CN109010814A - 副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于疫苗生产技术领域，具体公开了副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法。本发明利用生物反应器进行猪肺炎支原体的发酵培养，利用发酵罐进行血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌的发酵培养；将发酵培养后的菌液灭活、浓缩、纯化，再按一定比例混合，并加入免疫增强剂和疫苗佐剂，得到副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗。本发明生产的疫苗组合物具有特异性强、免疫性好的特点，可起到一针防二种疾病的目的，该技术方案更加经济实用，避免多次接种，节约了疫苗成本和人工成本，特别适用于预防和治疗混合感染病症的养殖场。

Description

副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明属于疫苗生产技术领域，具体地说，涉及副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产。

背景技术

副猪嗜血杆菌病近年来一直是猪病中最重要的细菌病之一，严重影响我国养猪业的健康发展。副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)能引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，可以影响从2周龄的哺乳仔猪到4月龄的育肥猪，主要在断奶后和保育阶段发病，多见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时病死率高达50％。本发明对2013～2017年分离的所有细菌进行分析，结果表明副猪嗜血杆菌分离率达到30.8％左右，其中分离的副猪嗜血杆菌血清4型占26.9％，血清5型占25.5％，说明副猪嗜血杆菌仍然是威胁养猪业最重要的细菌性疾病之一，副猪嗜血杆菌血清4型和5型仍是我国流行的主要血清型。另外，副猪嗜血杆菌病易与猪链球菌病、猪繁殖与呼吸障碍综合症、猪支原体肺炎以及其它疾病发生混合或继发感染。

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引起的呼吸道疾病。该疾病导致仔猪生长缓慢和饲养效率降低，是养猪业经济损失的重要原因。该疾病导致持续几周的持续性咳嗽、被毛失去光泽、生长迟缓和外观不壮实。虽然该疾病的死亡率低，但受感染的猪常常易于受到机会病原体的继发感染，从而导致死亡或应激。

猪支原体肺炎可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原，这也是副猪嗜血杆菌病与猪支原体肺炎病混合感染的重要原因，混合感染病猪的病死率也将大大提高，有的可达25％～40％。

但是，由于联合疫苗(疫苗组合物)，如二联疫苗或三联疫苗中，多种抗原相互间存在干扰或影响，导致目前市场上还未见有副猪嗜杆菌病、猪支原体肺炎二联苗的产品。

不仅如此，现有文献中记载的涉及猪支原体肺炎的疫苗，多利用发酵罐进行培养，由于培养时间长，增加人力和生产成本,而且加大污染风险。

因此，急需提供一种在获得较高免疫原性的同时，缩短培养时间，降低生产成本的二联疫苗的生产方法，以预防由猪肺炎支原体引起的猪肺炎支原体、或副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病、或二种混合感染的疾病。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于，利用生物反应器进行猪肺炎支原体的发酵培养，利用发酵罐进行血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌的发酵培养；将发酵培养后的菌液灭活，再分别将血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌通过管式离心机离心；将猪肺炎支原体通过膜包浓缩纯化，根据离心前细菌计数结果，用生理盐水调整合适菌液浓度后混合，再加入免疫增强剂CIA 303，最后再与疫苗佐剂Summit-S550混合乳化，得到副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗。

本发明通过利用生物反应器进行猪肺炎支原体的发酵培养，相对于现有技术中利用发酵罐对猪肺炎支原体的发酵培养，缩短了培养时间，由原本的3～5天缩短为2～3天，显著降低了规模化生产过程中的微生物污染风险；且生物反应器比发酵罐控制更加精密，对设定值控制更加精确，可减少培养过程中的批间差。该培养方法可节约猪肺炎支原体培养时间，减少电气使用成本，减少人员操作时间，因此，减少人工成本。利用生物反应器发酵培养，较发酵罐发酵单位体积内活菌数更高，使得疫苗生产效力提高。

本发明所述方法中，利用生物反应器进行猪肺炎支原体的发酵培养,具体为：向生物反应器中加入改良猪肺炎支原体液体培养基，按所述改良猪肺炎支原体液体培养基总量的5％～15％(v/v)加入猪肺炎支原体种子液，培养温度37℃～38℃、搅拌转速80～100r/min、pH值7.6～7.8、罐内压0.03～0.05Mpa、溶氧量10～15％的条件下发酵培养，当pH值降至6.5-6.8时收获菌液；

所述改良猪肺炎支原体液体培养基的配方以如下比例计为：

将上述成分全部溶解后定容至1000ml，调节pH为7.6～7.8，最后116℃高压灭菌20min；灭菌结束后再分别添加10％(v/v)无支原体污染的无菌马血清。

本发明所述方法中，利用发酵罐进行血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌的发酵培养,具体为：向发酵罐中加入半合成培养基，同时加入0.1‰(v/v)消泡剂，按所述半合成培养基总量的2％～5％(v/v)加入血清4型副猪嗜血杆菌种子液或血清5型副猪嗜血杆菌种子液，培养温度在37℃～38℃、搅拌转速150r/min、pH值7.2、罐内压0.03～0.05Mpa、溶氧量40～50％的条件下发酵培养，培养10～12小时收获菌液；

其中，所述半合成培养基含有：酵母粉(20～40g/L)、磷酸二氢钾(0.3～0.6g/L)、氯化钠(2～5g/L)、磷酸氢二钠(1～4g/L)、TSB(5～10g/L)、牛血清(2％～7％V/V)和辅酶I(0.001～0.1g/L)。

作为优选，所述免疫增强剂为免疫增强剂CIA 303，所述和疫苗佐剂为疫苗佐剂Summit-S550。

进一步地，本发明利用甲醛溶液将发酵培养后的菌液灭活。

进一步地，前述方法中，所述猪肺炎支原体种子液的制备方法包括：取猪肺炎支原体冻干菌种，用改良猪肺炎支原体液体培养基稀释后，再接种于改良猪肺炎支原体液体培养基获得一级种子，取一级种子接种于改良猪肺炎支原体液体培养基上获得二级种子。

进一步地，前述方法中，所述血清4型副猪嗜血杆菌种子液或血清5型副猪嗜血杆菌种子液的制备方法包括：取血清4型副猪嗜血杆菌冻干菌种或血清5型副猪嗜血杆菌冻干菌种，接种TSA固体培养基获得一级种子，取一级种子接种于TSB液体培养基上获得二级种子液。

所述TSA固体培养基通过商业购买BD公司；TSB液体培养基通过商业购买BD公司。

更为具体地，本发明针对所述生产方法提供一套具体操作，包括如下步骤：

(1)生产菌种的制备：

取猪肺炎支原体冻干菌种，用改良猪肺炎支原体液体培养基稀释后，接种于改良猪肺炎支原体液体培养基获得一级种子，取一级种子接种于改良猪肺炎支原体液体培养基上获得二级种子液；

分别取血清4型副猪嗜血杆菌冻干菌种和血清5型副猪嗜血杆菌冻干菌种，接种TSA固体培养基获得一级种子，取一级种子接种于TSB液体培养基上获得二级种子液；

(2)菌液制备与灭活：

将猪肺炎支原体采用生物反应器发酵培养：按生物反应器容积的70％加入改良猪肺炎支原体液体培养基，按所述改良猪肺炎支原体液体培养基总量的5％～15％(v/v)加入猪肺炎支原体种子液，培养温度在37℃～38℃、搅拌转速80～100r/min、pH值7.6～7.8、罐内压0.03～0.05Mpa、溶氧量10～15％的条件下发酵培养，当pH值降至6.5～6.8时收获菌液，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，置于2℃～8℃条件下保存。

将血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌分别采用发酵罐培养：按发酵罐容积的70％加入半合成培养基，同时加入0.1‰(v/v)消泡剂，按所述半合成培养基总量的2％～5％(v/v)加入血清4型副猪嗜血杆菌或血清5型副猪嗜血杆菌种子液，培养温度在37℃～38℃、搅拌转速为150r/min、pH值为7.2、罐内压为0.03～0.05Mpa、溶氧量40～50％的条件下发酵培养，培养10～12小时收获菌液，按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，置于2℃～8℃条件下保存。

(3)浓缩、纯化：

将灭活后的猪肺炎支原体菌液采用超滤膜包10倍浓缩纯化；将灭活后的副猪嗜血杆菌菌液采用管式离心机离心浓缩。

副猪嗜血杆菌菌液通过管道与管式离心机连接即可快速离心，管式离心机每小时可以处理12万毫升样品，而传统连续流每小时处理2万毫升样品。采用管式离心机离心比传统连续流离心效力更高，更具规模化生产；猪肺炎支原体菌液采用密理博0.65m²微滤膜聚醚砜切向流过滤膜包纯化浓缩，操作简单，速度快，适合大规模生产。

(4)疫苗制备：

根据活菌计数结果，调整菌液浓度并与免疫增强剂CIA 303和疫苗佐剂Summit-S550混合乳化。

其中，作为优选，上述步骤(1)中的冻干菌种采用保藏号为CCTCC No.M2011283的血清4型副猪嗜血杆菌MD0322株，保藏号为CCTCC No.M2011284的血清5型副猪嗜血杆菌SH0165株，以及保藏号为CCTCC No.M2018505的猪肺炎支原体XJ03株。

其中，保藏号为CCTCC No.M2011283的血清4型副猪嗜血杆菌MD0322株，和保藏号为CCTCC No.M2011284的血清5型副猪嗜血杆菌SH0165株已在公开号为CN102329746A的中国专利申请中被记载。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)XJ03株，已于2018年7月30日在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。

猪肺炎支原体XJ03株为本发明通过临床发病猪肺组织病料分离、传代稳定后经过3次克隆、纯化所获得的一株免疫原性好、毒力强、生长稳定、发酵密度高的猪肺炎支原体。

本发明所使用的血清4型和血清5型副猪嗜血杆菌冻干菌种，和猪肺炎支原体冻干菌种，均可采用本领域在制备疫苗时常规使用的菌种进行。本领域技术人员应当理解，采用具有特殊优势(例如免疫原性更高等)的菌株并获得相应已知的效果与本发明的发明构思并不存在矛盾之处。本发明并不排除使用任何已发现，或将会发现的相应菌种。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本领域技术人员应当理解，在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

第二方面，本发明提供了由前述生产方法生产得到的疫苗组合物。

作为优选，所述疫苗组合物中血清4型副猪嗜血杆菌≥4×10⁹CFU/头份，血清5型副猪嗜血杆菌≥4×10⁹CFU/头份，猪肺炎支原体≥1×10⁹CCU/头份。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的规模化生产方法。本发明基于菌种的生长特性及抗原物质的理化特征，从规模化培养、灭活、离心/纯化、抗原配比、佐剂及免疫增强剂筛选等设计了一套全新的生产方法。该方法中猪肺炎支原体采用生物反应器制备，严格控制发酵液的pH值、溶氧及转速，有效保证了免疫原性、减少发酵培养时间，从而减少培养过程中微生物污染风险，减少人力、物力，从而降低生产成本，同时提高单位体积内活菌数；副猪嗜血杆菌通过细菌发酵罐制备，菌种繁殖过程中通过溶氧、pH、转速等的设定，保证了批间菌液的均一性。

本发明提供的副猪嗜血杆菌采用管式离心机浓缩，只需将灭活后的发酵液通过管道与管式离心机连接即可快速离心，管式离心机每小时可以处理12万毫升样品，而传统连续流每小时处理2万毫升样品。与传统连续流离心相比更加方便快捷，更适合规模化生产。

本发明生产的疫苗组合物具有特异性强、免疫性好的特点，还可以减少疫苗接种次数，可起到一针防二种疾病的目的，该技术方案更加经济实用，避免多次接种，节约了疫苗成本和人工成本，特别适用于预防和治疗混合感染病症的养殖场。另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

附图说明

图1为不同培养方式猪肺炎支原体生长曲线。

图2为猪肺炎支原体攻毒肺病变图片。

图3为猪肺炎支原体攻毒后肺组织病理切片。

图4为疫苗免疫后猪肺炎支原体ELISA抗体水平。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试验疫苗佐剂Summit-S550，购自上海锐而简国际贸易有限公司。

免疫增强剂CIA 303，购于河北韩美生物科技有限公司

本实施例采用保藏号为CCTCC NO：M2011283的血清4型副猪嗜血杆菌MD0322株，保藏号为CCTCC NO：M2011284的血清5型副猪嗜血杆菌SH0165株，以及保藏号为CCTCC No:M2018505的猪肺炎支原体XJ03株进行疫苗组合物的制备。

实施例1

一、疫苗的制备

1、种子菌制备

(1)一级种子繁殖与鉴定

将副猪嗜血杆菌血清4型MD0322株冻干菌种和副猪嗜血杆菌血清5型SH0165株冻干菌种分别划线接种于TSA琼脂平板上，37℃恒温培养20～24h，至长出典型菌落或菌苔，经纯粹检验合格后，作为一级种子，在2～8℃保存，应不超过7日；将猪肺炎支原体XJ03株冻干菌种按100ml/瓶接种支原体液体培养基中，37℃恒温培养3～5日，当培养基颜色变黄、呈轻度浑浊、pH值降至6.5-6.8时收获菌液，经纯粹检验合格后作为一级种子，具体参数见表1。

表1一级种子菌生长情况结果

(2)二级种子繁殖与鉴定

取副猪嗜血杆菌一级种子平皿，挑选典型菌落或菌苔，接种于TSB肉汤培养基上，置37℃振荡培养16～20h，经纯粹检验合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，应不超过24h；取猪肺炎支原体一级种子菌液按照10％(v/v)接种于改良猪肺炎支原体支原体培养基中，置37℃振荡培养3～5日，当培养基颜色变黄、呈轻度浑浊、pH值降至6.5-6.8时收获菌液，经纯粹检验合格后作为二级种子。

2、自制培养基配方

副猪嗜血杆菌液体培养基：酵母粉(20～40g/L)、磷酸二氢钾(0.3～0.6g/L)、氯化钠(2～5g/L)、磷酸氢二钠(1～4g/L)、TSB(5～10g/L)、牛血清(2％～7％V/V)和辅酶I(0.001～0.1g/L)；

改良的猪肺炎支原体培养基的配方为：

将上述成分全部溶解后定容至1000ml，调节pH为7.6～7.8，最后116℃高压灭菌20min；灭菌结束后再分别添加10％(v/v)无支原体污染的无菌马血清。

3、菌液培养

副猪嗜血杆菌4型和5型菌液，采用细菌发酵罐分别培养。按发酵罐容积的70％加入生产用的半合成培养基(其配制方法为：取副猪嗜血杆菌专用培养基)溶于去离子水，定容至700L，充分摇匀溶解后121℃高压蒸汽灭菌15min，加入35L过滤除菌的牛血清、7L过滤除菌的0.01％NAD)，同时加入0.1‰(v/v)消泡剂(泡敌)防止搅拌培养过程中产生大量气泡，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(4型或5型)分别按2.0％～2.5％(v/v)加入到发酵罐内。调节培养温度为37～38℃、搅拌转速为150r/min、pH值为7.3、罐内压为0.03～0.05Mpa之间、溶氧量为30～50％，培养时间10～12小时收获各型菌液，按菌液体积的0.4％(v/v)加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存。

猪肺炎支原体菌液，采用生物反应器发酵培养，按生物反应器容积的70％加入过滤除菌的支原体培养基(改良猪肺炎支原体培养基)，按培养基总量的5.0％～15.0％(v/v)将种子液加到生物反应器内，培养温度为37～38℃、搅拌转速为80～100r/min、pH值为7.7、罐内压为0.03～0.05Mpa之间、溶氧量10～15％，培养时间2～3日，当pH值降至6.8时收获菌液，然后取样进行纯粹检验和活菌滴度测定，最后按菌液体积的0.4％(v/v)加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存。

纯粹检验：按现行版《中国兽药典》进行检验，应纯粹无杂菌生长。

4、活菌计数

当副猪嗜血杆菌4型和5型菌液培养至9～10h时，分别取发酵菌液1ml，按《中国兽药典》附录方法进行活菌计数(CFU)；当猪肺炎支原体培养时间2～3日，pH值降至6.8时，取发酵菌液1ml，按《中国兽药典》附录方法进行活菌计数(CCU)。

表2发酵菌液培养结果

5、灭活与检验

按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验，检验合格后的灭活菌液置2～8℃保存，应不超过7日。

6、浓缩与纯化

将灭活检验合格的副猪嗜血杆菌菌液分别进行管式离心机离心浓缩菌液；将猪肺炎支原体通过300KD膜包浓缩纯化至原体积10倍。

7、配苗及分装

将检验合格的XJ03株、MD0322株和SH0165株菌液按适宜比例均匀混合，再用生理盐水调整浓度后与免疫增强剂CIA 303和疫苗佐剂Summit-S550混合乳化，最终成品疫苗组合物中血清4型副猪嗜血杆菌≥4×10⁹CFU/头份，血清5型副猪嗜血杆菌≥4×10⁹CFU/头份，猪肺炎支原体≥1×10⁹CCU/头份。

二、疫苗的安全性检验

(1)试验疫苗对靶动物一次超剂量接种的安全性试验

用本发明人试制的3批疫苗(0701、0702和0801)分别对2～3周龄健康易感仔猪以及产前1个月怀孕母猪各5头分别颈部肌肉注射，4ml/头，观察试验猪接种疫苗后的安全性。结果表明，2～3周龄仔猪和怀孕母猪接种后注射部位均未出现红肿反应，精神、采食均正常；产前1个月怀孕母猪接种后均未出现任何不良反应，所产仔猪均正常，与对照猪无明显差异。说明我们试制的疫苗一次超剂量接种怀孕母猪是安全的，详见表3。

表3Mhp-HPS二联灭活疫苗超剂量接种的安全性试验

(2)单剂量重复接种安全试验

用本发明人试制的3批试验疫苗对2～3周龄健康易感仔猪及产前1个月的怀孕母猪进行疫苗接种，21日后重复接种一次，观察疫苗单剂量重复接种对接种猪的安全性。结果表明，该疫苗对接种猪无不良影响，无过敏现象，接种部位无红肿等不良反应，接种猪的精神、采食量均正常，与对照猪无明显差异。证明我们试制的疫苗单剂量重复接种是安全的。详见表4。

表4Mhp-HPS二联灭活疫苗单剂量重复接种的安全性试验结果

三、疫苗的效力性检验

(1)猪肺炎支原体效力检验部分

3批实验室产品支原体效力检验试验结果见表5。

表5支原体效力检验结果(CVCC354株攻毒)

(2)副猪嗜血杆菌效力检验部分

3批疫苗效力检验试验结果见表6。

表6副猪嗜血杆菌MD0322株或SH0165株攻毒试验结果

从表5结果可以看出，本发明的3批疫苗免疫组肺炎病变减少率为71.30％、73.91％、71.30％，从肺炎病变结果可以看出，3批疫苗免疫后攻毒均保护；从图2病理剖检变化结果可以看出，空白对照组于肺脏的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘甚至一侧或整个肺脏呈“肉样”或“虾肉样”实变；从图3病理组织学观察结果可以看出，免疫组攻毒后肺支气管内有淋巴样细胞和巨噬细胞浸润、白细胞渗出；对照组攻毒后白细胞变性、夹杂有单核细胞，中性粒细胞及脱落的肺泡上皮细胞坏死，组织崩解。从表6试验结果可以看出，3批疫苗免疫后攻毒，副猪嗜血杆菌4型(MD0322株)保护率为5/5、4/5、5/5、空白对照组为1/5；副猪嗜血杆菌5型(SH0165株)保护率为4/5、5/5、4/5、空白对照组为0/5。

因此，从表3～表6、图2和图3试验结果可以看出，本发明人生产的3批疫苗安全性检验、效力检验，结果均符合“猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗(XJ03株+MD0322株+SH0165株)质量标准”要求，结果表明按本工艺制备的疫苗对猪安全，且免疫效果良好。

对比例1猪肺炎支原体菌液培养

1、一级生产种子制备将冻干菌种接种于支原体液体培养基，37℃振荡培养2～4日，待pH值降至6.8时收获，经纯粹检验合格后，作为一级生产种子，在2～8℃保存，应不超过5日。

2、二级生产种子制备取一级种子按10％(v/v)接种量接种支原体液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值降至6.8时收获，经纯粹检验合格后，作为二级生产种子，在2～8℃保存，应不超过5日。生产种子代次应不超过5代。

3、菌液发酵培养将检验合格二级菌种按10％(v/v)比例接种猪肺炎支原体液体培养基中，发酵罐通氧量为10～20％，罐内压为0.03～0.05Mpa之间，搅拌速度为80～100r/min，37℃恒温培养5～7日，培养基颜色变黄，pH值降至6.50～6.80左右收获菌液，进行纯粹检验和活菌滴度(CCU)测定。采用此方法连续制备3批菌液，分别抽样进行纯粹检验和活菌滴度(CCU)测定，详细结果见表7。

3.1纯粹检验按现行版《中国兽药典》进行检验，应纯粹无杂菌生长。

3.2活菌滴度检验按《中国兽药典》附录方法进行活菌计数(CCU)。

表7菌液培养条件参数

4、发酵结束后，将菌液用无菌空气通过管道压入灭菌好的灭活罐中，按菌液总体积的0.3％加入甲醛溶液进行灭活。37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验后，置2～8℃保存。

从试验结果(图1)可以看出，传统的细菌发酵罐与本发明采用的生物反应器发酵相比，培养时间长，活菌数低。因此，采用生物反应器培养猪肺炎支原体可以降低生产成本，减少人力、物力，更有利于规模化生产。

对比例2两种不同离心浓缩方式对比试验

将2种各300L菌液分别通过管式离心机和连续流离心机进行离心对比试验，转速设定为9000r/min，比较两种离心机离心工作效率，分别收集离心后的废液，测定OD600值，详细结果见表8、表9。

表8 300LMD0322株菌液离心浓缩对比试验结果

表9 300L SH0165株菌液离心浓缩对比试验结果

通过试验结果可以看出，管式离心机每小时可以处理120L样品，而传统连续流每小时处理20L样品。与传统连续流离心相比更加方便快捷，效率更高，更适合规模化生产，同时管式离心机离心更加彻底。

对比例3免疫增强剂在试验疫苗中的效果比较

1材料与方法

1.1材料

1.1.1Mhp-HPS二联灭活疫苗，由武汉科前生物股份有限公司制备。

1.1.2普泰克猪肺炎支原体灭活疫苗，商业渠道购买。

1.1.3猪肺炎支原体检验用强毒为济南系猪肺炎支原体强毒CVCC354株，2.0ml/瓶，购于中国兽医药品监察室。

1.1.4佐剂试验疫苗佐剂Summit-S550，购自上海锐而简国际贸易有限公司。

1.1.5免疫增强剂CIA 303购于河北韩美生物科技有限公司。

1.1.6健康易感仔猪购自华中农业大学实验猪场，实验入选标准为“母猪及仔猪均未注射过猪肺炎支原体疫苗，且经过IDEXX公司猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒测定其猪肺炎支原体血清抗体均为阴性，仔猪临床上无咳嗽、气喘等肺炎支原体感染症状”。

1.1.5猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.2方法

1.2.1试验设计，详细见表10。

表10试验设计

1.2.2试验方法将3组不同疫苗分别接种健康易感猪各5头，每头颈部肌肉注射2.0ml，并设攻毒对照5头，不注射疫苗，同条件下隔离饲养。在首免后21日按照相同方式进行二免，在二免后14日进行气管攻毒，每头猪各气管注射济南系猪肺炎支原体强毒CVCC354株5ml。各组试验猪于攻毒前1天采血，用ELISA法测定其猪肺炎支原体血清抗体水平，并于攻毒后28日全部剖杀。根据55分评分法对试验猪的肺部病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。

1.2.3健康状况临床检测在攻毒前1日开始，逐日观察至实验结束，记录猪的日常活动、呼吸症状及咳漱和消化是否正常。

2结果

2.1试验疫苗在二免后14日采血，猪肺炎支原体抗体检测结果，见图4。

2.2不同试验组疫苗免疫结束后，进行猪肺炎支原体攻毒，肺炎病变结果见表11。

表11不同组疫苗免疫猪后Mhp攻毒保护结果

从试验结果(图4)可以看出，本发明疫苗中添加免疫增强剂在抗体水平上明显比不添加对照试验组和阳性对照组高；在攻毒保护试验中，疫苗中添加免疫增强剂试验组2肺病变减少率为77.0％，对照试验组1为68.9％，阳性对照试验组3为70.1％，试验结果可以说明，疫苗中添加免疫增强剂可以提高免疫保护效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于，利用生物反应器进行猪肺炎支原体的发酵培养，利用发酵罐进行血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌的发酵培养；将发酵培养后的菌液灭活、浓缩、纯化，再按一定比例混合，并加入免疫增强剂和疫苗佐剂，得到副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，利用生物反应器进行猪肺炎支原体的发酵培养,具体为：向生物反应器中加入改良猪肺炎支原体液体培养基，按所述改良猪肺炎支原体液体培养基总量的5％～15％(v/v)加入猪肺炎支原体种子液，培养温度在37℃～38℃、搅拌转速80～100r/min、pH值7.6～7.8、罐内压0.03～0.05Mpa、溶氧量10％～15％的条件下发酵培养，当pH值降至6.5-6.8时收获菌液；

所述改良猪肺炎支原体液体培养基的配方以如下比例计为：

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，利用发酵罐进行血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌的发酵培养,具体为：向发酵罐中加入半合成培养基，同时加入0.1‰(v/v)消泡剂，按所述半合成培养基总量的2％～5％(v/v)加入血清4型副猪嗜血杆菌种子液或血清5型副猪嗜血杆菌种子液，培养温度为37℃～38℃、搅拌转速为120～180r/min、pH值7.0～7.3、罐内压为0.03～0.05Mpa、溶氧量40～50％的条件下发酵培养，培养10～12小时收获菌液；

所述半合成培养基为所述的发酵培养基成分为：酵母粉(20～40g/L)、磷酸二氢钾(0.3～0.6g/L)、氯化钠(2～5g/L)、磷酸氢二钠(1～4g/L)、TSB(5～10g/L)、牛血清(2％～7％V/V)和辅酶I(0.001～0.1g/L)。

4.根据权利要求1～3任一项所述的生产方法，其特征在于，所述免疫增强剂为免疫增强剂CIA303，所述疫苗佐剂为Summit-S550。

5.根据权利要求1～4任一项所述的生产方法，其特征在于，利用甲醛溶液将发酵培养后的菌液灭活。

6.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述猪肺炎支原体种子液的制备方法包括：取猪肺炎支原体冻干菌种，用改良猪肺炎支原体液体培养基稀释后，接种于改良猪肺炎支原体液体培养基获得一级种子，取一级种子接种于改良猪肺炎支原体液体培养基上获得二级种子。

7.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述血清4型副猪嗜血杆菌种子液或血清5型副猪嗜血杆菌种子液的制备方法包括：取血清4型副猪嗜血杆菌冻干菌种或血清5型副猪嗜血杆菌冻干菌种，接种TSA固体培养基获得一级种子，取一级种子接种于TSB液体培养基上获得二级种子液。

8.根据权利要求1～7任一项所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：

(1)生产菌种的制备：

取猪肺炎支原体冻干菌种，用改良猪肺炎支原体液体培养基稀释后，接种于改良猪肺炎支原体液体培养基获得一级种子，取一级种子接种于改良猪肺炎支原体液体培养基上获得二级种子液；

分别取血清4型副猪嗜血杆菌冻干菌种和血清5型副猪嗜血杆菌冻干菌种，接种TSA固体培养基获得一级种子，取一级种子接种于TSB液体培养基上获得二级种子液；

(2)菌液制备与灭活：

将猪肺炎支原体采用生物反应器发酵培养：按生物反应器容积的70％加入改良猪肺炎支原体液体培养基，按所述改良猪肺炎支原体液体培养基总量的5％～15％(v/v)加入猪肺炎支原体种子液，培养温度在37℃～38℃、搅拌转速在80～100r/min、pH值7.6～7.8、罐内压在0.03～0.05Mpa、溶氧量10％～15％的条件下发酵培养，当pH值降至6.5-6.8时收获菌液，按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，置于2℃～8℃条件下保存；

将血清4型副猪嗜血杆菌和血清5型副猪嗜血杆菌分别采用发酵罐培养：按发酵罐容积的70％(v/v)加入半合成培养基，同时加入0.1‰(v/v)消泡剂，按所述半合成培养基总量的2％～5％(v/v)加入血清4型副猪嗜血杆菌或血清5型副猪嗜血杆菌种子液，培养温度在37℃～38℃、搅拌转速150r/min、pH值7.2、罐内压0.03～0.05Mpa、溶氧量40％～50％的条件下发酵培养，培养10～12小时收获菌液，按菌液体积的0.4％加入甲醛溶液，37℃搅拌灭活24h，置于2℃～8℃条件下保存；

(3)浓缩、纯化：

将灭活后的猪肺炎支原体菌液采用超滤膜包10倍浓缩纯化；将灭活后的副猪嗜血杆菌菌液采用管式离心机离心浓缩；

(4)疫苗制备：

根据活菌计数结果，调整菌液浓度并与免疫增强剂CIA 303和疫苗佐剂Summit-S550混合乳化。

9.由权利要求1～8任一项所述的生产方法生产得到的疫苗组合物。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中血清4型副猪嗜血杆菌≥4×10⁹CFU/头份，血清5型副猪嗜血杆菌≥4×10⁹CFU/头份，猪肺炎支原体≥1×10⁹CCU/头份。