CN104288762A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疫苗组合物,该疫苗组合物含有免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的副猪嗜血杆菌抗原、免疫量的猪圆环病毒2型抗原以及兽医学上可接受的载体。该疫苗组合物能有效地同时防治猪瘟、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病,其一次注射即可达到单苗注射2次的免疫效果,副反应小,免疫期长,耗时少、费力少。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗组合物。
背景技术
猪瘟是猪的一种急性、热性、高度接触性传染病,主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。早年又称猪霍乱,对猪危害极为严重,给养猪业造成重大损失。
猪圆环病毒(Porcine circovirus,缩写:PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型,即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒,它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原,最早发现于加拿大(1991),很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行,除PMWS外,PDNS(猪皮炎与肾病综合征)、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病,死亡率10%~30%不等,较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%,给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)是猪Glasser’S病的病原体,猪上呼吸道的一种共栖菌,它可在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。目前,我国很多省市患病猪群中均可分离获得副猪嗜血杆菌,该菌可影响从2周龄的哺乳仔猪到4月龄的育肥猪,主要在断奶后和保育阶段发病,多见于5-8周龄的猪,发病率在10%-15%,严重时死亡率高达50%,已成为保育猪死亡的主要原因之一,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。
目前这三种病原常常侵袭猪只,存在混合感染的情况,进一步加剧了发病死亡情况,给养殖业带来了巨大的风险。解决这个问题最有效、直接的方式是进行疫苗免疫,猪瘟疫苗常用免疫程序是30-35日龄首免,60-70日龄二免;猪圆环疫苗常用免疫程序为14-21日龄首免,间隔2周二免;副猪嗜血杆菌病疫苗常用免疫程序为3-4周龄首免,2周后二免。三种疫苗在应用时都需要进行二次免疫,增加了工作的强度,多次免疫也易于造成猪群的应激反应。
目前尚没有猪瘟、猪圆环病毒和副猪嗜血杆菌的三联组合疫苗。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供一种含有猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌与猪圆环病毒抗原的三联混合疫苗及其制备方法,有效地同时防治猪瘟、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病,达到一针多防的效果,其一次注射即可达到单苗注射2次的免疫效果,副反应小,免疫期长,耗时少、费力少。该发明经济实用,简化了免疫程序,降低了防疫成本和冷链运输的成本。
因此,本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物含有免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的副猪嗜血杆菌抗原、免疫量的猪圆环病毒2型抗原以及兽医学上可接受的载体。
优选地,所述猪瘟抗原是猪瘟全病毒抗原,优选灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪瘟病毒抗原,含有至少猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒,任何其它含至少猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽。优选地,本发明疫苗组合物中,所述猪瘟病毒为减毒形式的全病毒抗原,可以是选自细胞源猪瘟病毒、兔源猪瘟病毒、脾淋源猪瘟病毒中的一种或几种。
所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种,并且,所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原,含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒,任何至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成份。
本发明中,所述猪圆环病毒2型抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地,本发明疫苗组合物中,所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的全病毒抗原,可以是江苏南农高科猪圆环病毒2型灭活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北农猪圆环病毒2型灭活疫苗的DBN-SX07株、哈尔滨维科猪圆环病毒2型灭活疫苗的LG株、武汉科前猪圆环病毒2型灭活疫苗的WH株中的一种或几种。
本发明中术语“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌抗原形式的组合物,所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。副猪嗜血杆菌的野毒株,包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株,包含目前已鉴定的1~15个血清型或无法确定血清型的副猪嗜血杆菌。所述副猪嗜血杆菌抗原为副猪嗜血杆菌的完整细胞体。
在本发明中,所述的副猪嗜血杆菌抗原可以是选自(武汉科前副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清4型MD0322+血清5型SH0165),勃林格茵格发副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株),西班牙海博莱猪副猪嗜血杆菌灭活疫苗(血清1型SV1+血清6型SV6))中的一种或几种。
优选地,所述猪瘟病毒抗原为全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌为全菌抗原、所述猪圆环病毒2型抗原为全病毒抗原。
更优选地,所述猪瘟病毒抗原为活的形式的全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌为灭活形式的全菌抗原、所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的全病毒抗原。
进一步优选地,所述灭活形式的副猪嗜血杆菌全菌抗原为副猪嗜血杆菌4型JS株全菌灭活抗原和5型ZJ株全菌灭活抗原;所述活的形式的猪瘟病毒全病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株抗原;所述灭活形式的猪圆环病毒2型全病毒抗原为猪圆环病毒2型SH株全病毒灭活抗原。
所述猪瘟兔化弱毒株由中国兽医药品监察所保藏,保藏号AV1412。
所述猪圆环病毒2型SH株(Porcine Circovirus Type2,strain SH),在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏日期:2008年3月4日,保藏号为CGMCC No.2389,公开于中国专利申请CN101240264A。
副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus Parasuis,Serotype4,strain JS)的保藏编号为:CCTCC NO:M2011172;副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus Parasuis,Serotype5,strain ZJ)的保藏编号为:CCTCC NO:M2011173;上述菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期均为2011年05月18日。
优选地,所述副猪嗜血杆菌抗原含量为108~1010CFU/头份;所述猪圆环病毒2型抗原含量为105.0~106.0TCID50/头份;所述猪瘟病毒抗原含量为105.0~106.0TCID50/头份。
更优选地,所述副猪嗜血杆菌抗原含量为109CFU/头份;所述猪圆环病毒2型抗原含量为106.0TCID50/头份;所述猪瘟病毒抗原含量为106.0TCID50/头份。
优选地,所述兽医学上可接受的载体包括冻干保护剂和佐剂;所述冻干保护剂冻干保护剂为按1:1比例的2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液,所述佐剂为兽医学上可接受的矿物油佐剂、铝盐佐剂、水佐剂或细胞因子佐剂。
优选地,本发明的兽药学上可接受的佐剂为水佐剂。
本发明所用术语“水佐剂”又称“水基佐剂”或“水溶性佐剂”,是一种聚合物水溶性分散体,用于提高水溶性疫苗的功效和安全性,可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。
优选地,本发明的兽药学上可接受的佐剂为gel佐剂。
在本发明中,所述疫苗组合物还可以进一步包括其它猪的病原体的附加抗原,其选自猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪肺炎支原体抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪流感病毒(SIV)中的一种或几种。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:
1)培养增殖所述副猪嗜血杆菌,灭活并浓缩;培养增殖所述猪圆环病毒2型病毒,灭活并浓缩;将所述副猪嗜血杆菌抗原、所述猪圆环病毒2型抗原按比例混合,添加兽医学上可接受的佐剂制备成灭活疫苗;
2)培养增殖所述猪瘟病毒;加入冻干保护剂混匀,冷冻干燥,制成活疫苗部分。
优选地,先将副猪嗜血杆菌菌液和猪圆环病毒2型病毒液分别进行灭活,然后将灭活检验合格的副猪嗜血杆菌抗原和猪圆环病毒2型抗原分别进行浓缩,配苗,制备得到灭活苗部分;猪瘟病毒液加入冻干保护剂,制备得到活苗部分,用所述灭活苗部分稀释所述活苗部分,即得所述含有圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原和猪瘟病毒抗原的三联疫苗组合物。
本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在用于制备预防和治疗猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌和猪圆环病毒2型的感染的药物中的应用。
使用时可将抗猪圆环、副猪嗜血杆菌的疫苗组合物稀释抗猪瘟的疫苗组合物,得到抗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪瘟的三联疫苗组合物,也可将抗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌的疫苗组合物与抗猪瘟的疫苗组合物分别单独使用。
本发明技术方案带来的有益效果:
1、含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比,联合疫苗可以减少疫苗的接种次数,避免因漏种而不能得到全程免疫;另外,疫苗大多不耐热,其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行,即所谓的“冷链”,这种环环相扣的冷链运作,费用极高,使疫苗成本居高不下,而使用联合疫苗,则可以大大降低冷链运作的费用,因此具有显著的优越性。
2、本发明的猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的三联疫苗,在一定抗原含量范围内不仅不会产生抗原成份的相互免疫干扰或影响,而且意外发现猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌的抗原混合后,猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌的抗原组合物不仅能产生的保护性免疫应答的同时,猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌的抗原有相互增强免疫效果的作用,而且如本发明后续实施例所证明的,特别是存在其中一种抗原的情况下,另两种抗原量减半仍能维持本抗原的免疫效果,而这出乎本领域普通技术人员预料的。
3、上述预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的三联疫苗与猪瘟、猪圆环病毒2型或副猪嗜血杆菌的单疫苗的效力相比,在对猪注射免疫过程中,猪体的应激反应出人预料地小,因此,本发明的三联疫苗安全性更佳,可以避免多次接种免疫出现的不良反应。
4、此外,本发明预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌相关疾病的三联疫苗,制备方法简单,疫苗的效价含量高,免疫方便快捷,与现有技术中的多次免疫,至少需要打2针或3针才能防治以上三种疾病的疫苗及其免疫方法相比,本发明仅免疫1次就能够预防猪瘟、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌三种病原感染,降低了免疫成本,节约了免疫程序,更加高效。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1猪瘟抗原、猪圆环病毒抗原和副猪嗜血杆菌抗原的制备
1猪瘟抗原制备
1.1将长成良好单层的对猪瘟病毒(猪瘟兔化弱毒株由中国兽医药品监察所保藏,保藏号AV1412)高敏感的ST细胞(购自ATCC)用含0.125%胰酶和0.03%EDTA的消化液,进行消化分散,细胞计数后接种细胞培养瓶,加入1.5%-5%FBS的MEM细胞培养液,同时按照M.O.I.=0.01-0.6接毒剂量加入种毒,进一步优选接毒剂量为M.O.I.=0.1-0.6,进一步优选接毒剂量为M.O.I.=0.2-0.4,置于34-37℃温箱中进行培养,进一步优选培养温度为34-35℃。
培养三天后进行第一次收毒,收毒后补加1.5-3%FBS的细胞维持液,以后每隔2天收毒一次,可连续收毒5次。收毒后将抗原混合置于-20℃储藏。
1.2猪瘟病毒含量测定:各收次病毒培养液分别采用间接免疫荧光法进行TCID50测定。每ml病毒含量为106.5TCID50。
2猪圆环病毒2型抗原制备
2.1菌株来源:制造及检验本品用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2毒株SH株,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏日期:2008年3月4日,保藏号为CGMCC No.2389。
2.2制苗用病毒液的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞(购自ATCC),倒去细胞培养液,将毒种液按细胞培养液体积5%的接种量接种于PK15细胞上,轻轻旋转细胞瓶2周,37℃吸附30分钟,加入细胞维持液,置37℃旋转(10~12转/小时)培养。每日观察1~2次,细胞生长良好,37℃培养4日收获细胞和细胞液,冻融3次,置-20℃以下保存,应不超过2个月。
2.3含量测定:将病毒培养液采用间接免疫荧光法进行TCID50测定,每ml病毒含量应≥105.5TCID50。
2.4灭活:将病毒液按病毒液总量加入终浓度为0.2%的甲醛溶液(V/V),随即充分摇匀升温,当温度升至37℃时开始计时,保持18小时灭活完毕,加入0.2wt%的焦亚硫酸钠终止灭活,取样进行灭活检验。
2.5浓缩:将灭活检验合格的猪圆环病毒2型病毒液分别采用超滤浓缩技术进行浓缩,浓缩后抗原含量为107.0TCID50/ml。
3副猪嗜血杆菌抗原制备
3.1菌株来源:制造及检验本品用的副猪嗜血杆菌菌株为副猪嗜血杆菌4型JS株(CCTCC M2011172)和5型ZJ株(CCTCC M2011173),均由普莱柯生物工程股份有限公司从河南发病猪场分离鉴定,在湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心保藏。。
3.2副猪嗜血杆菌生产用种子的制备:
一级种子的繁殖:将副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株的菌种分别接种于TSA平板,与37℃培养24h作为一级种子。在2-8℃保存,保存期不超过5天。在培养基上传代,不超过5代。
二级种子繁殖:分别挑取副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌落于5ml含NAD的TSB试管中,于150-220rpm,37℃振荡培养16h。以上种子液分别以1%的接种量接种于100ml相应培养基,于150-220rpm,37℃振荡培养12h,按《中国兽药典》附录进行纯粹检验,合格后作为二级种子,在2-8℃保存,不超过8h。
3.3副猪嗜血杆菌菌液的制备:采用生物发酵罐分别进行副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株菌液的制备。将鉴定合格的二级种子液以1%的接种量接种于发酵罐发酵培养基,37℃,200rpm,通过不断增大通气量和流加补料的方式发酵培养16-24h,收获菌液。并按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验,应纯粹。
3.4活菌数测定:取样进行菌落平板计数,活菌数应不低于109CFU/ml。
3.5灭活:纯粹检验合格的副猪嗜血杆菌4型和5型菌液,按菌液总量的0.2%-0.5%加入甲醛溶液(v/v),37℃灭活48h,其间不断摇动。然后取样按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验,应无菌落生长
3.6浓缩:将灭活检验合格的副猪嗜血杆菌菌液采用超滤浓缩技术进行浓缩,浓缩后抗原含量为1011CFU/ml。
实施例2猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌三联混合疫苗组合物的制备
1副猪嗜血杆菌、猪圆环二联灭活疫苗制备
1.1防腐剂的配制
1%(w/v)的硫柳汞水溶液:1g硫柳汞溶解于100ml纯化水,121℃高压灭菌30min备用。
1.2稀释剂的配制
无菌的PBS缓冲溶液:在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾,然后定容至1L,121℃高压灭菌30min备用。
1.3疫苗佐剂处理
Gel01佐剂灭菌:将Gel01佐剂转入可灭菌容器内,121℃高压灭菌30min备用。
1.4配苗
通过无菌操作,将实施例1中制备的浓缩副猪嗜血杆菌抗原、猪圆环病毒2型抗原、佐剂、防腐剂、稀释剂等按照不同配比混合后,用乳化机低速搅拌30min。灭活疫苗部分猪圆环病毒抗原含量为104.0~106.0TCID50/头份,副猪嗜血杆菌抗原含量为107.0~2×1010.0CFU/头份,Gel01佐剂,基于所述灭活苗部分含量为12%(V/V)
2猪瘟疫苗的制备
将检验合格的猪瘟各收次病毒液,混合于同一容器,分别取适量混匀的病毒液进行稀释,加入适当冻干保护剂(2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀,定量分装,迅速进行冷冻真空干燥。
3三联苗的制备
将实施例1中所制备的浓缩抗原按照表1的配比进行疫苗配制。使用前取灭活苗部分稀释活苗部分。
表1疫苗配比具体实施案例
实施例3不同抗原含量猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌三联混合疫苗效力检验
1试验材料
实施例2中制备的疫苗1(副猪嗜血杆菌107CFU/头份、猪瘟病毒104.0TCID50/头份、猪圆环病毒104.0TCID50/头份)、疫苗2(副猪嗜血杆菌108CFU/头份、猪瘟病毒105.0TCID50/头份、猪圆环病毒105.0TCID50/头份)、疫苗3(副猪嗜血杆菌109CFU/头份、猪瘟病毒106.0TCID50/头份、猪圆环病毒106.0TCID50/头份)、疫苗4(副猪嗜血杆菌1010CFU/头份、猪瘟病毒106.0TCID50/头份、猪圆环病毒106.0TCID50/头份)和疫苗5(副猪嗜血杆菌2×1010CFU/头份、猪瘟病毒106.0TCID50/头份、猪圆环病毒106.0TCID50/头份)。
3-4周龄,无猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌抗体的断奶仔猪。
2试验方法
2.1安全试验
选3-4周龄,无猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌抗体的断奶仔猪30只,随机分为6组,其中5组分别颈部肌肉注射两头份(4ml)疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5,剩余作为对照,观察两周,疫苗接种猪应无明显体温变化,精神食欲正常,无其他可见临床反应出现。
2.2效力检验
选3-4周龄,无猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌抗体的断奶仔猪120只,随机分为24组,第1、2、3、4组免疫1头份疫苗1,第5、6、7、8组免疫2ml疫苗2,第9、10、11、12组免疫1头份疫苗3,第13、14、15、16组免疫1头份疫苗4,第17、18、19、20组免疫1头份疫苗5,间隔14d后,加强免疫1次。第21、22、23、24组为对照攻毒组。首免后35天,第1、5、9、13、17、21组用PCV-2SH株进行攻毒,肌肉注射2ml(含106.0TCID50/ml),连续观察25天,进行剖检,记录发病数(包括死亡数),判定保护情况;第2、6、10、14、18、22组注射猪瘟石门系血毒1ml/头(105MLD),连续观察16天,记录发病和死亡情况,判定保护情况;第3、7、11、15、19、23组用副猪嗜血杆菌4型进行攻毒,3ml/头(3×109CFU/ml),第4、8、12、16、20、24组用副猪嗜血杆菌5型进行攻毒,3ml/头(6×109CFU/ml),连续观察14天,进行剖检,记录发病数(包括死亡数),判定保护情况。
3试验结果
3.1安全试验结果
对仔猪双倍剂量注射疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5,注射后观察体温、食欲、精神状态,有无可见临床反应和死亡情况,疫苗注射局部有无肿胀等炎症反应,连续观察2周,三周后剖杀,进行病理变化观察,观察结果见表2。
表2疫苗安全试验观察结果
安全检验结果显示:注射疫苗4和疫苗5后有个别猪体温持续2天达到40.5℃,其中疫苗5有1只猪注射部位出现肿胀,疫苗4和疫苗5中抗原含量较其他疫苗高,可能是由于抗原含量高导致应激反应更加明显。
3.2效力检验结果
攻毒保护结果见表3。
表3不同抗原含量疫苗效力检验
攻毒保护的结果显示:对猪圆环的保护率疫苗1为60%,疫苗2为80%,疫苗3、疫苗4和疫苗5均为100%;对猪瘟的保护率疫苗1为60%,疫苗2为80%,疫苗3和疫苗4均为100%,而疫苗5为60%。对副猪嗜血杆菌病的保护率疫苗1为40-60%,疫苗2为80%,疫苗3为100%,而疫苗4为60-80%,疫苗5只有40-60%。结果表明,猪瘟、猪圆环和副猪三联疫苗在一定抗原含量范围内,均能对猪只产生较好的保护作用,且抗原含量越高,产生的保护作用越强;但是当副猪嗜血杆菌抗原的含量达到1010CFU/头份时发现副猪嗜血杆菌的的保护率下降到80%,当其抗原含量达到2×1010CFU/头份时,对副猪嗜血杆菌的保护率只有40-60%,并且对猪瘟的保护率也下降至60%。说明当副猪嗜血杆菌抗原的含量过高时,会干扰猪瘟抗原的免疫保护。
实施例41/2剂量的猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌三联混合苗与单剂量单苗的免疫效果比较
1试验材料
实施例2中制备的疫苗3(副猪嗜血杆菌109CFU/头份、猪瘟病毒106.0TCID50/头份、猪圆环病毒106.0TCID50/头份)、疫苗6(副猪嗜血杆菌109CFU/头份)、疫苗7(猪瘟病毒106.0TCID50/头份)、疫苗8(猪圆环病毒106.0TCID50/头份)。
3-4周龄,无猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌抗体的断奶仔猪。
2试验方法
2.1疫苗效力检测
选取3-4周龄断奶仔猪60头,分为12组,第1、2、3、4组免疫1/2头份疫苗3,第5、6组免疫1头份疫苗6,第7组免疫1头份疫苗7,第8组免疫1头份疫苗8,第9-12组为对照组;间隔14d后,各组加强免疫1次。首免后35天,第1、5、9组用副猪嗜血杆菌4型进行攻毒,3ml/头(3×109CFU/ml),第2、6、10组用副猪嗜血杆菌5型进行攻毒,3ml/头(6×109CFU/ml),连续观察14天,进行剖检,记录发病数(包括死亡数),判定保护情况;第3、7、11组注射猪瘟石门系血毒1ml/头(105MLD),连续观察16天,记录发病和死亡情况,判定保护情况;第4、8、12组用PCV-2SH株进行攻毒,肌肉注射2ml(含106.0TCID50/ml),连续观察25天,进行剖检,记录发病数(包括死亡数),判定保护情况。
表4疫苗免疫及攻毒分组情况
3试验结果
3.1效力检验结果见表5、表6和表7。
表5副猪嗜血杆菌攻毒保护结果
表6猪瘟攻毒保护结果
表7猪圆环攻毒保护结果
注:PCV攻毒后符合以下三项中的任何2项即判为发病。临床症状:仔猪体温升高(≥40℃),应至少持续3日,出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓;病理变化:腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿,肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入,或有多核巨细胞;病毒检测:用PCR检测淋巴结组织,检测到PCV2。
效力检验结果显示,1/2剂量的猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌联苗对猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌的保护与单剂量的单苗的保护水平相当。令人意外地,在相同抗原含量的情况下,1/2剂量的猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌联苗对猪瘟的保护甚至超过单剂量单苗的保护水平。说明猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌的三联混合疫苗能很好得抵抗猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌的感染,而且猪圆环抗原可能还提高猪瘟的免疫保护水平。
实施例5猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌三联混合苗与单苗免疫持续期比较
1试验材料
实施例2中制备的疫苗3(副猪嗜血杆菌109CFU/头份、猪瘟病毒106.0TCID50/头份、猪圆环病毒106.0TCID50/头份)、疫苗6(副猪嗜血杆菌109CFU/头份)、疫苗7(猪瘟病毒106.0TCID50/头份)、疫苗8(猪圆环病毒106.0TCID50/头份)。
3-4周龄,无猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌抗体的断奶仔猪。
2试验方法
选取3-4周龄断奶仔猪25头,随机分为5组,第1组免疫1头份疫苗3,第2组免疫1头份疫苗6,第3组免疫1头份疫苗7,第4组免疫1头份疫苗8,第5组为对照组,各组免疫方法见表8。各组分别于3周龄、5周龄、3月龄、6月龄采血,分离血清。分别采用ELISA抗体检测猪圆环抗体水平,采用阻断ELISA检测猪瘟抗体水平,采用微量凝集方法检测副猪嗜血杆菌抗体水平。
表8疫苗免疫分组
3试验结果
分别对各组3周龄、5周龄、3月龄、6月龄的血清进行抗体测定,副猪嗜血杆菌抗体在不同免疫时期抗体水平见表9,猪瘟抗体在不同免疫时期抗体水平见表10,猪圆环抗体在不同免疫时期抗体水平见表11。
表9免疫不同时期副猪嗜血杆菌抗体水平测定
表10免疫不同时期猪瘟抗体水平测定
表11免疫不同时期猪圆环抗体水平测定
抗体水平测定结果显示:对照组猪和免疫组猪免疫前(3周龄)抗体检测均为阴性,首免后14天(5周龄)各免疫组相应抗体的检测均为阳性。疫苗3的副猪嗜血杆菌抗体水平、猪圆环抗体水平和猪瘟抗体水平与各单苗的抗体水平呈相同的变化趋势,抗体水平在不同免疫期逐渐升高,且疫苗3在各免疫期抗体水平与单苗的抗体水平差异不显著,说明猪瘟、猪圆环和副猪嗜血杆菌三联苗只需一次免疫,就能达到各单苗二次免疫的免疫效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物含有免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的副猪嗜血杆菌抗原、免疫量的猪圆环病毒2型抗原以及兽医学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述猪瘟病毒抗原为全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌为全菌抗原、所述猪圆环病毒2型抗原为全病毒抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述猪瘟病毒抗原为活的形式的全病毒抗原、所述副猪嗜血杆菌为灭活形式的全菌抗原、所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的全病毒抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物,其中,所述灭活形式的副猪嗜血杆菌全菌抗原为副猪嗜血杆菌4型JS株全菌灭活抗原和5型ZJ株全菌灭活抗原;所述活的形式的猪瘟病毒全病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株抗原;所述灭活形式的猪圆环病毒2型全病毒抗原为猪圆环病毒2型SH株全病毒灭活抗原。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述副猪嗜血杆菌抗原含量为108~1010CFU/头份;所述猪圆环病毒2型抗原含量为105.0~106.0TCID50/头份;所述猪瘟病毒抗原含量为105.0~106.0TCID50/头份。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物,其中,所述副猪嗜血杆菌抗原含量为109CFU/头份;所述猪圆环病毒2型抗原含量为106.0TCID50/头份;所述猪瘟病毒抗原含量为106.0TCID50/头份。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述兽医学上可接受的载体包括冻干保护剂和佐剂;所述冻干保护剂冻干保护剂为按1:1比例的2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液,所述佐剂为兽医学上可接受的矿物油佐剂、铝盐佐剂、水佐剂或细胞因子佐剂。
8.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:
1)培养增殖所述副猪嗜血杆菌,灭活并浓缩;
培养增殖所述猪圆环病毒2型病毒,灭活并浓缩;
将所述副猪嗜血杆菌抗原、所述猪圆环病毒2型抗原按比例混合,添加兽医学上可接受的佐剂制备成灭活疫苗;
2)培养增殖所述猪瘟病毒;加入冻干保护剂混匀,冷冻干燥,制成活疫苗部分。
9.根据权利要求1~7任一项所述的疫苗组合物在用于制备预防和治疗猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌和猪圆环病毒2型的感染的药物中的应用。
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