CN104873966B - 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的制备方法和应用。本发明所提供的制备方法包括以下步骤：将人工优化的编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因克隆到杆状病毒载体中，通过转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒。利用重组杆状病毒感染high five细胞，使Cap蛋白在细胞中大量表达。本发明还公开了一种快速简便纯化病毒样颗粒的方法。本发明所提供的纯化方法包括以下步骤：离心收集high five细胞，以冰预冷PBS重悬细胞，使用细胞均质仪将细胞悬液裂解为较澄清的液体。通过凝胶过滤层析方法对病毒样颗粒进行纯化。使用本发明所提供的方法能够快速从复杂的细胞裂解液中特异的纯化到病毒样颗粒蛋白，纯度达到90％以上。

Description

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法

技术领域

本发明属于生物技术疫苗制备领域，具体涉及到一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属成员，是迄今为止发现的最小动物病毒。1974年，德国学者Tisch等首次在PK15(ATCC-CCL31)的细胞系培养基中发现了一种细胞污染物，分析表明该污染物为单链共价环状的无囊膜的二十面体对称的DNA病毒，并将其命名为猪圆环病毒(PCV)。该病毒虽然广泛传播，但是对猪群不具有致病性，也不引起临床症状和病理变化。随后研究人员在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪中分离出了对猪具有致病性的PCV病毒，并将其命名为PCV2，而将之前不具有致病性的PCV命名为PCV1。

PCV2引起的疾病范围非常广泛，不但能够导致母猪出现繁殖障碍，还能够使断奶仔猪和育肥猪出现呼吸道疾病、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、增生性坏死性肺炎(PNP)等相关疾病。所以，这些与PCV2相关的疾病被有些学者统称为猪圆环病毒病(PCVDS)。在养猪业蓬勃发展的中国PCV2感染情况相当普遍。据国内部分地区流行病学调查结果显示：PCV2一般感染率为26.03-77.46％，部分省份和地区抗体或病毒核酸阳性率高达100％。PCV2常与猪瘟、猪蓝耳病等病原混合感染，有证据显示PCV2感染使机体继发感染其他传染病的几率增加，这一现象可能是由于PCV2感染引起猪的免疫抑制所导致的。

自从加拿大首次发现PMWS以来，出现了一系列与PCV2相关的疾病和综合征。疫苗免疫被认为是针对这一病毒的主要防治手段。迄今为止，已注册上市的PCV2疫苗主要是灭活疫苗和亚单位疫苗。其中灭活疫苗由于不能在动物体内复制，因此对机体刺激时间比较短，如果想要获得持久免疫力就需要多次重复接种。

PCV2基因组含有11个开放阅读框(orf)，其中orf1与orf2是其最大的两个阅读框。现已证实，orf1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，该蛋白氨基酸序列相当保守，是PCV1和PCV2产生抗原交叉性的主要原因；orf2编码的Cap蛋白是圆环病毒的结构蛋白，也是圆环病毒的主要抗原蛋白。由于亚单位疫苗具有产量高、纯度高、安全性好等优点，因此，Cap蛋白成为研制PCV2亚单位疫苗的明星抗原。至今为止，Cap蛋白在多种表达系统中均得到表达。由于杆状病毒表达系统具有宿主范围窄、极易灭活、对外源基因克隆容量大、具有完整的翻译后加工修饰系统等优势，因此，本发明采用昆虫杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型的Cap蛋白。为了使其能够更加适应昆虫杆状病毒表达系统、提高其蛋白产量，本发明在不改变氨基酸序列的前提下对编码Cap蛋白的氨基酸密码子进行优化，经人工改造的Cap蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明显示，经过氨基酸密码子优化的Cap蛋白在昆虫细胞中高效大量表达，产量达到100mg/L。

Cap蛋白能够自我组装成为病毒样颗粒结构(VLPs)，目前，对于病毒样颗粒的纯化方案通常是使用蔗糖密度梯度离心的方式，但是采用这种方式存在耗时长、纯化效率低等缺点。为了解决上述问题，本发明提供了一种快速简便地从细胞裂解物中纯化病毒样颗粒的方案，采用本方案仅需要一步凝胶过滤层析即可得到纯度大于90％的病毒样颗粒，不但节省了大量时间还会因为简化纯化步骤从而减少蛋白在纯化中间环节中所造成的损失。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种能够预防猪圆环病毒2型感染的病毒样颗粒疫苗。

本发明提供一种利用昆虫杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的方法。

本发明提供一种简便的病毒样颗粒纯化方法。

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括下述步骤：

1)将人工改造的编码猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的orf2基因克隆到昆虫杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒BV-PCV2-CAP。

2)将重组杆状病毒BV-PCV2-CAP进行扩大培养，通过凝胶过滤层析纯化得到目的蛋白。

3)将猪圆环病毒2型Cap蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗。

具体地，1)所述的重组的杆状病毒BV-PCV2-CAP构建方法为将优化的编码猪圆环病毒2型Cap蛋白的orf2基因克隆到载体中，得到重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP，将重组质粒转化到大肠杆菌DH10Bac^TM感受态细胞中产生重组杆状病毒质粒(bacmid-PCV2-CAP)，最后将重组杆状病毒质粒转染sf9细胞产生重组杆状病毒BV-PCV2-CAP。

2)所述扩大培养为：重组杆状病毒质粒bacmid-PCV2-CAP转染处于对数期的sf9细胞(细胞密度为1.5-2.5×10⁶/ml)得到P1代病毒；两代扩增后以P3代病毒感染处于对数期的昆虫细胞High five进行扩大培养。

2)所述回收纯化为：离心收集2)所述的扩大培养细胞，以冰预冷PBS(含蛋白酶抑制剂)重悬细胞，使用细胞均质仪Avestin将细胞悬液裂解为较澄清的液体。12,000rpm离心30min后用0.45μm滤膜去除细胞碎片。使用凝胶过滤层析方法对细胞裂解上清中的病毒样颗粒进行纯化。

3)所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA 201VG。

猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，经人工改造的Cap蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

如上所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗在防控猪圆环病毒中的应用。

附图说明

图1.质粒图谱。

图2.重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP PCR鉴定结果。M.DNA Marker DL5,000；1.重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP PCR电泳结果；2.阴性对照。

图3.bacmid-PCV2-CAP PCR鉴定结果。M.DNA Marker DL5,000；1.M13引物PCR鉴定重组杆状病毒质粒bacmid-PCV2-CAP结果。

图4.Western blot(anti-His)鉴定Cap蛋白表达。+.阳性对照；M.PrestainedProtein Ladder；CAP.Cap细胞裂解物。

图5.凝胶过滤层析色谱图以及SDS-PAGE结果。

图6.Cap蛋白透射电镜观察结果。

图7.Cap蛋白免疫猪后抗体效价监测结果。

具体实施方式

实施例1表达载体的构建

1.1PCR扩增引物(平末端连接)：

上游引物：5’-ACCTACCCCCGTAGAAGATA-3’

下游引物：5’-TTAGGGGTTCAGGGTGGGGGC-3’

加样体系为(50μl)：

PCR扩增程序：

1.2PCR产物回收

(1)将样品进行琼脂糖凝胶电泳，设定电泳仪恒压95V，30min；

(2)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中小心切下，放入干净的1.5ml Eppendorf管中，称取重量；利用天根生物的DNA提取试剂盒回收DNA片段，具体操作步骤如下：

(3)向步骤(2)中的1.5ml Eppendorf管中加入等体积PC buffer 50℃水浴放置10min，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(4)柱平衡：向吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL，离心(12,000rpm，1min)，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(5)将步骤(3)所得溶液加入吸附柱CB2中，静置2min，离心(12,000rpm，1min)，倒掉收集管中的废液；

(6)向吸附柱中加入600μl漂洗液PW buffer，静置3min，离心(12,000rpm，1min)，倒掉收集管中的废液；

(7)重复步骤(6)；

(8)空吸附柱离心(12,000rpm，2min)，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；

(9)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl ElutionBuffer(65℃预热5-10min)，静置3min，离心(12,000rpm，2min)；

(10)将步骤(9)中的DNA样品置于4℃保存，并进行琼脂糖凝胶电泳。

1.3连接反应(3μl体系)

在0.5ml EP管中按照上述体积进行加样、混匀，而后将连接反应液置于室温放置10min。

1.4转化

(1)取出步骤1.3中的连接反应液，向其中添加100μl E.coli TOP10感受态细胞，混匀；

(2)冰浴30min；

(3)42℃水浴热激90sec；

(4)冰浴2min；

(5)向EP管中加入600μl LB液体培养基，37℃水浴1h；

(6)取出样品管，离心(8,000rpm，2min)，去掉600μl上清液，以剩余的100μl LB液体培养基重悬菌体；

(7)取菌液铺板于含相应抗性的LB平板中(Amp浓度为100μg/ml)，将LB平板置于生化恒温培养箱中37℃培养20h。

1.5重组质粒提取及PCR鉴定

(1)从转化平板中挑取单克隆菌落至3ml LB液体培养基(含相应抗性)中，37℃，260rpm摇菌过夜；

(2)取1ml菌液至1.5ml EP管中，离心(12,000rpm，2min))，弃上清；

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μl P1buffer，重悬菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μl P2buffer，温和混匀，静置2min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μl P3buffer，温和混匀；

(6)将步骤(5)溶液离心(12,000rpm，10min)；

(7)将步骤(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，离心(8,000g，30sec)；

(8)弃废液，向吸附柱中心加入500μl wash buffer，离心(9,000g，30sec)；

(9)重复步骤(8)；

(10)空吸附柱离心(9,000g，1min)；

(11)向吸附柱中心加入30μl Elution buffer，静置2min，离心(12,000rpm，2min)：

(12)收集步骤(11)DNA样品进行电泳；

(13)如步骤1.5所示，对提取到的质粒进行PCR鉴定，而后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP PCR鉴定结果见图2。如图所示，以特异性引物对质粒模板进行PCR扩增能够扩增出一条大约为700bp的条带，与预期大小一致。

实施例2重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP转化大肠杆菌DH10Bac

(1)取100μl DH10Bac感受态细胞置于冰上；

(2)加入至少1ng重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP至100μl DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min；

(3)42℃水浴热激45sec，EP管插回冰上，静置2min；

(4)在超净台内加入900μl无抗性的LB培养液；

(5)37℃220rpm震荡培养4h；

(6)4h后取30μl菌液涂于KGT三抗平板(50μg/ml Kanamycin，7μg/ml Gentamicin和10μg/ml Tetracycline，100μg/ml Bluo-gal，40μg/ml IPTG)，于37℃避光培养48h；

(7)挑选白斑转接至KGT三抗平板继续37℃培养24h左右。后挑选均匀的白斑，每个单克隆加至50μl KGT三抗LB液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养；

按照步骤1.1对培养菌液进行PCR鉴定，结果见图3。由图3可见，M13引物能够扩增出一条大约3,000bp的条带，与预期大小相符。由此可见，目的基因已通过Tn7转座作用成功插入到杆状病毒基因组中。

实施例3bacmid-PCV2-CAP提取

(1)取菌液PCR鉴定为阳性的白斑菌液转接到5ml KGT三抗LB液体培养基中继续37℃225rpm过夜培养；

(2)取过夜培养的1ml菌液接种于100ml KGT三抗LB液体培养基中继续37℃225rpm过夜培养，按照碱裂解法抽提Bacmid质粒；

(3)将培养的菌液分装到2个50ml的离心管中，4℃12,000rpm离心10min；

(4)弃上清，尽可能吸干培养液，回收菌体，加入10ml冰预冷溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0，使用时加入40μg/ml RNaseA)，用移液器轻轻吹打，使菌体完全悬浮；

(5)加入新鲜配置的溶液II20ml(1％SDS，0.2M NaOH)，盖紧管口，轻轻颠倒离心管数次，以混合内容物，切勿用力振荡，然后将离心管置于冰上5min；

(6)加入15ml冰预冷的溶液III(5M醋酸钾，2M冰乙酸)，盖紧管口，轻轻颠倒混匀，使溶液III在黏稠的细菌裂解液中分散均匀，置于冰上5-10min，此时可观察到出现白色絮状沉淀(蛋白质和大肠杆菌基因组DNA)；

(7)4℃12,000rpm离心30min，小心吸取上清后再离心10min，在上清中加入2/3倍体积的冷异丙醇，轻轻颠倒混匀几次，冰浴30min以上，4℃离心，12,000rpm，30min；

(8)弃掉上清后，加入10ml 75％乙醇洗涤沉淀，4℃12,000rpm离心10min，弃掉上清，将沉淀室温干燥5-10min至透明，用适量10mM Tris-HCl，pH8.0溶解沉淀并分装，即为重组Bacmid质粒，置于4℃或-20℃保存，用nano分光光度计测定bacmid样品浓度。

实施例4重组杆状病毒BV-PCV2-CAP的获得

(1)准备好悬浮培养的sf9细胞，细胞处于对数生长期，密度约1.5-2.5×10⁶cells/ml，铺六孔板，每孔8-9×10⁵个细胞；

(2)在生物安全柜中，取Cellfectin II6-8μl加入到100μl unsupplementedGrace's Medium中，轻轻混匀，静置5min另取bacmid 1-2μg加入到100μl unsupplementedGrace's Medium中，轻轻混匀，然后将Cellfectin II与bacmid轻轻混匀，室温孵育15-45min；

(3)孵育完成后，加入0.8ml unsupplemented Grace's Medium，轻混后，沿板壁缓缓加入植入细胞的六孔板中，放入27℃培养箱中孵育5h；

(4)弃去六孔板中的混合液，每孔加2ml Sf-900^TMIII SFM培养基，27℃培养箱中孵育72h，观察转染现象；

取培养细胞裂解液与5×SDS-PAGE loading buffer混合后，煮沸10min，适当离心后即可进行聚丙烯凝胶电泳，再进行western blot检测。由图4可知，Cap蛋白在细胞中大量表达，蛋白分子量与预期一致。

实施例5蛋白大量表达

将两次传代的杆状病毒BV-PCV2-CAP感染处于对数生长期的昆虫细胞High five(细胞密度为1.5-2.5×10⁶cells/ml)，27℃悬浮培养96h后，即可收获细胞。

实施例6蛋白纯化

6.1凝胶过滤层析纯化Cap蛋白

(1)将细胞样品拿出置于冰上，加入等体积冰预冷的PBS(含蛋白酶抑制剂)，用移液器重悬细胞；

(2)使用细胞均质仪Avestin裂解重悬细胞；

(3)将裂解后产物4℃离心(12,000rpm，30min)；

(4)取上清，用0.45μm滤器过滤，除去大分子碎片，防止阻塞分子筛柱；

(5)凝胶过滤层析：进样5ml，流速0.2ml/min，收集2ml/管；

(6)取收集到的蛋白样品，利用SDS-PAGE检测回收蛋白的纯度与分子量是否正确。由图5可知，通过凝胶过滤层析能够得到纯度大于90％的Cap蛋白。

6.2SDS-PAGE

(1)向纯化样品中加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10min，4℃12,000rpm离心5min，小心吸取上清上样；

(2)蛋白电泳胶的配置及上样：按照分子克隆常规方法制备12％的分离胶和5％的浓缩胶。取10-15μl样品上样，初始电压为80V，时间一般为30min，待样品进入分离胶时，电压调至120V，时间一般为90min；

(3)染色：电泳结束后，小心取下凝胶，放置于平皿中，加入考马斯亮蓝染液，置于摇床上旋转染色2h；

(4)脱色：弃掉染色液，用清水冲洗两遍凝胶，放置于平皿中加入脱色液，直至看到清晰的蛋白条带，将凝胶放置在凝胶成像系统下拍照。

6.3Western Blot

(1)SDS-PAGE凝胶电泳结束后，剪大小完全相等或者略微小于凝胶的1张硝酸纤维素滤膜和6张滤纸；

(2)安装转移装置，放置3张浸泡过的滤纸，硝酸纤维素滤膜，凝胶，然后把最后3张滤纸放于凝胶的上面；

(3)转膜：按黑(负极)-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-白夹子(正极)的顺序放好胶和膜(白膜黑胶)，100V或200mA转膜60min；

(4)封闭：电转后，滤膜用1XTBS漂洗1次，置于5％脱脂奶中，37℃封闭30-90min；

(5)一抗：抗体(抗体稀释比例根据自身实验具体确定)，孵育1-2h；

(6)用0.05％TBST漂洗滤膜三次，5min/次；

(7)二抗：用1∶1000-1∶5000TBST稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1h；

(8)用0.05％TBST漂洗滤膜三次，5min/次；

(9)显色：将膜放在PARAFILM膜上，滴加等比例混合好的显影液，待滤膜上出现清晰条带后即可用清水冲洗滤膜终止反应。

6.4蛋白浓缩与浓度测定

将蛋白样品放置于适当的浓缩管中进行浓缩，用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。蛋白得率约为100mg/L。

实施例7透射电镜观察

将纯化好的Cap蛋白用适量的磷钨酸进行负染，而后置于透射电镜下观察样品。由图6结果可见，Cap蛋白能够自我组装成约17nm大小的颗粒样结构。由此确认本专利所生产的Cap蛋白是以病毒样颗粒状态存在。

实施例8疫苗制备

(1)乳化前4h将超声波细胞破碎仪的2号杆用30％双氧水浸泡，之后将双氧水换成超纯水再浸泡30min；

(2)将超声波细胞破碎仪用75％酒精消毒后放置于生物安全柜中；

(3)疫苗混合：按照实验需要以及佐剂推荐混合比例，计算所需抗原和佐剂的剂量，使蛋白抗原的浓度为25μg/ml；

(4)超声乳化疫苗：按照60％的功率，工作5sec，间隔5sec，超声10min的条件进行乳化；

(5)结束后，观察乳化效果。取10ml乳化后的疫苗于离心管中3,000rpm离心15min，以水相析出不超过0.5ml为合格。

实施例9免疫实验

选3-4周龄长白猪进行免疫试验，每次免疫1ml PCV2病毒样颗粒疫苗(25μg/ml)，免疫一次，免疫后每周取血1次，分离血清，用ELISA方法测定抗体效价，结果如图7所示。

由图7结果可知，相较于市场上某品牌的PCV2疫苗产品而言，本发明制备的PCV2病毒样颗粒疫苗产生的抗体效价显著高于该疫苗，并且在免疫21d后抗体效价即可达到高峰。

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1.1猪圆环病毒2型的衣壳蛋白Cap其特征在于如SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；

1.2将人工改造的编码猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的orf2基因克隆到昆虫杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒BV-PCV2-CAP；

1.3将重组杆状病毒BV-PCV2-CAP进行扩大培养，通过凝胶过滤层析纯化得到目的蛋白；

1.4将Cap蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到PCV2病毒样颗粒疫苗；

其中猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，经人工改造的Cap蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

其中，步骤1.3所述的扩大培养为：重组杆状病毒质粒bacmid-PCV2-CAP转染处于对数期的sf9细胞，细胞密度为1.5-2.5×10⁶/ml，得到P1代病毒；两代扩增后以P3代病毒感染处于对数期的昆虫细胞High five进行扩大培养；杆状病毒感染复数(MOI)为0.5-10；所述昆虫细胞High five细胞密度为1.5-2.5×10⁶/ml；培养时间为96h。

2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，步骤1.2所述的重组的杆状病毒BV-PCV2-CAP构建方法为：将优化的编码猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的orf2基因克隆到载体pFastBac^TM/中，得到重组质粒Inv-TOPO-N-PCV2-CAP，将重组质粒转化到大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中产生重组杆状病毒质粒bacmid-PCV2-CAP，最后将重组杆状病毒质粒转染sf9细胞产生重组杆状病毒BV-PCV2-CAP。

3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，所述杆状病毒感染复数(MOI)为2；所述昆虫细胞High five细胞密度为1.5×10⁶/ml。

4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，步骤1.3所述的蛋白纯化方法为：离心收集步骤1.3所述的扩大培养细胞，以冰预冷含蛋白酶抑制剂的PBS重悬细胞，使用细胞均质仪Avestin将细胞悬液裂解为较澄清的液体；12,000rpm离心30min后用0.45μm滤膜去除细胞碎片；使用凝胶过滤层析方法对细胞裂解上清中的病毒样颗粒进行纯化；凝胶过滤柱为Hiload 16/60superdex 200PG；缓冲液为PBS，pH7.4。

5.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，步骤1.4所述佐剂为油乳佐剂。

6.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒纯化及其疫苗制备方法，其特征在于，步骤1.4所述佐剂为ISA201VG；所述的Cap蛋白与佐剂ISA201VG按推荐比例混合乳化。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备得到的猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗。