的VP2编码区。以不破坏VP2编码区的方式引入ClaI位点。SEQ ID NO:2系对应于SEQ ID NO:4的蛋白质序列。SEQ ID NO:3系密码子优化PPV 27a VP2核苷酸序列(不含ClaI限制酶位点)。SEQ ID NO:1系对应于SEQ ID NO:3的蛋白质序列。

术语“核酸”或“核酸序列”或“核苷酸序列”或“多核苷酸”可在本文中互换使用且系指包含DNA分子、RNA分子、cDNA分子或衍生物的多核苷酸。该术语涵盖单链以及双链多核苷酸。本发明核酸涵盖经分离多核苷酸(亦即自其天然背景分离)及基因修饰形式。此外，亦包括经化学修饰的多核苷酸，包含天然修饰的多核苷酸(例如糖基化或甲基化多核苷酸)或人工修饰者(例如生物素化多核苷酸)。另外，术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且系指任一核酸。术语“核酸”及“多核苷酸”亦具体而言包含由除5个生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。

术语“相同性”或“序列相同性”已为业内所习知且系指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参考序列与拟与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。由在将序列最佳地比对以得到最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性，如由该等序列串之间的匹配所测定。在该比对时，基于逐个位置来确定序列相同性，举例而言，若在一个位置处核苷酸或氨基酸残基一致，则该等序列在该位置处“一致”。然后将该等位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可易于由已知方法来计算，包含(但不限于)彼等阐述于以下文献中的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，部分I，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.,及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教示内容以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。该等程序的实例包含(但不限于)GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic AcidsResearch,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLASTManual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示内容以引用方式并入本文中)。该等程序最佳地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间制造最高序列相同性程度。作为阐释，对于多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％“序列相同性”的核苷酸序列而言，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列一致，只是给定多核苷酸序列可包含最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高15％、优选地10％、甚至更优选地5％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或参考序列中全部核苷酸中最高15％、优选地10％、甚至更优选地5％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的该等突变可发生在参考核苷酸序列的5’-或3’-末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置，其系个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于多肽具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列相同性的给定氨基酸序列而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列一致，只是给定多肽序列可包含最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言的，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列相同性的给定多肽序列，参考序列中的最高15％、优选地最高10％、甚至更优选地最高5％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可将参考序列中最高15％、优选地最高10％、甚至更优选地最高5％总氨基酸残基数量的诸多氨基酸插入参考序列中。参考序列的该等改变可发生在参考氨基酸序列的氨基-或羧基-末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置，其系个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列相同性时，并不包含保守取代作为匹配。

术语“相同性”、“序列相同性”及“相同性百分比”可在本文中互换使用。出于本发明目的，本文定义，为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分比，比对序列以用于最佳对比目的(举例而言，可将空位引入第一氨基酸或核酸的序列中以用于与第二氨基或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。在第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则该等分子在该位置一致。两个序列之间的相同性百分比系该等序列所共享的一致位置数的函数(亦即，相同性％＝一致位置数/总位置(亦即重叠位置)数乘以100)。优选地，两个序列具有相同长度。

可对所比较两个序列的整个长度或两个序列的片段实施序列对比。通常，对所比较两个序列的全长实施对比。然而，可在(例如)20、50、100或更多个连续氨基酸残基的区域中实施序列相同性对比。

熟习此项技术者应知晓，实际上，可利用若干不同计算机程序来测定两个序列之间的同源性。举例而言，两个序列之间的序列对比及相同性百分比的测定可使用数学算法来达成。在一优选实施方式中，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法(其已纳入Accelrys GCG软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/处获得)中的GAP程序中)、使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6)来测定两个氨基酸或核酸序列之间的相同性百分比。熟习此项技术者应了解，所有该等不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时两个序列的整体百分比相同性并不显著改变。

可进一步使用本发明的蛋白质序列及核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索以(例如)鉴定其他家族成员或相关序列。可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN及BLASTP程式(2.0版)实施该等检索。可使用BLASTP程序、评分＝50、字长＝3实施BLAST蛋白质检索以获得本发明的蛋白质分子的同源氨基酸序列。为获得用于对比目的的空位比对，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所阐述来利用空位BLAST。在利用BLAST及空位BLAST程序时，可使用各别程序(例如BLASTP及BLASTN)的预设参数。参见国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处的主页。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PRRS病毒系选自由以下组成的群：PRRS病毒基因型1，PRRS病毒基因型2，包括由与SEQ ID NO:17的核酸序列(莱利斯塔德野生型序列)具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％相同性的核苷酸序列编码的基因组的PRRS病毒基因型1，包括由与SEQ IDNO:18的核酸序列(VR2332野生型序列)具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％相同性的核苷酸序列编码的基因组的PRRS病毒基因型2。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PRRS病毒系选自由以下组成的群：活减毒/经修饰活PRRS病毒、活减毒/经修饰活PRRS病毒类型1基因型(例如Porcilis PRRS、Unistrain PRRS、Amervac PRRS等)、活减毒/经修饰活PRRS病毒类型2基因型(例如PRRS MLV、Fostera PRRS等)、活减毒/经修饰活PRRS病毒株94881[(基因型1)、/>PRRS EU]、杀死/灭活PRRS病毒、杀死/灭活PRRS病毒类型1基因型(例如Progressis)、杀死/灭活PRRS病毒类型2基因型、莱利斯塔德病毒株(CDI-NL-2.91，Institut Pasteur,Paris,France，保藏号I-1102)、PRRS病毒亚单位或其他株(例如以登录号ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACCV93070108、北美PRRS病毒pT7P129A(ATCC登录号203488)、ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402保藏)。

术语“免疫原性组合物”或“组合疫苗”或“组合”系指包括至少一种抗原、在“组合疫苗”或“组合”的情形下包括至少两种抗原的组合物，该(等)抗原在施用“免疫原性组合物”或“组合疫苗”或“组合”的宿主中诱发免疫学反应。该免疫学反应可为对本发明的“免疫原性组合物”或“组合疫苗”或“组合”的细胞和/或抗体介导的免疫反应。优选地，“免疫原性组合物”或“组合疫苗”或“组合”诱导免疫反应且更优选地赋予抵抗PPV和/或PRRSV感染的一或多种临床体征的保护性免疫性。宿主亦阐述为“个体”。优选地，本文所阐述或提及的任一宿主或个体系猪。

通常，“免疫反应”包含(但不限于)一或多种下列效应：制造或活化特异性地针对本发明的“免疫原性组合物”或“组合疫苗”或“组合”中所包含的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主显示保护性免疫学反应或治疗反应。

“保护性免疫学反应”或“保护性免疫性”显示为减少或缺乏通常由受感染宿主显示的临床体征、较快恢复时间和/或较低感染性持续时间或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的较低病原体效价。

若宿主显示保护性免疫学反应以便对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度有所减小，则将“免疫原性组合物”或“组合”阐述为“疫苗”。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合经调配用于单一剂量施用。

用于单一剂量施用的体积已定义于本文其他处。

如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合优选地系经局部或全身性施用。常用的适宜施用途径系经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，端视化合物的性质及作用模式，如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合亦可由其他途径施用。最佳地，经肌内施用如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中经肌内施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于在怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕30天、优选地怀孕40天的后备母猪和/或经产母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合进一步包括至少一种医药上可接受的载剂。

术语“医药上可接受的载剂”包含任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。

“稀释剂”可包含水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油、磷酸盐缓冲盐水及诸如此类。等渗剂可包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。稳定剂包含白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐等。

在本发明的一方面中，医药上可接受的载剂系卡波姆(carbomer)。

优选地，免疫原性组合物可进一步包含一或多种其他免疫调节剂，例如介白素、干扰素或其他细胞介素。可用于本发明背景中的佐剂及添加剂的量及浓度可易于由熟习此项技术者测定。

在一些方面中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的“佐剂”可包含氢氧化铝及磷酸铝、皂素(例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(EuropeanPharmacopea)型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特定而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，特定而言异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选系非离子表面活性剂，特定而言系以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其视情况经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory andPractical Application of Adjuvants(Stewart-Tull编辑，D.E.S.),JohnWiley andSons,NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。实例性佐剂系由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach“，Plenum Press,1995的第147页上阐述的SPT乳液及同一本书第183页上阐述的乳液MF59。

佐剂的另一实例系选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物系丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。该等化合物以术语卡波姆为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述与具有至少3个、优选地不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的该等丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团系含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团。不饱和基团可自身含有其他取代基，例如甲基。以名称Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品尤其适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳系使用Carbopol 971P。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，尤其系共聚物EMA(Monsanto)，其系马来酸酐与乙烯的共聚物。该等聚合物在水中的溶解产生酸溶液，其将被中和、优选地中和至生理学pH以产生将引入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身的佐剂溶液。

其他适宜佐剂包含(但不限于)尤其RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽或其天然或重组细胞介素或其类似物或内源细胞介素释放的刺激剂等。

预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量、优选地以每剂量约100μg至约10mg的量、更优选地以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选地以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量及最佳地以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选为约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，仍更优选为约7％至22％的浓度，且最佳为10％至20％的浓度。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种医药上可接受的载剂系卡波姆。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合包括0.1μg至50μg PPV VP2抗原、优选地0.5μg至10μg PPVVP2抗原、更优选地1.0μg至10μg PPV VP2抗原和/或3.9至7.0log₁₀TCID₅₀PRRS病毒。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其包括介于约0.1μg与50μg之间的PPV VP2抗原。优选地，免疫原性组合物包括介于约0.2μg与40μg之间、更优选地介于约0.3μg与30μg之间、更优选地介于约0.4μg与20μg之间及甚至更优选地介于约0.5μg与10μg之间及甚至更优选地介于约1.0μg与10μg之间的PPVVP2抗原，其中0.5μg、0.75μg、1μg、1.25μg、1.5μg、2μg、2.5μg、3μg、3.5μg、4μg、4.5μg、5μg、5.5μg、6μg、6.5μg、7μg、7.5μg、8μg、8.5μg、9μg、9.5μg或10μg抗原的量最佳。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其包括介于约3.9至7.0log₁₀TCID₅₀之间的PRRS病毒。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合，其中该免疫原性组合物或组合系疫苗。

术语“疫苗”已阐述于本文中其他处。然而，若宿主显示保护性免疫学反应以便对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度有所减小，则将免疫原性组合物或组合阐述为“疫苗”。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其可抵抗同源和/或异源攻击。有利的是，由本发明提供的实验数据揭示，本发明的免疫原性组合物或组合疫苗或组合具有宽保护范围，此乃因其可抵抗异源北美和/或异源欧洲攻击毒株。

术语“保护”及“预防(prophylaxis及preventing)”在本申请案中可互换使用。该等术语已定义于其他处。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其可抵抗北美和/或欧洲分离物的攻击。

术语“北美和/或欧洲分离物”为熟习此项技术者所熟知。术语“北美和/或欧洲分离物”涵盖已或将在北美及欧洲分离的所有分离物。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其可交叉抵抗北美和/或欧洲分离物。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其可有效治疗和/或预防有需要的个体中由PPV和/或PRRSV感染引起的临床体征。术语“治疗和/或预防”、“临床体征”及“有需要”已定义于其他处。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗PPV的同源和/或异源攻击和/或同源和/或PRRS病毒的异源攻击。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗北美和/或欧洲PPV分离物的攻击和/或北美和/或欧洲PRRS病毒分离物的攻击。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可交叉抵抗北美和/或欧洲PPV分离物和/或可交叉抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可有效治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染和/或PRRS病毒感染引起的临床体征。

另外，本发明提供包括如本文所阐述及主张的PPV VP2的病毒样颗粒。

术语“病毒样颗粒”(VLP)涵盖来自病毒的非复制性空病毒壳体。VLP通常由一或多种病毒蛋白(例如(但不限于)彼等称为衣壳蛋白、包衣蛋白、壳体蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的蛋白质)或衍生自该等蛋白质的形成颗粒的多肽构成。VLP可在于适当表达系统中重组表达蛋白质后自发形成。可使用业内已知的习用技术(例如由电子显微术、X射线结晶术及诸如此类)来检测在重组表达病毒蛋白后VLP的存在。例如参见Baker等人，Biophys.J.(1991)60:1445-1456；Hagensee等人，J.Virol.(1994)68:4503-4505。举例而言，可对所论述VLP制剂的玻璃化水性试样实施低温电子显微术，且在适当暴露条件下记录影像。

术语“病毒样颗粒”(VLP)亦涵盖由多个PPV VP2构成的VLP。

在本发明的另一方面中，病毒样颗粒系由多个如本文所阐述及主张的PPV VP2构成。

另外，本发明提供包括如本文所阐述的多核苷酸或载体的细胞。优选地，载体系杆状病毒。

术语“细胞”为熟习此项技术者所熟知。术语“细胞”涵盖真核细胞，例如动物细胞、原生生物细胞、植物细胞或真菌细胞。优选地，真核细胞系哺乳动物细胞(例如CHO、BHK或COS)或真菌细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或昆虫细胞(例如Sf9)。

在本发明的另一方面中，细胞系昆虫细胞。

本文所用的“昆虫细胞”意指衍生自昆虫物种的细胞或细胞培养物。本发明尤其关注衍生自物种草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的昆虫细胞。

优选地，本文所提及的昆虫细胞系草地贪夜蛾(Sf)细胞或来自衍生自草地贪夜蛾的细胞系的细胞，且更优选地选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。分别地，如本文所提及的昆虫细胞优选系草地贪夜蛾(Sf)细胞或来自衍生自草地贪夜蛾的细胞系的细胞，且更优选地选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。

在本发明的另一方面中，昆虫细胞系选自由Sf9细胞及Sf+细胞组成的群。

另外，本发明提供制造如本文所阐述及主张的PPV VP2的方法，其包括使用如本文所阐述的载体转染细胞。

术语“载体”为熟习此项技术者所熟知。如业内已知的术语“载体”系指用于将基因材料传递至宿主细胞的多核苷酸构筑体、通常质粒或病毒。载体可为(例如)病毒、质粒、黏粒或噬菌体。本文所用的载体可由DNA或RNA构成。在一些实施方式中，载体系由DNA构成。

“表达载体”系在存在于适当环境中时能够引导表达由由载体携载的一或多种基因编码的蛋白质的载体。载体优选地能够自主复制。通常，表达载体包括转录启动子、基因及转录终止子。基因表达通常系在启动子的控制下，且基因可视为“可操作地连接至”启动子。

如本文中所使用，术语“可操作地连接”用于阐述调控组件与基因或其编码区之间的连接。通常，基因表达系在一或多种调控组件(例如(但不限于)组成型或可诱导启动子、组织特异性调控组件及增强子)的控制下进行。基因或编码区可视为与调控组件“可操作地连接”或“可操作地连接”或“可操作地缔合”，此意味着该基因或编码区由调控组件控制或影响。举例而言，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。

载体及制备载体和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可尤其由以下文献揭示或类似于以下文献中所揭示的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virusvectors to vaccination:An update,“PNASUSA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,“PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smi th等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编者),Methods in MolecularBiology 39,“Baculovirus Expression Protocol s“(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”,Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号；欧洲专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function of herpes simplex virusgenes:A primer for genetic engineering of novel vectors,”PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineeredherpes simplex viruses to the treatment ofexperimental brain tumors,“PNAS USA93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors for genedelivery to B lymphocytes“,PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,“PNAS USA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；1996年7月3日提出申请的允许美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus ascloning vectors,“Seminars in Virology(第3卷)，第237-52页，1993；Ballay等人，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页，Graham,Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，J.GenVirol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccinesencoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,inducesprotective immunity in animal models of herpes simplex virus-2disease“,PNASUSA 93:11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号以及WO 90/11092、WO 93/19183、WO 94/21797、WO 95/11307、WO 95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry(关于DNA表达载体)。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbachet等人(Intracel)；WO90/01543；Robinson等人，Seminars inImmunology，第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(致细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文所引用的其他文件。

术语“调控组件”及“表达控制组件”可互换使用且系指可影响可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的核酸分子。该等术语可广泛使用且涵盖促进或调控转录的所有组件，包含启动子、RNA聚合酶与转录因子的碱性相互作用的核心组件、上游组件、增强子及反应元件。原核生物中的实例性调控组件包含启动子、操纵子序列及核糖体结合位点。用于真核细胞中的调控组件可包含(但不限于)提供和/或调控宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生的转录及翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入组件(IRES)、2A序列及诸如此类。

如本文中所使用，术语“启动子”系允许结合RNA聚合酶且引导转录基因的核苷酸序列。通常，启动子位于基因中邻近基因的转录开始位点的5'非编码区中。启动子内用于引发转录的序列组件的特征通常在于共有核苷酸序列。启动子的实例包含(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及哺乳动物(包含人类)的启动子。启动子可为诱导型、抑制型和/或组成型。诱导型启动子引发在其控制下因应于培养条件的一定变化(例如温度变化)增加来自DNA的转录程度。

如本文中所使用，术语“增强子”系指可增加转录效率的一类调控组件，不论增强子相对于转录起始位点的距离或定向如何。

可使用业内熟知的任何适宜基因改造技术来生成病毒载体，包含(但不限于)细胞培养物中的限制性内核酸酶消解、连接、转变、质粒纯化及DNA测序，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1989))中所阐述。

另外，本发明提供制造如本文所阐述的PPV VP2的方法，包括使用如本文所阐述的杆状病毒感染细胞、优选地昆虫细胞。

若期望，组合物可提供于可包含含有活性成分的一或多种单位剂型的包装或分配器装置中。包装可(例如)包含金属或塑料箔，例如泡罩包。包装或分配器装置可带有用于施用、优选地施用动物、尤其猪的说明书。该(等)容器可附带有监管医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告显示该机构已批准用于人类施用的制造、使用或销售。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原一起含于一个单一容器中或在空间上彼此分开、优选地含有于两个或更多个单独容器中。

在另一方面中，本发明系关于一种试剂盒，其包括如本文所揭示及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的试剂盒，其中至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原彼此分开地含于两个或更多个单独容器中，优选地二者彼此独立地呈冻干或冷冻形式，且其中该试剂盒进一步包括用于混合在空间上分开的至少一种PPV抗原及至少一种PRRS病毒抗原的说明书手册，其中优选地该说明书手册含有组合含有至少一种PPV抗原的容器的内容物与含有至少一种PPRS病毒抗原的容器的内容物的指导，其中更优选地该说明书手册含有将至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原同时、更优选地在相同或不同施用位点同时、依序(以任一顺序)和/或以按时间顺序交错方式分开施用个体的指导。

在另一方面中，本发明系关于如本文所揭示及主张的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括治疗和/或预防猪疾病的指导和/或进一步包括治疗和/或预防PPV感染和/或PRRS病毒感染的指导，优选地该试剂盒进一步包括联合使用如本文所揭示及主张且含于该试剂盒中的免疫原性组合物或组合疫苗或组合的PPV组分(优选地以分开试剂盒组分形式)及PRRSV组分(优选地以分开试剂盒组分形式)的指导。

本发明范围内的术语“联合使用”系关于由在一个注射位点施用之前混合两种疫苗或在不同施用位点同时施用两种疫苗来使用两种疫苗或疫苗组分PRRSV及PPV(各自彼此独立地亦在本文中称为“分开试剂盒组分”)。优选地，同时施用该两种疫苗，更优选地在相同或不同施用位点同时、依序(以任一顺序)和/或以按时间顺序交错方式分开施用。

在本发明的另一方面中，本发明的PPV和/或PRRSV已灭活，从而产生如本文所阐述的具有病毒蛋白2(VP2)的全灭活病毒。

任一习用灭活方法皆可用于本发明目的。因此，可由熟习此项技术者已知的化学和/或物理处理来实施灭活。优选灭活方法包含添加环化次乙亚胺(cyclized binaryethylenimine,BEI)，其包含添加2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(环化成二乙烯亚胺(BEI))的溶液。优选其他化学灭活剂包括(但不限于)Triton X-100、脱氧胆酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、酚及甲醛(福尔马林(Formalin))。然而，灭活亦可包括中和步骤。优选中和剂包含(但不限于)硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠及诸如此类。

优选福尔马林灭活条件包含福尔马林浓度介于约0.02％(v/v)-2.0％(v/v)、更优选地约0.1％(v/v)-1.0％(v/v)、仍更优选地约0.15％(v/v)-0.8％(v/v)、甚至更优选地约0.16％(v/v)-0.6％(v/v)及最佳地约0.2％(v/v)-0.4％(v/v)之间。培育时间取决于PPV和/或PRRSV的抗性。一般而言，实施灭活方法直至可在适宜培养系统中检测到PPV和/或PRRSV不再生长为止。

优选地，本发明的灭活PPV和/或PRRSV系福尔马林灭活，其优选使用如上文所阐述的浓度。

优选地，本发明的灭活PPV和/或PRRSV系环化二乙烯亚胺(BEI)灭活，其包含添加2-溴乙烯胺盐酸盐(BEA)(其环化成二乙烯亚胺(BEI))的溶液。

可使用已知技术(例如阐述于Nature,1974,252,252-254或Journal ofImmunology,1978,120,1109-1113中者)将本发明的灭活PPV和/或PRRSV纳入脂质体中。在本发明的另一实施方式中，本发明的灭活PPV可偶联至适宜生物化合物(例如多糖、肽、蛋白质或诸如此类或其组合)。

术语“实施免疫”系关于由以下主动免疫：向欲实施免疫的个体施用免疫原性组合物，由此引起针对该免疫原性组合物中所包含抗原的免疫学反应。

优选地，免疫作用使得畜群中特定PPV和/或PRRSV感染的发病率减小或特定PPV和/或PRRSV感染所引起或有关的临床体征的严重程度减小。

此外，使用如本文所提供的免疫原性组合物对有需要的个体进行免疫可预防个体由PPV和/或PRRSV感染。甚至更优选地，免疫针对PPV和/或PRRSV感染产生有效长久免疫学反应。应理解，该时间段将持续大于1个月、优选地大于2个月、优选地大于3个月、更优选地大于4个月、更优选地大于5个月、更优选地大于6个月。应理解，免疫作用不可能在实施免疫的所有个体中皆有效。然而，该术语需要畜群的大部分个体有效地免疫。

优选地，在此设想的畜群个体通常(亦即未免疫)会发生PPV和/或PRRSV感染所引起或有关的临床体征。熟习此项技术者可轻易地测定畜群的个体是否有效地免疫。优选地，若与未实施免疫或使用在本发明之前可得的免疫原性组合物实施免疫但随后感染特定PPV的个体相比，特定畜群中至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、仍更优选地至少95％及最佳地100％个体的临床体征的发生率或严重程度减弱至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％、仍更优选地至少95％及最佳地100％，则免疫作用应有效。

在另一方面中，本发明系关于如本文所述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合或试剂盒的用途，其用于制备药剂、优选地疫苗。

在另一方面中，本发明系关于如本文所述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合或试剂盒的用途，其用于治疗和/或预防PPV和/或PRRS病毒感染，减少、预防或治疗由PPV和/或PRRS病毒感染引起的临床体征，或治疗和/或预防由PPV和/或PRRS病毒感染引起的疾病。

在另一方面中，本发明系关于对个体实施免疫的方法，其包括向该个体施用如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于治疗和/或预防有需要的个体、优选地猪中由PPV感染和/或PRRS病毒感染引起的临床体征、优选地猪生殖与呼吸道综合征的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的生殖障碍的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的胚胎及胎儿死亡的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于主动免疫化种猪(经产母猪及后备母猪)以用于保护胚胎及胎儿免受猪细小病毒感染的方法，该方法包括向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用治疗有效量的如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中个体系选自由以下组成的群：猪、牛、猫及狗，优选系猪，更优选系经产母猪和/或后备母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中一次性或以两个或更多个剂量来施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中经肌内施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中将免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)施用后备母猪和/或经产母猪，优选地施用至少3周龄的后备母猪和/或经产母猪，更优选地施用怀孕之前的后备母猪和/或经产母猪，甚至更优选地施用怀孕及哺乳期间的经产母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可安全用于怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪及怀孕之前的后备母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可安全用于怀孕30天、优选地怀孕40天的经产母猪和/或后备母猪。在

另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)包括0.1μg至50μgPPV VP2抗原、优选地0.5μg至10μg PPV VP2抗原、更优选地1.0μg至10μg PPV VP2抗原和/或3.9至7.0log₁₀TCID₅₀PRRS病毒。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可抵抗PPV的同源和/或异源攻击和/或PRRS病毒的同源和/或异源攻击。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可抵抗北美和/或欧洲PPV分离物的攻击和/或北美和/或欧洲PRRS病毒分离物的攻击。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可交叉抵抗北美和/或欧洲PPV分离物和/或可交叉抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中该方法使得与相同物种的未免疫对照组的个体相比改良至少一种选自由以下组成的群的效能参数：暂时性白血球减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖障碍减少或其组合。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于对个体实施免疫的方法中，该方法包括向该个体施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于治疗和/或预防有需要的个体、优选地猪中由PPV感染和/或PRRS病毒感染引起的临床体征、优选地猪生殖与呼吸道综合征的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的生殖障碍的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的胚胎及胎儿死亡的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于主动免疫化种猪(经产母猪及后备母猪)以用于保护胚胎及胎儿免受猪细小病毒感染的方法中，该方法包括向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中该个体系选自由以下组成的群：猪、牛、猫及狗，优选系猪，更优选系经产母猪和/或后备母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中一次性或以两个或更多个剂量来施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中经肌内施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中将免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)施用后备母猪和/或经产母猪，优选地施用至少3周龄的经产母猪，更优选地施用怀孕之前的经产母猪，甚至更优选地施用怀孕及哺乳期间的经产母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可安全用于怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可安全用于怀孕30天、优选地怀孕40天的后备母猪和/或经产母猪。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)包括0.1μg至50μg PPV VP2抗原、优选地0.5μg至10μg PPV VP2抗原、更优选地1.0μg至10μg PPV VP2抗原和/或3.9至7.0log₁₀TCID₅₀PRRS病毒。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可抵抗PPV的同源和/或异源攻击和/或可抵抗PRRS病毒的同源和/或异源攻击。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可抵抗北美和/或欧洲PPV分离物的攻击和/或可抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物的攻击。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)可交叉抵抗北美和/或欧洲PPV分离物和/或可交叉抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)，其用于如本文所阐述及主张的用途，其中该方法使得与相同物种的未免疫对照组的个体相比改良至少一种选自由以下组成的群的效能参数：暂时性白血球减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖障碍减少或其组合。

术语“治疗和/或预防”系指减小畜群中特定PPV和/或PRRSV感染的发病率或减小由特定PPV和/或PRRSV感染引起或与其有关的临床体征的严重程度。因此，术语“治疗和/或预防”亦系指与动物尚未接受如本文所提供的免疫原性组合物或组合疫苗或组合的动物群相比，在动物已接受有效量的该等免疫原性组合物或组合疫苗或组合的动物群中，减小畜群中感染特定PPV和/或PRRSV的动物数量(＝减小特定PPV和/或PRRSV感染的发病率)或减小通常与PPV和/或PRRSV感染有关或由其引起的临床体征的严重程度。

“治疗和/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物或组合疫苗或组合施用需要此一治疗/预防或可自其获益的个体或个体畜群。术语“治疗”系指在个体或畜群的至少一些动物已感染该PPV和/或PRRSV且其中该等动物已展示一些由该PPV和/或PRRSV感染引起或与其有关的临床体征后，施用有效量的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。术语“预防”系指在患有PPV和/或PRRSV的该个体的任一感染或至少该动物或动物群中没有动物并不展示任一由该PPV和/或PRRSV感染引起或与其有关的临床体征之前，施用个体。术语“预防(prophylaxis及preventing)”在本申请案中可互换使用。

本文所用的术语“有效量”意指(但不限于)诱发或能够诱发个体中的免疫反应的抗原量。该有效量能够减小畜群中特定PPV和/或PRRSV感染的发病率或减小特定PPV和/或PRRSV感染的临床体征的严重程度。

优选地，与未治疗或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物或组合疫苗或组合治疗但随后感染特定PPV和/或PRRSV的个体相比，临床体征的发生率或严重程度减弱至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％、仍更优选地至少95％及最佳地100％。

本文所用的术语“临床体征”系指个体中来自PPV和/或PRRSV的感染体征。感染的临床体征取决于所选病原体。该等临床体征实例包含(但不限于)暂时性白血球减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖障碍减少或其组合。直接可观察的临床体征的实例包含窝仔数减小、每窝的胚胎或胎儿干尸化增加、胚胎或胎儿自溶、胚胎或胎儿的大小减小、胚胎或胎儿的体重减小及诸如此类或其组合。该等临床体征的其他实例包含(但不限于)病毒血症增加、靶组织及血液内的病毒负荷增加、PPV对同舍动物的传播/棚舍扩散增加及诸如此类或其组合。

优选地，经治疗个体中发生或严重程度减弱(与未治疗或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后感染特定PPV和/或PRRSV的个体相比)的临床体征系指暂时性白血球减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖障碍或其组合。

本文所用的术语“有需要(in need或of need)”意指，施用/治疗涉及加强或改良健康或临床体征或对于接受本发明的免疫原性组合物的动物(包含其胚胎或胎儿)的健康的任一其他阳性医学效应。

术语“减少(reducing或reduced或reduction)“或“降低”可在本申请案中互换使用。术语“减少”意指，与未治疗(未实施免疫)但随后感染特定PPV和/或PRRSV的个体相比，临床体征减少至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、仍更优选地至少95％、最佳地100％。

在本发明的一方面中，一次性施用如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。应理解，单一剂量仅施用一次。

每一个体的剂量体积取决于接种疫苗途径及个体年龄。优选地，单一剂量的总体积介于约0.2ml与2.5ml之间、更优选地介于约0.2ml与2.0ml之间、甚至更优选地介于约0.2ml与1.75ml之间、仍更优选地介于约0.2ml与1.5ml之间、甚至更优选地介于约0.4ml与1.25ml之间、甚至更优选地介于约0.4ml与1.0ml之间，其中单一0.5ml剂量或1.0ml剂量最佳。最佳地，单一剂量具有0.5ml、1ml、1.5ml或2ml的总体积。

在本发明的一方面中，以两个或更多个剂量来施用如本文所阐述及主张的免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。

然而，可以两个或更多个剂量施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中第一剂量系在施用第二(加强)剂量之前施用。优选地，在第一剂量之后至少15天施用第二剂量。更优选地，在第一剂量之后15天与40天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少17天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后17天与30天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少19天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后19天与25天之间施用第二剂量。最佳地，在第一剂量之后至少21天施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后约21天或在第一剂量之后21天施用第二剂量。在两次施用方案的一优选方面中，免疫原性组合物的第一剂量及第二剂量皆以相同量施用。优选地，每一剂量系以上文指定的优选量，其中1ml或2ml的第一剂量及第二剂量最佳。除第一剂量及第二剂量方案外，替代实施方式包括其他后续剂量。举例而言，可在该等方面中施用第三、第四或第五剂量。优选地，以与第一剂量相同的量施用后续第三、第四及第五剂量方案，其中各剂量之间的时间范围与上文所提及第一及第二剂量之间的时间一致。将上述施用方案优选地仅应用于后备母猪。优选地，仅以单一施用/单一注射形式向经产母猪施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

在本发明的一方面中，个体系选自由猪、牛、猫及狗组成的群。

优选地，个体系猪。必须理解，猪包括雌性动物及雄性动物。精液可含有PPV且出于该原因，词语“猪”涵盖雌性及雄性育种动物。因此，词语“猪”包括雄性动物(例如公猪)以及雌性动物(例如后备母猪及经产母猪)。

本文所用的术语“后备母猪”系指在首次怀孕/妊娠之前及期间的猪类、优选地猪。相对地，本文所用的术语“经产母猪”系指在首次分娩(作为其首次怀孕/妊娠的阳性结果)之后的猪类、优选地猪。

每一个体的剂量体积取决于接种疫苗途径及个体年龄。优选地，总体积介于约0.2ml与5ml之间、更优选地介于约0.5ml与3.0ml之间、甚至更优选地介于约1.0ml与2.5ml之间、甚至更优选地介于约1.0ml与2.0ml之间。最佳体积为1ml、1.5ml、2ml或2.5ml/剂量。

优选地，经局部或全身性施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合(或分开的试剂盒组分)。常用的适宜施用途径系经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、真皮内、经皮、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，视化合物的性质及作用模式，亦可由其他途径施用免疫原性组合物。举例而言，该等其他途径包含经皮内、经静脉内、经血管内、经动脉内、经腹膜腔内、经鞘内、经气管内、经皮内、经心脏内、经肺叶内(intralobally、intralobarly)、经髓内、经肺内、经直肠内及经阴道内。然而，更优选地，经皮下或经肌内施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合。最佳地，经肌内施用免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

本文阐述下列方案：

1.一种免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其包括

2.如方案1的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该PPV系选自由以下组成的群：活减毒/经修饰活PPV病毒、杀死/灭活PPV病毒(例如Porcilis Parvo)、杀死/灭活PPV株014、猪细小病毒PPV-27a及PPV-143a的德国野外分离物及猪细小病毒疫苗病毒PPV-NADL-2及PPV-IDT(MSV)。

3.如方案1至2中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种PPV抗原系一或多种PPV亚单位。

4.如方案1至3中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种PPV亚单位系PPV病毒蛋白2(VP2)。

5.如方案4的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系唯一PPV抗原。

6.如方案4至5中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2

-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基，和/或

-在氨基酸位置414具有丝氨酸残基，和/或

-在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基，和/或

-在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，

其中氨基酸位置的编号参照野生型PPV VP2的氨基酸序列。

7.如方案6的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2另外具有

-在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基，和/或

-在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和/或

-在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基。

8.如方案6至7中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中氨基酸位置的编号参照如SEQ ID NO:1中所展示的氨基酸序列。

9.如方案4至8中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系重组PPV VP2。

10.如方案9的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系重组杆状病毒表达的PPVVP2。

11.如方案4至10中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。

12.如方案11的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列或由其组成。

13.如方案12的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成或包括任一具有至少210、至少250或至少300个来自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的连续氨基酸残基的片段或由其组成。

14.如方案13的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列或由其组成。

15.如方案4至14中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系由编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。

16.如方案15的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系由编码与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列编码。

17.如方案16的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PPV VP2系由编码SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5至16的氨基酸序列的核苷酸序列编码。

18.如方案1至16中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PRRS病毒系选自由以下组成的群：PRRS病毒基因型1，PRRS病毒基因型2，包括由与SEQ ID NO:17的核酸序列(莱利斯塔德(Lelystad)野生型序列)具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％相同性的核苷酸序列编码的基因组的PRRS病毒基因型1，包括由与SEQ ID NO:18的核酸序列(VR2332野生型序列)具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％相同性的核苷酸序列编码的基因组的PRRS病毒基因型2。

19.如方案18的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中PRRS病毒系选自由以下组成的群：活减毒/经修饰活PRRS病毒、活减毒/经修饰活PRRS病毒类型1基因型(例如Porcilis PRRS、Unistrain PRRS、Amervac PRRS)、活减毒/经修饰活PRRS病毒类型2基因型(例如PRRS MLV、Fostera PRRS)、活减毒/经修饰活PRRS病毒株94881[(基因型1)、PRRS EU]、杀死/灭活PRRS病毒、杀死/灭活PRRS病毒类型1基因型(例如Progressis)、杀死/灭活PRRS病毒类型2基因型、莱利斯塔德病毒株(CDI-NL-2.91，Institut Pasteur,Paris,France，保藏号I-1102)、PRRS病毒亚单位或其他株(例如以登录号ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474及VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108、北美PRRS病毒pT7P129A(ATCC登录号203488)、ATCC登录号VR-2332、ATCC登录号VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474及ATCC VR 2402保藏)。

20.如方案1至19中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种PPV抗原系一或多种PPV亚单位，优选地其中至少一种PPV抗原系PPV病毒蛋白2(VP2)，其中更优选地PPV VP2系唯一PPV抗原，且其中至少一种PRRS病毒抗原系活减毒/经修饰活PRRS病毒、优选地活减毒/经修饰活PRRS病毒类型1基因型(例如Porcilis PRRS、UnistrainPRRS、Amervac PRRS)、更优选地活减毒/经修饰活PRRS病毒株94881[(基因型1)、PRRS EU]及活减毒/经修饰活PRRS病毒类型2基因型(例如/>PRRS MLV、FosteraPRRS)。/>

21.如方案1至20中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合经调配用于单一剂量施用或两剂量施用。

22.如方案1至21中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中经肌内施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

23.如方案1至22中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪。

24.如方案23的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕30天、优选地怀孕40天的后备母猪和/或经产母猪。

25.如方案1至24中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合进一步包括至少一种医药上可接受的载剂。

26.如方案25的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该至少一种医药上可接受的载剂系卡波姆。

27.如方案4至26中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合包括0.1μg至50μg PPV VP2抗原、优选地0.5μg至10μg PPV VP2抗原、更优选地1.0μg至10μg PPV VP2抗原和/或3.9至7.0log₁₀TCID₅₀PRRS病毒。

28.如方案1至27中任一项的免疫原性组合物或组合，其中该免疫原性组合物或组合系疫苗。

29.如方案1至28中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗PPV的同源和/或异源攻击和/或PRRS病毒的同源和/或异源攻击。

30.如方案1至29中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗北美和/或欧洲PPV分离物的攻击和/或北美和/或欧洲PRRS病毒分离物的攻击。

31.如方案1至30中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可交叉抵抗北美和/或欧洲PPV分离物和/或可交叉抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物。

32.如方案1至31中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可有效治疗和/或预防有需要的个体中由PPV感染和/或PRRS病毒感染引起的临床体征。

33.如方案1至31中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其中至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原一起含于一个单一容器中或在空间上彼此分开、优选地含于两个或更多个单独容器中。

34.一种试剂盒，其包括如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

35.如方案34的试剂盒，其中至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原彼此分开地含于两个或更多个单独容器中，优选地二者彼此独立地呈冻干或冷冻形式，且其中该试剂盒进一步包括用于混合在空间上分开的至少一种PPV抗原及至少一种PRRS病毒抗原的说明书手册，其中优选地该说明书手册含有组合含有至少一种PPV抗原的容器的内容物与含有至少一种PPRS病毒抗原的容器的内容物的指导，其中更优选地使用含有至少一种PPV抗原的容器的液体内容物作为含有至少一种PPRS病毒抗原的容器的冻干内容物的稀释剂。

36.如方案34至35中任一项的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括治疗和/或预防猪疾病的指导和/或进一步包括治疗和/或预防PPV感染和/或PRRS病毒感染的指导，优选地该试剂盒进一步包括联合使用如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合的PPV组分及PRRSV组分的指导。

37.一种如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合或如方案34至36中任一项的试剂盒的用途，其用于制备药剂、优选地疫苗。

38.如方案37的用途，其用以制备用于以下药剂：治疗和/或预防PPV和/或PRRS病毒感染，减少、预防或治疗由PPV和/或PRRS病毒感染引起的临床体征，或治疗和/或预防由PPV和/或PRRS病毒感染引起的疾病。

39.一种对个体实施免疫的方法，其包括向该个体施用如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

40.一种治疗和/或预防有需要的个体、优选地猪中由PPV感染和/或PRRS病毒感染引起的临床体征、优选地猪生殖与呼吸道综合征的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

41.一种与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的生殖障碍的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

42.一种与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的胚胎或胎儿死亡的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

43.如方案39至42中任一项的方法，其中该个体系选自由以下组成的群：猪、牛、猫及狗，优选系猪，更优选系经产母猪和/或后备母猪。

44.如方案39至43中任一项的方法，其中一次性或以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

45.如方案39至44中任一项的方法，其中经肌内施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

46.如方案39至45中任一项的方法，其中将该免疫原性组合物或组合疫苗或组合施用后备母猪和/或经产母猪，优选地施用至少3周龄的经产母猪，更优选地施用怀孕之前的经产母猪，甚至更优选地施用怀孕及哺乳期间的经产母猪。

47.如方案39至46中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪。

48.如方案39至47中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕30天、优选地怀孕40天的经产母猪和/或后备母猪。

49.如方案39至48中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合包括0.1μg至50μg PPV VP2抗原、优选地0.5μg至10μg PPV VP2抗原、更优选地1.0μg至10μgPPV VP2抗原和/或3.9至7.0log₁₀TCID₅₀PRRS病毒。

50.如方案39至49中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗PPV的同源和/或异源攻击和/或PRRS病毒的同源和/或异源攻击。

51.如方案39至50中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗北美和/或欧洲PPV分离物的攻击和/或北美和/或欧洲PRRS病毒分离物的攻击。

52.如方案39至51中任一项的方法，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可交叉抵抗北美和/或欧洲PPV分离物和/或可交叉抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物。

53.如方案39至52中任一项的方法，其中该方法使得与相同物种的未免疫对照组的个体相比改良至少一种选自由以下组成的群的效能参数：暂时性白血球减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖障碍减少或其组合。

54.如方案39至53中任一项的方法，其中向该个体同时、优选地在相同或不同施用位点同时、依序(以任一顺序)和/或以按时间顺序交错方式分开施用至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原。

55.如方案39至54中任一项的方法，其用于主动免疫化种猪(经产母猪及后备母猪)以用于保护胚胎及胎儿免受猪细小病毒感染，该方法包括向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

56.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于对个体实施免疫的方法中，该方法包括向该个体施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

57.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于治疗和/或预防有需要的个体、优选地猪中由PPV感染和/或PRRS病毒感染引起的临床体征、优选地猪生殖与呼吸道综合征的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

58.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体的生殖障碍的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

59.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于与相同物种的未免疫对照组的个体相比减少个体中的胚胎及胎儿死亡的方法中，该方法包括向该个体施用治疗有效量的该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

60.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至59中任一项的用途，其中该个体系选自由以下组成的群：猪、牛、猫及狗，优选系猪，更优选系经产母猪和/或后备母猪。

61.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至60中任一项的用途，其中一次性或以两个或更多个剂量施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

62.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至61中任一项的用途，其中经肌内施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

63.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至62中任一项的用途，其中将该免疫原性组合物或组合疫苗或组合施用后备母猪和/或经产母猪，优选地施用至少3周龄的经产母猪，更优选地施用怀孕之前的经产母猪，甚至更优选地施用怀孕及哺乳期间的经产母猪。

64.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至63中任一项的用途，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕及哺乳期间的后备母猪和/或经产母猪。

65.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至64中任一项的用途，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可安全用于怀孕30天、优选地怀孕40天的后备母猪和/或经产母猪。

66.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至65中任一项的用途，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合包括0.1μg至50μg PPVVP2抗原、优选地0.5μg至10μg PPVVP2抗原、更优选地1.0μg至10μg PPV VP2抗原和/或3.9至7.0log10TCID50PRRS病毒。

67.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至66中任一项的用途，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗PPV的同源和/或异源攻击和/或可抵抗PRRS病毒的同源和/或异源攻击。

68.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至67中任一项的用途，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可抵抗北美和/或欧洲PPV分离物的攻击和/或可抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物的攻击。

69.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至68中任一项的用途，其中该免疫原性组合物或组合疫苗或组合可交叉抵抗北美和/或欧洲PPV分离物和/或可交叉抵抗北美和/或欧洲PRRS病毒分离物。

70.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至69中任一项的用途，其中该方法使得与相同物种的未免疫对照组的个体相比改良至少一种选自由以下组成的群的效能参数：暂时性白血球减少症及特征在于胚胎和/或胎儿感染及死亡的生殖障碍或其组合。

71.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于如方案56至70中任一项的用途，其中向该个体同时、优选地在相同或不同施用位点同时、依序(以任一顺序)和/或以按时间顺序交错方式分开施用至少一种猪细小病毒(PPV)抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒抗原。

72.如方案1至33中任一项的免疫原性组合物或组合疫苗或组合，其用于主动免疫化种猪(经产母猪及后备母猪)以用于保护胚胎及胎儿免受猪细小病毒感染的方法中，该方法包括向该等猪(经产母猪及后备母猪)施用该免疫原性组合物或组合疫苗或组合。

本发明的第二关注项

在一方面中，本发明系关于制造包括重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中该方法按以下顺序包括下列步骤：

(i)提供/获得包括以下的混合物：

-第一液体，

-重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，及

-包括编码该重组蛋白的核酸序列的载体；

(iii)由向源自步骤(ii)的混合物中进一步添加另外第二液体且自该组合混合物去除一部分第一和/或第二液体来洗涤混合物中的重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构且视情况最后浓缩；

(iv)由向源自步骤(iii)的混合物中添加灭活剂来使载体灭活；

(v)由向源自步骤(iv)的混合物中添加中和剂来中和灭活剂。

出于本发明目的，“第一液体”系指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗及诸如此类组合使用的液体、水性或流体培养基。优选地，第一液体包括来自抗原性组合物的培养基；更优选地，第一液体包括用于在所培养宿主细胞中制造重组蛋白的细胞培养基或优选地由其组成。该等经培养宿主细胞可为细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞及哺乳动物细胞，其中昆虫及哺乳动物细胞尤佳。因此，第一液体可包括用于培养细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的培养基或由其组成。优选地，细胞培养基系血清游离细胞培养基，且最佳地，在使用昆虫细胞时，培养基系Excell420无血清培养基。

出于本发明目的，“第二液体”系指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗及诸如此类组合使用的任何液体，其不同于第一液体。优选地，第二液体系水溶液、甚至更优选地医药上可接受的溶液及甚至更优选地缓冲液，例如盐水或磷酸盐缓冲液及诸如此类。最佳地，第二液体的特征在于，在将活病毒或活细菌培养或储存于此一液体中时，该液体对任一活病毒或活细菌无杀病毒性。

出于本发明目的，“部分”系指不涵盖全部量的任一量。举例而言，一部分液体为小于100体积％液体的任一者(例如90％液体、80％液体、70％液体)及大于0％且小于100％之间的所有量。

出于本发明目的，“重组蛋白”系指任一重组蛋白，优选地系指PPV VP2蛋白，更优选地包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NOS 5至16的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％序列相同性的序列或其由组成。

出于本发明目的，“四级结构”以及“由多个该重组蛋白构成的四级结构”系指多个该重组蛋白的三维配置，例如病毒样颗粒和/或同源三聚体。

出于本发明目的，“载体”以及“包括编码该重组蛋白的核酸序列的载体”系指适宜表达载体、优选地杆状病毒表达载体，其继而用于转染或在杆状病毒表达载体的情形下感染宿主细胞以制造由DNA编码的蛋白质或多肽。

载体及制备载体和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可尤其由以下文献揭示或类似于以下文献中所揭示的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virusvectors to vaccination:An update,“PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,“PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smi th等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编者),Methods in MolecularBiology 39,“Baculovirus Expression Protocols“(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”,Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号；欧洲专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function of herpes simplex vi rusgenes:A primer for genetic engineering of novel vectors,”PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineeredherpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,“PNASUSA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors forgene delivery to B lymphocytes“,PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,“PNAS USA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；1996年7月3日提出申请的允许美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus ascloning vectors,“Seminars in Virology(第3卷)，第237-52页，1993；Ballay等人，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页，Graham,Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，J.GenVirol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccinesencoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,inducesprote ctive immunity in animal models of herpes simplex virus-2disease“,PNASUSA 93:11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry(关于DNA表达载体)。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbachet等人(Intracel)；WO90/01543；Robinson等人，Seminars inImmunology，第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(致细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文所引用的其他文件。

优选细胞系易于感染含有重组蛋白DNA且表达重组蛋白的适当重组病毒载体者。优选地，细胞系昆虫细胞，且更优选地，其包含以商标SF+昆虫细胞(Protein SciencesCorporation,Meriden,CT)出售的昆虫细胞。优选细胞培养物具有介于约0.3-2.0×10⁶个细胞/mL、更优选地约0.35-1.9×10⁶个细胞/mL、仍更优选地约0.4-1.8×10⁶个细胞/mL、甚至更优选地约0.45-1.7×10⁶个细胞/mL及最佳地约0.5-1.5×10⁶个细胞/mL之间的细胞计数。

优选病毒载体包含诸如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)等杆状病毒，特定而言，条件系制造细胞系昆虫细胞。尽管杆状病毒表达系统优选，但熟习此项技术者应理解，其他表达系统(包含上文所阐述者)可用于本发明目的，亦即表达重组蛋白。

适当生长培养基亦可由熟习此项技术者来确定，其中优选生长培养基系无血清昆虫细胞培养基，例如Excell 420(JRH Biosciences,Inc.,Lenexa,KS)及诸如此类。

在用于感染易感细胞时，含有重组蛋白DNA序列的重组病毒载体的优选感染复数(MOI)介于约0.03-1.5之间、更优选地约0.05-1.3、仍更优选地约0.09-1.1及最佳地约0.1-1.0。优选地，上文所提及的MOI系关于1mL细胞培养流体。优选地，本文所阐述的方法包括使用含有重组蛋白DNA且表达重组蛋白的重组病毒载体感染0.35-1.9×10⁶个细胞/mL、仍更优选约0.4-1.8×10⁶个细胞/mL、甚至更优选地约0.45-1.7×10⁶个细胞/mL及最佳地约0.5-1.5×10⁶个细胞/mL，其中MOI(感染复数)介于约0.03-1.5之间、更优选地约0.05-1.3、仍更优选地约0.09-1.1及最佳地约0.1-1.0。

可由过滤步骤利用过滤器自步骤(iii)中包括重组蛋白的组合混合物去除第一液体的部分。然而，可使用熟习此项技术者已知的任一其他方法来去除任何液体的部分，包含来自步骤(iii)的组合混合物的第一液体及(在适应时)一部分第二液体。该方法(例如)包含(但不限于)离心和/或层析。

然而，过滤系最佳方法。去除该部分的第一液体或任何其他液体(在适应时)的优选过滤方法包括超滤和/或渗滤。超滤及渗滤系熟习此项技术者已知的标准方法，其详细阐述于(例如)Protein Purification Methods–A Practical Approach–编者：E.L.V.Harris及S.Angel,Oxford University Press 1995(其内容及教示内容以引用方式并入本文中)中。特定而言，在该教科书的第3章中，阐述若干方法及设备类型，其皆可由熟习此项技术者以实例性方式用于本发明目的。

出于本发明目的，“灭活剂”系指任一可用于任一习用灭活方法中的试剂。可由熟习此项技术者已知的化学和/或物理处理来实施灭活。优选灭活剂包含环化二乙烯亚胺(BEI)，包含2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(环化成二乙烯亚胺(BEI))的溶液。优选其他化学灭活剂包括(但不限于)Triton X-100、脱氧胆酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、酚及甲醛(福尔马林)。

出于本发明目的，“中和剂”系指任一能够中和如本文所阐述的灭活剂以便灭活剂不再能够使载体灭活的试剂。中和灭活剂的试剂优选系硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠及诸如此类。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中步骤(i)的混合物可由包括以下步骤的程序来获得：

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中将步骤(a)中的细胞培养物维持于27±2℃下，优选地同时重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构由该载体表达，和/或其中步骤(b)中的回收发生在使用该载体接种所述细胞之后6至8天，优选8天。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中分离步骤包含以下部分或由其组成：

-经由至少一个孔径为约2μm至约4μm的过滤器进行微过滤，和/或

-经由至少一个孔径为约0.1μm至约0.8μm的过滤器进行微过滤。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中该第一液体包括一部分细胞培养基或由细胞培养基组成，且其中细胞培养基优选系昆虫细胞培养基。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中该重组蛋白系选自由以下组成的群：

-PPV VP2蛋白，其优选地包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NOS:5至16的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％序列相同性的序列或由其组成。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中由多个该重组蛋白构成的该等四级结构系病毒样颗粒或其中由多个该重组蛋白构成的该等四级结构系同源三聚体。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中载体系重组病毒、优选地杆状病毒，和/或其中核酸序列系DNA序列。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中包括编码该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的核酸的载体系重组杆状病毒，其中该杆状病毒包括编码该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的DNA序列。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中在步骤(iii)中，使用与步骤(i)的混合物中的该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的原始体积相比，至少2×、优选地2×至3×的第二液体洗涤该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构，且视情况最后浓缩。更优选地，在步骤(iii)中，在低于37℃的温度下、更优选地在低于30℃的温度下、甚至更优选地在低于20℃的温度下、甚至更优选地在低于10℃的温度下(例如在介于4℃与29℃之间的温度下，例如27℃或4℃)实施所述洗涤步骤(亦即渗滤过程)。因此，沉淀(聚集)程度显著减小。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中在步骤(iii)中，由过滤自混合物去除第一和/或第二液体的部分，其中优选利用包括半渗透膜的过滤器或空心过滤器，该半渗透膜的平均孔径小于该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构和/或防止大部分、优选地实质上所有20kDa至500kDa大小的蛋白质通过半渗透膜。

过滤器可为业内的任一习用过滤器。优选地，该过滤器包含半渗透膜。在另一优选形式中，该半渗透膜的平均孔径小于重组蛋白以由此防止至少90％的该重组蛋白通过该等半渗透膜孔隙且藉助过滤器保留重组蛋白。

在另一方面中，该过滤器具有防止通过至少90％的20kDa至500kDa大小蛋白质的平均孔径；更优选地，该过滤器具有防止通过至少90％的50kDa至400kDa大小蛋白质的平均孔径；且最佳地，该过滤器具有防止通过至少90％的75kDa至300kDa大小蛋白质的平均孔径。在重组蛋白以全病毒或全病毒样颗粒形式制得时，此孔径优选。在另一方面中，该半渗透膜包含选自由以下组成的群的材料：聚砜、聚醚砜及再生纤维素。然而，可使用任一使得自重组蛋白去除第一液体的部分及在多方法步骤情形下去除第一流体及第二液体的混合物的其他材料。该过滤器可选自由以下组成的群：空心纤维膜超滤柱、平板或盒，其中空心纤维膜超滤柱尤佳。

拟用于任一所阐述方法中的优选第二液体系缓冲液，优选系生理上可接受的缓冲液，其中盐水尤佳。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中第二液体系缓冲溶液，优选系洗涤性磷酸盐缓冲盐水(WPBS)。

可实质上同时实施如本文所阐述的方法的浓缩步骤及液体添加步骤，或替代地，依序实施浓缩步骤及液体添加步骤。

在依序实施浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤顺序无关紧要。举例而言，在另一方面中，液体添加步骤发生于该浓缩步骤之前，且在替代方面中，浓缩步骤发生于该液体添加步骤之前。不论实施顺序如何，液体添加步骤及浓缩步骤可实施多次。举例而言，该等各别步骤中的每一者可视需要实施至少两次、至少三次、至少4次、至少5次、至少10次、直至更多次。在一方面中，浓缩步骤及液体添加步骤各自实施至少两次。在另一方面中，浓缩步骤及液体添加步骤各自实施至少三次。

可实施本文所提供的方法的浓缩步骤，从而与该第一液体的体积相比将重组蛋白浓缩3倍至50倍。更优选地，可进行该浓缩步骤，从而与该第一液体的体积相比将重组蛋白浓缩4倍至20倍。最佳地，可进行该浓缩步骤，从而与该第一液体的体积相比将重组蛋白浓缩7倍至10倍。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中在步骤(ii)中添加的第二液体的体积约为在步骤(iii)中去除的第一和/或第二液体的体积。换言的，并不实施和/或需要浓缩步骤。

在使用病毒载体(例如重组痘病毒、腺病毒或杆状病毒)制造重组蛋白的情形下，推荐由适当灭活处理来使病毒核酸灭活。该灭活可发生于纯化重组蛋白期间的任一时间。因此，灭活可发生于收获包括重组蛋白的细胞培养流体之后或微滤重组蛋白(若进行微滤)之后即刻，发生于纯化步骤之前或之后(例如在凝胶过滤之前或之后及在阴离子交换层析之前或之后，若进行此步骤)。

任一习用灭活方法皆可用于本发明目的。因此，可由化学和/或物理处理实施灭活。在优选形式中，测定收获流体的体积且使温度介于约32℃-42℃之间、更优选地介于约34℃-40℃之间及最佳地介于约35℃-39℃之间。优选灭活方法包含以优选地约1mM至约20mM、优选地约2mM至约10mM、仍更优选地约2mM至约8mM、仍更优选地约3mM至约7mM、最佳地约5mM的浓度添加环化二乙烯亚胺(BEI)。举例而言，灭活包含将优选地约0.4M 2-溴乙烯胺盐酸盐(BEA)(其环化至0.2M二乙烯亚胺(BEI))于0.3N NaOH中的溶液添加至流体中以得到约5mM BEI的最终浓度。优选地，然后将流体连续搅拌2-96小时且可将灭活收获流体冷冻储存于-40℃或更低温度或约1℃-7℃下。在完成灭活之后，添加硫代硫酸钠溶液(优选地以1.0M)以中和任何残余BEI。优选地，以等于在灭活之前所添加BEI的量的量添加硫代硫酸钠。举例而言，在添加BEI直至最终浓度为5mM的情形下，添加1.0M硫代硫酸钠溶液以得到最终5mM的最小浓度，从而中和任何残余BEI。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中灭活剂系氮丙啶化合物、优选地二乙烯亚胺(BEI)，和/或其中相对于载体添加摩尔过量的灭活剂。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中中和剂系硫代硫酸钠和/或其中相对于灭活剂添加摩尔过量的中和剂。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：混合在步骤(v)之后剩余的混合物与另一选自由医药上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的组分。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中源自该方法的混合物与未经历该方法的混合物相比杀病毒活性减小至少10％，和/或其中在将活病毒与由该方法制得的免疫原性组合物混合两小时或两小时以上，该免疫原性组合物使得每mL活病毒损失小于1logTCID₅₀。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中活病毒系猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中该方法进一步包括收获在步骤(v)之后剩余的重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构的步骤(vi)，且特定而言进一步包括由层析方法、优选地体积排阻层析(size exclusionchromatography)来纯化包括重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构的收获物的步骤。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中该方法进一步包括组合(经纯化)所收获重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构与至少一种其他抗原的步骤。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的方法，其中至少一种其他抗原系猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒。

在另一方面中，该方法进一步包括以下步骤：收获在自该重组蛋白去除至少一部分该第一液体之后所获得的重组蛋白。

如本文中所使用，“收获(harvesting或harvest)”系指收集或回收重组蛋白。在制造重组蛋白以与本发明的方法及组合物一起使用时或在重组蛋白经历本文所阐述的方法时，可使用业内已知的任一习用方法来回收重组蛋白。在尤佳收获方式中，经由过滤步骤自该重组蛋白去除该第一液体的部分且自过滤滞留物回收或收获重组蛋白。在更优选形式中，自具有本文所阐述孔径的半渗透膜的滞留物收获或收集或回收重组蛋白。

将在经历本文所提供的方法之后、优选地在自过滤滞留物收获之后剩余的重组蛋白与另一选自由医药上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的组分混合。优选地，该另一组分系佐剂，甚至更优选地，该佐剂系丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且仍更优选地，该佐剂系卡波姆。

在本申请案的另一方面中，上述方法进一步包括以下步骤：混合在灭活及中和步骤之后获得的重组蛋白与另一选自由医药上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的组分。在混合经纯化重组蛋白与佐剂之前，亦推荐使用pH 7.4磷酸盐缓冲盐水或任一其他生理学缓冲剂透析经纯化重组蛋白。

如本文中所使用，“医药可接受的载剂”及“兽医可接受的载剂”包含任何及所有的溶剂、分散介质、涂层、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及诸如此类。

本文所用的“佐剂”可包含氢氧化铝及磷酸铝、皂素(例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL))、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(European Pharmacopea)型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特定而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，特定而言异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选系非离子表面活性剂，特定而言系以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其视情况经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Stewart-Tull编辑，D.E.S.)。JohnWiley and Sons,NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。举例而言，可使用由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,TheSubunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press,1995的第147页上阐述的SPT乳液及同一本书第183页上阐述的乳液MF59。其他适宜佐剂尤其包含(但不限于)RIBI佐剂系统(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽等。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，尤其包含共聚物EMA(Monsanto)，其系马来酸酐与乙烯的共聚物。该等聚合物在水中的溶解产生酸溶液，其将被中和、优选地中和至生理学pH以产生将引入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身的佐剂溶液。

佐剂的另一实例系选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物系丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。该等化合物以术语卡波姆为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述与具有至少3个、优选地不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的该等丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团系含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团。不饱和基团可自身含有其他取代基，例如甲基。以名称Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品尤其适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳系使用Carbopol 971P。

“稀释剂”可包含水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。稳定剂包含白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐等。

本文所用的“防腐剂”系指抗微生物活性剂，例如庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)及诸如此类。特别地，添加防腐剂最佳用于制备多剂量组合物。以有效防止所关注组合物为任何微生物污染或抑制所关注组合物内任何微生物生长的浓度添加该等抗微生物活性剂。

可使用层析方法、优选地两步骤层析方法来进一步纯化重组蛋白。若将重组蛋白组装成病毒样颗粒(VLP)，则一个步骤、优选地第一步骤优选系体积排阻(凝胶过滤)层析，其可例如由使用Sephacryl S300基质来进行。在实验室规模中，最佳使用HiPrep 26/60Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟习此项技术者已知的任何其他体积排阻层析基质，该等基质容许自培养滤液或上清液分离重组蛋白VLPs。适宜基质阐述于例如E.L.V.Harris及S.Angel(编者),Protein purification methods-a practicalapproach,IRL Press Oxford 1995)中。例如，可由以1.0ml/min的流速向管柱加载包括重组蛋白的粗制剂且使用1.5管柱体积包括20mM Tris(pH 6.5)、5mM DTT的缓冲液洗脱管柱来实施凝胶过滤层析。然而，亦可由使用亲和力层析，例如经由选择性结合至经固定重组蛋白特异性抗体，或熟习此项技术者已知的任何其他方法来纯化重组蛋白。

为获得较高纯度等级，可进行第二层析步骤，然而第二层析步骤不同于第一步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤系体积排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应与该步骤不同，例如亲和力层析、离子交换层析等。优选地，若纯化重组蛋白的第一步骤系体积排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析、优选地阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化重组蛋白的优选阴离子交换层析基质系Q琼脂糖凝胶(Sepharose)。在约50ml的小规模中，最佳使用5ml HiTrap Q琼脂糖凝胶HP管柱。

本申请案不仅提供制造含有重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其亦关于含有重组蛋白的免疫原性组合物。

在另一方面中，本发明系关于可由如本文所阐述及主张的方法获得的免疫原性组合物。

在另一方面中，与未经历本文制造方法的含有重组蛋白的免疫原性组合物相比，由该方法制得的含有重组蛋白的免疫原性组合物的杀病毒活性减小至少10％。更优选地，与未经历该制造方法的含有重组蛋白的免疫原性组合物相比，含有重组蛋白的免疫原性组合物的杀病毒活性减小至少50％。仍感更优选地，与未经历该制造方法的含有重组蛋白的免疫原性组合物相比，含有重组蛋白的免疫原性组合物的杀病毒活性减小至少70％。甚至仍感更优选地，与未经历该制造方法的含有重组蛋白的免疫原性组合物相比，含有重组蛋白的免疫原性组合物的杀病毒活性减小至少90％。

出于本发明目的，发明术语“杀病毒活性”意指，在将液体、流体、溶液、组合物或诸如此类与活病毒或活细菌混合时，该液体、流体、溶液、组合物或诸如此类使该等活病毒或活细菌灭活或杀死至一定某些程度。因此，液体、流体、溶液、组合物或诸如此类的杀病毒活性减小10％意指，与未经历该等制造方法中的任一者的液体、流体、溶液、组合物或诸如此类相比，经历本文所阐述制造方法中的任一者的液体、流体、溶液、组合物或诸如此类活中的病毒或活细菌的存活率高90％。

在将活病毒或活细菌与重组蛋白免疫原性组合物混合且一起培育2个或更多个小时、优选地大于4小时、甚至更优选地大于12小时、甚至更优选地大于24小时、甚至更优选地大于2天、甚至更优选地大于4天、甚至更优选地大于7天、甚至更优选地大于2周、甚至更优选地大于4周、甚至更优选地大于2个月、甚至更优选地大于3个月、甚至更优选地大于4个月、甚至更优选地大于6个月、甚至更优选地大于9个月、甚至更优选地大于12个月、甚至更优选地大于18个月、最佳地大于2年时，由本文所阐述方法制得的重组蛋白免疫原性组合物使得损失小于1log TCID₅₀的活病毒或小于1log CFU/ml活细菌。更优选地，在将活病毒或活细菌与重组蛋白免疫原性组合物混合且一起培育2个或更多个小时、优选地大于4小时、甚至更优选地大于12小时、甚至更优选地大于24小时、甚至更优选地大于2天、甚至更优选地大于4天、甚至更优选地大于7天、甚至更优选地大于2周、甚至更优选地大于4周、甚至更优选地大于2个月、甚至更优选地大于3个月、甚至更优选地大于4个月、甚至更优选地大于6个月、甚至更优选地大于9个月、甚至更优选地大于12个月、甚至更优选地大于18个月、最佳地大于2年时，由本文所阐述方法制得的重组蛋白免疫原性组合物使得损失小于0.9logTCID₅₀/ml活病毒或小于0.9log CFU/ml活细菌。甚至更优选地，在将活病毒或活细菌与重组蛋白免疫原性组合物混合且一起培育2个或更多个小时、优选地大于4小时、甚至更优选地大于12小时、甚至更优选地大于24小时、甚至更优选地大于2天、甚至更优选地大于4天、甚至更优选地大于7天、甚至更优选地大于2周、甚至更优选地大于4周、甚至更优选地大于2个月、甚至更优选地大于3个月、甚至更优选地大于4个月、甚至更优选地大于6个月、甚至更优选地大于9个月、甚至更优选地大于12个月、甚至更优选地大于18个月、最佳地大于2年时，由本文所阐述方法制得的重组蛋白免疫原性组合物使得损失小于0.7log TCID₅₀/ml活病毒或小于0.7log CFU/ml活细菌。仍更优选地，在将活病毒或活细菌与重组蛋白免疫原性组合物混合且一起培育2个或更多个小时、优选地大于4小时、甚至更优选地大于12小时、甚至更优选地大于24小时、甚至更优选地大于2天、甚至更优选地大于4天、甚至更优选地大于7天、甚至更优选地大于2周、甚至更优选地大于4周、甚至更优选地大于2个月、甚至更优选地大于3个月、甚至更优选地大于4个月、甚至更优选地大于6个月、甚至更优选地大于9个月、甚至更优选地大于12个月、甚至更优选地大于18个月、最佳地大于2年时，由本文所阐述方法步骤制得的重组蛋白免疫原性组合物使得损失小于0.5log TCID₅₀/ml活病毒或小于0.5logCFU/ml活细菌。甚至更优选地，在将活病毒或活细菌与重组蛋白免疫原性组合物混合且一起培育2个或更多个小时、优选地大于4小时、甚至更优选地大于12小时、甚至更优选地大于24小时、甚至更优选地大于2天、甚至更优选地大于4天、甚至更优选地大于7天、甚至更优选地大于2周、甚至更优选地大于4周、甚至更优选地大于2个月、甚至更优选地大于3个月、甚至更优选地大于4个月、甚至更优选地大于6个月、甚至更优选地大于9个月、甚至更优选地大于12个月、甚至更优选地大于18个月、最佳地大于2年时，由本文所阐述方法制得的重组蛋白免疫原性组合物使得损失小于0.3log TCID₅₀/ml活病毒或小于0.3log CFU/ml活细菌。可由标准活体外滴定分析来估计TCID₅₀/ml，该分析使得可估计活病毒量。亦可由标准活体外滴定分析来测定CFU/ml，该分析使得可估计活细菌量。术语“每ml”优选地系指1ml流体。与如本文所定义的未纯化重组蛋白相比，该经纯化重组蛋白不仅展示减小的杀病毒活性(如本文所定义)，其亦展示增加的免疫原性，优选地，与由包括未纯化重组蛋白的参考免疫原性组合物所诱发的细胞和/或抗体介导的免疫反应相比，该重组蛋白将细胞和/或抗体介导的免疫反应增加至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少75％、最佳地至少100％。

包括经纯化重组蛋白的免疫原性组合物、优选地可由本文所阐述方法获得者的特征在于其免疫原性大于未包括此一纯化重组蛋白的免疫原性组合物。

另外，本文所用的术语“增加的免疫原性或改良的免疫原性”意指，由包括所关注抗原的免疫原性组合物引起的免疫反应大于包括不同抗原或不同纯度等级抗原的参考免疫原性组合物，不论此免疫反应系细胞介导和/或抗体介导的免疫反应。根据一优选实施方式，术语增加的免疫原性或改良的免疫原性意指，由包括所关注抗原的免疫原性组合物诱发的抗体介导的免疫反应大于包括不同抗原或不同纯度等级抗原的参考免疫原性组合物。就此而言，抗体介导的免疫反应意指，与由包括不同抗原或不同纯度等级抗原的参考免疫原性组合物诱发的抗体制造相比，所关注抗原的特异性抗体的制造有所增加。

术语“增加”意指，与由包括重组蛋白或不同纯度等级重组蛋白的参考免疫原性组合物诱发的细胞和/或抗体介导的免疫反应相比，细胞和/或抗体介导的免疫反应增加至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少75％、最佳地至少100％。

熟习此项技术者熟知如何量测细胞和/或抗体介导的免疫反应。特定而言，熟习此项技术者熟知如何比较所关注免疫原性组合物的细胞介导的免疫反应与参考的细胞介导的免疫反应，或比较所关注免疫原性组合物与参考组合物的抗体介导的免疫反应，但并不比较所关注免疫原性组合物的细胞介导的免疫反应与参考的抗体介导的免疫反应或反的亦然。此外，举例而言，可由量测所关注免疫原性组合物/抗原对细胞毒性T细胞的活化来量测细胞介导的免疫反应。举例而言，可由量测因向动物施用包括该抗原的免疫原性组合物所生成抗原特异性抗体的量来量测抗体介导的免疫反应。举例而言，可由使用小鼠模型来量测细胞和/或抗体介导的免疫反应。根据本发明，使用小鼠模型作为参考方法。

术语“免疫原性组合物”意指(但不限于)包括至少一种抗原的物质组合物，该抗原在宿主中诱发针对所关注抗原的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包含(但不限于)一或多种下列效应：制造或活化特异性地针对所论述组合物或疫苗中所包含的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主将显示治疗或保护性免疫反应，从而新感染抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度有所减小。在此一情形下，免疫原性组合物系“疫苗”。该保护将显示为减少或缺乏通常由感染宿主显示的症状、恢复时间变快和/或感染宿主中的病毒效价降低。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包括减毒活病毒、优选地减毒猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒或减毒活细菌。

出于本发明目的，“活”病毒或细菌系指能够在宿主中复制的病毒或细菌。本发明的优选活病毒及优选活细菌分别系PRRS病毒及猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia)细菌。然而，术语活病毒或活细菌并不分别限于PRRS及猪肺炎支原体。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物，其中减毒活病毒系猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对病原体、优选地如本文所阐述及主张包括重组蛋白的病原体的保护性免疫反应。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒的保护性免疫反应。

可组合根据上述方法获得的重组蛋白免疫原性组合物或上述方法的步骤i)中所使用的重组蛋白与至少一种其他抗原、优选地病毒或细菌抗原及甚至更优选地来自猪中至少一种其他病原生物体的病毒或细菌抗原。其他抗原可为任一揭示于国际专利申请案WO2007/094893(其内容及教示内容以引用方式并入本文中)中者。简言之，其他抗原可为猪的任一其他病原生物体的抗原。优选地，猪的“另一病原生物体”系选自由以下组成的群：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)(1)；腺病毒(2)；甲病毒属(Alphavirus)，例如东方马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis viruse)(3)；支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)(4)；短螺螺菌属(Brachyspiraspp.)(5)；优选地，猪赤痢短螺旋菌(B.hyodyentheriae)(6)；大肠柔毛短螺旋菌(B.piosicoli)(7)；猪布氏杆菌(Brucella suis)，优选系生物变型1、2及3(8)；经典猪瘟病毒(9)；梭菌属(Clostridium spp.)(10)；优选地难养芽胞梭菌(Cl.difficile)(11)；产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)类型A、B及C(12)；诺非氏梭菌(Cl.novyi)(13)；腐败梭菌(Cl.septicum)(14)；破伤风梭菌(Cl.tetani)(15)；冠状病毒(Coronavirus)(16)；优选地猪呼吸道冠状病毒(Porcine Respiratory Corona virus)(17)；猪附红细胞体(Eperythrozoonosis suis)(18)；豚丹毒菌(Erysipelothrix rhsiopathiae)(19)；大肠杆菌(20)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选系亚型1、7及14(21)；血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus)(22)；日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitis Virus)(23)；胞内劳森菌(Lawsonia intracellular)(24)钩端螺旋体属(Leptospira spp.)(25)；优选地澳洲钩端螺旋体(Leptospira australis)(26)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)(27)；感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)(28)；出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagicae)(29)；及问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(30)；波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)(31)；塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)(32)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)(33)；优选地，鸟分枝杆菌(M.avium)(34)；细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(35)；及牛分枝杆菌(M.bovis)(36)；猪肺炎支原体(37)；出血败血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)(38)；猪巨细胞病毒(39)；猪细小病毒(40)；猪生殖与呼吸道综合征病毒(41)；假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus)(42)；轮状病毒属(Rotavirus)(43)；沙门杆菌属(Salmonellaspp.)(44)；优选地鼠伤寒沙门杆菌(S.thyhimurium)(45)；及猪霍乱沙门杆菌(S.choleraesuis)(46)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)(47)；葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)(48)；优选地链球菌属(Streptococcus spp.)(49)；优选地猪链球菌(Strep.suis)(50)；猪疱疹病毒(51)；猪流行性感冒病毒(52)；猪痘病毒(53)；猪痘病毒(54)；水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)(55)；猪水疱疹病毒(56)；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)(57)；和/或猪关节滑膜霉浆菌(Mycoplasma hyosynoviae)(58)。

在另一方面中，本发明系关于一种试剂盒，其包括含有如本文所阐述及主张的免疫原性组合物的容器。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的试剂盒，其进一步包括至少一个含有至少一种选自由减毒活病毒、优选地减毒PRRS病毒及减毒活细菌组成的群的其他抗原的其他容器。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物，其用作药剂，优选地用作疫苗。

在另一方面中，本发明系关于如本文所阐述及主张的免疫原性组合物和/或如本文所阐述及主张的试剂盒，其用于与不接受该免疫原性组合物的动物相比减少动物的病原体感染的一或多种临床症状的方法中。

术语“减小临床体征的发生率或严重程度”应意指，与“对照组”的动物相比，接受施用疫苗的动物中该等体征中的任一者的发生率或严重程度有所减小，其中两种动物皆感染衍生疫苗中的免疫学活性组分的病原体或由该病原体攻击且对照组未接受施用该疫苗或免疫原性组合物。在此背景下，术语“降低”或“减小”意指与未接种疫苗的对照组相比在接种疫苗的组中减小至少10％、优选地25％、甚至更优选地50％、最佳地大于100％。

如本文中所使用，“临床症状”或“临床体征”应系指自活动物直接可观察的来自病原体的感染的体征，例如症状。代表性实例取决于所选病原体，但可包含(例如)流鼻涕、嗜睡、咳嗽、高热、增重或减重、脱水、腹泻、肿胀、跛行及诸如此类。

如本文中所使用，“保护性免疫反应”系指减小来自所关注病原体的感染的临床、病理学或组织病理学体征或症状的发生率或减小其严重程度，最多且包含完全预防该等体征或症状。

术语“病理学体征”应指可在微观或分子层面上经由生物化学测试或在验尸时使用肉眼观察到的感染体征。

术语“组织病理学体征”应指源自感染的组织变化体征。

术语“临床症状”或“临床体征”定义于上文中。

本文阐述下列方案：

1.一种制造包括重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中该方法按以下顺序包括下列步骤：

(i)提供/获得包括以下的混合物：

-第一液体，

-重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，及

-包括编码该重组蛋白的核酸序列的载体；

(iv)由向源自步骤(iii)的混合物中添加灭活剂来使载体灭活；

(v)由向源自步骤(iv)的混合物中添加中和剂来中和灭活剂。

2.如方案1的方法，其中步骤(i)的该混合物可由包括以下步骤的程序获得：

(b)然后自细胞培养物回收重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，其中优选地经由分离步骤(优选地包含经由至少一个过滤器、优选地两个过滤器进行微过滤)来分离细胞碎屑与重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，其中至少一个过滤器的孔径优选地大于重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构，特定而言，孔径为约0.1μm至约4μm。

3.如方案2的方法，其中将步骤(a)中的该细胞培养物维持于27±2℃下，优选地同时重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构由该载体表达，和/或其中步骤(b)中的回收发生在使用该载体接种所述细胞之后6至8天，优选8天。

4.如方案2或3的方法，其中该分离步骤包含以下过程或由其组成：

-经由至少一个孔径为约0.1μm至约0.8μm的过滤器进行微过滤。

5.如方案1至4中任一项的方法，其中该第一液体包括一部分细胞培养基或由细胞培养基组成，且其中该细胞培养基优选系昆虫细胞培养基。

6.如方案1至5中任一项的方法，其中该重组蛋白系选自由以下组成的群：

7.如方案1至6中任一项的方法，其中由多个该重组蛋白构成的该等四级结构系病毒样颗粒或其中由多个该重组蛋白构成的该等四级结构系同源三聚体。

8.如方案1至7中任一项的方法，其中该载体系重组病毒、优选地杆状病毒，和/或其中该核酸序列系DNA序列。

9.如方案1至8中任一项的方法，其中包括编码该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的核酸的该载体系重组杆状病毒，其中该杆状病毒包括编码该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的DNA序列。

10.如方案1至9中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，使用与步骤(i)的混合物中的该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构的原始体积相比，至少2×、优选地2×至3×的第二液体洗涤该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构，且视情况最后浓缩。

11.如方案1至10中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，在低于37℃的温度下、更优选地在低于30℃的温度下、甚至更优选地在低于20℃的温度下、甚至更优选地在低于10℃的温度下(例如在介于4℃与29℃之间的温度下，例如27℃或4℃)实施所述洗涤步骤(亦即渗滤过程)。

12.如方案1至11中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，由过滤自混合物去除第一和/或第二液体的部分，其中优选利用包括半渗透膜的过滤器或空心过滤器，该半渗透膜的平均孔径小于该重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的该等四级结构和/或防止大部分、优选地实质上所有20kDa至500kDa大小的蛋白质通过半渗透膜。

13.如方案1至12中任一项的方法，其中该第二液体系缓冲溶液，优选系洗涤磷酸盐缓冲盐水(WPBS)。

14.如方案1至13中任一项的方法，其中在步骤(ii)中所添加第二液体的体积约为在步骤(iii)中去除的第一和/或第二液体体积，亦即并不实施和/或无需浓缩步骤。

15.如方案1至14中任一项的方法，其中该灭活剂系氮丙啶化合物、优选地二乙烯亚胺(BEI)，和/或其中相对于该载体添加摩尔过量的该灭活剂。

16.如方案1至15中任一项的方法，其中该中和剂系硫代硫酸钠和/或其中相对于该灭活剂添加摩尔过量的该中和剂。

17.如方案1至16中任一项的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：混合在步骤(v)之后剩余的混合物与另一选自由医药上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的组分。

18.如方案1至17中任一项的方法，其中源自该方法的混合物与未经历该方法的混合物相比杀病毒活性减小至少10％，和/或其中在将活病毒与由该方法制得的免疫原性组合物混合两小时或两小时以上，该免疫原性组合物使得每mL活病毒损失小于1log TCID₅₀。

19.如方案18的方法，其中该活病毒系猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒。

20.如方案1至19中任一项的方法，其中该方法进一步包括收获在步骤(v)之后剩余的重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构的步骤(vi)，且特定而言进一步包括由层析方法、优选地体积排阻层析来纯化包括重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构的收获物的步骤。

21.如方案1至20中任一项的方法，其中该方法进一步包括组合(经纯化)所收获重组蛋白和/或由多个该重组蛋白构成的四级结构与至少一种其他抗原的步骤。

22.如方案21的方法，其中该至少一种其他抗原系猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒。

23.一种免疫原性组合物，其可由如方案1至22中任一项的方法获得。

24.如方案23的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包括减毒活病毒、优选地减毒猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒或减毒活细菌。

25.如方案23或24的免疫原性组合物，其中该减毒活病毒系猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)病毒。

26.如方案23至25中任一项的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对病原体、优选地包括如方案6的重组蛋白的病原体的保护性免疫反应。

27.如方案23至26中任一项的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒的保护性免疫反应。

28.一种试剂盒，其包括含有如方案23至27中任一项的免疫原性组合物的容器。

29.如方案28的试剂盒，其进一步包括至少一个含有至少一种选自由减毒活病毒、优选地减毒PRRS病毒及减毒活细菌组成的群的其他抗原的其他容器。

30.如方案23至29中任一项的免疫原性组合物，其用作药剂，优选地用作疫苗。

31.如方案23至29中任一项的免疫原性组合物和/或如方案28或29中任一项的试剂盒，其用于与未接受该免疫原性组合物的动物相比减小动物中病原体感染的一或多种临床症状的方法中。

实施例

下文陈述下列实施例以阐释本发明的具体实施例。该等实施例仅为阐释性且应理解为并不限制本发明的范围或基本原理。

实施例1：猪细小病毒(PPV)27a VP2的制造-上游处理

在经杆状病毒感染的SF+细胞中制造PPV 27a VP2，且在略微类似于PCV2ORF2(WO2006/072065；实施例1至3)的方法中实施BEI灭活。然而，PPV 27a VP2使用称为“DiamondBac”的不同杆状病毒骨架(Sigma Aldrich,D6192)(代替用于PCV2ORF2的较早BaculoGold骨架)。

自基因库登录号AY684871.1获得猪细小病毒(PPV)27a VP2核苷酸序列。反翻译PPV 27a VP2编码区且使用由Integrated DNA Technologies提供的Web Tools软件针对果蝇属(Drosophila)实施密码子最佳化。进一步修饰经密码子优化的PPV 27a VP2基因以将两个ClaI限制酶位点插入VP2编码区中，且将BamHI及NotI限制酶位点分别添加至5’-端及3’-端。以不破坏VP2编码区的方式来插入ClaI位点。插入ClaI位点可在所预测27aVP2氨基酸序列中引入三个次要氨基酸变化。源自ClaI插入的氨基酸变化位于位置25(甘氨酸→异亮氨酸)、36(丙氨酸→丝氨酸)及37(甘氨酸→异亮氨酸)。在Integrated DNATechnologies处，以化学方式合成经密码子优化的PPV 27a-ClaI VP2基因且随后克隆至标准克隆质粒pUC57中(PPV27a-ClaI 38320377)。然后由使用BamHI及NotI限制酶进行消解自Integrated DNA Technologies所提供pUC57质粒切除PPV 27a-ClaI基因，且将PPV 27a-ClaI基因亚克隆至杆状病毒转移载体pVL1393(BD Pharmingen,21486P)的各别酶位点中。在DH5(大肠杆菌(Invitrogen^TMMAX Efficiency^TM)中扩增含有PPV 27a-ClaI基因的pVL1393质粒且随后提取，并使用商业质粒纯化试剂盒(QIAprep Spin Miniprep试剂盒，Qiagen)纯化。使用Escort^TM转染试剂(Sigma Aldrich,E9770)将含有PPV 27a-ClaI基因的经纯化pVL1393质粒及线性化杆状病毒/>骨架共转染至Sf9昆虫细胞中以生成重组杆状病毒。实施限制性稀释以获得含有在多角体蛋白启动子控制下的PPV 27a-ClaI VP2基因的经纯化重组杆状病毒储备液。利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来使悬浮昆虫细胞培养物(SF+)制造包括PPV 27a VP2蛋白的重组抗原。对于此产物而言，以间歇模式培养经感染SF+细胞大约7天且然后加以处理以去除细胞碎屑及培养基组分。

实施例2：猪细小病毒(PPV)27a VP2的制造-下游处理

实施两个连续步骤以构成下游处理。在称为“净化”的方法中去除细胞碎屑，而经由两个体积的洗涤磷酸盐缓冲盐水(WPBS)去除培养基组分(称为“渗滤”)。

在生物反应器中制造PPV 27a VP2杆状病毒载体。将培养基以预灭菌或无菌过滤方式添加至生物反应器中。与培养基一起添加源自扩增培养物的SF+细胞。在使用PPV 27aVP2杆状病毒晶种接种时，同时接种细胞(并行感染)。在整个病毒传播中，将温度维持于27±2℃下且监测pH。由吹扫清洁-压缩空气及氧(O₂)来控制溶解氧(DO)。收获窗口出现于病毒感染之后6至8天且达成≤20％细胞存活率的收获准则。在收获时，使用两组过滤器净化PPV 27a VP2抗原流体，预过滤器具有2.0-4.0μm孔径且最终过滤器具有0.1-0.8μm孔径。将所过滤收获流体收集于罐中。

然后使用≥两体积(2×-2.5×)WPBS[使用300,000-500,000千道尔顿(kDa)标称截留分子量(NMWC)空心纤维过滤器]在介于4℃与29℃之间的温度下“渗滤”经净化PPV 27aVP2抗原流体。在渗滤之后，将PPV 27aVP2抗原温度增加至37±2℃。以由添加二乙烯亚胺(BEI)至最终浓度为5mM来达成灭活。在37±2℃下培育抗原且混合72-96小时。使用钠摩尔过量的硫代硫酸盐溶液将残余BEI中和至少30分钟。将PPV 27a VP2抗原流体转移至袋中以储存于4±3℃下直至疫苗掺和为止。

下表1A及1B中的数据展示，在一起混合长达8小时(一个工作日)时，PPV 27a VP2疫苗分别对PRRS EU疫苗及/>PRRSMLV疫苗无杀毒性。

表1A：将两个(2)系列的ReproCyc PRRS(批号为3910003A(10个剂量)及3910004A(50个剂量))在5℃±3℃下储存于包装材料中直至用于研究。使用两个(2)系列的PPV 27a VP2(批号为7600016A(10个剂量)及7600018B(50个剂量))分别作为IngelvacPRRS EU的批次3910003A(10个剂量)及3910004A(50个剂量)的稀释剂。将该两个批次在5℃±3℃下储存于包装材料中直至用于研究。将/>PRRS EU疫苗在重构(在组1中重构于含Carbopol稀释剂中或在组2中重构于液体疫苗PPV 27a VP2中)之后在室温下(15-25℃)储存最长8小时时段且在0、2、4及8小时时测试效价。下表1A中在T0、T2、T4及T8时的组1的病毒滴定结果(Log10TCID₅₀/2mL剂量)显示最长8h时的病毒稳定性。组2的相关产物在T0、T2、T4及T8时的病毒滴定结果(Log₁₀TCID₅₀/2mL剂量)显示，PPV 27a VP2疫苗在最长8h时并无针对/>PPRS EU的杀病毒活性。

表1A

表1B：将两个(2)系列的Ingelvac PRRS MLV(批号为2451189A(10个剂量)及2451188A(50个剂量))在5℃±3℃下储存于包装材料中直至用于研究。使用两个(2)系列的PPV 27a VP2(批号为7600016A(10个剂量)及7600018B(50个剂量))分别作为PRRSMLV的批次2451189A(10个剂量)及2451188A(50个剂量)的稀释剂。将该两个批次在5℃±3℃下储存于包装材料中直至用于研究。将/>PRRS MLV疫苗在重构(在组1中重构于含Carbopol稀释剂中或在组2中重构于液体疫苗PPV 27aVP2中)之后在室温下(15-25℃)储存最长8小时时段且在0、2、4及8小时时测试效价(TCID50/2mL剂量)。下表1B中在T0、T2、T4及T8时的组1的病毒滴定结果(Log10 TCID50/2mL剂量)显示最长8h时的病毒稳定性。组2的相关产物在T0、T2、T4及T8时的病毒滴定结果(Log10TCID50/2mL剂量)显示，PPV 27a VP2疫苗在最长8h时并无针对/>PRRS MLV的杀病毒活性。

表1B

实施例3：在混合PRRSV-EU疫苗与PPV VP2疫苗时的PRRSV-EU疫苗有效性

将三十六(36)头未怀孕、育种年龄的后备母猪随机化至三个治疗组中，每一组包括12头后备母猪。组T01在第0及21天(D0、D21)接受WPBS(洗涤磷酸盐缓冲盐水)的对照产品(对照)。组T02在D0接受PRRS EU(PRRS毒株94881，3.9log10TCID50/剂量)及猪细小病毒疫苗PPV-27a VP2(10μg/剂量)(混合)且在D21仅接受PPV-27a VP2(10μg/剂量)。使用液体PPV-27a VP2重构呈冻干饼形式的/>PRRS EU。组T03在D0接受/>PRRS EU(单独)。调配治疗剂，从而后备母猪接受最小免疫化剂量的/>PRRS EU及最大相对功效的PPV-27a VP2。使用5.5log₁₀TCID₅₀/6mL总剂量(2mL经肌内及每一鼻孔2mL)的异源PRRSV EU分离物190136在初始接种疫苗之后4周(D28)攻击后备母猪，且在下列日期收集血清试样：D31、D35、D38、D42及D49。由定量PCR(qPCR)测试PRRSV病毒血症[SandraRevilla-Fernández等人，Journal of Virological Methods 126(2005)21-30]。攻击病毒欧洲PRRS病毒分离物190136最始系自来自农场的新生仔猪的肺组织获得，该新生仔猪展示在2004年4月爆发于德国Lower Saxony期间的PRRSV的典型生殖体征(经产母猪流产且新生仔猪虚弱)。主治兽医将肺试样呈递至BioScreen(试样于2004年4月21日到达)用于诊断测试。攻击病毒传播于AK-MA104细胞中且在攻击之前传代两次。

在攻击后，两个组(混合及单独)皆展示可有效抵抗毒性PRRSV，其中混合组在D28至D49的定量病毒负荷曲线下面积(AUC)为24.36GE/mL(GE＝基因组等效物)(p＝0.0002)且单独组为32.54GE/mL(p＝0.0045)，相对地，在对照中为50.85GE/mL。此代表混合组的猪中的全身性循环病毒随时间减少大约50％且在PRRS EU单独组中大约减小40％(图1)，从而证实了混合组及单独组的重大保护效应。另外，定量平均PRRSV qPCR分析证实，与对照相比，混合组在D35(p<0.0001)及D38(p＝0.0052)以及单独组在D35(p<0.0001)的PRRSV病毒负荷显著减小，从而证实了混合组及单独组的重大保护效应。qPCR分析展示，与对照相比，混合组(p＝0.0013)及单独组(p＝0.0046)在D35以及混合组在D38(p＝0.0137)的阳性后备母猪比例显著减小。尽管并非统计学显著，但在混合组中于D42及D49观察到平均病毒负荷及PRRSV qPCR阳性比例的数值减小趋势。类似趋势可见于单独组中，其中D49的平均病毒负荷及D42及D49的qPCR阳性比例有所减小。

可证实，使用单独PRRS EU疫苗或在与PPV-27a VP2疫苗混合时皆可有效抵抗毒性PRRSV-EU攻击毒株，从而证实4周免疫性开始。自图1及图2中的数据显而易见，混合/>PRRS EU疫苗与PPV-27a VP2可改良效能。结果展示，混合组中的PRRSV组分与PPV组分之间并无干扰，从而证实可有利地经由混合来联合使用。

实施例4：在混合PRRSV-EU疫苗与PPV VP2疫苗时的PPV VP2疫苗有效性

组合疫苗的有效性评价：针对PPV实验感染来评估联合使用两种疫苗[PRRS EU(PRRS毒株94881)及PPV-27a VP2]的效能。

针对使用PPV野生毒株的实验攻击的效能：基于胎儿的PPV感染来评估组合疫苗针对PPV的效能。若每一治疗组中≥80％的胎儿关于PPV为血清阴性，则疫苗可视为有效。

动物护理：动物处于良好健康中且开始研究之前的营养状态。在纳入及随机化程序之前，实施健康检验。在研究的整个持续时间中使用不含药进食。根据设施标准操作程序，日量适用于针对测试动物的年龄、病状及物种。在整个研究中随意提供水。

在使用异源PPV株攻击之后联合使用PPV及PRRSV疫苗的效能评价：在D0，将5-6个月龄的习用未怀孕后备母猪等分随机化至三个治疗组中。组T01在第0及21天(D0、D21)接受2mL(肌内)对照产品(PBS-Carbopol稀释剂(Impran)。组T02在D0接受2mL(肌内)PRRSEU(PRRS毒株94881)及猪细小病毒疫苗PPV-27a VP2且在D21仅接受PPV-27aVP2。对于组T02而言，使用PPV-27a VP2疫苗溶液重构呈冻干饼形式的/>PRRS EU。组T03在D0及D21接受2mL(肌内)猪细小病毒疫苗PPV-27a VP2(1μg/剂量)。每天观察后备母猪的一般健康状况。在怀孕39天与42天之间使用自BioScreen(Münster,Germany)所获得来自于2004年6月15日干尸化且发送至Leipzig University,Germany的仔猪的组织的异源PPV株401/09(198669)攻击动物(将攻击病毒解冻且稀释于DMEM(1×,Gibco，参考号11966-025，批号1632505)中直至靶剂量为6.0log₁₀TCID₅₀/6-mL剂量)。在怀孕约90天收获胎儿(标准程序)且由PCR(Molitor TW等人，Journal of Virological Methods 1991,32:201-211)自其器官或组织流体试样评估PPV的存在且评估其病状、大小及体重。调配治疗剂，从而后备母猪接受/>PRRS EU(PRRS毒株94881)及猪细小病毒疫苗PPV-27a VP2，其中接受最大/>PRRS EU免疫化剂量(10^7.0TCID₅₀/2-mL剂量；几何平均值)及最小相对功效的猪细小病毒疫苗PPV-27a VP2(1μg/剂量)。

根据Ph.Eur.Monograph 8.0 04/2013:0965，研究系有效的，此乃因该疫苗提供95.7％(T03组)及94.3％(T02组)的保护，而T01组(对照)具有91.4％的阳性胎儿(参见表2)。

可推断出，在交配之前三周完成接种疫苗时，使用PPV疫苗(单独或与PRRS EU混合)接种疫苗较为安全及有效。

表2-每组的阳性胎儿百分比

组	N后备母猪	N胎儿	N阳性胎儿	％PPV阳性胎儿/治疗¹
					T01	19	269	246	91.4
T02	14	176	10	5.7
					T03	19	231	10	4.3

1阳性PPV胎儿数/每组胎儿数。

实施例5：亚单位PPV疫苗的制备

选择将PPV VP2抗原表达于基于German PPV 27a分离物的感染杆状病毒的昆虫细胞中。自基因库登录号AY684871.1获得猪细小病毒(PPV)27aVP2核苷酸序列。反翻译PPV27a VP2编码区且针对果蝇属(SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3)实施密码子优化。在Integrated DNATechnologies处以化学方式合成密码子优化PPV 27a VP2基因。然后将PPV27a基因亚克隆至杆状病毒转移载体pVL1393中，且使用线性化杆状病毒骨架共转染至Sf9昆虫细胞中以生成含有在多角体蛋白启动子的控制下的PPV 27a VP2基因的重组杆状病毒。

在表达于Sf9昆虫细胞中时，PPV VP2自组装成非包膜VLP(数据未展示)。

使用卡波姆(Carbopol)将PPV VP2抗原佐剂化。

实施例6：PPV疫苗的概念验证研究

在所有动物研究中，动物皆处于良好健康中且开始研究之前的营养状态。在随机化程序之前，实施健康检验。在研究的整个持续时间中使用不含药进食。根据设施标准操作程序，日量适用于针对测试动物的年龄、病状及物种。在整个研究中随意提供水。

此接种疫苗-攻击研究的目标在于确立育种前亚单位猪细小病毒(PPV)疫苗的概念验证剂量测定效能(参见实施例5)。对后备母猪接种疫苗且在使用活毒性PPV分离物(PPV002346-5；北美毒株)于大约怀孕40天(dG)时攻击之前进行育种。在大约90dG时评估胎儿的PPV感染。研究设计阐述于表3中。

表3：研究设计

NTX＝未治疗/未攻击对照；IN＝鼻内；IM＝肌内；dG＝怀孕天数。

使用67头源自先前测试为PPV阴性且并无先前生殖疾病或PPV接种疫苗史的畜群的后备母猪。将后备母猪随机化至6个n＝9的治疗组(T)中，混合至3个畜舍中，使其在D0接受接种疫苗且在D21进行加强：T1NC(阴性对照，注射用水)；T2，10μg PPV，T3PC(阳性对照；全灭活猪细小病毒(PPV)、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体(L.icterohaemorrhagiae)及波摩那钩端螺旋体；市面有售；根据制造商手册使用)。包含三头未治疗对照(NTX)后备母猪，每个畜舍一头。在接种疫苗后，使后备母猪同步化(经由施用烯丙孕素(altrenogest)，Intervet Schering-Plough Animal Health；每一标记连续14天，D18至D31)且然后在D35与D42之间育种。67头后备母猪中的54头变得怀孕。在D80(大约40dG)，对NTX后备母猪进行验尸，且以4.25log₁₀TCID₅₀/剂量向剩余后备母猪接种6mLPPV株PPV002346-5(北美毒株)(2mL经肌内且2mL于每一鼻孔经鼻内)。每周对后备母猪放血，在同步化及育种期间(D35-D70)除外。自D0、D7、D14、D21、D28及D73对血清实施血清学研究；自D80、D87、D94、D101、D108、D115、D122及D128针对病毒血症对血清实施血清学及聚合酶链反应(PCR)研究(如Jozwik等人，2009；Journal of General Virology,90,2437-2441中所阐述)。在D129或D130(大约90dG)对后备母猪进行验尸。在验尸时，去除每一生殖道，且记录子宫中的胎儿位置、胎儿状况、大小及体重。收集来自每一胎儿的胸腔洗涤液及肺的试样。自每一胎儿无菌收集胸腔洗涤试样。简言之，使用无菌针及注射器将3ml无菌PBS注射至胸腔中。将流体抽吸回注射器中且注射至适宜大小的适当无菌SST(血清分离管)中。由PCR测试胸腔洗涤液中的PPV的存在且由血球凝集抑制(HI)测试PPV抗体的存在。将肺组织冷冻储存。

后备母猪病毒血症(PPV)

在D0、D73(数据未展示)及D80(表4)攻击之前，所有后备母猪皆为PPV病毒血症阴性。所有阴性对照在D87皆系病毒血性，且4/7在D94系病毒血性。

在接种疫苗后，T3后备母猪在加强接种疫苗后发生血清转化。T2对初始接种疫苗具有血清学反应且在加强接种疫苗之后保持血清阳性。T1对照后备母猪保持血清学PPV阴直至攻击。在攻击后，所有阴性对照后备母猪在D87皆系病毒血性(在攻击之后7天)。一头T3后备母猪在D87系病毒血性。所有其他后备母猪在该等时间点皆非病毒血性(参见表4)。

NTX后备母猪保持血清阴性且其胎儿皆系PPV阴性(由胸腔洗涤试样的PCR)。

表4：在D80于怀孕40天(dG)使用PPV攻击时PPV阳性(PCR)后备母猪的频率分布。

胎儿结果

所有NTX胎儿在D80验尸时皆视为正常(表5)。在D129及D130进行最终验尸时，22.5％的T1(阴性对照)胎儿正常，而98.39％的T3胎儿及97.62％的T2胎儿正常。T1(阴性对照)胎儿的平均大小及体重分别为11.5cm及168.8g，而T2胎儿的平均大小及体重分别为17.5cm及590.1g。

由PCR针对胸腔洗涤试样测得，所有T4(NTX)胎儿皆系PPV阴性(参见表3)。可证实，在67/80的T1阴性对照胎儿中患有PPV感染(83.75％)。67个证实为PPV感染的阴性对照胎儿中的62个为干尸化胎儿。相对地，仅在0.79％的T2胎儿中证实有PPV感染。

由用于确立效能的结论参数(如欧洲药典(European Pharmacopoeia)(monograph01/2008:0965)中所陈述)，所有疫苗(包含阳性对照(全细胞灭活PPV))皆满足抵抗感染的准则(>80％的胎儿为PPV阴性)。

表5：窝仔细节：胎儿的数量、大小、体重及状况及PPV感染的实验室证实(针对胸腔洗涤试样的PCR)。

结论：在毒性异源PPV攻击之后，本发明PPV疫苗展示胎儿保护性。研究结果展示，疫苗在育种前施用时系安全的且可有效地显著减少胎儿的病毒血症及经胎盘感染。另外，已展示，该疫苗可抵抗异源北美PPV攻击毒株。另外，已展示，亚单位PPV VP2蛋白与完整死病毒同等有效。

实施例7：抵抗异源US PPV株的PPV疫苗的最小免疫化剂量的确立

此接种疫苗-攻击研究的目标在于确立猪细小病毒(PPV)疫苗的最小免疫化剂量(MID)。使用活毒性PPV血清型1分离物(PPV 002346-5)在大约怀孕40天(dG)时攻击后备母猪。若接种疫苗组中≥80％的胎儿在攻击之后为PPV阴性，则疫苗可视为有效。支持性参数包含胎儿的大小、体重及状况、后备母猪攻击后病毒血症状态及后备母猪血清学状态。

将后备母猪(无先前生殖疾病或PPV接种疫苗史)随机化至以下治疗组中：T01阴性对照(产品匹配安慰剂(PMP))及T02＝1.0μg PPV/2mL剂量)。将未治疗/未攻击(NTX)后备母猪随机分配至畜舍中作为一般健康状态的对照。

在D0及D21经肌内给予后备母猪2mL适当治疗剂。在接种疫苗后，在D37与D50之间将后备母猪育种，且然后在D74评估怀孕状态。在D81，使用6.77log₁₀TCID₅₀/6mL PPV血清型1经肌内及经鼻内攻击怀孕后备母猪。每周对后备母猪放血，在动情期同步化及育种期间(D36-D73)除外。自D7、D14、D21、D28及D35对血清实施血球凝集抑制(HI)分析；自D-3、D74、D80、D88、D95、D102及D127针对病毒血症对血清实施HI及聚合酶链反应(PCR)研究(参见实施例6)。在D128及D129(大约90dG)将后备母猪验尸。在验尸时，去除每一经产母猪的生殖道，且记录每一子宫中的胎儿位置、胎儿状况、大小及体重。自每一胎儿收集胸腔洗涤试样(参见实施例6)且由PCR测试PPV的存在。

后备母猪病毒血症(PPV)

疫苗可视为安全，此乃因动物在接种疫苗后24小时或48小时并不展示异常体温，不展示可归因于疫苗的异常局部反应且不展示与接种疫苗相关的临床体征(数据未展示)。

在接种疫苗之前、在攻击之前于D74及在D80，所有后备母猪皆系PPV病毒血症阴性。因此，在接种疫苗后，并未观察到与疫苗施用相关的临床体征。在D88，所有10头T01后备母猪皆系病毒血性，且所有接种疫苗的后备母猪皆系阴性。所有治疗组的所有其他血样在D95、D102及D127皆系PPV病毒血症阴性(表6)。

表6：在D81于约怀孕40天(dG)使用PPV攻击时PPV阳性(PCR)后备母猪的频率分布。

*2头后备母猪已诊断为不怀孕且由此自组去除

胎儿结果

在D128及D129进行最终验尸时，38％的T01(阴性对照)胎儿处于正常状况下，而95％的疫苗组胎儿处于正常状况下。T01(阴性对照)胎儿的平均大小及体重分别为14.4cm及245.9g，而接种疫苗的母兽的胎儿的平均大小及体重分别为19.3cm及550g(表7)。因此，疫苗组满足抵抗PPV感染的准则，此乃因由Ph.Eur.01/2008:0965确立的PPV效能结论参数为，治疗组中>80％的胎儿必须为PPV阴性。

在113/146的阴性对照(T01)胎儿(77％)中证实有PPV感染。然而，接种疫苗组(T02)中的PPV感染仅为10％。

表7窝仔细节：胎儿的数量、大小、体重及状况及PPV感染的实验室证实(针对胸腔洗涤试样的PCR)。

结论：本发明的PPV VP2亚单位疫苗展示可在使用毒性异源PPV攻击之后保护胎儿。此研究结果揭示，在使用仅1μg PPV VP2亚单位疫苗时，该疫苗可安全且有效地预防后备母猪的病毒血症及胎儿的PPV感染。另外展示，该疫苗可抵抗异源北美攻击毒株。

实施例8：抵抗异源EU PPV株的PPV疫苗的最小免疫化剂量的确立

此研究的目标在于评估猪细小病毒疫苗(PPV VP2，自此处始称为PPV疫苗)的免疫性开始。另外，使用随机化、盲式、阴性对照的接种疫苗-攻击研究设计来评估安全性及效能。

将后备母猪随机分配至三组中。在组1及2中，使用三周间隔(在D0及D21)对后备母猪接种疫苗两次。在交配之前三周给予第二剂量。由肌内(IM)途径以2mL体积来施用所有治疗剂。组2接受PPV疫苗，而组1系接受无菌稀释剂作为对照产品的安慰剂组且组3用作不进行任何治疗的严格控制。

将后备母猪动情期同步化且在第二接种疫苗之后三周对其人工授精。在怀孕第39天与第42天之间于D84使用毒性、异源PPV株攻击怀孕动物。

在D132-135(约怀孕第90天)，对后备母猪实施安乐死，验尸且评估胎儿。

表8：研究设计

由PCR评估攻击前及攻击后后备母猪的PPV病毒血症：

在接种疫苗之前D-6及D-1，由PCR测得所有动物皆系PPV阴性，从而满足纳入准则。在接种疫苗后，严格对照及对照产品组中的所有动物皆系PPV抗原阴性直至攻击为止，因此，可排除攻击之前的PPV感染。

在攻击后7(D90)、14(D97)及21(D104)天及在验尸的日探究病毒血症。在攻击之后，在接种疫苗的动物中并未检测到病毒血症，病毒血症仅发生于未接种疫苗的对照动物中。

在D90(攻击后7天)，95％的未接种疫苗的对照动物已为PPV阳性。在D97，仍有60％的该等动物具有阳性结果，而在D104所有动物皆测试系PPV阴性。相对地，在接种疫苗的组中，所测试所有动物在第D90、D97或D104天皆系PPV阴性。

表9：在攻击之后患有病毒血症的动物数

胎儿结果

对照组中的PPV感染胎儿的百分比为91.4％，但在PPV组中仅为4.3％(参见表10)。

表10：每组的阳性胎儿百分比及窝仔数

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1每一组的阳性PPV胎儿数/胎儿数。N为总数

胎儿状况的评估

评估所有胎儿的状况且分配为以下三类：正常、干尸化及自溶。

大部分干尸化及自溶胎儿发现于对照组中。仅39.8％的此组胎儿处于正常状况下，而在接种疫苗的组中97.4％(PPV组)的胎儿具有正常病状(参见表11)。

表11：胎儿状况

结论：本发明PPV疫苗展示可在毒性异源PPV攻击之后保护胎儿，从而指示在仅使用1μg疫苗时该疫苗可安全且有效地预防胎儿的病毒血症及PPV感染。另外展示，该疫苗亦可抵抗PPV的异源欧洲攻击毒株。因此，该疫苗具有宽保护范围，此乃因该疫苗可抵抗异源北美以及异源欧洲攻击毒株。

根据本发明，本文所揭示及主张的所有组合物及方法皆可在无需过度实验的情形下进行及执行。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施例予以阐述，但熟习此项技术者应明了，可改变该等组合物及方法及本文所阐述方法的步骤或步骤顺序，此并不背离本发明的概念、精神及范围。更具体而言，应明了，某些在化学及生理上皆相关的试剂可代替本文所阐述试剂且同时可达成相同或类似结果。熟习此项技术者显而易见的所有该等类似替代物及修改皆视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明精神、范围及概念内。

实施例9：PPV亚单位与猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)和/或猪生殖与呼吸道综合征病毒的组合疫苗在育种年龄后备母猪猪细小病毒(PPV)概念验证/疫苗剂量测定

此接种疫苗-攻击研究的目标在于提供关于联合使用PRRSV MLV以及实验亚单位猪细小病毒(PPV)与猪丹毒杆菌(Ery)菌苗的组合疫苗的数据，且在5至6个月龄后备母猪中确立PPV与Ery菌苗的组合疫苗的效能的概念验证剂量测定。

67头后备母猪系源自先前测试为PPV阴性且并无先前PPV疾病或接种疫苗史的畜群。将后备母猪随机化至6个治疗组中(n＝9)，混合至3个畜舍中，使其在D0接受接种疫苗且在D21进行加强：T1，阴性对照；T2，10μg PPV；T3；0.1μg PPV+10log Ery，T4；1.0μg PPV+10log Ery；T5，10μg PPV+10log Ery；T6，阳性对照(GOLD)。包含三头未治疗对照(NTX)后备母猪，每个畜舍一头。另外，将10头后备母猪饲养于单独房屋中，使其接受T710μg PPV+10log Ery(用于再水合/>PRRSV MLV)以评价在与市售猪生殖与呼吸道综合征(PRRS)疫苗组合时的PPV效能。T7系用于此实施例9的所关注组。

向后备母猪接种疫苗且使其交配；67头后备母猪中的54头变得怀孕。在大约怀孕40天(dG)，对NTX后备母猪进行验尸，且以4.25log₁₀TCID₅₀/剂量向剩余后备母猪接种6mLPPV株PPV002346-5(2mL经肌内且经鼻内每一鼻孔2mL)。每周对后备母猪放血，在同步化及育种期间(D35-D70)除外，且如表12中所阐述来测试血清。

表12试样及实验室测试，后备母猪

在D129或D130(约90dG)对后备母猪进行验尸。在验尸时，去除每一生殖道，且记录子宫中的胎儿位置、胎儿状况、大小及体重。收集来自每一胎儿的胸腔洗涤液及肺的试样。由PCR测试胸腔洗涤液中的PPV的存在且由血球凝集抑制(HI)测试PPV抗体的存在。将肺组织冷冻储存。

T7后备母猪对接种疫苗具有血清学反应且攻击后并无病毒血性。在验尸时，97.37％(111/114)的T7胎儿处于正常状况下，且仅一个胎儿测试为PPV阳性。相对地，所有T1后备母猪在接种疫苗期期间皆为血清阴性并发生血清转化，且在攻击后变得具有病毒血性。在验尸时，仅22.50％(18/80)的T1胎儿处于正常状况下，且83.75％(67/80)由胸腔洗涤流体的PCR测试为PPV感染阳性。总而言的，组合疫苗(PPV 10μg+Ery)以及Ingelvac PRRSMLV可有效预防在40dG胎儿的病毒血症及PPV感染。

研究设计：

表13-研究设计

#＝数量；NTX＝未治疗/未攻击对照；IN＝鼻内；IM＝肌内；dG＝怀孕天数

材料：

对照产品：施用阴性对照(T1)动物的对照产品为使用来自纯化水的注射用水(WFI)在BIVI,St.Joseph MO,USA制得的无菌稀释剂(批号240)。以呈递于塑料瓶中的100-mL填充体积来供应对照产品。将2-mL剂量在D0施加于右颈肌且将2-mL加强剂量在D21施加于左颈肌。

疫苗：T7的所关注组合疫苗系实验亚单位PPV组合疫苗，其中使用Ery菌苗作为稀释剂来再水合PRRS MLV。311-171号系列为10μg/剂量PPV与10log/剂量死Ery菌苗的组合的靶，该死Ery菌苗系由实验室科学家提供于含有20mL的塑料瓶中(10个剂量)。使用单瓶311-171号系列再水合单瓶商业系列的/>PRRS MLV(由研究探究者获得，系列号245-B53)。将2-mL剂量在D0施加于右颈肌且将2-mL加强剂量在D21施加于左颈肌。

攻击材料：攻击材料系由BIVI-R&D,Ames IA的实验室科学家在攻击事件之前来制备。PPV株002346-5在5log₁₀TCID₅₀/剂量、6mL剂量(分配批号354-021)下为靶且在攻击事件期间保持于冰上。由TCID₅₀分析针对保持于4℃下的保留攻击后材料来测定攻击效价。攻击材料的最终效价为3.47log/mL或4.25log/6mL剂量。在D80，除在右颈经肌内接种2mL外，经每一鼻孔向所有后备母猪接种2mL攻击材料。

方法：

验尸及胎儿评估：在D79，由静脉内巴比妥酸盐注射对所有NTX后备母猪实施安乐死，且在D129及D130，对所有剩余后备母猪实施安乐死。对于每一验尸而言，去除生殖道，且经由剖腹产无菌递送胎儿。由胎儿ID来标识胎儿，该胎儿ID由后备母猪ID、及之后的字母(R为“右角”或L为左角)、及之后自子宫分支遇到该胎儿时的编号构成。记录胎儿状况(正常或干尸)、大小及体重。

胎儿试样收集：为防止试样的交叉污染，在验尸时及在实验室中，在处置每一胎儿及每一试样期间使用所有适当技术来灭菌或清洗工作区域及器具。使用胎儿ID、试样类型、研究日期及收集日期来标记试样。在收集的日的最早可能时间，将试样于冰上传输至实验室科学家。实验室科学家或设计者使用适当技术处理每一试样以防止交叉污染，而将每一试样等分至适当大小及适当标记的管中。将一种等分试样呈递至ISU-VDL。由PCR量测每一试样中的病毒的存在。将剩余等分试样在BIVI-R&D-Ames储存于-70℃下。

胸腔洗涤液收集：由研究探究者自每一胎儿尽可能无菌地收集胸腔洗涤液。简言之，使用无菌针及注射器将3mL无菌PBS注射至胸腔中。将尽可能多的流体抽吸回注射器中且然后注射至适当大小的SST中。

统计学方法：

实验单元：后备母猪系T1-T6的实验单元。倘若与T7进行对比，则屋子系实验单元，且应理解，T7的房屋应与其他治疗组分开。

动物数量验证：欧洲药典需要攻击至少7头接种疫苗的后备母猪及5头对照后备母猪(EPh 01/2008:0965)。最初将9或10头后备母猪用于每一治疗中以补偿不能怀孕的后备母猪。

随机化：在开始研究之前，向统计学家提供后备母猪ID编号且完全随机地将后备母猪随机化至畜舍及治疗中。将三头后备母猪随机化至NTX组中，将10头后备母猪随机化至T7组中且将剩余后备母猪等量随机化至T1、T2、T3、T4、T5及T6组中。将T1-6后备母猪及NTX后备母猪等分至棚1的三个畜舍中。将T7后备母猪个别地饲养于棚2的圈中。

盲化准则：在整个研究中，任一涉及收集数据或实施实验室分析的人员在蒙面下将后备母猪分配至治疗组T1、T2、T3、T4、T5及T6中。因T7及NTX后备母猪系单独饲养且针对PRRSV抗体来测试血清，故工作人员不能盲化至该两个组中。由不涉及数据收集的个体施用治疗剂。

数据管理：由统计学家实施数据的统计学分析。将所有数据输入SAS 9.2版(Cary,USA/North Carolina,SAS Institute Inc.)中用于管理及分析。

结果：

在此研究汇总中仅呈现阴性对照(T1)与PPV 10μg+10log Ery(用于再水合PRRSV MLV)组(T7)的对比，且呈现T1、T7及NTX组的数据。

后备母猪结果：在D0，由ELISA获知，所有后备母猪对于PRRSV皆系血清学阴性。在D21、D80及D128，所有T7后备母猪皆系PRRSV血清阳性。在D73，所有T7后备母猪皆系血清阳性，且所有其他治疗组中的后备母猪皆系血清阴性。

在D21加强接种疫苗之后，T7的几何平均PPV HI效价变为且保持于血清阳性，而T1及NTX治疗的几何平均PPV HI效价在接种疫苗期期间保持于血清阴性(<100)。在D80之后，在使用PPV攻击T1及T7后备母猪时，两个组皆系血清阳性。

在D0、D73(数据未展示)及D80(0)攻击之前，所有后备母猪对于PPV病毒血症皆系阴性。所有阴性对照在D87皆系病毒血性，且4/7在D94系病毒血性。

表14在D80于怀孕40天(dG)使用PPV攻击时PPV阳性(PCR)后备母猪的频率分布。

胎儿结果：所有NTX胎儿在D80验尸时皆可视为正常([00430])。在D129及D130最终验尸时，22.5％的T1(阴性对照)胎儿正常，而99.12％的T7胎儿正常。T1(阴性对照)胎儿的平均大小及体重分别为11.5cm及168.8g，而T7胎儿的平均大小及体重分别为17.8cm及576.3g。

由PCR针对胸腔洗涤试样测得所有NTX胎儿皆系PPV阴性。在67/80的T1阴性对照胎儿(83.75％)中证实有PPV感染。67个证实为感染PPV的阴性对照胎儿中的62个系干尸胎儿。18个正常表达胎儿皆系来自同一窝，且该18个胎儿中的仅5个证实为PPV阳性。对于T7而言，仅一个猪感染且感染率<1％。

表15窝仔细节：胎儿的数量、大小、体重及状况及PPV感染的实验室证实(针对胸腔洗涤试样的PCR)。

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论述/结论

NTX后备母猪保持血清阴性，且由PCR针对胸腔洗涤试样测得其胎儿皆系PPV阴性。

施用T7(10μg PPV+Ery+PRRSV)的后备母猪对初始接种疫苗具有血清学反应且在加强接种疫苗之后保持血清阳性。并无T7后备母猪在攻击后于每周采样点时具有病毒血性。在验尸时，97.37％(111/114)的T7胎儿处于正常状况下，且由胸腔洗涤流体的PCR仅一个胎儿测试为PPV感染阳性。相对地，施用T1(阴性对照)的后备母猪在接种疫苗期期间系血清阴性，且在攻击后，所有后备母猪皆发生血清转化且变得具有病毒血性。T1胎儿的平均大小及平均体重实质上小于T7的平均值。在验尸时，仅22.50％(18/80)的T1胎儿处于正常状况下，且83.75％(67/80)由胸腔洗涤流体的PCR测试为PPV感染阳性。

总而言的，组合疫苗(10μg PPV+Ery+PRRS MLV)可有效预防40dG胎儿的病毒血症及PPV感染。

序列表

SEQ ID NO:4系密码子优化的PPV 27a VP2核苷酸序列，其经进一步修饰以具有两个ClaI限制酶位点(氨基酸位置25系异亮氨酸残基，氨基酸位置36系丝氨酸残基，氨基酸位置37系异亮氨酸残基)以侧接包括甘氨酸重复的VP2编码区。然而，以不破坏VP2编码区的方式引入ClaI位点。SEQ ID NO:2系对应于SEQ ID NO:4的蛋白质序列。SEQ ID NO:3系密码子优化PPV 27a VP2核苷酸序列(不含ClaI限制酶位点)。SEQ IDNO:1系对应于SEQ ID NO:3的蛋白质序列。SEQ ID NO:5至16揭示具有(SEQ ID NO:5至10)或不具有(SEQ ID NO:11至16)ClaI位点的其他PPVVP2蛋白序列。SEQ ID NO:17对应于PRRSV莱利斯塔德野生型序列且SEQID NO:18对应于PRRSV VR2332野生型序列。

序列表

<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司

<120> 抗猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒的疫苗及其制造方法

<130> 01-3229

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 579

<212> PRT

<213> Porcine parvovirus

<400> 1

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Leu Ser Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

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Gln Thr Glu Phe Gln Tyr Leu Gly Glu Gly Leu Val Arg Ile Thr Ala

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His Ala Ser Arg Leu Ile His Leu Asn Met Pro Glu His Glu Thr Tyr

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Lys Arg Ile His Val Leu Asn Ser Glu Ser Gly Val Ala Gly Gln Met

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100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Ala Asp Trp Gln Leu

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Ile Ser Asn Asn Met Thr Glu Ile Asn Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

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Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Ile Thr Glu Ser Ala Thr Ser Pro

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Pro Thr Lys Ile Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

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Gly Gly Lys Thr Asn Met His Phe Met Asn Thr Leu Asn Thr Tyr Gly

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Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Thr Ala Pro Val Phe Pro Asn Gly Gln

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Ile Trp Asp Lys Glu Leu Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val

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Thr Ala Pro Phe Val Cys Lys Asn Asn Pro Pro Gly Gln Leu Phe Val

485 490 495

Lys Ile Ala Pro Asn Leu Thr Asp Asp Phe Asn Ala Asp Ser Pro Gln

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Gln Pro Arg Ile Ile Thr Tyr Ser Asn Phe Trp Trp Lys Gly Thr Leu

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<212> DNA

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ggcggagtgg gcgtttcgac cggaagcttc aataatcaaa ccgagtttca gtacctgggc 180

gagggtttgg tgcggattac ggctcacgcg tcccgactga tacatctcaa tatgccggag 240

catgagacct acaagcgtat ccatgtcctg aactcggaat cgggcgtcgc cggtcagatg 300

gtccaagatg atgctcatac tcagatggtg acaccctgga gcttgataga tgccaacgca 360

tggggcgtgt ggttcaaccc tgcggattgg cagctgataa gcaataacat gacagaaatc 420

aatttggtta gtttcgagca agagatattt aatgtcgtgc tgaaaaccat cacagagagc 480

gccacgagcc ccccgacgaa gatttacaat aacgacctga cggcgtcctt gatggtcgcc 540

ttggacacaa ataacaccct cccgtacacc cccgcggccc cccgcagcga gaccctgggc 600

ttttatccct ggctgcccac caagccaacg cagtatcgct actacctgag ttgtacacga 660

aatttgaatc cgccgacata cactggtcag tcggagcaga tcacggacag cattcaaacg 720

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cgtacgggag atgagttctc gaccggtatc tatcattttg acacaaaacc cttgaaattg 840

acgcacagtt ggcaaaccaa tcgctcgctg ggcttgcccc caaagttgtt gacggaaccc 900

accaccgagg gtgaccaaca cccaggcact ctccccgcag caaatacccg caagggctat 960

catcaaacga tcaacaatag ctataccgag gctaccgcca ttcggccagc acaggtggga 1020

tacaacacac cttacatgaa ctttgaatac tccaacggcg gcccgttcct gaccccgata 1080

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<213> Porcine parvovirus

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<213> Porcine parvovirus

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<211> 579

<212> PRT

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<400> 16

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<212> DNA

<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

<400> 17

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ctctcggggc gagtgcgccg cctgctgctc ccttgcagcg ggaaggacct cccgagtatt 180

tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240

ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggaacgc cggccaagtc ttttgcacac 300

ggtgtctcag tgcgcggtct cttctctctc cagagcttca ggacactgac ctcggtgcag 360

ttggcttgtt ttacaagcct agggacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc 420

aggtggaatg tactccatcc gggtgctgtt ggctctcagc tgttttccct ttggcgcgta 480

tgacctccgg caatcacaac ttcctccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc 540

gtgacggttg cttggcacct cgacaccttc gtgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600

actggtaccc gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt gtttgcgaac tccatgcacg 660

tatccgacca gccgttccct ggtgccaccc atgtgttgac taactcgcct ttgcctcaac 720

aggcttgtcg gcagccgttc tgtccatttg aggaggctca ttctagcgtg tacaggtgga 780

agaaatttgt ggttttcacg gactcctccc tcaacggtcg atctcgcatg atgtggacgc 840

cggaatccga tgattcagcc gccctggagg tactaccgcc tgagttagaa cgtcaggtcg 900

aaatcctcat tcggagtttt cctgctcatc accctgtcga cctggccgac tgggagctca 960

ctgagtcccc tgagaacggt ttttccttca acacgtctca ttcttgcggt caccttgtcc 1020

agaaccccga cgtgtttgat ggcaagtgct ggctctcctg ctttttgggc cagtcggtcg 1080

aagtgcgctg ccatgaggaa catctagctg acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140

tgcatggtaa gtacctccag cgcaggcttc aagttcgcgg cattcgtgct gtagtcgatc 1200

ctgatggtcc cattcacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga 1260

ctctggatga tgatgtcacc ccaggattcg ttcgcctgac atcccttcgc attgtgccga 1320

acacagagcc taccacttcc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380

ccggcaaacg ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaagtga gaaggattcg gctcccaccc 1440

ccaaggttgc cctgccggtc cccacctgtg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg 1500

ggtcttgtgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca 1560

cgtcccctct gactcagtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620

ttcaggcgat tcaatgtcta cgactgcctg ctaccgtggt tcggaatcgc gcctgtccta 1680

acgccaagta ccttataaaa cttaacggag ttcactggga ggtagaggtg aggtctggaa 1740

tggctcctcg ctccctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggctgtgtcg 1800

caccgcctta tccagcagac gggctaccta aacgtgcact cgaggccttg gcgtctgctt 1860

acagactacc ctccgattgt gttagctctg gtattgctga ctttcttgct aatccacctc 1920

ctcaggaatt ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct 1980

tctctagttt gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag 2040

gggctttcat ctatgctgtt gagaggatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca 2100

tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tccctggacg 2160

agtgtttccc tacggatgtt ttagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa 2220

gttccggcgc tgctgttgtc ctgtgttcac cggatgcaaa agagttcgag gaagcagccc 2280

cggaagaagt tcaagagagt ggccacaagg ccgtccactc tgcactcctt gccgagggtc 2340

ctaacaatga gcaggtacag gtggttgccg gtgagcaact gaagctcggc ggttgtggtt 2400

tggcagtcgg gaatgctcat gaaggtgctc tggtctcagc tggtctaatt aacctggtag 2460

gcgggaattt gtccccctca gaccccatga aagaaaacat gctcaatagc cgggaagacg 2520

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cacccgacaa cccaggttct gatgccggtg ccctccccgt caccgttcga gaatttgtcc 2640

cgacggggcc tatactctgt catgttgagc actgcggcac ggagtcgggc gacagcagtt 2700

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cttggccagt gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgcgagcctg 2820

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cccccccaaa accggttggg ccagtgcttg accagatcgt ccctccgcct acggatatcc 3420

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ttttacttgc tctcttgctc tgtcgttctt acccgatact cggatgcctt cccttattgg 3720

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ttgctgtatt tttattctcg actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt 3840

cgccggagtg tcatgctgag cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc 3900

gcggccttgt ggtcggcccc tcaggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ttactcggtg 3960

ggtcacgtta tctctggcat gttctcctac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt 4020

ctcttgttta tgtggtgtcc caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagga 4080

cagctcctgc ggaggtggct cttaatgtat ttcctttctc gcgcgccacc cgtgtctctc 4140

ttgtatcctt gtgtgatcga ttccaaacgc caaaaggggt tgatcctgtg cacttggcaa 4200

cgggttggcg cgggtgctgg cgtggtgaga gccccatcca tcaaccacac caaaagccca 4260

tagcttatgc caatttggat gaaaagaaaa tgtctgccca aacggtggtt gctgtcccat 4320

acgatcccag tcaggctatc aaatgcctga aagttctgca ggcgggaggg gccatcgtgg 4380

accagcctac acctgaggtc gttcgtgtgt ccgagatccc cttctcagcc ccatttttcc 4440

caaaagttcc agtcaaccca gattgcaggg ttgtggtaga ttcggacact tttgtggctg 4500

cggttcgctg cggttactcg acagcacaac tggttctggg ccggggcaac tttgccaagt 4560

taaatcagac cccccccagg aactctatct ccaccaaaac gactggtggg gcctcttaca 4620

cccttgctgt ggctcaagtg tctgcgtgga ctcttgttca tttcatcctc ggtctttggt 4680

tcacatcacc tcaagtgtgt ggccgaggaa ccgctgaccc atggtgttca aatccttttt 4740

catatcctac ctatggcccc ggagttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg 4800

gggtcaccct gccattgttc tcagccgtgg cacaactctc cggtagagag gtggggattt 4860

ttattttggt gctcgtctcc ttgactgctt tggcccaccg catggctctt aaggcagaca 4920

tgttagtggt cttttcggct ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttaatct 4980

gcttctttcc tatactcttg aagtgggtta cccttcaccc tcttactatg ctttgggtgc 5040

actcattctt ggtgttttgt ctgccagcag ccggcatcct ctcactaggg ataactggcc 5100

ttctttgggc aattggccgc tttacccagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc 5160

accagtacac ctctgggcca cgtggtgcag ctgctgtggc cacagcccca gaaggcactt 5220

atatggccgc cgtccggaga gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg 5280

cagttggatc ccttctcgaa ggtgctttca ggactcataa accctgcctt aacaccgtga 5340

atgttgtagg ctcttccctt ggttccggag gggttttcac cattgatggc agaagaactg 5400

tcgtcactgc tgcccatgtg ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca 5460

accgcatgca cactttcaag accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc 5520

agggcgttgc ccctgtggtc aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa 5580

catcaactgg tgtcgaaccc ggtatcattg gggaagggtt cgccttctgt tttactaact 5640

gcggcgattc ggggtcaccc gtcatctcag aatctggtga tcttattgga atccacaccg 5700

gttcaaacaa acttggttct ggtcttgtga caacccctga aggggagacc tgcaccatca 5760

aagaaaccaa gctctctgac ctttccagac attttgcagg cccaagcgtt cctcttgggg 5820

acattaaatt gagtccggcc atcatccctg atgtaacatc cattccgagt gacttggcat 5880

cgctcctagc ctccgtccct gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg 5940

tctttttcct tctctggcgc atgatgggcc atgcctggac acccattgtt gccgtgggct 6000

tctttttgct gaatgaaatt cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac 6060

tctttgtgct tgcatgggcc accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca 6120

cggcatctct caaccgcaac aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggtgtcgtcg 6180

gtttggcagc tgaaatcggg acttttgctg gcagattgtc tgaattgtct caagctcttt 6240

cgacatactg cttcttacct agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca 6300

ttggtggact ccataccctc ggtgtgattc tgtggttatt caaataccgg tgcctccaca 6360

acatgctggt tggtgatggg agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg 6420

gtaatctcag aaaaggtgtt tcacagtcct gtggcatgaa taacgagtcc ctaacggctg 6480

ctttagcttg caagttgtca caggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca 6540

agtgctttgt atctgcttca aacatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcagcgt 6600

atgccaaggc cctgcgccaa gagttggcct ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag 6660

ttttgtccaa gctcgaggcc tttgctgaaa cagccacccc gtcccttgac ataggtgacg 6720

tgattgttct gcttgggcaa catcctcacg gatccatcct cgatattaat gtggggactg 6780

aaaggaaaac tgtgtccgtg caagagaccc ggagcctagg cggctccaaa ttcagtgttt 6840

gtactgtcgt gtccaacaca cccgtggacg ccttgaccgg catcccactc cagacaccaa 6900

cccctctttt tgagaatggt ccgcgtcatc gcagcgagga agacgatctt aaagtcgaga 6960

ggatgaagaa acactgtgta tccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca 7020

aaatttggga caagtctacc ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tacacccaag 7080

accatgcttt tcaggacagg tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa 7140

ccacccccca acagggattt gatccaaagt ctgaaacccc tgttggcact gttgtgatcg 7200

gcggtattac gtataacagg tatctgatca aaggtaagga ggttctggtc cccaagcctg 7260

acaactgcct tgaagctgcc aagctgtccc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa 7320

cttgcgacct tacagctgcc gaggtggaaa agctaaagcg catcattagt caactccaag 7380

gtttgaccac tgaacaggct ttaaactgtt agccgccagc ggcttgaccc gctgtggccg 7440

cggcggccta gttgtgactg aaacggcggt aaaaattata aaataccaca gcagaacttt 7500

caccttaggc cctttagacc taaaagtcac ttccgaggtg gaggtaaaga aatcaactga 7560

gcagggccac gctgttgtgg caaacttatg ttccggtgtc atcttgatga gacctcaccc 7620

accgtccctt gtcgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acaatacccg gcattcaacc 7680

agggcatggg gccgggaata tgggcgtgga cggttctatt tgggattttg aaaccgcacc 7740

cacaaaggca gaactcgagt tatccaagca aataatccaa gcatgtgaag ttaggcgcgg 7800

ggacgccccg aacctccaac tcccttacaa gctctatcct gttagggggg atcctgagcg 7860

gcataaaggc cgccttatca ataccaggtt tggagattta ccttacaaaa ctcctcaaga 7920

caccaagtcc gcaatccacg cggcttgttg cctgcacccc aacggggccc ccgtgtctga 7980

tggtaaatcc acactaggta ccactcttca acatggtttc gagctttatg tccctactgt 8040

gccctatagt gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccctttta tgtgtactaa 8100

acatggcact tccaaggctg ctgcagagga cctccaaaaa tacgacctat ccacccaagg 8160

atttgtcctg cctggggtcc tacgcctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa 8220

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tggccagagg ttcccaacaa aggacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc 8340

ccgcgctgtc aaggagaatt ggcaaactgt gacaccttgc accctcaaga aacagtactg 8400

ttccaagccc aaaaccagga ccatcctggg caccaacaac tttattgcct tggctcacag 8460

atcggcgctc agtggtgtca cccaggcatt catgaagaag gcttggaagt ccccaattgc 8520

cttggggaaa aacaaattca aggagctgca ttgcactgtc gccggcaggt gtcttgaggc 8580

cgacttggcc tcctgtgacc gcagcacccc cgccattgta agatggtttg ttgccaacct 8640

cctgtatgaa cttgcaggat gtgaagagta cttgcctagc tatgtgctta attgctgcca 8700

tgacctcgtg gcaacacagg atggtgcctt cacaaaacgc ggtggcctgt cgtccgggga 8760

ccccgtcacc agtgtgtcca acaccgtata ttcactggta atttatgccc agcacatggt 8820

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gttcgaggac ctccttgaaa ttcagcctat gttggtatac tctgatgatc ttgtcttgta 8940

cgctgaaaga cccacatttc ccaattacca ctggtgggtc gagcaccttg acctgatgct 9000

gggtttcaga acggacccaa agaaaaccgt cataactgat aaacccagct tcctcggctg 9060

cagaattgag gcagggcgac agctagtccc caatcgcgac cgcatcctgg ctgctcttgc 9120

atatcacatg aaggcgcaga acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg caatcctgat 9180

ggattcatgt gcttgcattg accatgaccc tgagtggtat gaggacctca tctgcggtat 9240

tgcccggtgc gcccgccagg atggttatag cttcccaggt ccggcatttt tcatgtccat 9300

gtgggagaag ctgagaagtc ataatgaagg gaagaaattc cgccactgcg gcatctgcga 9360

cgccaaagcc gactatgcgt ccgcctgtgg gcttgatttg tgtttgttcc attcgcactt 9420

tcatcaacac tgccctgtca ctctgagctg cggtcaccat gccggttcaa aggaatgttc 9480

gcagtgtcag tcacctgttg gggctggcag atcccctctt gatgccgtgc taaaacaaat 9540

tccatacaaa cctcctcgta ctgtcatcat gaaggtgggt aataaaacaa cggccctcga 9600

tccggggagg taccagtccc gtcgaggtct cgttgcagtc aagaggggta ttgcaggcaa 9660

tgaagttgat ctttctgatg gggactacca agtggtgcct cttttgccga cttgcaaaga 9720

cataaacatg gtgaaggtgg cttgcaatgt actactcagc aagttcatag tagggccacc 9780

aggttccgga aagaccacct ggctactgag tcaagtccag gacgatgatg tcatttacac 9840

acccacccat cagactatgt ttgatatagt cagtgctctc aaagtttgca ggtattccat 9900

tccaggagcc tcaggactcc ctttcccacc acctgccagg tccgggccgt gggttaggct 9960

tattgccagc gggcacgtcc ctggccgagt atcatacctc gatgaggctg gatattgtaa 10020

tcatctggac attcttagac tgctttccaa aacacccctt gtgtgtttgg gtgaccttca 10080

gcaacttcac cctgtcggct ttgattccta ctgttatgtg ttcgatcaga tgcctcagaa 10140

gcagctgacc actatttaca gatttggccc taacatctgc gcagccatcc agccttgtta 10200

cagggagaaa cttgaatcta aggctaggaa cactagggtg gtttttacca cccggcctgt 10260

ggcctttggt caggtgctga caccatacca taaagatcgc atcggctctg cgataaccat 10320

agattcatcc cagggggcca cctttgatat tgtgacattg catctaccat cgccaaagtc 10380

cctaaataaa tcccgagcac ttgtagccat cactcgggca agacacgggt tgttcattta 10440

tgaccctcat aaccagctcc aggagttttt caacttaacc cctgagcgca ctgattgtaa 10500

ccttgtgttc agccgtgggg atgagctggt agttctgaat gcggataatg cagtcacaac 10560

tgtagcgaag gcccttgaga caggtccatc tcgatttcga gtatcagacc cgaggtgcaa 10620

gtctctctta gccgcttgtt cggccagtct ggaagggagc tgtatgccac taccgcaagt 10680

ggcacataac ctggggtttt acttttcccc ggacagtcca acatttgcac ctctgccaaa 10740

agagttggcg ccacattggc cagtggttac ccaccagaat aatcgggcgt ggcctgatcg 10800

acttgtcgct agtatgcgcc caattgatgc ccgctacagc aagccaatgg tcggtgcagg 10860

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agccacagat tgtcgggagt atctcgacgc ggctgaggaa gaggcagcaa aagaactccc 11040

ccacgcattc attggcgatg tcaaaggtac cacggttggg gggtgtcatc acattacatc 11100

aaaataccta cctaggtccc tgcctaagga ctctgttgcc gtagttggag taagttcgcc 11160

cggcagggct gctaaagccg tgtgcactct caccgatgtg tacctccccg aactccggcc 11220

atatctgcaa cctgagacgg catcaaaatg ctggaaactc aaattagact tcagggacgt 11280

ccgactaatg gtctggaaag gagccaccgc ctatttccag ttggaagggc ttacatggtc 11340

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tccgtgtata ggaccggcaa cagccaaccg taaggtcgtg cgaaccacag actggcgggc 11460

cgacctggca gtgacaccgt atgattacgg tgcccagaac attttgacaa cagcctggtt 11520

cgaggacctc gggccgcagt ggaagatttt ggggttgcag ccctttaggc gagcatttgg 11580

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cactgactat aactggaact gtgttcgaga acgcccacac gccatctacg ggcgtgctcg 11700

tgaccatacg tatcattttg cccctggcac agaattgcag gtagagctag gtaaaccccg 11760

gctgccgcct gggcaagtgc cgtgaattcg gggtgatgca atggggtcac tgtggagtaa 11820

aatcagccag ctgttcgtgg acgccttcac tgagttcctt gttagtgtgg ttgatattgc 11880

cattttcctt gccatactgt ttgggttcac cgtcgcagga tggttactgg tctttcttct 11940

cagagtggtt tgctccgcgc ttctccgttc gcgctctgcc attcactctc ccgaactatc 12000

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ctcgtcgcat ttaccagacc atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggttg 12180

gtgaggccac tctcacgaag ctgtcagggc tcgatatagt tactcatttc caacacctgg 12240

ccgcagtgga ggcggattct tgccgctttc tcagctcacg actcgtgatg ctaaaaaatc 12300

ttgccgttgg caatgtgagc ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct 12360

tccccacgcc aggtacgagg cccaagttga ccgatttcag acaatggctc atcagtgtgc 12420

acgcttccat tttttcctct gtggcttcat ctgttacctt gttcatagtg ctttggcttc 12480

gaattccagc tctacgctat gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga 12540

gctgaccatc aactacacca tatgcatgcc ctgttctacc agtcaagcgg ctcgccaaag 12600

gctcgagccc ggtcgtaaca tgtggtgcaa aatagggcat gacaggtgtg aggagcgtga 12660

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cgggataggg aatgtgtcgc gcgtcttcgt ggacaagcga caccagttca tttgtgccga 12840

gcatgatgga cacaattcaa ccgtatctac cggacacaac atctccgcat tatatgcggc 12900

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cttttcttcc tggctggtgc tcaacatatc atggtttctg aggcgttcgc ctgtaagccc 13020

tgtttctcga cgcatctatc agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg 13080

gtccttcagg acatcaattg tttccgacct cacggggtct cagcagcgca agagaaaatt 13140

tccttcggaa agtcgtccca atgtcgtgaa gccgtcggta ctccccagta catcacgata 13200

acggctaacg tgaccgacga atcatacttg tacaacgcgg acctgctgat gctttctgcg 13260

tgccttttct acgcctcaga aatgagcgag aaaggcttca aagtcatctt tgggaatgtc 13320

tctggcgttg tttctgcttg tgtcaatttc acagattatg tggcccatgt gacccaacat 13380

acccagcagc atcatctggt aattgatcac attcggttgc tgcatttcct gacaccatct 13440

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gttctcacaa attggggcgt ttcttgactc cgcactcttg cttctggtgg ctttttttgc 13560

tgtgtaccgg cttgtcctgg tcctttgccg atggcaacgg cgacagctcg acataccaat 13620

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ttgttggcgg gcggtacgta ctctgcagcg tctacggcgc ttgtgctttc gcagcgttcg 13860

tatgttttgt catccgtgct gctaaaaatt gcatggcctg ccgctatgcc cgtacccggt 13920

ttaccaactt cattgtggac gaccggggga gagttcatcg atggaagtct ccaatagtgg 13980

tagaaaaatt gggcaaagcc gaagtcgatg gcaacctcgt caccatcaaa catgtcgtcc 14040

tcgaaggggt taaagctcaa cccttgacga ggacttcggc tgagcaatgg gaggcctaga 14100

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cacacctata atgatatacg cccttaaggt gtcacgcggc cgactcctgg ggctgttgca 14220

catcctaata tttctgaact gttcctttac attcggatac atgacatatg tgcattttca 14280

atccaccaac cgtgtcgcac ttaccctggg ggctgttgtc gcccttctgt ggggtgttta 14340

cagcttcaca gagtcatgga agtttatcac ttccagatgc agattgtgtt gccttggccg 14400

gcgatacatt ctggcccctg cccatcacgt agaaagtgct gcaggtctcc attcaatctc 14460

agcgtctggt aaccgagcat acgctgtgag aaagcccgga ctaacatcag tgaacggcac 14520

tctagtacca ggacttcgga gcctcgtgct gggcggcaaa cgagctgtta aacgaggagt 14580

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tgattcgcgt gacttctaca tccgccagtc agggtgcaag ttaatttgac agtcaggtga 15000

atggccgcga ttggcgtgtg gcctctgagt cacctattca attagggcga tcacatgggg 15060

gtcatactta atcaggcagg aaccatgtga ccgaaattaa aaaaaaaaaa a 15111

<210> 18

<211> 15182

<212> DNA

<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

<400> 18

tttctccacc cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc 60

cagggtgttt atggcggagg gccaagtcta ctgcacacga tgcctcagtg cacggtctct 120

ccttcccctg aacctccaag tttctgagct cggggtgcta ggcctattct acaggcccga 180

agagccactc cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg 240

ggcctgctgg ctctctgcaa tctttccaat cgcacgaatg accagtggaa acctgaactt 300

ccaacaaaga atgatacggg tcgcagctga gctttacaga gccggccagc tcacccctgc 360

agtcttgaag gctctacaag tttatgaacg gggttgccgc tggtacccca ttgttggacc 420

tgcccctgga gtggccgttt acgccaattc cctacatgtg agtgataaac ctttcccggg 480

agcaactcac gtgttgacca acctgccgct cccgcagaga cccaagcctg aagacttttg 540

cccctttgag tgtgctatgg ctactgtcta tgacattggt catgacgccg tcatgtatgt 600

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agtggacatg tctaagttcg ccttcacagc ccctgggtgt ggtgtttcta tgcgggttga 780

acgccaacac ggctgccttc ccgctgacac tgtccctgaa ggcaactgct ggtggagctt 840

gtttgactcg cttccactgg aagttcagaa caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg 900

ctaccagacc aagcatggtg tctctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg 960

tctccgagca gtaactgacc taaacggacc tatcgtcgta cagtacttct ccgttaagga 1020

gagttggatc cgccatttga aactggcggg agaacccagc tactctgggt ttgaggacct 1080

cctcagaata agggttgagc ctaacacgtc gccattggct gacaaggaag aaaaaatttt 1140

ccggtttggc agtcacaagt ggtacggcgc tggaaagaga gcaagaaaag cacgctcttg 1200

tgcgactgcc acagtcgctg gccgcgcttt gtccgttcgt gaaacccggc aggccaagga 1260

gcacgaggtt gccggcgcca acaaggctga gcacctcaaa cactactccc cgcctgccga 1320

agggaattgt ggttggcatt gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaaatt 1380

tgaaaccacc cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctactg acgaggatct 1440

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tagcgccaag tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tggcccctgg 1560

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gcctgtcccc gccccgcgca ggaaggttgg gtccgattgt ggcagcccgg tttcattagg 2580

cggcgatgtc tctaacagtt gggaagattt ggctgttagt agcccctttg atctcccgac 2640

cccacctgag ccggcaacac cttcaagtga gctggtgatt gtgtcctcac cgcaatgcat 2700

cttcaggccg gcgacaccct tgagtgagcc ggctccaatt cccgcacctc gcggaactgt 2760

gtctcgaccg gtgacaccct tgagtgagcc gatccctgtg cccgcaccgc ggcgtaagtt 2820

tcagcaggtg aaaagattga gttcggcggc ggcaatccca ccgtaccaga acgagcccct 2880

ggatttgtct gcttcctcac agactgaaca tgaggcctct cccccagcac cgccgcagag 2940

cgggggcgtt ccgggagtag aggggcatga agctgaggaa accctgagtg aaatctcgga 3000

catgtcgggt aacattaaac ctgcgtccgt gtcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag 3060

aatcacacgc ccaaaatact cagctcaagc catcatcgac tcgggcgggc cctgcagtgg 3120

gcatctccaa gaggtaaagg aaacatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac 3180

taagcttgat gaccctgcta cgcaggaatg gctttctcgc atgtgggatc gggtggacat 3240

gctgacttgg cgcaacacgt ctgtttacca ggcgatttgc accttagatg gcaggttaaa 3300

gttcctccca aaaatgatac tcgagacacc gccgccctat ccgtgtgagt ttgtgatgat 3360

gcctcacacg cctgcacctt ccgtaggtgc ggagagcgac cttaccattg gctcagttgc 3420

tactgaagat gttccacgca tcctcgagaa aatagaaaat gtcggcgaga tggccaacca 3480

gggacccttg gccttctccg aggataaacc ggtagatgac caacttgtca acgacccccg 3540

gatatcgtcg cggaggcctg acgagagcac atcagctccg tccgcaggca caggtggcgc 3600

cggctctttt accgatttgc cgccttcaga tggcgcggat acggacgggg gggggccgtt 3660

tcggacggca aaaagaaaag ctgaaaggct ctttgaccaa ctgagccgtc aggtttttga 3720

cctcgtctcc catctccctg ttttcttctc acgccttttc taccctggcg gtggttattc 3780

tccgggtgat tggggttttg cagcttttac tctattgtgc ctctttttat gttacagtta 3840

cccagccttt ggtattgctc ccctcttggg tgtgttttct gggtcttctc ggcgcgttcg 3900

aatgggggtt tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt ctgttcaagc ctgtgtccga 3960

cccagtcggc gctgcttgtg agtttgactc gccagagtgt agaaacatcc ttcattcttt 4020

tgagcttctc aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg tcggtctcgg 4080

tcttgccatt cttggcaggt tactgggcgg ggcacgctgc atctggcact ttttgcttag 4140

gcttggcatt gttgcagact gtatcttggc tggagcttac gtgctttctc aaggtaggtg 4200

taaaaagtgc tggggatctt gtataagaac tgctcctaat gaggtcgctt ttaacgtgtt 4260

tcctttcaca cgtgcgacca ggtcgtcact tatcgacctg tgcgatcggt tttgtgcgcc 4320

aaaaggaatg gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgc gggtgctggg ccggccgaag 4380

ccccattgag caaccctctg aaaaacccat cgcgtttgcc caattggatg aaaagaagat 4440

tacggctagg actgtggtcg cccagcctta tgaccccaac caagccgtaa agtgcttgcg 4500

ggtattgcag gcgggtgggg cgatggtggc taaggcggtc ccaaaagtgg ttaaggtttc 4560

cgctgttcca ttccgagctc ccttctttcc cactggagtg aaagttgacc ctgattgcag 4620

ggtcgtggtt gaccctgaca ctttcactgc agctctccgg tctggctact ccaccacaaa 4680

cctcgtcctt ggtgtagggg actttgccca gctaaatgga ttaaaaatca ggcaaatttc 4740

caagccttca gggggaggcc cacatctcat ggctgccctg catgttgcct gctcgatggc 4800

tctgcacatg cttgctggga tttatgtgac tgcggtgggt tcttgcggca ccggcaccaa 4860

cgacccgtgg tgcgctaacc cgtttgccgt ccctggctac ggacctggct ctctctgtac 4920

gtccagattg tgcatttccc aacacggcct taccctgccc ttgtcagcac ttgtggcggg 4980

attcggtatt caagaaattg ccttggtcgt tttgattttt gtttccatcg gaggcatggc 5040

tcataggttg agctgtaagg ctgacatgct gtgtgttttg cttgcaattg ccagctatgt 5100

ttgggtacct cttacctggt tgctttgtgt gtttccttgc tggttgcgct gtttttcttt 5160

gcaccccctc accatcctat ggttggtgtt tttcttgatt tctgtgaata tgccttcagg 5220

aatcttggcc atggtgttgt tggtttctct ttggcttctt ggtcgttata ctaatgttgc 5280

tggccttgtc accccctacg acattcatca ttacaccagt ggcccccgcg gtgttgccgc 5340

cttggctacc gcaccagatg ggacctactt ggccgctgtc cgccgcgctg cgttgactgg 5400

ccgcaccatg ctgtttaccc cgtcccagct tgggtctctt cttgagggtg ccttcagaac 5460

tcgaaagccc tcactgaaca ccgtcaatgt gatcgggtcc tccatgggct ctggcggggt 5520

gtttaccatc gacgggaaag tcaagtgcgt aactgccgca catgtcctta cgggcaattc 5580

agctcgggtt tccggggtcg gcttcaatca aatgcttgac tttgacgtaa agggagattt 5640

cgctatcgct gattgcccga attggcaagg ggctgccccc aagacccaat tctgcacgga 5700

tggatggact ggccgtgcct attggctaac atcctctggc gtcgaacccg gcgtcattgg 5760

aaaaggattc gccttctgct tcaccgcatg tggcgattcc gggtccccag tgatcaccga 5820

ggccggtgag cttgtcggcg ttcacacggg atcgaataaa caaggggggg gcattgttac 5880

gcgcccctca ggccagtttt gtaatgtggc acccatcaag ctaagcgaat taagtgaatt 5940

ctttgctggg cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtc ggcagccaca taattaaaga 6000

cataagcgag gtgccttcag atctttgtgc cttgcttgct gccaaacctg aactggaagg 6060

aggcctctcc accgtccaac ttctttgtgt gttttttctc ctgtggagaa tgatgggaca 6120

tgcctggacg cccttggttg ctgtgagttt ctttattttg aatgaggttc tccctgccgt 6180

cctggtccgg agtgttttct cctttggaat gtttgtgcta tcctggctca cgccatggtc 6240

tgcgcaagtt ctgatgatca ggcttctgac agcagctctt aacaggaaca gatggtcact 6300

tgcctttttc agcctcggtg cagtgaccgg ttttgtcgca gatcttgcgg ccactcaggg 6360

gcatccgttg caggcagtga tgaatttgag cacctatgca ttcctgcctc ggatgatggt 6420

tgtgacctca ccagtcccag tgatcacgtg tggtgtcgtg cacctacttg ccatcatttt 6480

gtacttgttt aagtaccgtg gcctgcacca tatccttgtt ggcgatggag tgttctctgc 6540

ggctttcttc ttgagatact ttgccgaggg aaagttgagg gaaggggtgt cgcaatcctg 6600

cggaatgaat catgagtctc tgactggtgc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt 6660

ggatttcctt atgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt tctgcgtcca acatgaggaa 6720

tgcagcgggt caatttatcg aggctgccta tgctaaagca cttagagtag aactggccca 6780

gttggtacag gttgataaag ttcgaggtac tttggccaaa cttgaagctt ttgctgatac 6840

cgtggctcct caactctcgc ccggtgacat tgttgtcgct ctcggccaca cgcctgttgg 6900

cagtatcttc gacctaaagg ttggtagcac caagcatacc ctccaagcca ttgagaccag 6960

agtccttgct gggtccaaaa tgaccgtggc gcgcgtcgtc gacccgaccc ccacgccccc 7020

acccgcaccc gtgcccatcc ccctcccacc gaaagttctg gagaatggcc ccaacgcttg 7080

gggggatgag gaccgtttga ataagaagaa gaggcgcagg atggaagccc tcggcatcta 7140

tgttatgggc gggaaaaagt accagaaatt ttgggacaag aattccggtg atgtgtttta 7200

tgaggaggtc cataataaca cagatgagtg ggagtgtctc agagttggcg accctgccga 7260

ctttgaccct gagaagggaa ctctgtgtgg acatgtcacc attgaaaata aggcttacca 7320

tgtttacacc tccccatctg gtaagaagtt cttggtcccc gtcaacccag agaatggaag 7380

agttcaatgg gaagctgcaa agctttccgt ggagcaggcc ctaggtatga tgaatgtcga 7440

cggcgaactg actgccaaag aactggagaa actgaaaaga ataattgaca aactccaggg 7500

cctgactaag gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg acttgacccg ctgtggtcgc 7560

ggcggcttgg ttgttactga aacagcggta aaaatagtca aatttcacaa ccggaccttc 7620

accctgggac ctgtgaattt aaaagtggcc agtgaggttg agctaaaaga cgcggttgag 7680

cacaaccaac acccggttgc gagaccgatc gatggtggag ttgtgctctt gcgttccgcg 7740

gttccttcgc ttatagacgt cttgatctcc ggtgctgatg catctcccaa gttacttgcc 7800

catcacgggc cgggaaacac tgggatcgat ggcacgctct gggattttga gtccgaagcc 7860

actaaagagg aagtcgcact cagtgcgcaa ataatacagg cttgtgacat taggcgcggc 7920

gacgctcctg aaattggtct cccttacaag ctgtaccctg ttaggggtaa ccctgagcgg 7980

gtgaaaggag ttctgcagaa tacaaggttt ggagacatac cttacaaaac ccccagtgac 8040

actggaagcc cagtgcacgc ggctgcctgc cttacgccca acgccactcc ggtgactgat 8100

gggcgctccg tcttggccac gaccatgccc cccgggtttg agttatatgt accgaccata 8160

ccagcgtctg tccttgatta ccttgactct aggcctgact gccctaaaca gctgacagag 8220

cacggctgcg aagatgccgc actgaaagac ctctctaaat atgacttgtc cacccaaggc 8280

tttgttttac ctggagttct tcgccttgtg cggaaatacc tgtttgccca tgtaggtaag 8340

tgcccacccg ttcatcggcc ttctacttac cctgctaaga attctatggc tggaataaat 8400

gggaacaggt tcccaaccaa ggacattcag agcgtccctg aaatcgacgt tctgtgcgca 8460

caggctgtgc gagaaaactg gcaaactgtc accccttgta ctcttaagaa acagtattgc 8520

gggaagaaga agactaggac catactcggc accaataact tcatcgcact agcccaccga 8580

gcagtgttga gtggtgttac ccagggcttc atgaaaaagg cgtttaactc gcccatcgcc 8640

ctcggaaaga acaagtttaa ggagctacag actccggtcc tgggcaggtg ccttgaagct 8700

gatctcgcat cctgcgatcg atccacgcct gcaattgtcc gctggtttgc cgccaacctt 8760

ctttatgaac ttgcctgtgc tgaagagcat ctaccgtcgt acgtgctgaa ctgctgccac 8820

gacttactgg tcacgcagtc cggcgcagtg actaagagag gtggcctgtc gtctggcgac 8880

ccgatcacct ctgtgtctaa caccatttat agtttggtga tctatgcaca gcatatggtg 8940

cttagttact tcaaaagtgg tcacccccat ggccttctgt tcttacaaga ccagctaaag 9000

tttgaggaca tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt cggacgacct cgtgctgtat 9060

gccgagtctc ccaccatgcc aaactatcac tggtgggttg aacatctgaa tttgatgctg 9120

gggtttcaga cggacccaaa gaagacagca ataacagact cgccatcatt tctaggctgt 9180

agaataataa atgggcgcca gctagtcccc aaccgtgaca ggatcctcgc ggccctcgcc 9240

tatcacatga aggcgagtaa tgtttctgaa tactatgcct cagcggctgc aatactcatg 9300

gacagctgtg cttgtttgga gtatgatcct gaatggtttg aagaacttgt agttggaata 9360

gcgcagtgcg cccgcaagga cggctacagt tttcccggca cgccgttctt catgtccatg 9420

tgggaaaaac tcaggtccaa ttatgagggg aagaagtcga gagtgtgcgg gtactgcggg 9480

gccccggccc cgtacgctac tgcctgtggc ctcgacgtct gcatttacca cacccacttc 9540

caccagcatt gtccagtcac aatctggtgt ggccatccag cgggttctgg ttcttgtagt 9600

gagtgcaaat cccctgtagg gaaaggcaca agccctttag acgaggtgct ggaacaagtc 9660

ccgtataagc ccccacggac cgttatcatg catgtggagc agggtctcac cccccttgat 9720

ccaggtagat accaaactcg ccgcggacta gtctctgtca ggcgtggaat taggggaaat 9780

gaagttgaac taccagacgg tgattatgct agcaccgcct tgctccctac ctgcaaagag 9840

atcaacatgg tcgctgtcgc ttccaatgta ctgcgcagca ggttcatcat cggcccaccc 9900

ggtgctggga aaacatactg gctccttcaa caggtccagg atggtgatgt tatttacaca 9960

ccaactcacc agaccatgct tgacatgatt agggctttgg ggacgtgccg gttcaacgtc 10020

ccggcaggca caacgctgca attccccgtc ccctcccgca ccggtccgtg ggttcgcatc 10080

ctagccggcg gttggtgtcc tggcaagaat tccttcctag atgaagcagc gtattgcaat 10140

caccttgatg ttttgaggct tcttagtaaa actaccctca cctgtctagg agacttcaag 10200

caactccacc cagtgggttt tgattctcat tgctatgttt ttgacatcat gcctcaaact 10260

caactgaaga ccatctggag gtttggacag aatatctgtg atgccgttca gccagattac 10320

agggacaaac tcatgtccat ggtcaacaca acccgtgtga cctacgtgga aaaacctgtc 10380

aggtatgggc aggtcctcac cccctaccac agggaccgag aggacgacgc catcactatt 10440

gactccagtc aaggcgccac attcgatgtg gttacattgc atttgcccac taaagattca 10500

ctcaacaggc aaagagccct tgttgccatc accagggcaa gacacgctat ctttgtgtat 10560

gacccacaca ggcagctgca gggcttgttt gatcttcctg caaaaggcac acccgtcaac 10620

ctcgcagtgc accgcgacgg gcagctgatc gtgctggata gaaataacaa agaatgcacg 10680

gtcgctcagg ctctaggcaa cggggataaa tttagggcca cagataagcg tgttgtagat 10740

tctctccgcg ccatttgtgc tgatctagaa gggtcgagct ctccgctccc caaggtcgca 10800

cacaacttgg gattttattt ctcacctgat ttaacacagt ttgctaaact cccagtagaa 10860

cttgcacctc actggcccgt ggtgacaacc cagaacaatg aaaagtggcc agatcggctg 10920

gttgccagcc ttcgccctat ccataaatac agccgcgcgt gcatcggtgc cggctatatg 10980

gtgggccctt cggtgtttct aggcactcct ggggtcgtgt catactatct cacaaaattt 11040

gttaagggcg aggctcaatt gcttccggag acggttttca gcaccggccg aattgaggta 11100

gactgccggg aatatcttga tgatcgggag cgagaagttg ctgcgtccct cccacacgct 11160

ttcattggcg acgtcaaagg cactaccgtt ggaggatgtc atcatgtcac ctccagatac 11220

ctcccacgcg tccttcccaa ggaatcagtt gcggtagtcg gggtttcaag ccccggaaaa 11280

gccgcgaaag cattgtgcac actgacagat gtgtacctcc cagatcttga cgcctatctc 11340

cacccggaga cccagtccaa gtgctggaaa atgatgttgg acttcaaaga agttcgacta 11400

atggtctgga aagacaaaac agcctatttc caacttgaag gtcgctattt cacctggtat 11460

cagcttgcca gctatgcctc gtacatccgt gttcctgtca actctacggt gtacttggac 11520

ccctgcatgg gccccgccct ttgcaacagg agagtcgtcg ggtccaccca ctggggggct 11580

gacctcgcgg tcacccctta tgattacggc gctaaaatta tcctgtctag cgcgtaccat 11640

ggtgaaatgc cccccggata caaaattctg gcgtgcgcgg agttctcgtt ggatgaccca 11700

gttaagtaca aacatacctg ggggtttgaa tcggatacag cgtatctgta tgagttcacc 11760

ggaaacggtg aggactggga ggattacaat gatgcgtttc gtgcgcgcca ggaagggaaa 11820

atttataagg ccactgccac cagcttgaag ttttattttc ccccgggccc tgtcattgaa 11880

ccaactttag gcctgaattg aaatgaaatg gggtccatgc aaagcctttt ttacaaaatt 11940

ggccaacttt ttgtggatgc tttcacggag ttcttggtgt ccattgttga tatcactata 12000

tttttggcca ttttgtttgg cttcaccatc gccggttggc tggtggtctt ttgcatcaga 12060

ttggtttgct ccgcgatact ccgtacgcgc tctgccattc actctgagca attacagaag 12120

atcttatgag gcctttcttt cccagtgcca agtggacatt cccacctggg gaactaaaca 12180

tcctttgggg atgctttggc accataaggt gtcaaccctg attgatgaaa tggtgtcgcg 12240

tcgaatgtac cgcatcatgg aaaaagcagg gcaggctgcc tggaaacagg tggtgagcga 12300

ggctacgctg tctcgcatta gtagtttgga tgtggtggct cattttcagc atctagccgc 12360

cattgaagcc gagacctgta aatatttggc ctcccggctg cccatgctac acaacctgcg 12420

catgacaggt tcaaatgtaa ccatagtgta taatagcact ttgaatcagg tgtttgctat 12480

ttttccaacc cctggttccc ggccaaagct taatgatttt cagcaatggt taatagctgt 12540

acattcctcc atattttcct ctgttgcaac ttcttgtact ctttttgttg tgctgtggtt 12600

gcgggttcca atactacgta ctgcttttgg tttccgctgg ttaggggcaa tttttctttc 12660

gaactcacag tgaattacac ggtgtgtcca ccttgcctca cccggcaagc agccgcagag 12720

atctacgaac ccggtaggtc tctttggtgc aggatagggt atgaccgatg tgaggaggat 12780

gatcatgacg agctagggtt tatggtaccg cctggcctct ccagcgaagg ccacttgact 12840

agtgtttacg cctggttggc gttcttgtcc ttcagctaca cggcccagtt ccatcccgag 12900

atattcggga tagggaatgt gagtcgagtt tatgttgaca tcaaacatca actcatctgc 12960

gccgaacatg acgggcagaa caccaccttg cctcgtcatg acaacatttc agccgtgttt 13020

cagacctatt accaacatca agtcgacggc ggcaattggt ttcacctaga atggcttcgt 13080

cccttctttt cctcgtggtt ggttttaaat gtctcttggt ttctcaggcg ttcgcctgca 13140

aaccatgttt cagttcgagt cttgcagata ttaagaccaa caccaccgca gcggcaagct 13200

ttgctgtcct ccaagacatc agttgcctta ggcatcgcga ctcggcctct gaggcgattc 13260

gcaaaatccc tcagtgccgt acggcgatag ggacacccgt gtatgttacc atcacagcca 13320

atgtgacaga tgagaattat ttacattctt ctgatctcct catgctttct tcttgccttt 13380

tctatgcttc tgagatgagt gaaaagggat ttaaggtggt atttggcaat gtgtcaggca 13440

tcgtggctgt gtgtgtcaat tttaccagct acgtccaaca tgtcaaggag tttacccaac 13500

gctccctggt ggtcgaccat gtgcggttgc tccatttcat gacacctgag accatgaggt 13560

gggcaactgt tttagcctgt ctttttgcca ttctgttggc aatttgaatg tttaagtatg 13620

ttggagaaat gcttgaccgc gggctgttac tcgcaattgc tttctttgtg gtgtatcgtg 13680

ccgttctgtt ttgctgtgct cgtcaacgcc agcaacgaca gcagctccca tctacagctg 13740

atttacaact tgacgctatg tgagctgaat ggcacagatt ggctagctaa caaatttgat 13800

tgggcagtgg agagttttgt catctttccc gttttgactc acattgtctc ctatggtgcc 13860

ctcactacta gccatttcct tgacacagtc gctttagtca ctgtgtctac cgccgggttt 13920

gttcacgggc ggtatgtcct aagtagcatc tacgcggtct gtgccctggc tgcgttgact 13980

tgcttcgtca ttaggtttgc aaagaattgc atgtcctggc gctacgcgtg taccagatat 14040

accaactttc ttctggacac taagggcaga ctctatcgtt ggcggtcgcc tgtcatcata 14100

gagaaaaggg gcaaagttga ggtcgaaggt catctgatcg acctcaaaag agttgtgctt 14160

gatggttccg tggcaacccc tataaccaga gtttcagcgg aacaatgggg tcgtccttag 14220

atgacttctg tcatgatagc acggctccac aaaaggtgct tttggcgttt tctattacct 14280

acacgccagt gatgatatat gccctaaagg tgagtcgcgg ccgactgcta gggcttctgc 14340

accttttgat cttcctgaat tgtgctttca ccttcgggta catgactttc gcgcactttc 14400

agagtacaaa taaggtcgcg ctcactatgg gagcagtagt tgcactcctt tggggggtgt 14460

actcagccat agaaacctgg aaattcatca cctccagatg ccgtttgtgc ttgctaggcc 14520

gcaagtacat tctggcccct gcccaccacg ttgaaagtgc cgcaggcttt catccgattg 14580

cggcaaatga taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca 14640

cattggtgcc cgggttaaaa agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aaacagggag 14700

tggtaaacct tgtcaaatat gccaaataac aacggcaagc agcagaatag aaagaagggg 14760

gatggccagc cagtcaatca gctgtgccag atgctgggta agatcatcgc tcagcaaaac 14820

cagtccagag gcaagggacc gggaaagaaa aataagaaga aaaacccgga gaagccccat 14880

tttcctctag cgactgaaga tgatgtcaga catcacttta cccctagtga gcggcaattg 14940

tgtctgtcgt caatccagac cgcctttaat caaggcgctg ggacttgcac cctgtcagat 15000

tcagggagga taagttacac tgtggagttt agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcctg 15060

attcgcgtca cagcatcacc ctcagcatga tgggctggca ttcttgaggc atctcagtgt 15120

ttgaattgga agaatgtgtg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcctct aagcactata 15180

tt 15182

Claims

1.一种免疫原性组合物或疫苗，其包括a) 至少一种猪细小病毒抗原，其中该至少一种猪细小病毒抗原为猪细小病毒PPV-27a VP2抗原，及b) 至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原，其中该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原为包含在ReproCyc PRRS EU或者Ingelvac PRRS MLV中的猪生殖与呼吸道综合征病毒毒株；其中所述PPV-27a VP2抗原：-在氨基酸位置228具有谷氨酸残基或谷氨酸盐残基， - 在氨基酸位置414具有丝氨酸残基， -在氨基酸位置419具有谷氨酰胺残基， - 在氨基酸位置436具有苏氨酸残基，-在氨基酸位置25具有异亮氨酸残基， -在氨基酸位置36具有丝氨酸残基，和-在氨基酸位置37具有异亮氨酸残基，其中所述氨基酸位置的编号参考如SEQ ID NO:1中所示的猪细小病毒PPV-27aVP2抗原的氨基酸序列。

2.如权利要求1的免疫原性组合物或疫苗，其中该猪细小病毒VP2为唯一猪细小病毒抗原。

3.如权利要求1的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗经调配为用于单一剂量施用或两剂量施用的形式。

4.如权利要求1的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗进一步包括至少一种医药上可接受的载剂。

5.如权利要求4的免疫原性组合物或疫苗，其中该医药上可接受的载剂为卡波姆。

6. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括0.1 μg 至50 μg的猪细小病毒VP2抗原。

7. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括0.5 μg至10 μg的猪细小病毒VP2抗原。

8. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括1.0 μg至10 μg的猪细小病毒VP2抗原。

9. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括3.9至7.0 log10TCID50的猪生殖与呼吸道综合征病毒。

10. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括0.1 μg 至50 μg的猪细小病毒VP2抗原和3.9至7.0 log10TCID50的猪生殖与呼吸道综合征病毒。

11. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括0.5 μg至10 μg的猪细小病毒VP2抗原和3.9至7.0 log10TCID50的猪生殖与呼吸道综合征病毒。

12. 如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗包括1.0 μg至10 μg的猪细小病毒VP2抗原和3.9至7.0 log10TCID50的猪生殖与呼吸道综合征病毒。

13.如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原一起含于单一容器中或在空间上彼此分开。

14.如权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原含于两个或更多个单独容器中。

15.一种试剂盒，其包括如权利要求1至14中任一项的免疫原性组合物或疫苗。

16.如权利要求15的试剂盒，其中该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原彼此分开地含于两个或更多个单独容器中，且其中该试剂盒进一步包括用于混合在空间上分开的至少一种猪细小病毒抗原及至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原的说明书手册。

17.如权利要求16的试剂盒，其中该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原彼此独立地呈冻干或冷冻形式。

18.如权利要求16的试剂盒，其中该说明书手册含有组合含有该至少一种猪细小病毒抗原的容器的内容物与含有该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原的容器的内容物的指导。

19.如权利要求16的试剂盒，其中使用含有该至少一种猪细小病毒抗原的容器的液体内容物作为含有该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原的容器的冻干内容物的稀释剂。

20.如权利要求15至19中任一项的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括治疗和/或预防猪细小病毒感染和/或猪生殖与呼吸道综合征病毒感染的指导。

21.如权利要求20的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括联合使用含于该试剂盒中如权利要求1至14中任一项的免疫原性组合物或疫苗的猪细小病毒组分及猪生殖与呼吸道综合征病毒组分的指导。

22.一种如权利要求1至14中任一项的免疫原性组合物或疫苗在制备在个体中治疗和/或预防猪细小病毒和/或猪生殖与呼吸道综合征病毒感染的试剂盒中的用途。

23.一种如权利要求1至14中任一项的免疫原性组合物或疫苗在制备在个体中减少、预防或治疗由猪细小病毒和/或猪生殖与呼吸道综合征病毒感染引起的临床体征的试剂盒中的用途。

24.一种如权利要求1至14中任一项的免疫原性组合物或疫苗在制备在个体中治疗和/或预防由猪细小病毒和/或猪生殖与呼吸道综合征病毒感染引起的疾病的试剂盒中的用途。

25.如权利要求22至24中任一项的用途，其中所述个体被同时地施用该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原。

26.如权利要求22至24中任一项的用途，其中所述个体被在相同或不同施用位点施用该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原。

27.如权利要求22至24中任一项的用途，其中所述个体被依序地施用该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原。

28.如权利要求22至24中任一项的用途，其中所述个体被以时间顺序交错方式施用该至少一种猪细小病毒抗原及该至少一种猪生殖与呼吸道综合征病毒抗原。