CN104560835A - 一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法 - Google Patents

一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法 Download PDF

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候凤
王钢
李新苹
贺笋
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明提供一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该培养基是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混合，调整pH，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。发明所述的猪肺炎支原体培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间为2-3日，含菌量为1.0×109-10CCU/ml，达到最终含菌量的测定时间为9-10日，说明发明制备的培养基培养猪肺炎支原体CJ株含菌量高于现有技术的培养基，具有生长迅速，含菌量高的特点；该培养基制备方法工艺简单，适合工业化大生产。适用于培养猪肺炎支原体CJ株生长。

Description

一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于兽医微生物学技术领域，涉及一种高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法。
背景技术
猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)继发感染。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场都有发生。由于带菌病猪的存在和分布较广，通常会引起猪群生产性能显著下降，受感染猪群日增重下降，饲料报酬降低，上市时间延迟，猪群生长均匀度较差，药物治疗成本增加，因而给猪场造成较为严重的经济损失。由国内外临床经验可知，接种疫苗，能够显著的降低猪肺炎病变程度，降低饲养成本，是一种比较可行的预防方法。
目前培养猪肺炎支原体的培养基主要有1975年Goodwin等发明的Friis培养基，1975年江苏农科院发明的KM2培养基，2000年版兽医生物制品制造及检验规程中提出的猪肺炎支原体培养基，2006年农业行业标准中提出的A26培养基。
以上述传统培养基及培养工艺培养自行分离的猪肺炎支原体CJ株的共同缺点是，生长速度较慢，且含菌量较低(在1.0×107-8CCU/ml之间)，从而影响疫苗的免疫效力。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该培养基是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混合，调整pH，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。本发明所述的猪肺炎支原体培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间为2-3日，含菌量为1.0×109-10CCU/ml，达到最终含菌量的测定时间为9-10日，说明本发明制备的培养基培养猪肺炎支原体CJ株含菌量高于现有技术的培养基，具有生长迅速，含菌量高的特点；该培养基制备方法工艺简单，适合工业化大生产。适用于培养猪肺炎支原体CJ株生长。
本发明所述的一种培养猪肺炎支原体的培养基，该培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml、琼脂粉0-15.0g，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml、灭活的猪血清100-250.0ml制成。
所述的培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，按下列步骤进行：
a、制备基础培养基：
将基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉0-15.0g混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；
b、制备辅助培养基：
将辅助培养基为10×汉克氏(Hank′s)平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；
c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体或固体培养基。
该培养基中的酵母浸出液为取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度2-8℃保存备用。
该培养基中的10×Hank′s平衡盐溶液为CaCl21.4g，KCl 4.0g，KH2PO40.6g，MgCl2·6H2O 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 80.0g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，加去离子水至1000ml。
该培养基中的PPLO肉汤粉为BD公司生产，货号为255420；脑心浸液粉为BD公司生产，货号为237500；琼脂粉为BD公司生产，货号为214230；猪血清为Hyclone公司生产，货号：SH30908.04；青霉素为Sigma公司生产，货号为PENK-100MU；杆菌肽粉为MERCK公司生产，货号为B0125-1250KU；酚红为Sigma公司生产，货号为P3532；无机盐为MERCK公司生产；干酵母粉为安琪公司生产。
本发明所述的一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该猪肺炎支原体培养基运用微生物学、无机、有机分析化学的技术原理，对不同的碳源、氮源、无机盐、蛋白质和胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的pH值、渗透压、离子强度等进行了比较与分析，研究出了适合猪肺炎支原体快速生长的培养基。给培养基的配方中除了基本成分外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液，上述成分的添加能明显提高猪肺炎支原体的含菌量；未添加前的含菌量为1.0×107-8CCU/ml，添加后的含菌量为1.0×109-10CCU/ml；含菌量高于现有技术的培养基。
具体实施方式
实施例1
a、制备基础培养基：
将基础培养基为PPLO肉汤粉5.0g、脑心浸液粉4.0g、去离子水660ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；
b、制备辅助培养基：
配制酵母浸出液：取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度2℃保存备用；
配制10×Hank′s平衡盐溶液：取CaCl21.4g，KCl 4.0g，KH2PO40.6g，MgCl2·6H2O1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 80.0g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，加去离子水至1000.0ml备用；
将辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液40ml、酵母浸出液40ml、青霉素300U/ml、杆菌肽粉20U/ml、0.25％酚红10ml、灭活的猪血清250ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；
c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体培养基。
实施例2
a、制备基础培养基：
将基础培养基为PPLO肉汤粉4.0g、脑心浸液粉3.0g、去离子水700.0ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；
b、制备辅助培养基：
配制酵母浸出液：取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度4℃保存备用；
配制10×Hank′s平衡盐溶液：取CaCl21.4g，KCl 4.0g，KH2PO40.6g，MgCl2·6H2O1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 80.0g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，加去离子水至1000.0ml备用；
将辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液30ml、酵母浸出液30ml、青霉素200U/ml、杆菌肽粉10U/ml、0.25％酚红10ml、灭活的猪血清200ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；
c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体培养基。
实施例3
a、制备基础培养基：
将基础培养基为PPLO肉汤粉3.0g、脑心浸液粉2.0g、去离子水740ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；
b、制备辅助培养基：
配制酵母浸出液：取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度8℃保存备用；
配制10×Hank′s平衡盐溶液：取CaCl21.4g，KCl 4.0g，KH2PO40.6g，MgCl2·6H2O1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 80.0g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，加去离子水至1000.0ml备用；
将辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20ml、酵母浸出液20ml、青霉素100U/ml、杆菌肽粉5U/ml、0.25％酚红10ml、灭活的猪血清150ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；
c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体培养基。
实施例4
a、制备基础培养基：
将基础培养基为PPLO肉汤粉4.5g、脑心浸液粉2.5g、去离子水680ml和琼脂粉15.0g混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；
b、制备辅助培养基：
配制酵母浸出液：取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度6℃保存备用；
配制10×Hank′s平衡盐溶液：取CaCl21.4g，KCl 4.0g，KH2PO40.6g，MgCl2·6H2O1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 80.0g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，加去离子水至1000.0ml备用；
将辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液25ml、酵母浸出液30ml、青霉素150U/ml、杆菌肽粉15U/ml、0.25％酚红8ml、灭活的猪血清150ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；
c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的固体培养基。
实施例5
选择本发明制备的液体培养基、2000年版兽医生物制品制造及检验规程中提出的猪肺炎支原体培养基(以下简称猪肺炎支原体培养基)和ATCC 1699猪肺炎支原体培养基对猪肺炎支原体CJ株和猪肺炎支原体标准株J株进行比较培养试验：
猪肺炎支原体菌株和培养条件：
将自行分离鉴定的猪肺炎支原体CJ株(该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日)和猪肺炎支原体标准株J株分别接种本发明制备的液体培养基、传统的猪肺炎支原体培养基和ATCC 1699猪肺炎支原体培养基，种子继代复壮后，分别按1∶10(V/V)的比例接种，置于温度36-38℃恒温培养箱中培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.6降低至6.7-6.8时，无菌取出培养物，进行含菌量的测定；
含菌量的测定：
取猪肺炎支原体CJ株和标准株J株菌液依次10倍系列稀释，稀释度达到10-1、10-2、10-3……10-12，再设培养基作对照，置温度36-38℃恒温培养箱内培养14日，每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化，直至培养物pH值不发生变化，最后发生颜色变化的稀释度即为该培养物的CCU滴度，并测定3次；
结果：猪肺炎支原体CJ株接种3种培养基的生长时间及含菌量的测定结果见表1：
表1 猪肺炎支原体CJ株接种3种培养基的结果
从3种培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间结果可知：猪肺炎支原体CJ株在本发明制备的培养基中生长较快，为2-3日；猪肺炎支原体培养基为4-5日，ATCC 1699培养基为6-7日，说明本发明制备的培养基更适宜猪肺炎支原体CJ株生长。
从3种培养基培养猪肺炎支原体CJ株的测定含菌量结果可知：用本发明制备的液体培养基、猪肺炎支原体培养基和ATCC 1699培养基测定的含菌量逐渐降低，且达到最终含菌量的时间逐渐延长，含菌量(和达到最终含菌量的测定时间)分别为1.0×109-10CCU/ml(9-10日)，1.0×107-8CCU/ml(12-13日)，1.0×107CCU/ml(12-13日)，说明本发明制备的液体培养基培养猪肺炎支原体CJ株具有生长迅速，含菌量高的特点；
猪肺炎支原体J株接种3种培养基的生长时间及含菌量的测定结果见表2：
表2 猪肺炎支原体J株接种3种培养基的结果
从3种培养基培养猪肺炎支原体J株的生长时间结果可知：猪肺炎支原体J株在本发明制备的培养基和ATCC 1699培养基(J株专属培养基)中生长均较快，为3-4日；猪肺炎支原体培养基为5-6日；说明本发明制备的培养基也适宜猪肺炎支原体J株生长。
从3种培养基培养猪肺炎支原体J株的测定含菌量结果可知：用本发明制备的培养基、ATCC 1699培养基(J株专属培养基)和猪肺炎支原体培养基测定的含菌量逐渐降低，且达到最终含菌量的时间逐渐延长，含菌量(和达到最终含菌量的测定时间)分别为1.0×109CCU/ml(10-11日)，1.0×109CCU/ml(10-11日)，1.0×107CCU/ml(12-13日)，说明本发明制备的培养基与ATCC 1699培养基(J株专属培养基)培养猪肺炎支原体J株均具有生长迅速，含菌量高的特点。
从猪肺炎支原体接种本发明制备的猪肺炎支原体培养基的生长时间及含菌量测定的结果来看，本发明制备的猪肺炎支原体培养基具有生长迅速，含菌量高的特点，并具有广泛的适用性。

Claims (3)

1.一种培养猪肺炎支原体的培养基，其特征在于该培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉0-15.0g，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25%酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml制成。
2.根据权利要求1所述的培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、制备基础培养基：
将基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉0-15.0g混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；
b、制备辅助培养基：
将辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25%酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；
c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体或固体培养基。
3.根据权利要求2所述的培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于步骤b辅助培养基中的酵母浸出液为取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度2-8℃保存备用。
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