CN111349621A

CN111349621A - 一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用

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Publication number: CN111349621A
Application number: CN202010171954.4A
Authority: CN
Inventors: 郭伟伟; 李金积; 王宗升; 陈俭梅; 向银辉; 刘大卫
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2040-03-12
Also published as: CN111349621B

Abstract

本发明提供一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用，所提供的重组杆状病毒，其中包含有编码新城疫病毒HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8。本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备新城疫病毒的病毒样颗粒；本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗。本发明通过对新城疫病毒HN、F蛋白的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cDNA序列。再对HN和F蛋白进行优化改造后，利用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统制备病毒样颗粒，病毒蛋白产量显著高于SPF胚培养的病毒，生产成本明显降低。

Description

一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用

技术领域

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease vlrus,NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。自1926年首发于印度尼西亚和英国新城以来，在近90多年的历史中，新城疫在全世界曾发生过多次大流行。新城疫给我国的养禽业带来了巨大的经济损失，严重威胁我国养禽业的发展，故新城疫的防治十分重要。

新城疫病毒属于副粘病毒科，副粘病毒属，核酸为单链RNA。由螺旋形对称盘绕的核衣壳和囊膜组成。囊膜表面有放射状排列的纤突，含有刺激宿主产生血凝抑制和病毒中和抗体的抗原成分；其中F 蛋白、HN糖蛋白是新城疫病毒的主要宿主免疫保护性抗原。目前， F蛋白、HN糖蛋白已成为研制新城疫病毒亚单位疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗及新城疫病毒载体疫苗的热点，并且已在多种系统中得到表达。

杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。

AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约 130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点 (Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiroet al.,2001)。

在我国主要以疫苗接种来防控该病的蔓延，传统疫苗使用完整的病原体作为制苗用抗原，存在一定的安全风险。且全病毒的使用会对病毒造成选择压力，加速病毒的变异。与传统疫苗相比，将NDV基因组中一个或多个保护性抗原在原核或真核细胞中表达从而制备成亚单位疫苗更具有安全性能高、稳定性好、易于批量生产及生产成本低等优点。

发明内容

本发明提供一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用，使用重组杆状病毒制备的病毒样颗粒可用来制备疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码新城疫病毒 HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；

所述的核苷酸片段，其一种具体序列为SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；

本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备新城疫病毒的病毒样颗粒；

本发明再一个方面提供一种新城疫病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。

所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9；

本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；

本发明还提供一种新城疫病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明制备的病毒样颗粒。

本发明通过对新城疫病毒HN、F蛋白的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的 cDNA序列。再对HN和F蛋白进行优化改造后，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备病毒样颗粒(VLPS)，病毒蛋白产量显著高于 SPF胚培养的病毒，生产成本明显降低。

具体实施方式

本发明构建的用于表达抗原蛋白的重组杆状病毒，在昆虫细胞中能成功地表达出可溶性的HN、F蛋白，两个蛋白在体内自动组装成病毒样颗粒(VLPS)。VLP在空间构象上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高，可以减少新城疫全病毒疫苗免疫对病毒变异带来的压力，减少病毒的变异。因此，利用基因工程手段研制NDV-HN-F疫苗是NDV新型疫苗研究的热点和方向。

利用本发明的可以生产出NDV-HN-F(VLP)亚单位疫苗，具有商业使用价值。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1、新城疫病毒HN蛋白、F蛋白

2018年申请人从山东某养鸡场的鸡群中分离出一株新城疫病毒。将病料按1:5(w/v)比例加入到含双抗的生理盐水中，研磨制成悬液， 1000r/min离心5分钟，取上清尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，36℃～37℃孵化3～4日，每日照胚2次，取24小时后死亡的鸡胚，置2～8℃冷却8～16小时，收获鸡胚液，进行HA及HI 试验。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株是新城疫病毒，无细菌、支原体及外源病毒污染；纯化后的病毒株命名为YBF1907。

对筛选鉴定的YBF1907株的HN、F基因进行了序列分析，其中 HN基因全长1716bp(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)，编码572个氨基酸(氨基酸序列为SEQ ID NO:2)；F基因全长1662bp(氨基酸序列为 SEQ ID NO:3)，编码554个氨基酸(氨基酸序列为SEQ ID NO:4)。将其与GenBank中收录的HN、F基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，发现YBF1907株HN氨基酸与GenBank中同源性最近的AGL09067.1相比，第46位(Y变K)、第111位(S变R)、第142位(V变S)、第182位(T变P)、第310位(G变F)、第328位(T变S)、第443位(M变T)、第563位(V变G)发生了变异，同源性为98.6％；F氨基酸与GenBank中同源性最近的QCX35354.1相比，第22位(T变P)、第80位(P变V)、第 150位(S变T)、第151位(I变S)、168位(V变G)、190位(F变T)、519位(L变G)、520位(A变V)，同源性约98.3％。抗原蛋白分析结果表明筛选病毒的HN、F蛋白与已报道的新城疫病毒的HN、F基因存在着氨基酸差异，这将导致目前的疫苗无法预防新流行毒株，研究新流行毒株的亚单位疫苗迫在眉睫。

实施例2：表达HN和F基因的重组杆状病毒的构建

1、HN和F基因的剪切、优化

将HN基因的N端结构域前的45个氨基酸的跨膜区剪切掉；将 N端加上起始密码子ATG；同时根据昆虫细胞的偏爱性对密码子进行优化，其优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。将F基因N端前142氨基酸剪切掉，加上起始密码子ATG； C端的53个氨基酸剪切的跨膜区剪掉，同时进行密码子的优化，其优化后的核苷酸序列为SEQID NO:7，氨基酸序列为SEQ ID NO:8。进行剪切、优化的序列以及未经剪切优化的序列均由上海生物工程有限公司进行合成，并连入克隆载体。

2、HN阳性质粒的构建

2.1酶切反应

2.1.1标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：

2.1.2将步骤2.1.1中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。

2.1.3双酶切产物胶回收

取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer50℃水浴放置 5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL 平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2连接反应

(1)标记需要用到的0.2mL离心管。

(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

2.3转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。

(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴 2min。

(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入 600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。

(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB抗性平板。

(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600 μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。

(7)观察记录转化结果。

2.4质粒抽提与PCR鉴定

2.4.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的 LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(2)吸取菌液至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体。

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10 次混匀。室温静置2-4min。

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10 次混匀。室温静置2-4min。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm， 30s，倒掉收集管中液体。重复一次。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30 μlElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4 ℃保存管中DNA溶液。

2.4.2 PCR鉴定

(1)标记好需要用到的PCR管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μL：

(2)PCR扩增程序：

(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.5 HN-F阳性质粒的构建

将测序正确的pfastbacdual-HN阳性质粒和合成的puc57-F质粒进行酶切(SmaI/XhoI)、连接、转化，方法同上，将PCR鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.6转化

将测序正确的阳性的质粒pfastbacdual-HN-F转化DH10bac感受态细胞，方法同2.3.

2.7挑取杆粒与PCR鉴定

2.7.1挑取杆粒

(1)从2.4转化的平板中，用10μL移液枪头从转化平板中挑取白色单克隆菌落至5ml含卡那霉素抗性、四环素抗性、庆大霉素抗性的 LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

2.7.2 PCR鉴定

(2)PCR扩增程序：

(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒用于sf9细胞转染。

实施例3 SF9细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；TNM-FH培养液置于27 ℃水浴锅预热至27℃。

(2)将2μg实施例2制备的重组DNA加入到100μl无血清和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将9μl Cellfectin Reagent加入到100 μl无血清和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将脂质体与重组DNA 混合，室温静止40min。

(3)从27℃培养箱中取出6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的TNM-FH培养液洗细胞三次，并弃去TNM-FH培养液。

(4)每个细胞孔加入2ml 10％胎牛血清的TNM-FH培养液。

(5)将重组DNA与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6h。

(6)将孔中的液体弃掉，加入2ml完全TNM-FH培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静止培养5～6天。

(7)待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，标记为P1 代重组杆状病毒，命名为NDV-VLP-P1。

(8)用NDV-VLP-P1感染新培养的Sf9细胞，提高重组杆状病毒含量，反复接种2代后，收取细胞上清液，4℃或-80℃保存备用。

实施例4蛋白纯化与检测

4.1重组HN-F蛋白在昆虫细胞Sf9内的表达与鉴定

将重组杆状病毒NDV-HN-F-P1感染昆虫细胞Sf9，27℃培养72h，同时以未感染病毒的正常昆虫细胞Sf9 27℃培养48h作为对照，收获细胞，将培养上清冻存备用。细胞用pH7.4的PBS洗涤后，加入1 ×SDS-PAGE加样缓冲液[50mM Tris-HCl(pH6.8)，100mMDithiothreitol(DTT),2％SDS,0.05％Bromophemol blue,10％ Glycerol]，煮沸5min，用12％分离胶、5％浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100伏约2.5h，考马斯亮蓝R250染色，观察重组杆状病毒感染的昆虫细胞Sf9裂解物中是否出现新城疫病毒HN、F蛋白的特异性条带。结果序列未经优化的杆粒没有任何外源条带的表达，而序列优化的杆粒均有外源目的条带的表达。

4.2HN血凝检测将重组杆状病毒NDV-HN-F接种昆虫细胞 Sf9，27℃培养72小时后，离心收集细胞沉淀，细胞沉淀中加入适量生理盐水，重悬细胞沉淀，经超声波裂解细胞，以1000r/min 4℃离心10min，收集上清液，进行HA检测。结果显示HA>13log2，而分离的全病毒HA只有7log2.

4.3Western blot将获得的全病毒和4.2获得的重组HN-F蛋白病毒样颗粒进行SDS-PAGE，将蛋白条带转移到PVDF膜，采用半干法20伏转印30min，转印膜用封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶ 500稀释的新城疫病毒阳性血清37℃作用1.5h，PBST洗3次，用1∶ 2000稀释的HRP标记的羊抗鸡酶标抗体37℃作用1.5h，PBST洗涤 3次，底物溶液作用5min，在chemiDOC进行显色。结果全病毒条带很弱，而优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7的基因在昆虫细胞Sf9内表达的蛋白条带很亮，说明表达的HN、F蛋白免疫原性好。

实施例5透射电镜观察

将筛选的新城疫病毒YBF1907接种SPF鸡胚，72小时后收取尿囊液，进行100倍浓缩。将浓缩的全病毒液和NDV-HN-F的P3代表达产物同时进行负染后电镜观察。结果NDV-HN-F组装成很多病毒样颗粒，大小为120nm，而浓缩100倍的全病毒液只有微量的颗粒。

实施例6疫苗的制备及效果检测

1、疫苗的制备

1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持 30min，冷却后备用。

2)水相制备：将实施例4的4.2步骤表达的蛋白病毒样颗粒与无菌生理盐水适当比例混合，使每0.2ml水相中含蛋白含量不低于 10μg/ml(HA≥7log2)。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80 完全溶解。

3)乳化取油相1.5份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取 10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2、疫苗的效力检验

2.1血清学方法:用21～35日龄SPF鸡25只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗20μl，10只免疫市场疫苗，另5只作对照。接种后 21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用重组新城疫病毒A-Ⅶ株和YBF1907株抗原进行HI抗体效价测定。对照组鸡血清HI抗体效价均应不高于1︰4，结果见表1。

2.2免疫攻毒法用21～35日龄SPF鸡25只，10只颈部皮下注射亚单位疫苗20μl，10只颈部皮下注射市场全病毒疫苗，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射新城疫病毒JS02/06株强毒0.5ml (含10^5.0ELD50)，连续观察14日。攻毒后5日，对照鸡全部发病死亡；采集免疫组泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中，只要有 1枚鸡胚液的凝集价不低于1︰16，即可判为病毒分离阳性，对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。攻毒后14日，对所有存活鸡进行剖检，观察是否出现新城疫的临床症状和剖检病变。结果见表1。

表1疫苗效力检验结果

注：1、抗体为该组鸡的几何平均抗体值。

结果表明本发明制备的疫苗免疫25日龄SPF鸡后，21日采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。全病毒免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:548.7(微量法)，亚单位疫苗组HI 抗体效价的几何平均值为1:724.1(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:2(微量法)。说明重组HN-F蛋白病毒样颗粒稀释2⁶倍后，免疫效果比市场上全病毒疫苗效果好。

每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF1907株毒液，每只0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10日龄SPF 鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，盲传一次后再进行判定。结果表明：全病毒疫苗组9只鸡病毒分离为阴性；重组HN-F蛋白病毒样颗粒免疫组10只鸡病毒分离均为阴性，而对照组5只鸡病毒分离均为阳性。

上述结果表明本发明制备的亚单位疫苗的效果优于全病毒疫苗，该病毒样颗粒制备的疫苗能很好地预防NDV的感染，且亚单位疫苗产生的抗体滴度明显高于全病毒疫苗，所以具有良好的应用前景。而且，相比于市售的其它新城疫NDV病毒疫苗，本发明所提供的亚单位疫苗对YBF1907株毒液的免疫效果最好，表明本发明亚单位疫苗产生的抗体对发生变异的新城疫病毒株具有更好的中和效果。

综上，本发明将未优化的HN-F蛋白以及优化的HN-F蛋白同时构建用于表达抗原蛋白的杆粒载体，结果未经优化的全长HN-F基因不能在昆虫细胞中表达，而优化的HN-F蛋白在昆虫细胞中成功地表达出可溶性的重组蛋白。将浓缩100倍的YBF1907毒株、表达的HN-F上清同时进行电镜观察，结果浓缩100倍的全病毒只有少量的VLP，而未经稀释表达的HN和F蛋白在体内自动组装成病毒样颗粒 (VLPS)，且病毒粒子量很多。VLP在空间构想上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于 VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高。

序列信息如下：

SEQ ID NO:1

ATGGACCGCGCGGTTAACAGAGTCGTGCTGGAGAATGAGGAAAGAGAAGC AAAGAACACATGGCGCCTAGTTTTCCGGATCGCAGTCTTACTTTTAATGGTA ATGACTCTAGCTATCTCCGCGGCTGCCCTGGCAAAGAGCATGGGGGCCAGT ACGCCGCACGACCTCGCAGGCATATCGACTGTGATCTCCAAGACAGAAGA CAAGGTTACGTCTTTACTCAGTTCAAGTCAAGATGTGATAGATAGGATATAC AAGCAGGTAGCTCTTGAATCCCCGCTGGCACTACTAAACACCGAATCTATA ATTATGAATGCAATAACCTCTCTTAGGTATCAAATTAACGGGGCTGAGAACA ATAGCGGATGTGGTGCGCCTGTTCATGACCCAGATTATATCGGGGGGATAGG CAAAGAACTCATATCCGACGACATCAGTGATGTCACATCATTTTATCCTTCT GCATATCAAGAACACTTGAATTTCATCCCGGCGCCTACTACAGGATCCGGTTGCACTCGGATACCCTCATTTGACATGAGCCCTACCCATTATTGTTATACTCAC AATGTGATACTATCTGGTTGCAGAGATCACTCACACTCACATCAATACTTAG CACTTGGTGTGCTTCGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTTCTACTCT GCGCTCCATCAATTTAGATGACACCCAAAATCGGAAGTCCTGCAGTGTGAG TGCAACCCCTTTAGGTTGTGATATGCTGTGCTCTAAGGTCACAGGGACTGA AGAGGAGGATTACAAGTCAGTTGCCCCCACATCAATGGTGCACGGAAGGC TAGGGTTTGACGGTCAATACCATGAGAAGGACTTAGACACCACGGTCTTAT TTAAGGATTGGGTGGCAAATTACCCGGGAGTGGGAGGAGGGTCTTTTATTG ACTTTCGTGTATGGTTCCCAGTTTACGGAGGGCTCAAACCCAATTCACCCA GTGACTCTGCACAAGAAGGGAAATATGTAATATACAAGCGTCATAACAACA CATGCCCCGATGAACAAGATTACCAAATTCGGATGGCTAAGTCCTCATATAA ACCCGGGCGATTTGGTGGAAAGCGCGTACAGCAAGCCATCTTATCCATCAA AGTGTCAACATCCCTGGGTAAGGACCCGGTGCTGACTATTCCACCTAATAC AATCACACTCATGGGAGCTGAAGGCAGAATCCTCACAGTAGGGACATCTCA CTTCTTGTACCAACGAGGGTCTTCATATTTCTCCCCTGCCTTATTGTATCCCA TGACAGTAAATAACAAAACGGCTACACTCCATAGTCCTTACACCTTTAATGC TTTCACTCGGCCAGGTAGTGTCCCTTGCCAGGCATCAGCAAGATGCCCCAA CTCATGCATTACTGGGGTCTATACCGATCCATATCCCTTAATCTTCCATAGGA ATCATACTCTACGAGGGGTCTTCGGGACGATGCTTGATGATGAACAAGCGA GGCTTAACCCCGTATCTGCAGTATTTGACAACATATCTCGCAGTCGTGTCAC CCGGGTGAGTTCAAGCAGCACCAAGGCAGCATACACGACATCGACATGTT TTAAAGTTGTCAAGACCAATAAAGCTTATTGTCTTAGTATCGCAGAAATATC CAATACCCTATTCGGGGAATTTAGGATCGTTCCCTTACTAGGTGAGATCCTCAAGGATGATAGAGTTTAA

SEQ ID NO:2

MDRAVNRVVLENEEREAKNTWRLVFRIAVLLLMVMTLAISAAALAKSMGAS TPHDLAGISTVISKTEDKVTSLLSSSQDVIDRIYKQVALESPLALLNTESIIMNAI TSLRYQINGAENNSGCGAPVHDPDYIGGIGKELISDDISDVTSFYPSAYQEHLN FIPAPTTGSGCTRIPSFDMSPTHYCYTHNVILSGCRDHSHSHQYLALGVLRTSA TGRVFFSTLRSINLDDTQNRKSCSVSATPLGCDMLCSKVTGTEEEDYKSVAPTS MVHGRLGFDGQYHEKDLDTTVLFKDWVANYPGVGGGSFIDFRVWFPVYGG LKPNSPSDSAQEGKYVIYKRHNNTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRVQQ AILSIKVSTSLGKDPVLTIPPNTITLMGAEGRILTVGTSHFLYQRGSSYFSPALLY PMTVNNKTATLHSPYTFNAFTRPGSVPCQASARCPNSCITGVYTDPYPLIFHRN HTLRGVFGTMLDDEQARLNPVSAVFDNISRSRVTRVSSSSTKAAYTTSTCFKV VKTNKAYCLSIAEISNTLFGEFRIVPLLGEILKDDRV

SEQ ID NO:3

ATGGGCTCCAAACCTTCTACCAGGATCCCAGCACCTCTAATGCTGATCACTC GGATTATGCTGCCTTTGAGCTGTATCCGTCTGACAAGCTCTCTTGACGGCAG GCCCCTTGCAGCTGCAGGAATTGTAGTAACAGGAGATAAGGCAGTCAATGT ATACACCTCGTCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCCGAATATG CCCAGAGATAAGGAGGCATGTGCAAAAGCCGTGTTGGAGGCATATAACAG AACACTGACTACTCTGCTCACTCCTCTTGGCGACTCCATCCGCAAGATCCA AGGGTCTGTGTCCACGTCCGGAGGAAGGAGACAAAAACGCTTTATAGGTG CTGTTATTGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCAACAGCGGCACAGATAACAG CAGCTGCGGCCCTAATACAAGCCAAACAGAATGCCGCCACCTCCCTCCGGC TTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAAGCTGTGCATGAAGGTACCGAC GGATTATCACAACTATCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTCAAT GACCAGACCAATAATACGGCGCGAGAATTGGACTGTATAAAAATCACACAA CAGGTCGGTGTAGAACTCAACCTATACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAGATCACCTCCCCTGCATTAACTCAGCTGACCATCCAGGCACTTT ATAATTTAGCTGGTGGCAATATGGATTACTTATTAACTAAGTTAGGTATAGGA AACAATCAACTCAGCTCATTAATTGGTAGCGGCCTGATCACTGGTTACCCTA TACTGTATGACTCACATACTCAACTCTTGGGCATACAAGTAAATCTGCCCTC AGTCGGGAACTTAAATAATATGCGTGCCACCTATTTGGAGACCTTATCTGTA AGTACAACCAAAGGATATGCCTCAGCACTTGTCCCGAAAGTAGTGACACA AGTCGGTTCTGTGATAGAAGAGCTTGACACCTCATACTGTATAGAGTCCGAT CTGGATTTATATTGTACTAGAATAGTGACATTCCCCATGTCCCCAGGTATTTA TTCCTGTTTGAGCGGCAACACATCAGCTTGCATGTATTCAAAGACTGAAGG CGCACTCACTACGCCGTATATGGCCCTTAGAGGCTCAGTTATTGCCAATTGT AAGATAACAACATGCAGATGTACAGACCCTCCTGGTATCATATCGCAAAATT ACGGAGAAGCTGTATCCCTGATAGATAGACATTCATGCAATGTCTTATCATT AGACGGAATAACTCTGAGGCTCAGTGGGGAATTTGATGCAACTTATCAAAAGAACATCTCAATATTAGATTCTCAAGTCATCGTGACAGGCAATCTTGATATAT CAACTGAACTTGGAAACGTCAACAATTCAATCAGCAATGCCTTGGATAGGT TGGCAGAAAGCAACAGCAAGCTAGAAAAAGTCAATGTCAGACTAACTAGC ACATCTGCTCTCATTACCTATATTGTTCTAACTGTCATTTCCCTAATTTTCGGT GCACTTAGTGGGGTTTTAGCGTGTTACCTGATGTACAAACAGAAGGCACAA CAGAAGACCTTGCTATGGCTTGGGAATAATACCCTCGATCAGATGAGAGCC ACCACAAGAGCATGA

SEQ ID NO:4

MGSKPSTRIPAPLMLITRIMLPLSCIRLTSSLDGRPLAAAGIVVTGDKAVNVYTS SQTGSIIVKLLPNMPRDKEACAKAVLEAYNRTLTTLLTPLGDSIRKIQGSVSTSG GRRQKRFIGAVIGSVALGVATAAQITAAAALIQAKQNAATSLRLKESIAATNEA VHEGTDGLSQLSVAVGKMQQFVNDQTNNTARELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGGNMDYLLTKLGIGNNQLSSLIGSGLITG YPILYDSHTQLLGIQVNLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGYASALVPKVVT QVGSVIEELDTSYCIESDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGA LTTPYMALRGSVIANCKITTCRCTDPPGIISQNYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGIT LRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDRLAESNSKL EKVNVRLTSTSALITYIVLTVISLIFGALSGVLACYLMYKQKAQQKTLLWLGN NTLDQMRATTRA#

SEQ ID NO:5

GAATTCATGAAGAGCATGGGCGCAAGTACACCTCACGATCTGGCTGGAATA TCGACTGTGATCAGTAAAACTGAAGATAAGGTTACTTCCCTTTTGTCGAGTT CCCAGGACGTCATAGATAGAATATATAAACAGGTAGCATTGGAGTCGCCTCT CGCACTTCTGAACACCGAGTCGATTATAATGAACGCAATAACAAGCCTCCG TTATCAAATTAACGGCGCCGAGAACAATAGCGGATGCGGCGCTCCAGTACA TGACCCTGATTATATCGGAGGCATCGGTAAAGAACTTATCTCAGATGACATT TCTGACGTTACCTCCTTTTATCCTAGCGCTTACCAGGAGCATCTTAATTTCAT TCCTGCACCTACAACGGGTTCGGGCTGCACGCGCATACCATCCTTTGATATG TCTCCCACTCACTACTGTTATACGCATAACGTGATACTCAGTGGCTGTAGGG ATCATTCTCATTCCCACCAGTACCTGGCGCTTGGCGTCCTGCGCACTTCGGC CACTGGAAGAGTTTTTTTCTCGACCCTGAGGAGTATCAACCTTGATGATACT CAGAATAGGAAGAGTTGCTCAGTCTCGGCGACTCCACTGGGATGTGACATG CTGTGTTCTAAAGTTACGGGAACGGAGGAGGAAGACTATAAATCAGTTGCA CCGACATCGATGGTCCATGGTCGCCTTGGCTTTGATGGACAATACCATGAA AAAGACCTCGATACAACAGTGCTCTTCAAAGATTGGGTCGCTAATTATCCC GGAGTAGGCGGCGGCTCCTTCATTGATTTCCGCGTCTGGTTTCCGGTCTATG GTGGCCTGAAGCCCAACTCGCCCTCCGACAGCGCTCAAGAGGGAAAATAC GTGATCTACAAGCGTCACAATAATACGTGCCCAGACGAACAGGATTATCAG ATACGCATGGCCAAATCGTCTTACAAGCCGGGTAGATTCGGTGGCAAACGT GTCCAACAGGCGATACTCTCTATCAAGGTAAGCACCTCTCTGGGCAAGGAC CCCGTTCTTACCATTCCTCCGAATACGATCACGCTCATGGGTGCTGAAGGA AGAATCCTTACTGTGGGAACTTCTCACTTCCTCTATCAGAGAGGATCTTCGT ATTTCAGTCCTGCGCTCCTCTATCCTATGACAGTTAATAATAAGACAGCAAC ACTGCACAGTCCCTATACATTTAACGCTTTTACGAGACCAGGTTCGGTACCA TGCCAAGCAAGTGCGAGATGTCCGAATTCGTGTATCACAGGTGTCTACACC GATCCTTACCCTCTCATCTTCCACCGCAATCATACTTTGCGCGGCGTATTTGG AACGATGCTTGACGATGAGCAAGCTAGACTTAACCCAGTGAGTGCCGTTTT TGATAATATTAGTAGGTCCCGCGTTACGAGAGTCTCGTCTTCCAGCACAAAG GCAGCCTACACTACTTCGACTTGCTTCAAAGTCGTAAAAACTAACAAGGCG TATTGCCTCTCCATAGCGGAAATTTCGAATACCCTGTTCGGAGAATTCAGGA TCGTGCCTCTGCTCGGAGAGATTCTCAAAGATGATCGTGTCTAAGTCGAC

SEQ ID NO:6

MKSMGASTPHDLAGISTVISKTEDKVTSLLSSSQDVIDRIYKQVALESPLALLN TESIIMNAITSLRYQINGAENNSGCGAPVHDPDYIGGIGKELISDDISDVTSFYP SAYQEHLNFIPAPTTGSGCTRIPSFDMSPTHYCYTHNVILSGCRDHSHSHQYLA LGVLRTSATGRVFFSTLRSINLDDTQNRKSCSVSATPLGCDMLCSKVTGTEEEDYKSVAPTSMVHGRLGFDGQYHEKDLDTTVLFKDWVANYPGVGGGSFIDFRV WFPVYGGLKPNSPSDSAQEGKYVIYKRHNNTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRF GGKRVQQAILSIKVSTSLGKDPVLTIPPNTITLMGAEGRILTVGTSHFLYQRGSS YFSPALLYPMTVNNKTATLHSPYTFNAFTRPGSVPCQASARCPNSCITGVYTDP YPLIFHRNHTLRGVFGTMLDDEQARLNPVSAVFDNISRSRVTRVSSSSTKAAYT TSTCFKVVKTNKAYCLSIAEISNTLFGEFRIVPLLGEILKDDRV

SEQ ID NO:7

CCCGGGATGCAAGCAAAACAAAATGCCGCAACCTCGTTGCGCCTTAAAGA GAGTATCGCAGCAACGAATGAGGCAGTTCACGAGGGGACTGATGGCCTGT CTCAGCTTTCAGTAGCAGTTGGGAAAATGCAGCAGTTTGTTAACGACCAGA CCAACAATACGGCCCGTGAGCTTGACTGCATCAAGATTACACAACAAGTTG GGGTAGAGCTTAATCTTTATCTTACTGAGTTAACAACCGTGTTTGGCCCACA GATCACCAGTCCTGCCCTGACGCAGTTAACAATTCAAGCGCTTTATAACTTA GCAGGGGGTAACATGGACTACCTTTTAACTAAATTGGGCATTGGAAATAATC AACTTAGTAGTTTAATCGGTAGTGGATTGATCACTGGTTATCCTATTCTTTAC GATAGCCACACGCAACTTTTGGGCATCCAGGTCAACTTGCCATCGGTCGGC AACTTAAATAACATGCGCGCTACATACCTGGAAACACTGTCTGTTTCGACG ACGAAGGGATATGCCTCTGCTCTGGTTCCTAAGGTTGTAACACAGGTAGGC AGCGTCATCGAGGAACTGGATACGAGTTACTGCATTGAATCAGATCTGGAT TTATACTGTACTCGTATCGTAACCTTCCCCATGAGTCCGGGCATCTACTCCTG TCTTTCGGGGAACACGAGTGCTTGTATGTATTCTAAGACAGAGGGCGCCTT GACTACCCCTTATATGGCGTTACGCGGTAGCGTAATTGCTAATTGCAAGATC ACGACATGTCGCTGCACCGACCCGCCCGGTATTATCTCCCAGAACTACGGT GAAGCTGTTTCACTGATTGATCGTCATAGTTGCAACGTGCTTTCGTTAGATG GTATTACATTACGCCTTTCTGGCGAGTTCGATGCAACGTACCAGAAGAACAT TTCTATTTTAGATAGTCAGGTTATTGTCACTGGAAATTTGGATATTTCCACAG AACTTGGGAATGTAAATAACAGCATCTCAAACGCTTTGGACCGTTTGGCCG AGTCGAATAGCAAGTTAGAAAAAGTTAACGTTCGCCTTACAAGCACTAGCG CTTAACTCGAG

SEQ ID NO:8

MQAKQNAATSLRLKESIAATNEAVHEGTDGLSQLSVAVGKMQQFVNDQTNNT ARELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGGNMD YLLTKLGIGNNQLSSLIGSGLITGYPILYDSHTQLLGIQVNLPSVGNLNNMRAT YLETLSVSTTKGYASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCIESDLDLYCTRIVTFPM SPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMALRGSVIANCKITTCRCTDPPGIISQ NYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGITLRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDIST ELGNVNNSISNALDRLAESNSKLEKVNVRLTSTSA# 。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaccgcg cggttaacag agtcgtgctg gagaatgagg aaagagaagc aaagaacaca 60

tggcgcctag ttttccggat cgcagtctta cttttaatgg taatgactct agctatctcc 120

gcggctgccc tggcaaagag catgggggcc agtacgccgc acgacctcgc aggcatatcg 180

actgtgatct ccaagacaga agacaaggtt acgtctttac tcagttcaag tcaagatgtg 240

atagatagga tatacaagca ggtagctctt gaatccccgc tggcactact aaacaccgaa 300

tctataatta tgaatgcaat aacctctctt aggtatcaaa ttaacggggc tgagaacaat 360

agcggatgtg gtgcgcctgt tcatgaccca gattatatcg gggggatagg caaagaactc 420

atatccgacg acatcagtga tgtcacatca ttttatcctt ctgcatatca agaacacttg 480

aatttcatcc cggcgcctac tacaggatcc ggttgcactc ggataccctc atttgacatg 540

agccctaccc attattgtta tactcacaat gtgatactat ctggttgcag agatcactca 600

cactcacatc aatacttagc acttggtgtg cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc 660

ttttctactc tgcgctccat caatttagat gacacccaaa atcggaagtc ctgcagtgtg 720

agtgcaaccc ctttaggttg tgatatgctg tgctctaagg tcacagggac tgaagaggag 780

gattacaagt cagttgcccc cacatcaatg gtgcacggaa ggctagggtt tgacggtcaa 840

taccatgaga aggacttaga caccacggtc ttatttaagg attgggtggc aaattacccg 900

ggagtgggag gagggtcttt tattgacttt cgtgtatggt tcccagttta cggagggctc 960

aaacccaatt cacccagtga ctctgcacaa gaagggaaat atgtaatata caagcgtcat 1020

aacaacacat gccccgatga acaagattac caaattcgga tggctaagtc ctcatataaa 1080

cccgggcgat ttggtggaaa gcgcgtacag caagccatct tatccatcaa agtgtcaaca 1140

tccctgggta aggacccggt gctgactatt ccacctaata caatcacact catgggagct 1200

gaaggcagaa tcctcacagt agggacatct cacttcttgt accaacgagg gtcttcatat 1260

ttctcccctg ccttattgta tcccatgaca gtaaataaca aaacggctac actccatagt 1320

ccttacacct ttaatgcttt cactcggcca ggtagtgtcc cttgccaggc atcagcaaga 1380

tgccccaact catgcattac tggggtctat accgatccat atcccttaat cttccatagg 1440

aatcatactc tacgaggggt cttcgggacg atgcttgatg atgaacaagc gaggcttaac 1500

cccgtatctg cagtatttga caacatatct cgcagtcgtg tcacccgggt gagttcaagc 1560

agcaccaagg cagcatacac gacatcgaca tgttttaaag ttgtcaagac caataaagct 1620

tattgtctta gtatcgcaga aatatccaat accctattcg gggaatttag gatcgttccc 1680

ttactaggtg agatcctcaa ggatgataga gtttaa 1716

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Arg Ala Val Asn Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu Leu

20 25 30

Met Val Met Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Ala Lys Ser Met

35 40 45

Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser Thr Val Ile Ser

50 55 60

Lys Thr Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser Ser Gln Asp Val

65 70 75 80

Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Arg Tyr

100 105 110

Gln Ile Asn Gly Ala Glu Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His

115 120 125

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Ser Asp Asp

130 135 140

Ile Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His Leu

145 150 155 160

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

165 170 175

Ser Phe Asp Met Ser Pro Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

180 185 190

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

210 215 220

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225 230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Gly

245 250 255

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr Ser Met Val His

260 265 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr

275 280 285

Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Phe Ile Asp Phe Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

305 310 315 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile

325 330 335

Tyr Lys Arg His Asn Asn Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile

340 345 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg

355 360 365

Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Lys

370 375 380

Asp Pro Val Leu Thr Ile Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala

385 390 395 400

Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

405 410 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asn

420 425 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr

435 440 445

Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser

450 455 460

Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe His Arg

465 470 475 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln

485 490 495

Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser Arg Ser

500 505 510

Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr

515 520 525

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Ala Tyr Cys Leu Ser

530 535 540

Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

545 550 555 560

Leu Leu Gly Glu Ile Leu Lys Asp Asp Arg Val

565 570

<210> 3

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg 60

ctgcctttga gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120

ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180

atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagccgtg 240

ttggaggcat ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300

aagatccaag ggtctgtgtc cacgtccgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360

gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420

ctaatacaag ccaaacagaa tgccgccacc tccctccggc ttaaggagag cattgctgca 480

accaatgaag ctgtgcatga aggtaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540

aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagacc aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600

aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660

ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720

ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780

agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840

caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900

acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960

aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020

tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080

tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140

acgccgtata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgcaga 1200

tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260

agacattcat gcaatgtctt atcattagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320

gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ttagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380

cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440

ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatctgct 1500

ctcattacct atattgttct aactgtcatt tccctaattt tcggtgcact tagtggggtt 1560

ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaga agaccttgct atggcttggg 1620

aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagcat ga 1662

<210> 4

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile

1 5 10 15

Thr Arg Ile Met Leu Pro Leu Ser Cys Ile Arg Leu Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

35 40 45

Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

50 55 60

Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Val

65 70 75 80

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

85 90 95

Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg

100 105 110

Arg Gln Lys Arg Phe Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly

115 120 125

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

130 135 140

Lys Gln Asn Ala Ala Thr Ser Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

145 150 155 160

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Gly Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser

165 170 175

Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Thr Asn Asn

180 185 190

Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

195 200 205

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

210 215 220

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly

245 250 255

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr

260 265 270

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser His Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn

275 280 285

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

290 295 300

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro

305 310 315 320

Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

325 330 335

Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

340 345 350

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

355 360 365

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

370 375 380

Ala Leu Arg Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg

385 390 395 400

Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

405 410 415

Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

420 425 430

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

435 440 445

Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

450 455 460

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg

465 470 475 480

Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr

485 490 495

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu

500 505 510

Ile Phe Gly Ala Leu Ser Gly Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

515 520 525

Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

530 535 540

Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Ala

545 550

<210> 5

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcatga agagcatggg cgcaagtaca cctcacgatc tggctggaat atcgactgtg 60

atcagtaaaa ctgaagataa ggttacttcc cttttgtcga gttcccagga cgtcatagat 120

agaatatata aacaggtagc attggagtcg cctctcgcac ttctgaacac cgagtcgatt 180

ataatgaacg caataacaag cctccgttat caaattaacg gcgccgagaa caatagcgga 240

tgcggcgctc cagtacatga ccctgattat atcggaggca tcggtaaaga acttatctca 300

gatgacattt ctgacgttac ctccttttat cctagcgctt accaggagca tcttaatttc 360

attcctgcac ctacaacggg ttcgggctgc acgcgcatac catcctttga tatgtctccc 420

actcactact gttatacgca taacgtgata ctcagtggct gtagggatca ttctcattcc 480

caccagtacc tggcgcttgg cgtcctgcgc acttcggcca ctggaagagt ttttttctcg 540

accctgagga gtatcaacct tgatgatact cagaatagga agagttgctc agtctcggcg 600

actccactgg gatgtgacat gctgtgttct aaagttacgg gaacggagga ggaagactat 660

aaatcagttg caccgacatc gatggtccat ggtcgccttg gctttgatgg acaataccat 720

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aactcgccct ccgacagcgc tcaagaggga aaatacgtga tctacaagcg tcacaataat 900

acgtgcccag acgaacagga ttatcagata cgcatggcca aatcgtctta caagccgggt 960

agattcggtg gcaaacgtgt ccaacaggcg atactctcta tcaaggtaag cacctctctg 1020

ggcaaggacc ccgttcttac cattcctccg aatacgatca cgctcatggg tgctgaagga 1080

agaatcctta ctgtgggaac ttctcacttc ctctatcaga gaggatcttc gtatttcagt 1140

cctgcgctcc tctatcctat gacagttaat aataagacag caacactgca cagtccctat 1200

acatttaacg cttttacgag accaggttcg gtaccatgcc aagcaagtgc gagatgtccg 1260

aattcgtgta tcacaggtgt ctacaccgat ccttaccctc tcatcttcca ccgcaatcat 1320

actttgcgcg gcgtatttgg aacgatgctt gacgatgagc aagctagact taacccagtg 1380

agtgccgttt ttgataatat tagtaggtcc cgcgttacga gagtctcgtc ttccagcaca 1440

aaggcagcct acactacttc gacttgcttc aaagtcgtaa aaactaacaa ggcgtattgc 1500

ctctccatag cggaaatttc gaataccctg ttcggagaat tcaggatcgt gcctctgctc 1560

ggagagattc tcaaagatga tcgtgtctaa gtcgac 1596

<210> 6

<211> 527

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Ser Met Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser

1 5 10 15

Thr Val Ile Ser Lys Thr Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Ser Gln Asp Val Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser

35 40 45

Pro Leu Ala Leu Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr

50 55 60

Ser Leu Arg Tyr Gln Ile Asn Gly Ala Glu Asn Asn Ser Gly Cys Gly

65 70 75 80

Ala Pro Val His Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu

85 90 95

Ile Ser Asp Asp Ile Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr

100 105 110

Gln Glu His Leu Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys

115 120 125

Thr Arg Ile Pro Ser Phe Asp Met Ser Pro Thr His Tyr Cys Tyr Thr

130 135 140

His Asn Val Ile Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln

145 150 155 160

Tyr Leu Ala Leu Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe

165 170 175

Phe Ser Thr Leu Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys

180 185 190

Ser Cys Ser Val Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser

195 200 205

Lys Val Thr Gly Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr

210 215 220

Ser Met Val His Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys

225 230 235 240

Asp Leu Asp Thr Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro

245 250 255

Gly Val Gly Gly Gly Ser Phe Ile Asp Phe Arg Val Trp Phe Pro Val

260 265 270

Tyr Gly Gly Leu Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gln Glu Gly

275 280 285

Lys Tyr Val Ile Tyr Lys Arg His Asn Asn Thr Cys Pro Asp Glu Gln

290 295 300

Asp Tyr Gln Ile Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe

305 310 315 320

Gly Gly Lys Arg Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr

325 330 335

Ser Leu Gly Lys Asp Pro Val Leu Thr Ile Pro Pro Asn Thr Ile Thr

340 345 350

Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe

355 360 365

Leu Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro

370 375 380

Met Thr Val Asn Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe

385 390 395 400

Asn Ala Phe Thr Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg

405 410 415

Cys Pro Asn Ser Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu

420 425 430

Ile Phe His Arg Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu

435 440 445

Asp Asp Glu Gln Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn

450 455 460

Ile Ser Arg Ser Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala

465 470 475 480

Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Ala

485 490 495

Tyr Cys Leu Ser Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe

500 505 510

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<210> 7

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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gcaacgaatg aggcagttca cgaggggact gatggcctgt ctcagctttc agtagcagtt 120

gggaaaatgc agcagtttgt taacgaccag accaacaata cggcccgtga gcttgactgc 180

atcaagatta cacaacaagt tggggtagag cttaatcttt atcttactga gttaacaacc 240

gtgtttggcc cacagatcac cagtcctgcc ctgacgcagt taacaattca agcgctttat 300

aacttagcag ggggtaacat ggactacctt ttaactaaat tgggcattgg aaataatcaa 360

cttagtagtt taatcggtag tggattgatc actggttatc ctattcttta cgatagccac 420

acgcaacttt tgggcatcca ggtcaacttg ccatcggtcg gcaacttaaa taacatgcgc 480

gctacatacc tggaaacact gtctgtttcg acgacgaagg gatatgcctc tgctctggtt 540

cctaaggttg taacacaggt aggcagcgtc atcgaggaac tggatacgag ttactgcatt 600

gaatcagatc tggatttata ctgtactcgt atcgtaacct tccccatgag tccgggcatc 660

tactcctgtc tttcggggaa cacgagtgct tgtatgtatt ctaagacaga gggcgccttg 720

actacccctt atatggcgtt acgcggtagc gtaattgcta attgcaagat cacgacatgt 780

cgctgcaccg acccgcccgg tattatctcc cagaactacg gtgaagctgt ttcactgatt 840

gatcgtcata gttgcaacgt gctttcgtta gatggtatta cattacgcct ttctggcgag 900

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aatttggata tttccacaga acttgggaat gtaaataaca gcatctcaaa cgctttggac 1020

cgtttggccg agtcgaatag caagttagaa aaagttaacg ttcgccttac aagcactagc 1080

gcttaactcg ag 1092

<210> 8

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Gln Ala Lys Gln Asn Ala Ala Thr Ser Leu Arg Leu Lys Glu Ser

1 5 10 15

Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu Gly Thr Asp Gly Leu Ser

20 25 30

Gln Leu Ser Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln

35 40 45

Thr Asn Asn Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln

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Gly Pro Gln Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala

85 90 95

Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu

100 105 110

Gly Ile Gly Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile

115 120 125

Thr Gly Tyr Pro Ile Leu Tyr Asp Ser His Thr Gln Leu Leu Gly Ile

130 135 140

Gln Val Asn Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr

145 150 155 160

Tyr Leu Glu Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala

165 170 175

Leu Val Pro Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu

180 185 190

Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg

195 200 205

Ile Val Thr Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly

210 215 220

Asn Thr Ser Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr

225 230 235 240

Pro Tyr Met Ala Leu Arg Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr

245 250 255

Thr Cys Arg Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly

260 265 270

Glu Ala Val Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu

275 280 285

Asp Gly Ile Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln

290 295 300

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305 310 315 320

Asp Ile Ser Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala

325 330 335

Leu Asp Arg Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val

340 345 350

Arg Leu Thr Ser Thr Ser Ala

355

Claims

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码新城疫病毒HN、F蛋白的核苷酸片段；所述的HN和F蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的核苷酸片段，其序列为SEQID NO:5、SEQ ID NO:7。

3.权利要求1或2所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中制备新城疫病毒的病毒样颗粒的应用。

4.一种新城疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于，所述的是使用权利要求1或2所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。

5.如权利要求4所述的新城疫病毒的病毒样颗粒，其特征在于，所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9。

6.权利要求4所述的新城疫病毒的病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

7.一种新城疫病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒亚单位疫苗包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原包含有权利要求4所述的新城疫病毒的病毒样颗粒。