KR102117811B1 - 재조합 돼지파보바이러스 항원 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

재조합 돼지파보바이러스 항원 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포, 상기 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포로부터 수득한 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 포함하는 돼지파보바이러스에 대한 백신 조성물 및 돼지파보바이러스 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포를 이용할 경우, 돼지파보바이러스 항원 단백질을 고효율로 생산할 수 있으며 상기 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포를 이용한 돼지파보바이러스 항원 단백질 생산 방법은 다른 항원 생산 방법에 비해 우수한 안전성 및 안정성을 나타낸다. 본 발명의 돼지파보바이러스 진단용 조성물은 재조합 항원 단백질을 이용하기 때문에 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성이 없어 안전하고, 대량의 시료로부터 신속하게 돼지파보바이러스 감염 여부를 진단할 수 있다.

Description

재조합 돼지파보바이러스 항원 단백질 및 이의 용도{Recombinant Porcine Parvovirus VP2 Antigenic Protein and Uses Thereof}
본 발명은 재조합 돼지파보바이러스 항원 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
돼지파보바이러스(Porcine parvovirus, PPV)는 외피(non-enveloped)가 없고, 단일 가닥(single-stranded)이며, 약 5 kb 크기의 작은 DNA를 가진 바이러스로 돼지에서 번식장애를 일으키는 원인체 중 하나이다. 1965년 독일에서 처음으로 분리된 이후 현재까지도 유럽과 아시아를 비롯하여 전 세계에 걸쳐 유행하고 있다. PPV 혈청형 1형이 주로 번식장애와 연관되어 있으며, 대표적인 임상증상으로는 SMEDI 증후군이라 불리는 사산(stillbirth), 태아 미라화(mummification), 배아 사멸(embryonic death) 그리고 불임(infertility)이 있다. 또한 번식 장애 외에도 피부질환, 설사 그리고 호흡기 장애를 일으키기 때문에 양돈산업에 있어 많은 경제적 손실을 주고 있다.
돼지파보바이러스 감염증은 모돈에서 번식장애를 일으키기 때문에 전 세계적으로 많은 문제가 되고 있음에도 불구하고 여전히 근절되지 않고 있다. 따라서 양돈농가의 생산성 손실을 최소화하고 임신 모돈의 분만율을 높이기 위해서는 우수한 효능과 유효성이 개선된 새로운 백신의 필요성이 요구되고 있다.
현재 사용되고 있는 돼지파보바이러스 감염증 진단법으로는 중화시험(Virus Neutralization Test, VNT), 효소면역법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 혈구응집억제반응법(HI) 등이 있다. 현재 시도 가축 방역사업의 가축 혈청검사 및 병성감정을 위해 공급되는 진단액으로 HAI(Hemagglutination Inhibition) 진단액이 공급되고 있다. HAI 진단법은 동물(guinea pig)의 혈구를 이용하여야 하므로 사용이 번거롭고, 혈구 채취를 위해 동물을 항시 사육해야 하는 어려움이 있다. 중화시험법은 clean bench에서 돼지파보바이러스를 배양해야 하며, 결과를 얻기까지 3-4일 소요되는 문제점이 있다.
본 발명자들은 항원 단백질로써 우수한 항원성 및 면역원성을 갖는 재조합 돼지파보바이러스 항원 단백질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지파보바이러스 VP2 유전자의 코돈(codon)을 최적화(optimization)하여 합성하고 이를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포로부터 수득한 돼지파보바이러스 VP2 항원 단백질이 높은 안정성 및 면역원성을 갖는다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 돼지파보바이러스 VP2 단백질 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 발현하는 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지파보바이러스 백신용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지파보바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지파보바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지파보바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 돼지파보바이러스(porcine parvovirus)의 VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명자들은 항원 단백질로써 우수한 항원성 및 면역원성을 갖는 재조합 돼지파보바이러스 항원 단백질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지파보바이러스 VP2 유전자의 코돈(codon)을 최적화(optimization)하여 합성하고 이를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포로부터 수득한 돼지파보바이러스 VP2 항원 단백질이 높은 안정성 및 면역원성을 갖는다는 것을 규명하였다.
상기 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가질 수 있다.
상기 서열번호 3의 염기서열은 돼지파보바이러스 82 VP2 유전자의 코돈(codon)을 식물체 발현을 위해 최적화(optimization)한 서열이다.
상기 서열번호 4의 염기서열은 돼지파보바이러스 07 VP2 유전자의 코돈(codon)을 식물체 발현을 위해 최적화(optimization)한 서열이다.
상기 "기능적으로 동등한"이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 발현하는 재조합 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 니코티아나(Nicotiana) 속 식물일 수 있다.
상기 니코티아나(Nicotiana) 속 식물은 니코티아나 아쿠미나타(Nicotiana acuminata), 니코티아나 아프리카나(Nicotiana africana), 니코티아나 알라타(Nicotiana alata), 니코티아나 아테누아타(Nicotiana attenuata), 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana), 니코티아나 클레베란디(Nicotiana clevelandii), 니코티아나 이그지구아(Nicotiana exigua), 니코티아나 글라우카(Nicotiana glauca), 니코티아나 글루티노사(Nicotiana glutinosa L.), 니코티아나 랑스도르피(Nicotiana langsdorffii), 니코티아나 롱기플로라(Nicotiana longiflora), 니코티아나 옥시덴탈리스(Nicotiana occidentalis), 니코티아나 옵투시폴리아(Nicotiana obtusifolia), 니코티아나 오토포라(Nicotiana otophora), 니코티아나 플럼바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia), 니코티아나 쿠아드리발비스(Nicotiana quadrivalvis), 니코티아나 루스티카(Nicotiana rustica L.), 니코티아나 수아베올렌스(Nicotiana suaveolens Lehm.), 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum L.) 또는 니코티아나 토멘토시포르미스(Nicotiana tomentosiformis Goodsp.) 일 수 있고, 예를 들어, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 일 수 있다.
본 발명에 따른 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물체는, 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 발현할 수 있다. 상기 형질전환된 식물체를 이용할 경우, 식물체 재배가 가능한 일반 실험실에서 손쉽게 대량의 단백질을 제조할 수 있으며, 수득된 돼지파보바이러스 VP2 단백질은 기니피그 적혈구에 대한 혈구 응집능과 같은 돼지파보바이러스 항원 단백질 고유의 생물학적 기능을 가지고 있으며, 감염성을 지니고 있는 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성 없이 안전하고, 종래 항원 제조 과정에 비하여 매우 신속하고 정확하게 항원을 대량생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 식물체로부터 수득한 돼지파보바이러스 VP2 항원 단백질은 돼지파보바이러스를 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 발현하는 재조합 곤충 세포를 제공한다.
상기 곤충 세포는 담배거세미나방종의 도둑나방(Spodoptera frugiperda)에서 유래한 Sf9 세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터에 포함되는 돼지파보바이러스 VP2 유전자는 식물체 발현에 최적화된 서열로 구성되나, 상기 재조합 발현 벡터으로 형질전환된 재조합 곤충 세포에서도 돼지파보바이러스 VP2 단백질이 효과적으로 발현된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 곤충 세포로부터 수득한 돼지파보바이러스 VP2 항원 단백질은 돼지파보바이러스를 진단하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포가 발현하는 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 포함하는 돼지파보바이러스 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 돼지파보바이러스의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.
상기 진단 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 진단 키트는 돼지파보바이러스 VP2 항원 단백질뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포가 발현하는 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 항원으로 이용하여, 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 돼지파보바이러스 VP2 단백질에 대한 항체를 검출하는 돼지파보바이러스의 진단 방법을 제공한다.
상기 항원-항체 반응은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 모두 이용할 수 있으며, 예를 들어 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있다.
상기 시료는 돼지파보바이러스에 감염된 것으로 예상되거나 감염된 세포, 혈액, 소변, 타액, 조직 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 돼지파보바이러스(porcine parvovirus) VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포가 발현하는, 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 포함하는, 돼지파보바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 '백신 조성물'은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 대상(subject)에게 세포성 면역 반응, 예를 들어 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다.
상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.
본 발명인 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종, 에어로졸 분무, 경구 또는 비강내 용도일 수 있다. 음용수 또는 식용 펠렛으로 투여하는 것도 가능하다.
본 발명의 백신 조성물은 이종 항원 및 사이토카인과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수도 있으며, 면역증강제와 함께 투여할 수 있다. 본 명세서의 용어, "면역증강제(adjuvant)"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질(예컨대, alum, 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, LPS, poly IC, poly AU 등)을 의미한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포, 상기 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포로부터 수득한 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 포함하는 돼지파보바이러스에 대한 백신 조성물 및 돼지파보바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포를 이용할 경우, 돼지파보바이러스 항원 단백질을 고효율로 생산할 수 있으며 상기 재조합 식물체 또는 재조합 곤충 세포를 이용한 돼지파보바이러스 항원 단백질 생산 방법은 다른 항원 생산 방법에 비해 우수한 안전성 및 안정성을 나타낸다.
(c) 본 발명의 돼지파보바이러스 진단용 조성물은 재조합 항원 단백질을 이용하기 때문에 살아있는 바이러스 취급에 따른 오염 가능성이 없어 안전하고, 대량의 시료로부터 신속하게 돼지파보바이러스 감염 여부를 진단할 수 있다.
도 1은 돼지파보바이러스 계통(strain)별 VP2 단백질의 서열을 나타낸다.
도 2a는 PPV 82-opt VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 구조에 대한 모식도이다.
도 2b는 PPV 07-opt VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 구조에 대한 모식도이다.
도 3a는 식물체에서 발현된 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 식물체에서 발현된 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 곤충 세포에서 발현된 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 식물체에서 발현한 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질의 면역원성을 돼지에서 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 식물체에서 발현한 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질의 면역원성 평가에 사용된 96 플레이트를 나타낸 도이다.
도 6a는 식물체 및 곤충세포에서 발현한 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질에 대하여 기니피그에서 면역원성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 식물체 및 곤충세포에서 발현한 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 면역원성 평가에 사용된 96 플레이트를 나타낸 도이다.
도 7a는 식물체에서 발현한 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질의 기니피그 적혈구 응집능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 식물체에서 발현한 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 기니피그 적혈구 응집능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 재조합 돼지파보바이러스(PPV) VP2(PPV 82-opt, PPV 07-opt) 항원 식물 발현 벡터 제작
항원성이 가장 높은 VP2를 타겟팅 하기 위해 돼지 유사산태아의 시료에서 얻어낸 PPV VP2 DNA 서열을 사용했으며 Genescript 코돈 최적화(optimization) 프로그램을 통해 Nicotiana benthamiana에 맞게 최적화 하여 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 최적화된 PPV 82-opt VP2의 뉴클리오티드 서열은 1740 bp이고, PPV 07-opt VP2는 1737 bp로 구성된다.
1-1. 재조합 PPV 82-opt VP2 발현 벡터
PPV VP2 항원의 식물 발현을 위해 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 루비스코(RuBisCO) 트렌짓 펩타이드(transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1), 6개의 연속된 히스티딘(Histidin)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2) 및 PPV 82 VP2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3)를 순서대로 연결하여 재조합 PPV 82-opt VP2 식물 발현 벡터를 제작하였다(도 2a).
1-2. 재조합 PPV 07-opt VP2 발현 벡터
PPV VP2 항원의 식물 발현을 위해 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 루비스코(RuBisCO) 트렌짓 펩타이드(transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1), 6개의 연속된 히스티딘(Histidin)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2) 및 PPV 07 VP2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4)를 순서대로 연결하여 재조합 PPV 07-opt VP2 식물 발현 벡터를 제작하였다(도 2b).
실시예 2. 식물체에서 재조합 PPV VP2(PPV 82-opt, PPV 07-opt) 단백질의 발현
식물에서 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질 또는 PPV 07-opt VP2를 발현시키기 위해 상기의 실시예 1에서 준비한 재조합 발현 벡터는 제조사의 지시에 따라 Gene plusure XCell(Bio-Rad, USA)을 사용하여 전기 천공을 통해 아그로박테리아 균주 GV3101로 형질전환되었다. 형질전환된 GV3101을 안정기(stationary phase)에 도달할 때까지 적절한 항생제를 함유하는 YEP 배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 성장시켰다. 배양물을 원심 분리하고, 침전물을 침윤 배지(10 mM Mes, 10 mM MgCl2, 100 mM 아세토시린곤)에 0.5의 OD 600으로 재현탁시킨 후 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 25℃ 조건 하에서 4-6 주령으로 자란 니코티아나 벤타미아나 잎에 아그로박테리아 현탁액을 주사기 또는 진공 침투시키는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
실시예 3. 식물체에서 재조합 PPV VP2(PPV 82-opt, PPV 07-opt) 단백질 발현 확인
약 3 cm2의 잎 조직을 100 μl의 분쇄 완충액(20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0.1 % SDS, 5 mM DTT 및 식물 프로 테아제 억제제 칵테일 [Sigma-Aldrich])을 이용하여 분쇄하고, 불용성 잔해를 4℃에서 10분 동안 20,000 x g에서 원심분리하였다. 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하고, PVDF 멤브레인(Millipore Merck KGaA of Darmstadt, Germany)으로 옮겼다. 그 다음 단클론 His 항체(1:1,000 dilution, Invitrogen)와 반응시켜 Chemiluminescent Substrate로 검출하였다. 그 결과, 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질(도 3a) 및 재조합 PPV 07-opt VP2(도 3b)의 발현이 확인되었다.
실시예 3. 재조합 PPV 07-opt VP2 항원 곤충세포 발현 벡터 제작
PPV 07-opt VP2 서열을 증폭하여, pDrive vector에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. Baculovirus 재조합 발현을 위하여 pFastBacTM HT B vector(Invitrogen社)를 이용하여 클로닝을 수행하였다.
실시예 4. 곤충세포에서 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 발현 및 확인
곤충에서 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질을 발현시키기 위해 제조사의 지시에 따라 재조합 발현 벡터를 42℃ heat shock을 통해 DH10Bac으로 형질전환하였다. 형질전환된 DH10Bac을 S.O.C 배지에서 37℃ 4시간 동안 배양시켰다. 1/10 희석하여 LB 배지에 Gentamycin(7 ug/ml) 항생제를 첨가하여 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 10개의 colony를 10개의 plate에 옮긴 후, pUC/M13 primer로 PCR을 이용하여 재조합 PPV 07-opt VP2 서열을 확인하였다. Cellfectin II reagent(Invitrogen社) 이용하여 SF-9 세포에 transfection 하였다.
27℃에서 transfection하고, 5일 후에 세포를 수확하여 4℃에서 30분간 단백질을 추출하였다. 재조합 PPV VP2 단백질의 N-말단에 히스티딘이 결합되어 있어 VP2 단백질 정제를 위해 NI-NTA 레진을 이용하여 단백질을 분리하였다.
PVDF 멤브레인으로 정제한 단백질을 트랜스퍼한 다음, 5% BSA로 멤브레인을 블로킹하였다. 1차 항체 mouse-His(1:1,000)로 상온에서 1시간 반응시키고 TBST로 5회 세척한 다음, 2차 항체 mouse-HRP(1:5,000)로 상온에서 1시간 반응시키고 TBST로 5회 세척한 다음, ECL(Enhanced chemiluminescence)과 반응시켜 단백질 발현을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 재조합 PPV VP2 단백질의 면역원성 평가
4-1. 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질 면역원성 평가
식물체에서 발현시킨 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질을 25,000 HA unit으로 100-110일령 돼지에 1차 접종하고, 2주 후에 2차 접종한 다음, 2주 후에 채혈하여 HI titer를 측정하였다. 그 결과, 평균 27의 항체가를 확인하였다(도 5a 및 도 5b).
4-2. 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질 면역원성 평가
곤충 세포에서 발현시킨 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질과 식물 발현 시스템을 이용하여 발현시킨 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질을 각각 500 HA unit으로 기니피그에 1차 접종하고, 2주 후에 2차 접종한 다음, 2주 후에 채혈하여 HI titer를 측정하였다. 그 결과, 식물체에서 발현한 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질은 210의 평균 항체가를 나타냈고, 곤충세포에서 발현한 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질은 211의 평균 항체가를 나타냈다(도 6a 및 도 6b).
실시예 5. 혈구응집반응(HA)
5-1. 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질의 혈구 응집능
PPV는 기니피그 적혈구에 응집하는 특징을 나타내며, Senda et al. (1986) 논문을 참고하여 혈구응집반응을 실시하였다. 96웰 U 플레이트에 니코티아나 벤타미아나에서 발현된 PPV 82 VP2 단백질을 2배 희석한 뒤, 0.6% 기니피그 적혈구와 혼합하고 37℃에 1시간 동안 반응시킨 후 결과를 해석하였다.
재조합 PPV 82-opt VP2 단백질은 기니피그 혈구 응집능 211 HA unit(8 g/식물)을 나타냈으며, 이를 통해 식물에서 발현한 재조합 PPV 82-opt VP2 단백질의 항원성을 확인하였다(도 7a).
5-2. 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 혈구 응집능
PPV는 기니피그 적혈구에 응집하는 특징을 나타내며, Senda et al. (1986) 논문을 참고하여 혈구응집반응을 실시하였다. 96웰 U 플레이트에 니코티아나 벤타미아나에서 발현된 PPV 07-opt VP2 단백질을 2배 희석한 뒤, 0.6% 기니피그 적혈구와 혼합하고 37℃에 1시간 동안 반응시킨 후 결과를 해석하였다.
재조합 PPV 07-opt VP2 단백질은 기니피그 혈구 응집능 25 HA unit(8 g/식물)을 나타냈으며, 이를 통해 식물에서 발현한 재조합 PPV 07-opt VP2 단백질의 항원성을 확인하였다(도 7b).
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) BioApplications Inc. <120> Recombinant Porcine Parvovirus VP2 Antigenic Protein and Uses Thereof <130> PN180300 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Rubisco transit peptide <400> 1 atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60 gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120 aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180 ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac c 231 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of 6XHis <400> 2 caccaccatc accaccat 18 <210> 3 <211> 1740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPV 82 VP2 Nicotiana Benthamiana optimized sequence <400> 3 atgagcgaga atgttgaaca acacaacccc ataaacgccg ggacagaact ctcagctacc 60 gggaacgaaa gcgggggcgg tggcggaggg ggtggcggga ggggtgccgg aggggtgggc 120 gtgtcaacgg gtagtttcaa 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Claims (9)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 루비스코 트렌짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 6개의 연속된 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 돼지파보바이러스(porcine parvovirus, PPV) VP2 단백질을 코딩하는 유전자를 일련의 순서로 포함하는 재조합 발현 벡터.
  2. 제 1 항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 돼지파보바이러스(porcine parvovirus) VP2 단백질을 발현하는 재조합 니코티아나 벤타미아나.
  3. 제 1 항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 돼지파보바이러스(porcine parvovirus) VP2 단백질을 발현하는 재조합 SF-9 세포.
  4. 제 2 항의 재조합 니코티아나 벤타미아나 또는 제 3 항의 재조합 SF-9 세포가 발현하는, 돼지파보바이러스(porcine parvovirus) VP2 단백질을 포함하는, 돼지파보바이러스 백신용 조성물.
  5. 제 2 항의 재조합 니코티아나 벤타미아나 또는 제 3 항의 재조합 SF-9 세포가 발현하는, 돼지파보바이러스(porcine parvovirus) VP2 단백질을 포함하는, 돼지파보바이러스 진단용 조성물.
  6. 제 2 항의 재조합 니코티아나 벤타미아나 또는 제 3 항의 재조합 SF-9 세포가 발현하는, 돼지파보바이러스(porcine parvovirus) VP2 단백질을 포함하는, 돼지파보바이러스 진단용 키트.
  7. 제 2 항의 재조합 니코티아나 벤타미아나 또는 제 3 항의 재조합 SF-9 세포가 발현하는, 돼지파보바이러스 VP2 단백질을 항원으로 이용하여, 시료 내에서 항원-항체 반응을 통해 돼지파보바이러스의 VP2 항체를 검출하는 돼지파보바이러스 진단 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질 칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것인, 돼지파보바이러스 진단 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 시료는 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 돼지파보바이러스 진단 방법.
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