CN104623653A - 一种疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents
一种疫苗组合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104623653A CN104623653A CN201310556760.6A CN201310556760A CN104623653A CN 104623653 A CN104623653 A CN 104623653A CN 201310556760 A CN201310556760 A CN 201310556760A CN 104623653 A CN104623653 A CN 104623653A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- vaccine
- toxic substances
- counteracting toxic
- pcv2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 153
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 31
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 claims description 123
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 49
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 13
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 claims description 12
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- RXHSGRQJJBSBPN-UHFFFAOYSA-L [Na+].[Na+].Cl.OP([O-])([O-])=O Chemical group [Na+].[Na+].Cl.OP([O-])([O-])=O RXHSGRQJJBSBPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- QLFFCLRSMTUBEZ-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;sodium Chemical compound [Na].[Na].OP(O)(O)=O QLFFCLRSMTUBEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 127
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 126
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 48
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 35
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 21
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 19
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 17
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 13
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 9
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 8
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 7
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 6
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 6
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 5
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 5
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 5
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 5
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 description 4
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 4
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 3
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 3
- 101710113540 ORF2 protein Proteins 0.000 description 3
- 101710090523 Putative movement protein Proteins 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 3
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000951889 Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 206010004053 Bacterial toxaemia Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007882 Cellulitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 206010020741 Hyperpyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000005119 Necrotizing Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 1
- 208000013222 Toxemia Diseases 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002242 chlorocresol Drugs 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007235 immunity generation Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- AHADSRNLHOHMQK-UHFFFAOYSA-N methylidenecopper Chemical compound [Cu].[C] AHADSRNLHOHMQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- -1 water for injection compound Chemical class 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物中包括免疫量的PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原和稳定缓冲液。本发明的疫苗组合物中PCV2ORF2蛋白能以病毒样颗粒的形式稳定存在，在保存不同时间后，效果明显优于对比疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗组合物，具体地说，涉及一种抗圆环病毒疫苗组合物。
背景技术
猪圆环病毒（PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PMWS的临床特征有消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、腹泻、黄疽等。病理变化可见全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结肿大可达5～10倍；肺主要呈弥散性、间质性肺炎变化，质地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑驳状外观；肾的变化较多，可见皮质和髓质散在大小不一的白色坏死灶，由于水肿而导致其呈现蜡样外观；脾轻度肿大；大多病猪的肝有不同程度的萎缩、纤维化。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2相关的猪病，死亡率达10%～30%不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。现有技术通过全病毒灭活疫苗和PCV2的CAP蛋白制备的亚单位疫苗用于预防PMWS，然而全病毒灭活疫苗，由于PCV的细胞产量不高造成成本较高，而亚单位疫苗具有不在动物体内增殖，无外源性核酸，因此不具传染性等优点，但同时也存在纯化成本高的问题。现有技术需要一种成本低且高效的针对圆环病毒的疫苗。
制备成病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）和选择合适的佐剂是提高亚单位疫苗效力的两种常用技术手段。中国专利CN103173470A公开了一种病毒样颗粒的制备，但没有公开其疫苗产品中含有能保持稳定存在的病毒样颗粒。关于佐剂增强猪圆环病毒疫苗效力的研究，“不同佐剂对猪圆环病毒2型灭活抗原免疫效果的影响”（马涛等，中国兽医科学2011,41（06）：593-600）公开了ISA206和ISA15A为最优佐剂。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种圆环病毒疫苗，包含：圆环病毒2型病毒样颗粒抗原、佐剂和缓冲液以及药学上可以接受的载体。
本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物中包括免疫量的PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原和稳定缓冲液。
术语“圆环病毒2型病毒样颗粒抗原是指任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分，以病毒样颗粒存在。
优选地，所述PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原含量为≥30μg/ml，更优选60μg/ml。
圆环病毒的抗原含量，至少包含2μgPCV2ORF2蛋白/剂量，优选2-300μgPCV2ORF2蛋白/剂量，更优选20-150μgPCV2ORF2蛋白/剂量，更优选50-100μgPCV2ORF2蛋白/剂量，最优选60μgPCV2ORF2蛋白/剂量。
优选地，所述稳定缓冲液为磷酸氢二钠-氯化钠缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为2～100mM，氯化钠浓度为100～2000mM，pH为6.0～7.6；优选磷酸氢二钠浓度为50mM，氯化钠浓度为1100mM，pH为6.8。
更优选地，所述缓冲液的用量为疫苗组合物70%～90%重量比，优选80%。
PCV2Cap VLPs在特定的缓冲液中保持稳定，该缓冲液由磷酸氢二钠盐和氯化钠两种成分组成。
缓冲液中磷酸氢二钠盐的使用范围为2mM～100mM，优选范围为10mM～80mM，优选范围为30mM～70mM，优选范围为40mM～60mM，最优选为50mM。氯化钠的使用范围为100mM～2000mM，优选范围为400mM～1800mM，优选范围为600mM～1600mM，优选范围为800mM～1400mM，优选范围为1000mM～1200mM，最优选为1100mM。
缓冲液的用量为疫苗组合物70%～90%重量比，优选80%。
疫苗组合物pH值范围为6.0～7.6，优选范围为6.2～7.4，优选范围为6.4～7.2，优选范围为6.6～7.0，最优选为6.8。
优选地，所述疫苗组合物还包括佐剂，所述佐剂优选GEL、卡波姆。
更优选地，所述佐剂卡波姆的量为0.1-500mg/剂量，优选1～20mg/ml；或所述佐剂GEL的量为0.1g/ml。
疫苗组合物中含有佐剂，优选的为含有商品名为卡波姆（Carbomer）的聚丙烯酸，优选的法国赛比克（SEPPIC）的GEL佐剂。
本发明所述佐剂卡波姆的量为0.1-500mg/剂量，优选1～20mg剂量，更优选5～10mg/剂量，更优选1mg～3mg剂量，最优选2mg/剂量。
本发明的一种实施方式中，佐剂为赛比克（SEPPIC）的GEL佐剂，佐剂量为0.1g/剂量，每剂量为1ml。
优选地，所述疫苗组合物还包括药学上可以接受的载体，所述载体包括任何所用溶剂、分散介质、稳定剂、稀释剂、防腐剂；稀释剂包括水、磷酸盐缓冲溶液，盐水、乙醇、甘油，等渗剂包括氯化钠、右旋糖苷、葡萄糖；稳定剂包括蛋白、乙二胺四乙酸二钠。
.术语“药学上可以接受的载体包括任何所用溶剂、分散介质、稳定剂、稀释剂、防腐剂。例如稀释剂包括但不限于水、磷酸盐缓冲溶液，盐水、乙醇、甘油，等渗剂包括但不限于氯化钠、右旋糖苷、葡萄糖。稳定剂包括蛋白或乙二胺四乙酸二钠。
组合物中还可以含有抗生素或防腐剂，包括，例如：庆大霉素、硫柳汞、或氯甲酚。本领域技术人员公知可以选用不同类别的抗生素或防腐剂。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：
1）表达PCV2Cap蛋白；2）配制所述稳定缓冲液；3）混合所述PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原和稳定缓冲液。
本发明疫苗组合物的制备方法，先加入佐剂，再加入用缓冲液稀释的PCV2抗原液，最后加入药学上可以接受的载体。
本发明的再一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪圆环相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述应用包括距保护期提前14天施用所述疫苗组合物免疫仔猪。
由上可以看出，本发明的用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物至少有以下优点：
1.本发明的疫苗组合物中PCV2ORF2蛋白以病毒样颗粒的形式稳定的存在，提高疫苗的效力。
2.本发明当PCV2ORF2蛋白量达到30μg/ml时，能够清除病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
攻毒所用的PCV2SH株，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2389。公开于中国专利申请CN101240264A。
实施例1PCV2亚单位疫苗的制备及检验
1、Cap蛋白稳定缓冲液的制备
本实施例采用最优选配方制备缓冲液，具体步骤如下，使用注射用水配制浓度为50mM磷酸氢二钠溶液，磷酸调节pH至6.8，加入氯化钠使其终浓度为1100mM，溶液配制完全后使用0.22μm滤膜过滤，室温封闭保存备用。详细配方见下表1。
表1VLPs稳定缓冲液的配制（1000ml）
2、疫苗的制备
在灭菌烧杯中加入称量的GEL佐剂。按照专利CN103173470A实施例1～3制备PCV2蛋白病毒样颗粒抗原，含量为1.3mg/ml。按照表2的量用Cap蛋白稳定缓冲液稀释，制备5种不同Cap蛋白含量的PCV2亚单位疫苗（见表2），用搅拌混匀器以500r/min搅拌10min混匀，并在搅拌结束前1min加入1%的硫柳汞，使其终浓度为重量比0.01%（见表3），分装。
表2不同Cap蛋白含量的疫苗
| 疫苗 | Cap蛋白含量（μg/ml） |
| V1 | 60 |
| V2 | 30 |
| V3 | 10 |
| V4 | 5 |
| V5 | 2 |
表3疫苗配制（100ml）
| 疫苗 | 缓冲液 | Cap蛋白（1.3mg/ml） | GEL01佐剂 | 1%硫柳汞 |
| V1 | 85.4ml | 4.6ml | 10g | 1ml |
| V2 | 87.7ml | 2.3ml | 10g | 1ml |
| V3 | 89.2ml | 0.8ml | 10g | 1ml |
| V4 | 89.6ml | 0.4ml | 10g | 1ml |
| V5 | 89.8ml | 0.2ml | 10g | 1ml |
3、疫苗的检验
性状检验 置2-8℃24小时后取出观察，记录结果。
无菌检验 按《中国兽药典》（2010年版）附录进行检验。每种疫苗取1ml接种TG小瓶，3日后吸取培养物，分别接种各2支，每支0.2ml，1支置25℃，1支置37℃，另取1支GP小管，接种0.2ml，置25℃，均培养5日，观察结果。
4、结果
制备的5种不同Cap蛋白含量的PCV2亚单位疫苗，置2-8℃，24小时后取出观察，呈乳白色均一分布。
制备的5种不同Cap蛋白含量的PCV2亚单位疫苗接种TG小瓶，37℃培养3日后培养基澄清，没有出现污染，将培养物转接TG小管、GA斜面和GP小管后，分别置37℃和25℃培养5日，以上培养基没有出现浑浊污染，证明制备的5批不同Cap蛋白含量的PCV2亚单位疫苗无菌检验合格。
实施例2PCV2亚单位疫苗防治PCV2感染的功效
1、不同剂量PCV2亚单位疫苗免疫仔猪效果比较研究
本实施例测试了5种PCV2候选疫苗的效果，进一步确定了接触PCV2强毒株后的效率参数。将35只初生不吃初乳的9-14日龄小猪随机分成相同大小的7组，每组5头。第1组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，第2组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V2（30μg/ml）1ml，第3组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V3（10μg/ml）1ml，第4组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V4（5μg/ml）1ml，第5组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V5（2μg/ml）1ml，第6组不免疫，作为攻毒对照组，第7组不免疫、不攻毒，作为空白对照组。免疫前及免疫后7d、14d、21d、28d各采血，分离血清。免疫后25日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。免疫后28日称重、攻毒，第1、2、3、4、5、6、7、8组各用PCV2SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒后第4、7日，对所有猪再次分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒后7、14、21、28日对所有猪只采血。攻毒后连续观察28日，每日测量体温及记录临床症状，于第28日称重，剖杀，观察病理变化并取新鲜组织（扁桃体、肺脏、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及腹股沟淋巴结）一份置-20℃保存，一份用10%福尔马林固定。对新鲜组织和福尔马林固定组织分别进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和IHC检测，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。根据增重情况和PCV2抗原检测结果来评估保护效果。表4列出了此实施例的总体研究设计。
表4仔猪分组及处理
结果
平均每日体重增量（ADWG）结果见表5。第7组作为不免疫、不攻毒阴性对照组其ADWG最高（1.07+0.20kg/日），免疫疫苗V1和V2的第1、2组其ADWG（1.05+0.22kg/日）与第7组没有明显差别，最低的是不免疫的第6组（0.48+0.30kg/日），其余不同抗原含量疫苗免疫组ADWG较第7组有不同程度差异。由此可见，免疫疫苗V2（30μg/ml）后即可刺激机体产生意想不到的保护力，与疫苗V3（10μg/ml）相比，有显著差异（P<0.01)，这是我们之前没有想到的。免疫疫苗V1和V2相比，虽然抗原含量提升了1倍，但2组仔猪的ADWG差距并不明显（P＞0.05），由此可见，抗原含量达到一定的量（30μg/ml），就可以对机体产生最佳的保护力。
表5组间平均每日体重增量（ADWG）结果比较
PCV2抗体检测结果见表7。在免疫0日所有仔猪都是PCV2抗体阴性，免疫后14日、28日以及攻毒后14日和28日，第1组和第2组仔猪PCV2抗体效价最高，第7组仔猪PCV2抗体一直为阴性，其余疫苗免疫组抗体水平差异不明显。由此可见，免疫不同抗原含量的疫苗，刺激机体产生的抗体水平是不一样的，但是，免疫疫苗V2（30μg/ml）后刺激机体产生的抗体水平远远高于疫苗V3（10μg/ml），差异明显（P＜0.01），这是我们之前没有想到的。免疫疫苗V1和V2相比，虽然抗原含量提升了1倍，但就产生的抗体水平而言，差异不明显（P＞0.05），由此可见，抗原含量达到一定的量（30μg/ml），就可以刺激机体产生最佳的抗体保护力。
PCV2抗原检测结果见表6。攻毒前所有组别仔猪血清PCV2抗体检测均为阴性。攻毒后第14日，第7组PCV2抗原检测为阴性，第1组和第2组PCV2抗原检出量最低。攻毒后第28日，第1组、第2组和第7组PCV2抗原检测为阴性，其余免疫组抗原均有不同程度检出。由此可见，免疫不同抗原含量的疫苗后均可对机体产生一定的保护力，但是，免疫疫苗V2（30μg/ml）后刺激机体产生的抗体可以发挥意想不到的消除病毒的作用，与疫苗V3（10μg/ml）相比，其作用显著，这是我们之前没有想到的。免疫疫苗V1和V2相比，虽然抗原含量提升了1倍，但在消除体内PCV2病毒能力而言，差异不明显（P＞0.01），由此可见，抗原含量达到一定的量（30μg/ml），就可以有效消除体内PCV2病毒含量。
表6组间PCV2抗原检测结果比较（荧光PCR）
表7组间PCV2抗体检测结果比较（ELISA）
攻毒前所有猪只没有出现任何明显的临床症状，攻毒后第6组猪只出现连续体温超过40℃现象，并出现1头死亡，死亡前精神不振、食欲减退、呼吸急促、连续高烧。疫苗免疫组仔猪均没有出现死亡现象，但第4组和第5组出现个别仔猪体温超过40℃。剖杀后通过免疫组化检测PCV2抗原，第6组仔猪脏器检出率为100%，第7组、第1组和第2组检出率为0%，其余组别检出率在40%～60%。由此可见，免疫不同抗原含量的疫苗后均可对机体产生一定的保护力，但是，免疫疫苗V2（30μg/ml）后刺激机体产生的保护力是意想不到，与疫苗V3（10μg/ml）相比，其发挥的作用显著，这是我们之前没有想到的。免疫疫苗V1和V2相比，虽然抗原含量提升了1倍，但对仔猪的保护力差异并不明显（P＞0.01），由此可见，抗原含量达到一定的量（30μg/ml），就可以有效保护仔猪。
详细结果见表8。
表8组间PCV2临床症状及剖检症状比较
2、PCV2亚单位疫苗免疫持续期功效
将14-21日龄初生不吃初乳的健康易感仔猪60头，随机分为12组，每组5头。第1-4组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，第5-8组不免疫、只攻毒，作为攻毒对照，第9-12组不免疫、不攻毒作为空白对照。免疫日及免疫后7d、14d、21d、28d各采血，分离血清。免疫后28日（第1组、第5组和第9组）、60日（第2组、第6组和第10组）、90日（第3组、第7组和第11组）和120日（第4组、第8组和第12组）分别攻毒。每次攻毒用PCV2SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒前3日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒前称重，攻毒后第4、7日，对所有猪再次分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒后7、14、21、28日对所有猪只采血。攻毒后连续观察28日，每日测量体温及记录临床症状，于第28日称重，剖杀，观察病理变化并取新鲜组织（扁桃体、肺脏、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及腹股沟淋巴结）一份置-20℃保存，一份用10%福尔马林固定。对新鲜组织和福尔马林固定组织分别进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和IHC检测，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。根据增重情况和PCV2抗原检测结果来评估保护效果。
表9仔猪分组及处理
| 组别 | 数量 | 免疫方式及剂量 | 内容 |
| 1 | 5头 | 颈部肌肉注射疫苗V1-60μg/ml1ml | 免疫后28日攻毒 |
| 2 | 5头 | 颈部肌肉注射疫苗V1-60μg/ml1ml | 免疫后60日攻毒 |
| 3 | 5头 | 颈部肌肉注射疫苗V1-60μg/ml1ml | 免疫后90日攻毒 |
| 4 | 5头 | 颈部肌肉注射疫苗V1-60μg/ml1ml | 免疫后120日攻毒 |
| 5 | 5头 | 非免疫，攻毒 | 免疫后28日攻毒 |
| 6 | 5头 | 非免疫，攻毒 | 免疫后60日攻毒 |
| 7 | 5头 | 非免疫，攻毒 | 免疫后90日攻毒 |
| 8 | 5头 | 非免疫，攻毒 | 免疫后120日攻毒 |
| 9 | 5头 | 非免疫，非攻毒 | 与第1、5组同时剖杀 |
| 10 | 5头 | 非免疫，非攻毒 | 与第2、6组同时剖杀 |
| 11 | 5头 | 非免疫，非攻毒 | 与第3、7组同时剖杀 |
| 12 | 5头 | 非免疫，非攻毒 | 与第4、8组同时剖杀 |
结果
平均每日体重增量（ADWG）结果显示，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）其ADWG为1.12+0.20kg/日左右，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）其ADWG为1.17+0.17kg/日左右，不免疫的组别（第5组-第8组）其ADWG为0.40+0.34kg/日左右。由此可见，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，可刺激机体产生有效的保护力，消除强毒攻击带来的不良影响，保证仔猪健康生长。更值得一提的是，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，其产生的有效保护力可持续120日，从而保证仔猪经过1次免疫，在整个育肥阶段均可防止强毒攻击。
表10 组间平均每日体重增量（ADWG）结果比较
PCV2抗原检测结果见表11。攻毒前所有组别仔猪血清PCV2抗原检测均为阴性。攻毒后第14日，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗原检测为阴性，不免疫、攻毒组（第5组-第8组）PCV2抗原检出量最高，为2.75×106copy/ml左右，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）PCV2抗原为2.17×102copy/ml左右。攻毒后第28日，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）和免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）PCV2抗原检测为阴性，不免疫、攻毒组（第5组-第8组）PCV2抗原检出为5.71×109copy/ml左右。由此可见，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，机体产生的抗体可迅速中和攻击强毒，预防仔猪发病。更值得一提的是，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，其产生的中和抗体可持续120日，从而保证仔猪经过1次免疫，在整个育肥阶段均可防止强毒攻击。
PCV2抗体检测结果见表12。在免疫0日所有血清都是PCV2抗体阴性，免疫后第14日，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）PCV2抗体效价最高，为2560左右，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性。免疫后第28日，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）效价最高，为18000左右，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性。攻毒后14日，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）效价最高，为16800左右。攻毒后第28日，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）效价最高，为20160左右。由此可见，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，可刺激机体迅速产生抗体，抵抗强毒攻击，预防仔猪发病。更值得一提的是，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，其产生的有效保护力可持续120日，从而保证仔猪经过1次免疫，在整个育肥阶段均可防止强毒攻击。
表11组间PCV2抗原检测结果比较（荧光PCR）
表12组间PCV2抗体检测结果比较（ELISA）
攻毒前所有猪只没有出现任何明显的临床症状，不免疫、攻毒组（第5组-第8组）猪只出现连续体温超过40℃现象，并出现死亡现象，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）和免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）仔猪一切正常。剖杀后通过免疫组化检测PCV2抗原，不免疫、攻毒组（第5组-第8组）仔猪脏器检出率为100%，不免疫、不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）检出率为0%，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）检出率为0%。详细结果见表13。
表13组间PCV2临床症状及剖检症状比较
3、PCV2亚单位疫苗免疫产生期功效
将14-21日龄初生不吃初乳的健康易感仔猪30头，随机分为6组，每组5头。试验0日第1组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，试验第7日第2组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，试验第14日第3组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，试验第21日第4组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，第5组仔猪不免疫，作为攻毒对照组，第6组不免疫、不攻毒，作为空白对照组。试验第28日所有仔猪攻毒，攻毒用PCV2SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒前3日、攻毒后第4、7日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时采血。攻毒后连续观察28日，每日测量体温及记录临床症状，于第28日采血，称重，剖杀，观察病理变化并取新鲜组织（扁桃体、肺脏、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管及支气管淋巴结等异常病变组织）一份置-20℃保存，一份用10%福尔马林固定。对新鲜组织和福尔马林固定组织分别进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和IHC检测，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。根据增重情况和PCV2抗原检测结果来评估保护效果。
表14仔猪分组及处理
结果
平均每日体重增量（ADWG）结果显示，不免疫、不攻毒阴性对照组（第6组）其ADWG为1.04+0.37kg/日，不免疫、攻毒对照组（第5组）其ADWG为0.51+0.22kg/日，免疫疫苗V17日的组别（第4组）其ADWG为0.59+0.30kg/日，与攻毒对照组仔猪ADWG接近，免疫疫苗V114日的组别（第3组）其ADWG为0.87+0.20kg/日，其ADWG高于攻毒对照组，免疫疫苗V128日的组别（第1组）其ADWG最高，为1.13+0.27kg/日。由此可见，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，在28日内，其产生的抗体是不断升高的。
表15组间平均每日体重增量（ADWG）结果比较
PCV2抗原检测结果见表16。攻毒前所有组别仔猪血清PCV2抗原检测均为阴性。攻毒后第14日，不免疫、不攻毒阴性对照组（第6组）PCV2抗原检测为阴性，不免疫、攻毒组（第5组）PCV2抗原检出量最高，为3.51×106copy/ml左右，免疫疫苗V1的组别随着免疫时间的延长，PCV2在仔猪体内复制的速度也受到抑制，免疫后28日攻毒仔猪体内病毒含量最低，为1.35×102copy/ml，免疫后7日攻毒仔猪体内病毒含量较高，为3.11×104copy/ml。攻毒后第28日，不免疫、不攻毒阴性对照组（第6组）、免疫疫苗V1后28日的组别（第1组）和免疫疫苗V1后21日的组别（第2组）PCV2抗原检测为阴性，免疫疫苗V1后14日的组别（第3组）和免疫疫苗V1后7日的组别（第4组）PCV2抗原检测分别为1.06×102copy/ml和5.25×103copy/ml，不免疫、攻毒组（第5组）PCV2抗原检出为6.04×109copy/ml左右。由此可见，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，在不同的时间机体产生的抗体对病毒的中和能力是不一样的，但整体而言，免疫时间超过14日后，机体的PCV2抗体会有效中和病毒，并在一定的时间内将病毒消除干净，有效保护机体。
PCV2抗体检测结果见表17。整个试验阶段，不免疫、不攻毒阴性对照组（第6组）PCV2抗体均为阴性，不免疫、攻毒对照组（第5组）PCV2抗体在攻毒前为阴性，攻毒后转为阳性并持续升高，免疫疫苗V1的仔猪随着免疫时间的延长，其PCV2抗体水平也持续升高，攻毒后PCV2抗体短暂下降或上升缓慢，但总体呈上升趋势。由此可见，免疫疫苗V1（60μg/ml）后，在不同的时间机体产生的抗体水平是不一样的，但整体而言是呈快速上升趋势的。同时，免疫后14日机体产生的抗体水平较高，可有效抵抗强毒攻击。
表16组间PCV2抗原检测结果比较（荧光PCR）
表17.组间PCV2抗体检测结果比较（ELISA）
攻毒前所有猪只没有出现任何明显的临床症状，不免疫、攻毒组（第5组）猪只出现连续体温超过40℃现象，并出现死亡现象，不免疫、不攻毒阴性对照组（第6组）仔猪一切正常，免疫疫苗V128日后攻毒和免疫21日后攻毒的仔猪均未出现体温升高和死亡，免疫疫苗V1后14日攻毒和7日后攻毒的仔猪出现个别体温升高。剖杀后通过免疫组化检测PCV2抗原，不免疫、攻毒组（第5组）仔猪脏器检出率为100%，不免疫、不攻毒阴性对照组（第6组）检出率为0%，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）检出率为0%～20%。详细结果见表18。
表18组间PCV2临床症状及剖检症状比较
4、PCV2亚单位疫苗免疫后抗体消长与病毒血症之间的关系比较
将14-21日龄初生不吃初乳的健康易感仔猪20头，随机分为4组，每组5头。第1、3组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，第2组不免疫作为非免疫、攻毒对照组，第4组不免疫、不攻毒作为空白对照。免疫日及免疫后7d、14d、21d、28d各采血，分离血清。免疫后28日第1组和第2组分别攻毒。每次攻毒用PCV2SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒前3日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒前称重，攻毒后第4、7日，对所有猪再次分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒后7、14、21、28日对所有猪只采血。攻毒后连续每周采血，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。第3组和第4组免疫后连续每周采血，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。
表19仔猪分组及处理
结果
免疫疫苗V1后，仔猪PCV2抗体可持续产生18周，且抗体水平最高可达到102400，不免疫仔猪抗体水平持续为阴性。免疫仔猪攻毒后抗体出现短暂的下降，随后有出现一个上升，并持续存在至18周，非免疫仔猪攻毒后抗体上升和持续水平较免疫攻毒组差。由此可见，免疫疫苗V1后，刺激机体产生的抗体水平高且持续时间长，依据我们的实验结果，抗体持续可达18W之久。
免疫疫苗V1后，PCV2在仔猪体内的复制得到有效的抑制，病毒含量随着时间的延长快速降低，在攻毒后28日检测不到病毒的存在。不免疫、攻毒仔猪体内病毒含量持续升高，攻毒后5W病毒量最高，可达4.74×1014copy/ml,。不攻毒仔猪抗原检测一直为阴性。由此可见，免疫疫苗V1后，机体产生的抗体可有效抑制病毒复制，缩短病毒血症持续的时间。
实施例3PCV2亚单位疫苗稳定性研究
中国农业科学院兰州兽医研究所尹双辉博士学位论文《猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究》报道，其利用大肠杆菌表达系统，制备的PCV2Cap VLPs作为抗原接种猪，可在免疫后7日发生抗体转阳，直到免疫后28日，抗体仍表现为上升趋势。依据其技术方案和路线，我们构建了His-SUMO-Cap，并经过亲和层析纯化得到天然Cap蛋白。用弗氏完全佐剂乳化抗原后，作为对比疫苗Va进行PCV2亚单位疫苗稳定性相关研究。
专利申请CN103122352A公开了一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法。该方法利用杆状病毒表达系统构建得到重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，该重组杆状病毒可高效表达PCV2ORF2蛋白并形成病毒样颗粒，同时用该重组杆状病毒表达包装形成的病毒样颗粒制备亚单位疫苗，免疫28日龄仔猪后可诱导产生特异性免疫反应，并能完全保护猪体免受圆环病毒强毒攻击。该发明构建的一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒，被命名为重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2，该病毒含有PCV2免疫原性基因ORF2，该病毒于2012年8月16日送交中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为：CCTCC NO：V201238，分类命名：重组杆状病毒QP-Ac-PCV3ORF2RecominantAutographa californica multiple NucleopolyhedrovirusQP-Ac-PCV3ORF2，地址：中国武汉·武汉大学。依据其技术方案和路线，我们制备了对比疫苗Vb，进行PCV2亚单位疫苗稳定性相关研究。
疫苗的制备
实施例1制备的疫苗V1和V2，对比文献制备的疫苗描述为Va和Vb。以及按照表20制备的疫苗V1’：
表20疫苗配制（100ml）
VLPs稳定性比较
将制备的PCV2亚单位疫苗V1、V2、V1’、Va（60μg/ml）和Vb（60μg/ml）分别置于2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月，取出后分别进行物理性状测定。
对PCV2ORF2VLP（Virus like particles）的形态学检测采用日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为60,000倍，PCV2病毒样颗粒经5%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷碳的铜网上进行观察。病毒样颗粒动态光散射观察采用美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪（含温度控制器），使用算法为Regulation算法，样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。
结果
疫苗V1和V2放置不同时间后，其病毒样颗粒形态依旧完整，大小均一，呈现空心结构。其水化分子动力学半径为8.39nm。而V1’，Va和Vb疫苗，在电镜下无法观察到完整的病毒样颗粒，同样也无法对其进行病毒样颗粒动态光散射观察。为保证该对比试验有效进行，我们将用于制备疫苗Va和Vb的Cap蛋白分别直接放置2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月，取出后进行物理性状测定。结果显示：没有弗氏完全佐剂影响的情况下，2种Cap蛋白直接放置2～8℃保存1个月其病毒样颗粒依旧完整，但随着2～8℃保存时间的延长，用于制备疫苗Va和Vb的Cap蛋白其病毒样颗粒逐步降解，并在放置6个月后基本降解完全，看不到完整的病毒样颗粒；与此同时，其水化分子动力学半径也随着放置时间的延长逐步变小。由此可见，本研究制备的疫苗V1和V2与对比疫苗Va和Vb相比，2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月，甚至27个月，其物理稳定性都明显优于对比疫苗Va和Vb。
疫苗保存期研究
将制备的PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）、Va（60μg/ml）和Vb（60μg/ml）置于2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月时分别进行仔猪效力检验。每次将14-21日龄初生不吃初乳的健康易感仔猪25头，随机分为5组，每组5头。第1组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗V1（60μg/ml）1ml，第2组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗Va（60μg/ml）1ml，第3组颈部肌肉注射PCV2亚单位疫苗Vb（60μg/ml）1ml，第4组不免疫、只攻毒，作为攻毒对照，第5组不免疫、不攻毒作为空白对照。免疫日及免疫后7d、14d、21d、28d各采血，分离血清。免疫后28日第1、2、3和4组分别攻毒。每次攻毒用PCV2SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒前3日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒前称重，攻毒后第4、7日，对所有猪再次分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒后7、14、21、28日对所有猪只采血。攻毒后连续观察28日，每日测量体温及记录临床症状，于第28日称重，剖杀，观察病理变化并取新鲜组织（扁桃体、肺脏、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及腹股沟淋巴结）一份置-20℃保存，一份用10%福尔马林固定。对新鲜组织和福尔马林固定组织分别进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和IHC检测，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。根据增重情况和PCV2抗原检测结果来评估保护效果。
表21仔猪分组及处理
结果
平均每日体重增量（ADWG）结果见表22。不免疫、不攻毒阴性对照组其ADWG最高，免疫疫苗V1的组别其ADWG较不免疫、不攻毒阴性对照组差别不大，免疫疫苗Va和Vb的组别ADWG较不免疫、不攻毒阴性对照组稍低，不免疫、攻毒的组别ADWG最低。随着疫苗保存时间的延长，免疫疫苗V1的组别其ADWG变化不大，但免疫疫苗Va和Vb的组别其ADWG出现明显的变化，在保存6个月后其ADWG出现轻微下降，保存12个月后其ADWG迅速下降，保存18个月后基本没有保护力，与不免疫、攻毒组基本一致。由此可见，本研究制备的疫苗V1与对比疫苗Va和Vb相比，2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月时分别进行仔猪效力检验，效果明显优于对比疫苗Va和Vb。
表22组间平均每日体重增量（ADWG）结果比较
PCV2抗体检测结果见表24。免疫后及攻毒后不同时间，免疫疫苗V1的组别PCV2抗体效价均高于免疫疫苗Va和Vb的组别。疫苗保存不同时间后，免疫疫苗V1的组别PCV2抗体效价变化不明显，但免疫疫苗Va和Vb的组别PCV2抗体效价下降明显。由此可见，本研究制备的疫苗V1与对比疫苗Va和Vb相比，2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月时分别进行仔猪效力检验，效果明显优于对比疫苗Va和Vb。
PCV2抗原检测结果见表23。攻毒后不同时间，免疫疫苗V1的组别仔猪病毒血症持续时间及病毒含量均低于免疫疫苗Va和Vb的组别。疫苗保存不同时间后，免疫疫苗V1后消除病毒血症的能力变化不明显，但免疫疫苗Va和Vb后消除病毒血症的能力下降明显。由此可见，本研究制备的疫苗V1与对比疫苗Va和Vb相比，2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月时分别进行仔猪效力检验，效果明显优于对比疫苗Va和Vb。
表23组间PCV2抗原检测结果比较（荧光PCR）
表24组间PCV2抗体检测结果比较（ELISA）
临床症状及免疫组化检测结果见表25。攻毒后，免疫疫苗V1的组别仔猪发热、死亡及免疫组化检出率均低于免疫疫苗Va和Vb的组别。疫苗保存不同时间后，免疫疫苗V1后对仔猪的保护力变化不明显，但免疫疫苗Va和Vb后对仔猪的保护力下降明显。由此可见，本研究制备的疫苗V1与对比疫苗Va和Vb相比，2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月时分别进行仔猪效力检验，效果明显优于对比疫苗Va和Vb。
表25组间PCV2临床症状及剖检症状比较
实施例4不同缓冲液的亚单位疫苗稳定性研究
不同缓冲液的配制
PCV2Cap VLPs在特定的缓冲液中保持稳定，该缓冲液的2种成分磷酸氢二钠盐和氯化钠，分别起到pH调节剂和离子强度增强剂的作用。磷酸氢二钠盐的使用范围为2mM～100mM，优选范围为10mM～80mM，优选范围为30mM～70mM，优选范围为40mM～60mM，最优选为50mM。氯化钠的使用范围为100mM～2000mM，优选范围为400mM～1800mM，优选范围为600mM～1600mM，优选范围为800mM～1400mM，优选范围为1000mM～1200mM，最优选为1100mM。pH值范围为6.0～7.6，优选范围为6.2～7.4，优选范围为6.4～7.2，优选范围为6.6～7.0，最优选为6.8。为进一步验证不同浓度范围和pH值的缓冲液均可以保持VLPs的长期稳定性，我们制备了不同浓度范围和pH值的缓冲液，并将其分别制备成疫苗。与此同时，我们制备了一组添加卡波姆溶液的疫苗，证明该缓冲液可与以卡波姆为主要成分的佐剂同时使用保持疫苗的稳定性。详细配方见表26。
卡波姆溶液的配制：将卡波姆溶解于去离子水，制备成20mg/ml的溶液。
表26疫苗配制（100ml）
将制备的3组PCV2亚单位疫苗分别置于2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月，取出后分别进行物理性状测定。
对PCV2ORF2VLP的形态学检测采用日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为60,000倍，PCV2病毒样颗粒经5%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷碳的铜网上进行观察。病毒样颗粒动态光散射观察采用美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪（含温度控制器），使用算法为Regulation算法，样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。
结果
疫苗1、2和3放置不同时间后，其病毒样颗粒形态依旧完整，大小均一，呈现空心结构。其水化分子动力学半径为8.39nm，没有发生任何变化。由此可见，不同浓度范围和pH值的缓冲液均可以保持VLPs的长期稳定性，以卡波姆为主要成分的佐剂对VLPs的稳定性无影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物中包括免疫量的PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原和稳定缓冲液。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原含量为≥30μg/ml，优选60μg/ml。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述稳定缓冲液为磷酸氢二钠-氯化钠缓冲液，其中磷酸氢二钠浓度为2～100mM，氯化钠浓度为100～2000mM，pH为6.0～7.6；优选磷酸氢二钠浓度为50mM，氯化钠浓度为1100mM，pH为6.8。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述缓冲液的用量为疫苗组合物70%～90%重量比，优选80%。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括佐剂，所述佐剂优选GEL、卡波姆。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂卡波姆的量为0.1-500mg/剂量，优选1～20mg/ml；或所述佐剂GEL的量为0.1g/ml。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括药学上可以接受的载体，所述载体包括任何所用溶剂、分散介质、稳定剂、稀释剂、防腐剂；稀释剂包括水、磷酸盐缓冲溶液，盐水、乙醇、甘油，等渗剂包括氯化钠、右旋糖苷、葡萄糖；稳定剂包括蛋白、乙二胺四乙酸二钠。
8.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：
1）表达PCV2Cap蛋白；
2）配制所述稳定缓冲液；
3）混合所述PCV2Cap蛋白病毒样颗粒抗原和稳定缓冲液。
9.根据权利要求1～7任一项的疫苗组合物在制备预防和治疗猪圆环相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述应用包括距保护期提前14天施用所述疫苗组合物免疫仔猪。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310556760.6A CN104623653B (zh) | 2013-11-08 | 2013-11-08 | 一种疫苗组合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310556760.6A CN104623653B (zh) | 2013-11-08 | 2013-11-08 | 一种疫苗组合物及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104623653A true CN104623653A (zh) | 2015-05-20 |
| CN104623653B CN104623653B (zh) | 2017-08-01 |
Family
ID=53203208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310556760.6A Active CN104623653B (zh) | 2013-11-08 | 2013-11-08 | 一种疫苗组合物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104623653B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107308446A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-11-03 | 瑞普（保定）生物药业有限公司 | 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法 |
| WO2018196836A1 (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-01 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173470A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-26 | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 | 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 |
| CN103285387A (zh) * | 2004-12-30 | 2013-09-11 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法 |
-
2013
- 2013-11-08 CN CN201310556760.6A patent/CN104623653B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103285387A (zh) * | 2004-12-30 | 2013-09-11 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法 |
| CN103173470A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-26 | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 | 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018196836A1 (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-01 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用 |
| CN107308446A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-11-03 | 瑞普（保定）生物药业有限公司 | 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104623653B (zh) | 2017-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105087506B (zh) | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 | |
| CN104250640A (zh) | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN105451765A (zh) | 猪圆环病毒2型(pcv2)亚单位疫苗 | |
| CN111748529B (zh) | 猪伪狂犬病病毒毒株及其应用 | |
| CN105018433A (zh) | 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN109207436B (zh) | 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用 | |
| CN102727884B (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病二联活疫苗及其制备方法 | |
| CN108251382B (zh) | 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 | |
| CN103667196A (zh) | 含有猪圆环病毒2型抗原与猪流感抗原的疫苗组合物 | |
| CN102727883B (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟二联疫苗及其用途 | |
| CN110893235A (zh) | 一种鲫造血器官坏死病灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN104623653A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法 | |
| CN105802921B (zh) | 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其构建方法和应用 | |
| CN103059142B (zh) | 猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的重组蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN116120468B (zh) | 一种预防禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗及其制备方法 | |
| CN113384692A (zh) | 鸭呼肠弧病毒、鸭圆环病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN106929480B (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 | |
| CN104288760A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN104548083B (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN102727882A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病的三联活疫苗及其制备方法 | |
| CN110343670B (zh) | 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用 | |
| CN1202251C (zh) | 传染性法氏囊病病毒(ibdv)多聚蛋白基因(vp2/vp4/vp3)真核表达质粒及dna疫苗 | |
| CN104288762A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN106520623A (zh) | 一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株及其应用 | |
| CN107686833B (zh) | 一种猪细小病毒毒株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Tian Kegong Inventor after: Yuan Yuren Inventor after: Sun Jinzhong Inventor after: Mo Xiaobing Inventor after: Zhang Xuke Inventor before: Zhang Xuke Inventor before: Yuan Yuren Inventor before: Sun Jinzhong Inventor before: Mo Xiaobing Inventor before: Tian Kegong |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 471000 No. 5 Lingbo Road, Luoyang High-tech Zone, Henan Province Patentee after: PULIKE BIOLOGICAL ENGINEERING, Inc. Country or region after: China Patentee after: Aidi Weixin (Suzhou) Biological Products Co.,Ltd. Address before: 471000 No. 5 Lingbo Road, Luoyang High-tech Zone, Henan Province Patentee before: PULIKE BIOLOGICAL ENGINEERING, Inc. Country or region before: China Patentee before: SA BIOTECH (SUZHOU) Pte. Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240506 Address after: 471000 No. 5 Lingbo Road, Luoyang High-tech Zone, Henan Province Patentee after: PULIKE BIOLOGICAL ENGINEERING, Inc. Country or region after: China Patentee after: Sihui Biotechnology (Jiangsu) Co.,Ltd. Address before: 471000 No. 5 Lingbo Road, Luoyang High-tech Zone, Henan Province Patentee before: PULIKE BIOLOGICAL ENGINEERING, Inc. Country or region before: China Patentee before: Aidi Weixin (Suzhou) Biological Products Co.,Ltd. |