CN104511015A - 一种疫苗组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括：免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的猪伪狂犬病病毒抗原和免疫量的副猪嗜血杆菌抗原。该疫苗组合物使用安全、质量可控，免疫效果良好，攻毒保护率达到80～100%。使用时滴鼻免疫0～3日龄仔猪、肌肉注射免疫50日龄仔猪可以取得令人满意的免疫效果。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗组合物及其制备方法与应用。 

背景技术

猪瘟是猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。早年又称猪霍乱，对猪危害极为严重，给养猪业造成重大损失。 

副猪嗜血杆菌病是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎,该病又称为猪革拉泽氏病(Glasser’s Disease)。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪,主要在断奶后和保育阶段发病,通常见于5～8周龄的猪,发病率可达40%,死亡率可达50%。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱;主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行。近年来，由于我国目前饲养技术的调整进行不当,以及突发新的呼吸道综合征,使得该病日趋流行,危害日渐严重。 

猪伪狂犬病是由疱疹病毒I型引起的一种急性传染病。可导致：怀孕母猪发生流产、死亡、产木乃伊胎及弱仔；新生仔猪发生大批急性死亡，伴有呕吐、腹泻及发抖，震颤和运动失调等神经症状，并产生免疫抑制，免疫抑制猪对其它疫病易感性增加，影响仔猪生长发育。除猪外，其他动物主要表现为发热、奇痒，脑脊髓炎的致死性感染，但对仔猪的危害最严重，15日龄内的仔猪死亡率达100%，因此本病给养猪业造成严重的损失。 

根据近几年猪场流行病学研究结果显示，临床上表现为母猪相继出现流产、死胎、产木乃伊胎的情况，且产出的仔猪于产后不久相续出现精神沉郁、震颤、间歇性腹泻，粪便后期成黄色，有的发生呕吐和运动失调， 部分仔猪在发病后期皮肤出现出血点及皮下水肿等症状。并于不久死亡，病程1-7天，病死率100%。死亡猪剖检呈现眼睑肿胀，粘膜充血，肺有出血斑，肺间质增宽，肺组织呈肉样变化，淋巴结肿大，脾脏边缘有坏死小病灶，肠淋巴结呈大理石样变，胃底有大面积出血，肾表面有大小不一的出血点，心包炎、胸膜炎、腹膜炎和关节炎。从发病猪中分离出最常见的病原体是猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌。 

随着病原流行株和混合感染已经使现有疫苗及免疫程序很难达到预期的免疫效果，现在存在的问题是同时免疫两种活疫苗,猪伪狂犬病会干扰猪瘟前期抗体的产生：猪瘟抗体3周后才达到阳性,而猪伪狂犬病抗体在7d时就达到阳性（贺卫洁，河北农业大学，2010硕士论文）。而且，刘明亚（畜牧与兽医，2010，42卷2期：68-70）等研究发现，仔猪具有较高的母源抗体水平时,在一定时间接种猪瘟疫苗和伪狂犬疫苗后,仔猪体内的抗体水平迅速下降至较低水平并持续很长时间,而且下降后的抗体水平上升非常缓慢,使免疫猪产生一个免疫间隙期，因此在实际生产中各猪场不断调整免疫程序，单还是避免不了野毒感染的情况。 

另外，猪瘟和伪狂犬病毒感染猪并发猪副猪嗜血杆菌后，发病呈急性，且死亡率很高。 

目前市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大；而同时针对控制猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗，国内外也还是空白。因此，需要发明猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗以解决上述问题。 

发明内容

发明人发现，如果用猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗组合物进行滴鼻免疫，可以解决母源抗体干扰问题，产生对猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌产生良好的免疫保护；应用时猪瘟、猪伪狂犬活疫苗和副猪嗜血杆菌灭活疫苗可以以灭活疫苗稀释活苗的方式使用，还可以按一定比例混合后加入冻干保护剂冻干使用，运输方便且不降低免疫效果；此外，还发现副猪嗜血杆菌灭活疫苗对猪瘟和猪伪狂犬疫苗有免疫增强作用，后者抗原减半也能达到和单苗使用一样的效果。 

本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的猪伪狂犬病病毒抗原和免疫量的副猪嗜血杆菌抗原。 

优选地，所述猪瘟病毒抗原为活的形式的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原或合成肽抗原；所述猪伪狂犬病病毒抗原为减毒全病毒抗原、灭活的全病毒抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原或合成肽抗原；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活全菌抗原、减毒全菌抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原或合成肽抗原。 

优选地，所述猪瘟病毒抗原是猪瘟全病毒抗原，优选灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪瘟病毒抗原，含有至少猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽。优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪瘟病毒为减毒形式的全病毒抗原，可以是选自细胞源猪瘟病毒、兔源猪瘟病毒、脾淋源猪瘟病毒中的一种或几种。 

优选地，所述猪伪狂犬病病毒抗原是猪伪狂犬病全病毒抗原，优选灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪伪狂犬病病毒抗原，含有至少猪伪狂犬病病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪伪狂犬病病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽。优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪伪狂犬病病毒为减毒形式的全病毒抗原，可以是选自天然基因缺失猪伪狂犬病病毒、人工传代致弱猪伪狂犬病病毒和使用基因工程技术去除特定的和毒力有关的基因或基因片段而获得的缺失猪伪狂犬病病毒中的一种或几种。 

优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活形式的副猪嗜血杆菌全菌，改良的副猪嗜血杆菌活菌或减毒的副猪嗜血杆菌，含有至少副猪嗜血杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合菌株，任何其它含至少副猪嗜血杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽。优选地，本发明疫苗组合物中，所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活形式的副猪嗜血杆菌全菌，可以是选自包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1～15个血清型或无法确定血清型的副猪嗜血杆菌的一种或几种。 

本发明提供的猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌疫苗组合物，灭活疫苗部分包含副猪嗜血杆菌抗原和佐剂，作为优选实施方案，抗原包含已灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原，所述佐剂为进口的新型水佐剂Montanide GEL ST聚合物（包括同系列佐剂）佐剂，包括氢氧化铝胶、卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、蜂胶、爱菲金(Amphigen)、细胞因子等；活疫苗部分包含猪瘟、猪伪狂犬弱毒和耐热保护剂。 

疫苗组合物灭活疫苗部分还可替换为副猪嗜血杆菌其它血清型菌株、副猪嗜血杆菌基因工程抗原或进一步包括猪大肠杆菌抗原、猪巴氏杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪红斑丹毒丝菌抗原、猪肺炎支原体其它野毒株的抗原、或者猪蓝耳病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、传染性胃肠炎病毒抗原等。 

活疫苗部分病毒还可能加入或者替换为猪瘟、伪狂犬其它毒株、猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪蓝耳病病毒、猪流感病毒、猪流行性腹泻、传染性胃肠炎病毒及它们的核酸、基因工程修饰病毒或编码所述抗原的遗传信息。 

更优选地，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株；所述猪伪狂犬病病毒抗原为猪伪狂犬病病毒SA215（TK^-/gE^-/gI^-）株；所述副猪嗜血杆菌抗原为血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活全菌抗原。 

所选用的猪瘟兔化弱毒株购自中国兽医药品监察所，保藏号为AV1412。 

所选用的血清5型副猪嗜血杆菌菌株为副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus Parasuis，Serotype5,Strain ZJ)，保藏号为CCTCCNo.M2011173,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉·武汉大学，保藏日期为：2011年5月18日。 

所选用的猪伪狂犬SA215（TK^-/gE^-/gI^-）株，保藏号为V200002,保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）公开于中国专利CN101186902A。 

优选地，所述猪瘟病毒抗原含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/头份，所述伪狂犬病病毒的含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/头份，所述副猪嗜血杆菌抗原含量为 1.0×10⁹～4.0×10⁹CFU／mL。 

更优选地，所述猪瘟病毒抗原含量为10^5.0TCID₅₀/头份，所述伪狂犬病病毒的含量为10^5.0TCID₅₀/头份，所述副猪嗜血杆菌抗原含量为2×10⁹CFU／mL。 

作为本发明猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌疫苗组合物的优选实施方案，所述灭活疫苗副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原为所述疫苗总体积的75%～90%，疫苗中含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清5型活菌数1.0×10⁹～4.0×10⁹CFU／mL，更优选地2×10⁹CFU／mL。 

作为本发明猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌疫苗组合物的优选实施方案，所述猪瘟病毒的含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/头份，更优选地10^5.0TCID₅₀/头份；所述伪狂犬病毒的含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/头份，更优选地10^5.0TCID50/头份；加入耐热保护剂为2%明胶、15%乳糖、2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。 

本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：1）分别增殖培养所述猪瘟病毒，伪狂犬病病毒，加入冻干保护剂，冻干；2）增殖培养所述副猪嗜血杆菌，灭活，加入佐剂。 

副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备方法，按照灭活疫苗通用方法制备。猪瘟、猪伪狂犬活疫苗制备方法，用传代细胞制备，所述传代细胞选自ST（猪睾丸细胞）、STK（猪睾丸细胞克隆细胞）、PK15(猪肾细胞)、BHK21(幼年叙利亚地鼠肾细胞)、IBRS-2(猪肾细胞克隆细胞)和Vero（非洲绿猴肾细胞）。所述细胞、病毒培养方式为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。 

作为本发明猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌疫苗组合物的优选实施方案，所述组合物要进行相容性检验，各取2瓶活疫苗部分，分别用副猪嗜血杆菌病灭活疫苗部分（待检稀释液）和参考稀释液（无菌注射用水），按照使用说明（活疫苗部分1头份/瓶，灭活疫苗部分1头份（2ml）/瓶）复原。20±3℃放置2h，依照猪瘟、猪伪狂犬活疫苗滴定方法检验。通过与参考稀释液的比较，评估待检稀释液对病毒活性组分的影响，病毒组分的滴定结果的差值应不超过0.7log10。 

本发明的再一目的在于提供一种免疫试剂盒，所述试剂盒包括：冻干 的猪瘟兔化弱毒株和猪伪狂犬病病毒弱毒株；副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原，其中，所述猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬病病毒弱毒株与所述副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原分开保藏。 

本发明的又一目的在于提供一种免疫试剂盒，所述试剂盒包括：冻干的猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬病病毒弱毒株以及副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原，其中，所述猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬病病毒弱毒株与所述副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原共同冻干保藏。 

作为本发明猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌疫苗组合物的优选实施方案，所述组合物还可以是猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌灭活疫苗按1∶1∶2比例混合，加入冻干保护剂，使用时用生理盐水稀释使用。 

本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备治疗和预防猪瘟、猪伪狂犬病和副猪嗜血杆菌感染的药物中的应用。 

优选地，乳猪在1～3日龄时滴鼻免疫所述疫苗组合物，在50日龄时仔猪肌注免疫所述疫苗组合物。 

本发明还涉及到猪瘟、猪伪狂犬、副猪嗜血杆菌疫苗组合物的使用，对出生乳猪采用滴鼻免疫，免后28日用猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌感染，可以保护80%以上的猪，抗体不受母源抗体干扰，取得令人满意的免疫效果。 

本发明采用传代细胞培养的猪瘟抗原、细胞悬浮培养的三基因缺失SA215株伪狂犬抗原、国内流行副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原制备的疫苗组合物，免疫效果良好，能够有效预防由猪瘟病毒引起的猪瘟、伪狂犬病毒引起的伪狂犬病、副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病及其三者的混合感染；本发明灭活疫苗部分采用了水溶性聚合物类佐剂和适宜的配苗技术制备了副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，用其作为稀释剂可以稀释猪瘟、伪狂犬活疫苗组合物使用，或者猪瘟、伪狂犬活疫苗和副猪嗜血杆菌灭活疫苗冻干使用安全、质量可控，免疫效果良好，攻毒保护率达到80～100%。使用时滴鼻免疫0～3日龄仔猪、肌肉注射免疫50日龄仔猪可以取得令人满意的免疫效果。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典（二〇一〇年版）》及附录。其他未注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。 

本发明所述“每头份”或“/头份”是指每头猪每次用疫苗量。未作特别说明之处，本发明中所述“每头份”或“/头份”为2ml。 

本发明所述疫苗佐剂优选水溶性疫苗佐剂，包括但不限于：Montanide^TM Gel ST、蜂胶、爱菲金(Amphigen)、细胞因子、脂质体、免疫刺激复合物、含CpC脱氧寡核苷酸、纳米化磷酸铝、皂苷、山梨聚糖、二缩甘露醇、丙二醇、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种组合物。 

本发明所述冻干保护剂的例子，包括但不限于：明胶水溶液、乳糖水溶液及其混合物，优选2wt%明胶水溶液、2wt%聚乙烯吡咯烷酮与15wt%乳糖水溶液以1:1(v/v)比例混合所得的混合物。本发明中所使用的“%”，如无特别说明，均为质量百分比。 

本发明实施例中用猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬三基因缺失SA215株、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株为例说明本发明。 

菌株（毒株）的来源 

所选用的猪瘟兔化弱毒株购自中国兽医药品监察所，保藏号为AV1412。 

所选用的血清5型副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis，HPs)菌株为ZJ株，保藏号为CCTCC No.M2011173,保藏于中国典型培养物保藏中心。 

所选用的猪伪狂犬SA215（TK^-/gE^-/gI^-）株，保藏号为V200002,保藏 于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）公开于中国专利CN101186902A。 

实施例1抗猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和副猪嗜血杆菌疫苗组合物的制备 

1.猪瘟病毒抗原液的制备及检验 

（1）将长成良好单层的对猪瘟病毒高敏感的ST细胞（购自ATCC）（American type culture collection，美国模式培养物集存库）用0.125wt%胰酶和0.03wt%EDTA（乙二胺四乙酸）的消化液进行消化分散，细胞计数，并以合适的密度接种后，加入含有3wt%～5wt%FBS（胎牛血清）（购自PAA公司，批号A15110-1462）的MEM（购自GIBCO公司，批号856833），同时按照M.O.I.（感染复数）=0.1～0.2接毒剂量加入种毒，置于34～37℃温箱中进行培养。 

（2）培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加1.5wt%～3wt%FBS的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，连续收毒5次。收毒后将抗原置于-20℃储藏。 

（3）将5次收获的病毒液混合取样后进行TCID50和RID测定，测定结果为病毒液混合样为10^6.5TCID50/ml，50万RID/ml测定结果同时按照国家规定的检验标准进行检测，并将抗原液冻于-20℃保存。 

2.猪伪狂犬病病毒抗原液的制备及检验 

采用潮汐式生物反应器制备病毒液，参照中国专利CN101979518A中制备方法，将Vero细胞接种到细胞生长液PH为7.0-7.4聚酯纤维的载体罐中，启动贴附程序4h，使Vero细胞与聚酯纤维混合均匀，启动细胞培养程序，使pH值控制在7.2左右，溶氧为50%，二氧化碳浓度为5%；当Vero细胞生长至接种浓度5-40倍时换用维持液，按M.O.I.为0.01接种PRV病毒，启动病毒吸附程序，使其完全吸附在细胞上后，运行病毒培养程序使pH值维持在7.2；溶氧为30%，二氧化碳浓度为3%。培养5天后，收获病毒液；病毒滴度保持在10^7.0TCID₅₀/ml以上。同时按照国家规定的检验标准进行检测，并将抗原液冻于-20℃保存。 

3.副猪嗜血杆菌抗原液的制备及检验 

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株冻干菌种，划线接种于TSA/NAD平板上，置37℃培养18～24h，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12～16h，作为一级种子；按1%的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12～16h，经检验纯粹后作为二级种子；在发酵罐中加入70%（V/V按罐体积）培养基，将副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株菌液按1%的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃，转速180rmp，DO为80→0，pH值7.2～6.5，培养16～18h，当菌液的浓度OD600达到2.5以上、DO值降至0后又开始上升、pH值降低至6.5以下时停止培养，收获菌液。进行活菌计数和纯粹性检验后，检验合格的菌液按总量的0.2%（V/V）加入甲醛溶液，放置于37℃灭活24h。 

4.菌（毒）液的处理 

菌（毒）液通过超滤设备进行浓缩/透析，有效的除去杂蛋白和内毒素，使抗原更纯净，制备的疫苗无副反应、更安全。 

使用美国密理博公司的中试超滤设备Cogent M1。该设备由三部分装置组成。其一是病毒液储存搅拌装置，此装置使用圆筒式塑料制造装量10L，全不锈钢接口，下端和一台秤相连，可以确定病毒液的装量。其二是病毒液超滤装置，该装置使用316L不锈钢包夹具及管路，全部采用卫生接口，可夹持过滤及除菌过滤膜包数片。其三，控制系统，由动力装置、控制面板、控制系统等组成，动力装置使用不锈钢蠕动泵和硅胶蠕动泵管。此超滤膜包采用低蛋白吸附改良纤维材料，其蛋白吸附量仅为国际通用的聚醚砜材料的1/4～1/5。本超滤装置的进液口和回流口及透过口均配有隔膜压力表及隔膜阀，可控制系统的压力。 

先将超滤装置用蒸馏水反复冲洗干净，然后用1N浓度的氢氧化钠溶液浸泡过夜12小时以上，使用时先用灭菌的蒸馏水反复冲洗，将NaOH冲洗干净，使冲洗后的废弃液接近中性。然后将预过滤的病毒液容器通过消毒管道与超滤装置链接，开启蠕动泵，转速不大于30%，控制进料、回流、透过液的压力。 

步骤：冲洗膜面→加压清洗膜孔→水通量检测→菌（毒）液超滤→冲洗膜面→加压清洗膜孔→碱洗→水洗膜面→加压清洗膜孔→水通量检测 →碱液保存。 

病毒液超滤透析首先用1000～5000KD聚醚砜膜包超滤，然后用300～500KD聚醚砜膜包超滤，可以达到要求；菌液超滤透析用1000～5000KD聚醚砜膜包超滤，可以达到要求。 

5.疫苗的配制：具体成分配比（见表1、2） 

表1组合物疫苗各成分含量 

疫苗1、2、3中灭活疫苗部分含佐剂10%，其余用PBS缓冲溶液补充，制备的疫苗成品中副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清5型活菌数分别为1.0×10⁹CFU／mL、2.0×10⁹CFU／mL、4.0×10⁹CFU／mL；活疫苗部分冻干保护剂占50%。 

表2组合物冻干疫苗各成分含量 

疫苗4、5、6中冻干保护剂占50%，制备的疫苗成品中副猪嗜血杆菌抗原含量分别为灭活前副猪嗜血杆菌血清5型活菌数2.0×10⁹CFU／mL、4.0×10⁹CFU／mL、8.0×10⁹CFU／mL；猪瘟和伪狂犬含量分别为10^4.0TCID₅₀/头份、10^5.0TCID₅₀/头份和10^6.0TCID₅₀/头份。 

在本发明实施例中，还可以采用其他致病性副猪嗜血杆菌血清型菌株（比如血清1～15型、未分血清型等），并不局限于实施例1中采用的菌 株。灭活的方式也可以采用β-丙内酯（BPL）、缩水甘油醛（GDA）、⁶⁰Co照射和加热等其他灭活方法。佐剂也可以为纳米化氢氧化铝、蜂胶、爱菲金(Amphigen)、细胞因子、脂质体、免疫刺激复合物、含CpC脱氧寡核苷酸、纳米化磷酸铝、皂苷、山梨聚糖、二缩甘露醇、丙二醇、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种组合物。 

实施例2猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和副猪嗜血杆菌疫苗相关检验 

1、物理性状检测、无菌检验 

疫苗1～8经物理性状检测、无菌检验合格，详细结果见表3： 

表3疫苗物理性状检验及无菌检验 

注：T.G表示硫乙醇酸盐培养基，G.A表示酪胨琼脂培养基，G.P葡萄糖蛋白胨培养基；“－”表示无菌生长。 

2安全性试验 

用2～3周龄的猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和副猪嗜血杆菌抗原、抗体阴性仔猪45头，第1～3组各5头各肌肉接种以2头份灭活疫苗部分稀释的1头份活疫苗部分的待检样品；第4～6组各5头各肌肉接种2头份冻干稀释疫苗；第7组5头对照，连续观察21日，应不出现局部或全身性的异常反应且全部健活。检验结果如下表4： 

表4疫苗安全性试验结果 

3疫苗相容性检验 

各取2瓶疫苗1～3，分别用待检稀释液（灭活疫苗）和参考稀释液（无菌注射用水），按照使用说明（活疫苗部分1头份/瓶，灭活疫苗部分1头份（2ml）/瓶）复原。20±3℃放置2h，依照猪瘟和猪伪狂犬活疫苗滴定方法检验。通过与参考稀释液的比较，评估待检稀释液对病毒活性组分的影 响，病毒组分的滴定结果如表5，差值均不超过0.3log10。疫苗4～6进行冻干前后，依照猪瘟和猪伪狂犬活疫苗滴定方法检验毒价。病毒组分的滴定结果如表6，差值均不超过0.5log10。 

表5疫苗相容性检验结果 

4效力试验（在本公司试验动物房进行试验） 

每组疫苗各用3周龄的猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和副猪嗜血杆菌抗体阴性健康易感猪105头，每组疫苗各免疫15头，每头肌肉注射2mL，另外15头设为对照，免疫后28日将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为三组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、猪瘟病毒强毒石门系毒株（购自中国兽药监察所）、猪伪狂犬病强毒Fa株（购自中国兽药监察所）各自攻毒。对照猪15头，分3组，分别用所述副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、猪瘟病毒强毒石门系血毒（购自中国兽药监察所）、猪伪狂犬病强毒Fa株（购自中国兽药监察所）各自攻毒。 

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，腹腔注射5.0×10⁹CFU的血清5型ZJ株菌液，观察14天，免疫猪应4/5以上保护，对照猪应4/5以上发病。 

猪瘟病毒强毒石门系血毒：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，肌肉注射石门强毒培养液（10⁵MLD）1ml，观察14天，免疫猪应5/5保护，对照猪5/5均应发病，且至少3/5死亡。 

猪伪狂犬病强毒Fa株：选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，滴鼻方式攻毒，每头强毒培养液（10^5.0TCID₅₀）1ml，观察14天，免疫组应5/5保护，对照猪应5/5发病，且至少2/5死亡。 

检验结果如表7所示。 

表7疫苗效力检验结果 

注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪死亡或出现发热（体温40.5℃ 以上，持续1～5日）、精神萎靡，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎（胸膜炎、心包炎、腹膜炎）、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面（关节囊、心包膜、胸膜和腹膜）出现浆液性或纤维素性渗出物。 

猪伪狂犬发病标准：至少2日体温在40.5℃以上，或精神沉郁、食欲下降，呼吸困难、神经症状等，或大体剖检，肺部出现肉样或胰样实变，肾有灰白色坏死灶，扁桃体充血化脓，且至少2头死亡。 

猪瘟发病判断标准：猪强毒攻击后体温升高到41℃以上，成稽留热型。潜伏期24～48小时，食欲减退或废绝，拉稀，一般于5～9天内死亡。 

实施例3本发明猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗组合物的应用 

试验一：疫苗的比较试验 

1、试验材料猪瘟ELISA抗体检测试剂盒购自北京爱德士生物科技有限公司；猪伪狂犬ELISA gB抗体检测试剂盒购自北京爱德士生物科技有限公司。 

本发明猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗批号为20130202的疫苗若干瓶；广东永顺生产的猪瘟活疫苗批号为2012043，勃林格殷格翰公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗（z-1517）批号为746-380、勃林格殷格翰公司生产猪伪狂犬活疫苗批号为195A-23B。 

2、试验方法 

2.1随机抽取10头试验组仔猪，采血分离血清，进行猪瘟ELISA抗体、猪伪狂犬ELISA gB抗体、副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测。 

2.2试验用仔猪25头，随机分为5组，每组5头，第一组免疫猪瘟疫苗，第二组免疫猪伪狂犬疫苗，第三组免疫猪瘟疫苗+猪伪狂犬疫苗；第4组免疫副猪嗜血杆菌灭活疫苗；第5组免疫本发明猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗组合物；全部颈部肌肉注射。 

2.3抗体检测 

所有组分别于开始免疫后7d、14d、21d、28d采血，分离血清，检测猪瘟ELISA抗体、猪伪狂犬病ELISA抗体和副猪嗜血杆菌ELISA抗体。 

2.4检测结果判定 

2.4.1猪瘟ELISA Ab抗体结果判定 

用阻断率判定，阻断率=(N-S)/N*100%，其中N为标准阴性对照OD值，S为样品血清检测OD值。当阻断率≥40%，判为阳性；当阻断率≤30%，判为阴性；当阻 

断率介于30%-40%之间，判为可疑。 

2.4.2猪伪狂犬病ELISA gB抗体结果判定 

用S/N值判定，其中N为标准阴性对照OD值，S为样品血清检测OD值。当S/N≤0.6判为阳性；当S/N＞0.7判为阴性；当S/N介于0.6-0.7之间判为可疑。 

2.4.3副猪嗜血杆菌ELISA抗体结果判定 

用S/N值判定，其中N为标准阳性对照OD值，S为样品血清检测OD值。当S/N＜0.6判为阴性；当S/N＞0.9判为阳性；当S/N介于0.6-0.9之间判为可疑。 

2.5结果 

2.5.1试验前抽检猪抗体 

随机抽取10头试验组仔猪，采血分离血清，进行猪瘟ELISA抗体、猪伪狂犬ELISA gB抗体、副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测，结果均为阴性，见表8所示。 

表8试验前抽检仔猪抗体结果 

2.5.2不同疫苗免疫不同时期猪抗体检测结果，见表9。 

表9不同疫苗免疫不同时期猪抗体检测结果 

根据表9结果表明，第1组接种猪瘟疫苗的猪和第二组接种伪狂犬病疫苗的猪7日均产生抗体，第4组副猪嗜血杆菌疫苗免疫猪在第14天产生抗体；而第3组同时免疫猪瘟和伪狂犬后，猪瘟抗体在28日时才转为阳性，且随后产生的猪瘟抗体与单免猪瘟组的整体水平比较，明显偏低， 说明伪狂犬干扰抑制猪瘟抗体的产生；7日便可产生PR阳性抗体，但到14日时抗体增加不明显，可能是因为CSF活疫苗对PR的反干扰。当猪伪狂犬病病毒抗原使机体产生抗体后，免疫系统自我修复，此时猪瘟抗体上升，猪瘟抗体产生后，和伪狂犬抗体平行存在，两者互不干扰。 

试验结果还表明，副猪嗜血杆菌和猪瘟、伪狂犬活疫苗组成的组合物免疫后，第7天时CSF平均抗体水平比第3组明显提高，第7日和第14日和第三组相比差异极显著（P＜0.01）；PR平均抗体水平比第3组第21日相比较，差异显著（P＜0.05）；初步推断可能是副猪嗜血杆菌灭活疫苗对猪瘟、猪伪狂犬抗体产生起到增强作用；副猪抗体与单价苗相比差异不显著。 

试验二：滴鼻免疫保护初生仔猪不受伪狂犬野毒感染 

1、随机抽取检验合格的猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌批号为20130205的疫苗若干瓶，分别用gE抗体阳性母猪所产5窝0～3日龄的初生猪进行试验。猪伪狂犬ELISA gB抗体检测试剂盒和ELISA gE抗体检测试剂盒购自北京爱德士生物科技有限公司。 

2、试验方法 

2.1抽取5头母猪，采血分离血清，进行猪伪狂犬ELISA gB抗体检测。 

2.2试验用仔猪20头，按雌性、雄性分为4组，每组5头，按照表10程序进行免疫，每头猪滴鼻0.5ml，2个鼻孔各滴0.25ml。 

表10免疫程序 

2.3抗体检测 

所有组分别于开始免疫后7d、21d、49d、70d、84d、105d采血，分离血清，检测猪伪狂犬病gB免疫抗体和gE野毒抗体。 

2.4检测结果判定 

2.4.1猪伪狂犬病ELISA gB抗体结果判定 

用S/N值判定，其中N为标准阴性对照OD值，S为样品血清检测OD值。当S/N≤0.6判为阳性；当S/N＞0.7判为阴性；当S/N介于0.6-0.7之间判为可疑。 

2.4.2猪伪狂犬病ELISA gE抗体结果判定 

用S/N值判定，其中N为标准阴性对照OD值，S为样品血清检测OD值。当S/N≤0.6判为阳性；当S/N＞0.7判为阴性；当S/N介于0.6-0.7之间应重新测定。 

2.5检测结果 

2.5.1滴鼻免疫对母源抗体的影响，见表11。 

表11疫苗滴鼻免疫仔猪 

表11可以看出，对照组阳性数和平均阳性率随时间呈正常的下降趋势，而试验组的阳性数和平均阳性率始终高于或等于对照组的数据，说明滴鼻免疫不受母源抗体的干扰，这可能与滴鼻免疫后疫苗毒株在局部粘膜增殖有关。 

2.5.2免疫抗体检测结果，见表12。 

表12免疫gB抗体检测结果 

表12可以看出，疫苗免疫后，试验组与对照组的阳性数的免疫抗体阳性数无明显差异，但平均阳性率对照组比试验组增加10%～20%，差异显著，这与对照组已经发生了野毒感染有关，野毒也产生了抗体所致。 

2.5.2伪狂犬野毒感染检测结果，见表13。 

表13免疫gE抗体检测结果 

由表13可见，对照组伪狂犬野毒抗体阳性率随着仔猪日龄的增加而不断的上升，而试验组一直保持阴性，两者差异极显著。 

综上，根据试验结果证实，猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗组合物进行滴鼻免疫可以有效阻断伪狂犬野毒感染初生仔猪，因此，在种猪群已经感染伪狂犬病野毒的猪场或首次爆发伪狂犬的猪场，对3日龄内的仔猪进行疫苗组合物滴鼻免疫可以阻断伪狂犬野毒在保育猪和育肥猪中传播，对净化猪场有重要意义。 

同时，出人意料的是，滴鼻免疫猪瘟、猪伪狂犬和副猪嗜血杆菌疫苗组合物时，剂量减半也能达到很好的免疫效果，说明本疫苗安全、质量可控，免疫效果良好。 

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。 

Claims (10)

1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：免疫量的猪瘟病毒抗原、免疫量的猪伪狂犬病病毒抗原和免疫量的副猪嗜血杆菌抗原。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原为活的形式的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原或合成肽抗原；所述猪伪狂犬病病毒抗原为减毒全病毒抗原、灭活的全病毒抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原或合成肽抗原；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活全菌抗原、减毒全菌抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原或合成肽抗原。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株；所述猪伪狂犬病病毒抗原为猪伪狂犬病病毒SA215（TK^-/gE^-/gI^-）株；所述副猪嗜血杆菌抗原为血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活全菌抗原。

4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/头份，所述伪狂犬病病毒的含量为10^4.0～10^6.0TCID₅₀/头份，所述副猪嗜血杆菌抗原含量为1.0×10⁹～4.0×10⁹CFU／mL。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原含量为10^5.0TCID₅₀/头份，所述伪狂犬病病毒的含量为10^5.0TCID₅₀/头份，所述副猪嗜血杆菌抗原含量为2×10⁹CFU／mL。

6.一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1）分别增殖培养所述猪瘟病毒，伪狂犬病病毒，加入冻干保护剂，冻干；

2）增殖培养所述副猪嗜血杆菌，灭活，加入佐剂。

7.一种免疫试剂盒，所述试剂盒包括：冻干的猪瘟兔化弱毒株和猪伪狂犬病病毒弱毒株；副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原，其中，所述猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬病病毒弱毒株与所述副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原分开保藏。

8.一种免疫试剂盒，所述试剂盒包括：冻干的猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬病病毒弱毒株以及副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原，其中，所述猪瘟兔化弱毒株、猪伪狂犬病病毒弱毒株与所述副猪嗜血杆菌灭活全菌抗原共同冻干保藏。

9.权利要求1～6所述的疫苗组合物在制备治疗和预防猪瘟、猪伪狂犬病和副猪嗜血杆菌感染的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，乳猪在1～3日龄时滴鼻免疫所述疫苗组合物，在50日龄时仔猪肌注免疫所述疫苗组合物。