CN103173470A - 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经大肠杆菌表达密码子优化的猪圆环病毒 PCV2 ORF2 基因和大肠杆菌来源的 PCV2 ORF2 衣壳蛋白病毒样颗粒的制备方法。

Description

大肠杆菌来源的PCV2 ORF2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型衣壳蛋白基因及载体、菌株及其表达方法，和含该病毒样颗粒的疫苗及其在预防断奶仔猪多系统衰竭综合征(特别是PCV2）感染的用途。

背景技术

猪圆环病毒PCV属圆环病毒科，圆环病毒属，为无包膜的单链环状DNA病毒。此病毒在世界各国广泛流行，该病毒不仅造成猪仔生长缓慢，同时会侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，引起机体的免疫抑制，给世界养猪业造成了很大的经济损失。

基因组非常小，根据基因组成及抗原性的不同，PCV可以分为两种血清型，PCV1型和PCV2型；其中PCV1 基因组全长为1759bp，PCV2 为1767 bp或1768bp。约有11个开放框，即ORF1-ORF11，分别编码1.8~ 35.8 kD的蛋白质，其中ORF1、ORF5、ORF7 和ORF10 在编码链上，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9 和ORF11 在互补链上。ORF1、ORF2、ORF3为三个主要的开放阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的酶蛋白，通过剪切策略，编码长度大小分为Rep和Rep’，Rep和Rep’催化病毒DNA的复制。其中Rep和Rep’可以形成同源二聚体（Rep-Rep）和异源二聚体（Rep’-Rep’），同源和异源二聚体比例在病毒复制的不同阶段也在变化，分别发挥不同的作用。ORF2编码病毒的衣壳蛋白，是病毒的主要结构蛋白，在适当的条件下，ORF2蛋白可以自组装成病毒样颗粒（virus-like-particles，VLPs），VLPs不仅与病毒粒子具有相似的外形，而且不含有核酸，是预防性疫苗研发的靶位点。ORF3编码一种小蛋白，与PCV2诱导的细胞凋亡有关，其他的ORF功能尚不清楚。

调查显示，1997-2003年间，中国猪场中以PCV2a占主导，而自2004年后，PCV2b则越来越普遍。分子流行病学调查结果显示，PCV2b在中国的流行范围最广，所占比例最大，而且PCV2b的毒性更强，市场需求尽快研发相关疫苗，预防圆环病毒的感染。

目前市场上的猪圆环病毒疫苗的制作采用了全病毒灭活技术、病毒嵌合技术和病毒亚单位疫苗技术。目前国内注册的国产圆环病毒均为全病毒灭活疫苗，PCV在细胞内的增值滴度很低，而且灭活疫苗对机体的刺激时间较短，需要多次接种才能达到一定的保护效果。由于PCV2难培养、生长慢及难灭活，培养成本高，生产周期长等特点，全病毒灭活存在一系列的问题，最重要的是在灭活过程中灭活效果的检测是一大关键，此外，在灭活过程中对病毒的表面中和表位的破坏也是一大问题，造成灭活疫苗的保护性效果很差。全病毒培养、灭活是一项经典技术，不是未来研制的发展方向。分子生物学技术越来越多的应用于疫苗的研制。病毒样颗粒组装技术已经成功并广泛的运用于现代疫苗研发与生产。

目前认为引起PCV感染的原因主要有以下四点：病毒毒力、宿主易感性、并发感染以及免疫激发。其中，尤其要指出的是病毒感染后会造成机体的免疫抑制，降低机体的免疫能力，形成并发感染。

目前，已上市的PCV疫苗除了灭活苗外，基因工程疫苗均采用真核表达系统。由于PCV-2难培养、生长慢，考虑到病毒培养成本高、周期长，故而灭活苗存在一系列的问题。基因工程疫苗有Merck的Circumvent-PCVM、勃林格的CircoFlex等。这些疫苗均采用昆虫杆状病毒表达PCV2衣壳蛋白，再将其制备成疫苗，上市的疫苗的均被证实具有良好的免疫效果，但是高昂的售价成为了制约上述产品在广大发展中国家推广的瓶颈。

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高的显著特点，因此被广泛应用生物制药行业中。糖基化修饰是真核表达系统和原核表达系统的主要区别之一，但是PCV2的ORF2并不含有糖基化位点，两种系统之间在糖基化修饰方面并没有区别。此前也有众多的研究者尝试利用大肠杆菌表达系统进行PCV-ORF2蛋白的表达，进而进行PCV预防性疫苗的开发。但是众多的研究结果均表明，ORF2N端含有由41个氨基酸组成的核定位信号，这个信号肽由于密码子偏嗜性的原因，致使ORF2蛋白在E.coli中的表达量非常低，失去了大规模商业应用的可能，本发明因此而来。

发明内容

本发明所要解决的第一方面的技术问题，在于克服现有技术中PCV2 ORF2蛋白在E.coli中的表达量非常低的情况，提供一种在Ecoli中具有较高表达水平的PCV2 ORF2基因，最终获得的目的蛋白占到菌体总蛋白的约20%。

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种全长的PCV2 ORF2基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

优选地, 如实施例及图3所示，本发明PCV2 ORF2基因表达的蛋白能够在大肠杆菌内自组装成病毒样颗粒。

本发明的第二方面，提供了一种全长的PCV2 ORF2衣壳蛋白，具有如Seq ID No.2所示的序列。

本发明的第三方面，提供了一种含有权利要求1所述基因的表达载体。

优选地，所述表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

本发明的第四方面，提供了一种含有前述表达载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了一种制备纯化PCV2 ORF2基因表达的衣壳蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）在大肠杆菌表达系统中表达PCV2 ORF2基因，

（2）将表达了PCV2 衣壳蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液，

（3）用硫酸铵分级分离：先用30%硫酸铵沉淀除去部分杂蛋白，然后用50%硫酸铵沉淀粗目的蛋白，

（4）将上述目的蛋白在150mM－2500mM盐溶液中重新溶解，离心沉淀得到目的蛋白。

优选地，所述步骤（4）的重悬上清液通过滤膜过滤，进一步通过色谱层析纯化目的蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种PCV2类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有权利要求1或2基因表达的蛋白或者包含由权利要求3的蛋白。

本发明的第七方面，提供了一种用于预防PCV2感染的疫苗，其包括：（1）权利要求9的PCV2类病毒颗粒，及疫苗用赋形剂或载体。

本发明的第八方面，提供了一种预防PCV2感染的方法，其包括将含预防有效量的前述的PCV2 cap蛋白或类病毒颗粒的疫苗或预防有效量的疫苗给予需要预防PCV2感染的猪。

本发明提供一种基于大肠杆菌来源的、抗原表位的选择符合中国圆环病毒特征的PCV2b型别的衣壳蛋白高效表达的方法。基于本实验室的技术，从多个方面对原核表达PCV ORF2蛋白进行了研究，最终获得的目的蛋白占到菌体总蛋白的约20%。然后利用硫酸铵分级分离沉淀的方法对目的蛋白进行初步纯化。与其它的沉淀方法相比，该方法较为温和，一般认为不会对蛋白质的结构造成破坏。此外，在目的蛋白复溶时，也采用了不含变性剂的复溶液，这也进一步保持了ORF2蛋白的天然活性。通过沉淀，复溶两个步骤，目的蛋白得到显著富集纯化，其占总蛋白的含量从20%上升到了50%左右，为进行色谱精纯奠定了良好的基础。而且，在上述初步纯化的过程中，没有使用诸如尿素等变性剂，目的蛋白的活性得到了最大程度的保护。在色谱纯化过程中，整个工艺流程简单，无需进行缓冲液置换等步骤，也无需特殊的色谱介质，并且两步色谱的回收接近30%，使得以工业化规模可溶性表达纯化PCV-ORF2蛋白成为可能，而且整个工艺过程中，均未涉及到变性剂，纯化过程和组装过程均不会对蛋白的构象产生影响和破坏病毒样颗粒的中和表位，这样生产的病毒样颗粒具有高度的免疫原性，免疫机体后会诱导产生高滴度的中和抗体，对免疫动物起到很好的保护性效果。

本研究在大肠杆菌中以可溶性表达PCV2 ORF2蛋白，并在此基础上，建立了一套高效、适宜放大的PCV2疫苗中试生产工艺。建立了一套PCV2-VLP疫苗质量研究体系，并通过动物实验对大肠杆菌来源的PCV2-VLP疫苗的有效性，稳定性进行了评价。

本发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：GI698，ER2566， BL21(DE3)， B834(DE3)， BLR(DE3)。

根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于:Tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱（例如阳离子交换色谱）、疏水相互作用色谱、吸附层析法（例如羟基磷灰石色谱）、凝胶过滤（凝胶排阻）层析、亲和层析法。

根据本发明，在本发明获得的PCV2-ORF2蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。

根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现。

根据本发明，在本发明获得的PCV2-ORF2蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH ₄ Cl、(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 中的一种或几种。优选NaCl。

根据本发明，PCV2-ORF2蛋白类病毒颗粒如下获得：将上述纯度至少50％PCV2-ORF2蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的PCV2-ORF2蛋白溶液。PCV2-ORF2的类病毒颗粒。颗粒组装的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步描述：

图1为本发明PCV ORF2蛋白表达的SDS-PAGE结果。M:分子量Marker；1:诱导前全菌；2:诱导后全菌；3: 诱导后裂解细胞上清；结果显示，PCV2 ORF2在原核表达可溶，且目的蛋白占单位菌体总蛋白的20%左右。

图2 为PCV ORF2蛋白经过分级沉淀及色谱纯化后的SDS-PAGE结果。1，经本发明纯化所得PCV2 ORF2蛋白上样1μl；2，经本发明纯化所得PCV2 ORF2蛋白上样2 μl。结果显示，经过纯化的PCV2 ORF2蛋白纯度达到了96％以上。

图3为本发明所得的PCV2 ORF2-VLPs病毒样颗粒透射电镜观察（60，000倍）结果。视野中可见大量半径为9 nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。

图4为本发明所得的PCV2 ORF2-VLPs的动态光散射观测结果。结果显示，PCV2 ORF2病毒样颗粒的水化分子动力学半径为8.72 nm，颗粒组装百分比为99%。

图5为了PCV2 ORF2-VLPs接种兔后不同阶段血清总抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一月后，总抗滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到10 ⁷ 的高水平。

序列表说明：Seq ID No.1为本发明PCV2 ORF2基因的核苷酸序列。

为本发明PCV2 ORF2基因对应的氨基酸序列。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1：具有序列1的PCV2蛋白的表达

用做模板之PCV2 ORF2基因片段的制备

经过大肠杆菌密码子优化的PCV2 ORF2基因全长由上海博亚生物技术有限公司合成。所合成的基因片段全长为702 bp。在此人工合成的PCV2 ORF2基因片段的基础上制备本发明PCV2 ORF2蛋白的模板。

基因的非融合表达载体的构建

以前一步骤所合成的PCV2 ORF2全长基因片段用做PCR反应的模板。以PCV2-F: 5’- GGA TTC CCC GTG CCC GTG AGC AAG -3’为正向引物，其5’端引入限制性内切酶BamH I位点及保护性碱基，BamH I位点序列为GGA TCC，ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子； PCV2-R: 5'-CTC GAG CA CCT CTT CAC CTT CTT C -3'为反向引物，其5’端引入限制性内切酶Xho I位点及保护性碱基。在PCR仪按照如下条件进行PCR反应：

扩增得到0.7kb左右大小特异的DNA片段，经BamH I/Xho I酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pTO-T7载体连接，得到插入PCV2 ORF2基因的阳性克隆pTO-T7-PCV2 ORF2。将连接好的质粒转化用CaCl ₂ 制备的DH5a感受态细胞中，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃ 230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。

将上述的pTO-T7-PCV2 ORF2转化40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21（DE3），涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃ 230转/分振荡培养12小时，从中取1mL菌液于-80℃冻干保存。

蛋白的大量表达

从-80℃中取出带有重组质粒pTO-T7-PCV2 ORF2的大肠杆菌菌种，接入卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，230rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃大量表达，等OD ₆₀₀ 值达到0.6后，加入0.1mM的IPTG，诱导蛋白表达，20℃过夜。

主要仪器，上海保兴生物公司50升发酵罐

校正发酵罐pH电极，配制30升培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100%。

第二天将10瓶种子液5升接入发酵罐中，温度30℃，pH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40%以上。

流加补料，将50%葡萄糖和30%酪蛋白水解物按溶质质量比2：1的比例混合。

流加速度如下：

100%速度为25ml/min

第一小时：5%速度；

第二小时：10%速度；

第三小时：20%速度；

第四小时：40%速度；

第五小时以后60%速度。

培养至菌浓度达到OD ₆₀₀ 大约10左右时将培养温度降至25℃加入4g IPTG诱导培养12小时。终浓度大约为40左右（OD ₆₀₀ ）下罐，离心收集菌体大约2.5kg。

培养基配方如下 (1升) ：蛋白胨10g, 酵母粉5g, NaCl 10g。

实施例2：纯度约70％的PCV2 ORF2蛋白的获得

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液 pH7.2， 300mM NaCl)的比例重悬菌体，采用均质机以700bar压力破碎菌体4次。JA-14转头13500rpm(28000g)，离心40min，留取上清，通过15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中PCV2 ORF2的纯度约为20%。采用硫酸铵分级分离沉淀，初用30%饱和硫胺沉淀去除部分杂蛋白，然后50%硫胺沉淀目的蛋白。用等体积的10mM磷酸缓冲液 pH7.0，10mM DTT，300mM NaCl重悬沉淀，搅拌30min。JA-14转头（Beckman J25高速离心机），13500rpm (30000g)，离心20min，离心得上清，使用0.22μm孔径滤膜过滤样品，以该样品进行下一步的色谱纯化。取20μL过滤后样品，加入5X Loading Buffer 4μL。混匀，于100℃水浴10min后取10μL于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以240V电压电泳35min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图1。通过SDS-PAGE分析可知PCV2 ORF2蛋白在通过沉淀、复溶的步骤之后，目的蛋白得到了纯化和富集，纯度达到了约50％左右。

实施例3：PCV2 ORF2的色谱纯化

PCV2 ORF2的阳离子交换色谱纯化

仪器系统：GE Healthcare 原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA纯化制备型液相色谱系统。

层析介质：Butyl Sepharose 4 Fast Flow。

柱体积：5.5cm×20cm。

缓冲液：20mM磷酸缓冲液 pH8.0，0.2M NaCl；

       20mM磷酸缓冲液 pH8.0，2M NaCl。

流速：25 ml/min。

检测器波长：280nm。

样品为3L纯度约为70％PCV2 ORF2蛋白溶液。

洗脱程序为：穿透后，1500mM NaCl洗脱杂蛋白，200mM NaCl洗脱目的蛋白，收集1000mM NaCl洗脱产物，共获得PCV2 ORF2纯化样品900mL。

的SP纯化

仪器系统：GE Healthcare 原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA纯化制备型液相色谱系统。

层析介质：SP(购自Bio-RAD)。

柱体积：5.5cm×20cm 。

缓冲液：20mM磷酸缓冲液 pH8.0，0.2M NaCl；

        20mM磷酸缓冲液 pH8.0，2M NaCl。

流速：20ml/min。

检测器波长：280nm。

样品为：Butyl Sepharose 4 Fast Flow 200mM NaCl洗脱产物。

洗脱程序为：先搜集穿透的样品，500mM NaCl洗脱杂蛋白，1000mM NaCl洗脱目的蛋白，收集1000mM NaCl洗脱产物，共获得PCV2 ORF2纯化样品800mL。

收集1000mM NaCl洗脱目的蛋白，获得纯化的PCV2 ORF2样品800mL。取经本实施例方法纯化的PCV2 ORF2样品20μL，加入5X Loading Buffer 5μL混匀，于80℃水浴10min后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以240V电压电泳40min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图2。由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为0.7mg/ml， SDS-PAGE考染纯度大于96％。

实施例4：PCV2 ORF2 VLP的形态学检测及其免疫原性测定

PCV2 ORF2病毒样颗粒透射电镜观察

仪器为日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为60，000倍。PCV2病毒样颗粒经5%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图3，可见实施例4所得样品大量半径为9 nm左右的病毒样颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。

病毒样颗粒动态光散射观察

仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪（含温度控制器），使用算法为Regulation算法。样品为实施例3所得样品。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图4。结果显示PCV2 ORF2 VLPs的水化分子动力学半径为8.39nm。

实施例5  PCV2 VLPs疫苗免疫动物的免疫保护性评价

兔：普通级，雌性，6～8 周龄。实施例3所制备的PCV2 ORF2病毒样颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为100ug/只，此后分别于4，10周各加强一次，加强免疫剂量为50ug/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种全长的PCV2 ORF2基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的PCV2 ORF2基因，其中该基因表达的蛋白能够在大肠杆菌内自组装成病毒样颗粒。

3.一种全长的PCV2 ORF2衣壳蛋白，具有如Seq ID No.2所示的序列。

4.一种含有权利要求1所述基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，所述表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

6.一种含有权利要求4表达载体的细胞。

7.一种制备纯化PCV2 ORF2基因表达的衣壳蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）在大肠杆菌表达系统中表达PCV2 ORF2基因，

（2）将表达了PCV2 衣壳蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液， 

（3）用硫酸铵分级分离：先用30%硫酸铵沉淀除去部分杂蛋白，然后用50%硫酸铵沉淀目的蛋白，

（4）将上述目的蛋白在150mM－2500mM盐溶液中重新溶解，离心沉淀得到目的蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备纯化方法，其中，将所述步骤（4）的重悬上清液通过滤膜过滤，进一步通过色谱层析纯化目的蛋白。

9.一种PCV2类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有权利要求1或2基因表达的蛋白或者包含由权利要求3的蛋白。

10.一种用于预防PCV2感染的疫苗，其包括：（1）权利要求9的PCV2类病毒颗粒，及疫苗用赋形剂或载体。

11.一种预防PCV2感染的方法，其包括将含预防有效量的权利要求1-2任一项的PCV2 cap蛋白或权利要求7的类病毒颗粒的疫苗或预防有效量的权利要求9的疫苗给予需要预防PCV2感染的猪。

Images