CN109468248A - 一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法 - Google Patents

一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法 Download PDF

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朱月婷
陈兆霞
朱晓玮
徐霞
吴彦
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明涉及动物疫苗技术领域，尤其是一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法，包括以下步骤：材料准备、菌种复苏培养、培养基配制、发酵罐接种、设定联动培养参数、系统自动培养、出罐和抗原检查等。本方法能够节约产品主要原材料——猪支原体阴性血清使用量5％；人员操作减员60％以上，仅需2‑3人；抗原活菌数均有10倍以上提高，且培养周期稳定，大大减少了人的行为操作方面的误差。

Description

一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法
技术领域
本发明涉及动物疫苗领域，具体领域为一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法。
背景技术
猪气喘病(猪支原体肺炎)是由MpH引起的一种慢性接触性呼吸道病，本病发病率高，遍及全球，造成养殖业巨大的经济损失。且市场趋势规模化养殖，呼吸道病中猪支原体肺炎的防制作用效果对于整个猪场的的发病率和饲料转化率等方面起到的经济效益明显上升结果，所以猪支原体肺炎活疫苗的市场应用空间越来越明显，受到养殖业界的一致认可。
目前，猪支原体肺炎活疫苗抗原传统培养工艺是支原体菌种在玻璃转瓶中通过加入特定的含20％猪支原体阴性血清的无细胞培养基进行复苏培养，菌种生长按照pH值下降和 CCU活菌检测结果合格后，再进行10％的菌种接种量扩大培养，一般从冻干菌种复苏开始扩繁培养4代左右，每代培养96小时左右即可达到批量产品冻干生产的批次产量(27平方冻干容积)。
转瓶在批量生产过程会由于原材料、除菌条件、pH值、通气量、温室摆放位置等细微的差异引起瓶与瓶之间的培养菌数结果差异，批间抗原水平会出现不均一且逐瓶接种、取样、补料等操作比较繁琐，操作过程中容易造成细菌污染，浪费人力、物料资源。
为了生产高效、均一、稳定的批间产品，有必要建立一套发酵系统高效发酵培养猪支原体肺炎抗原的生产工艺，稳定抗原质量，保证活菌效率，保证产品品质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法，以解决现有技术中抗原批次质量不高、活菌效率无法保证的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法，包括以下步骤：
(1)准备培养用培养基、筛选好培养使用的猪肺炎支原体阴性血清(24L)、发酵罐等。
(2)菌种复苏培养：取10支冻干猪肺炎支原体菌种按1:10比例接种于150ml含有20％猪支原体阴性血清的培养基中，调整培养物pH值至7.5，在37℃温室中培养48-72小时后，待pH值下降0.5以上进行收获，再以10％菌种接种量进行传代培养2代，每代次培养72-96小时，pH值下降0.5以上收获，至菌种量为15000ml，检验合格后备发酵罐接种使用。
(3)检查发酵罐系统水、电、气管路正常供应，且罐体、管道无漏点、清洁验证合格。
(4)发酵罐pH电极、溶氧电极校准、安装，进行罐体气密性验证合格后，以121℃ 30分钟进行空罐灭菌。
(5)在已灭菌的罐内进行培养基配制(115L)，并立即以115℃40分钟进行在线灭菌后及时降温至37℃，对罐内培养基进行保温、保压24小时无菌测试合格后准备接种。
(6)发酵罐接种：利用36#硅胶管道无菌操作方法连接好血清瓶出料管口与发酵罐进料管口1号阀门；及菌种出料管口与发酵罐进料管口2号阀门，并检查管路间有无漏点，检查合格后安装好蠕动泵将23L血清(15％)和15L菌种接种入发酵罐内。
(7)利用24#硅胶管无菌操作方法将罐体消泡剂补料口与消泡瓶出液口连接，并安装好补料蠕动泵；以同样方法接好NaOH补料瓶。
(8)设定联动培养参数---温度37℃、pH值7.8、罐内压力0.02MPa、搅拌频率60 转/分钟。
(9)关闭深层通气系统，启动温度、pH、表层通气、转速、消泡联动程序进行系统自动培养。
(10)溶氧程序单独控制：在培养24小时内关闭深层通气，24小时后观察溶氧消耗情况，正常耗氧至30％以下，进行深层通气补养至50％关闭通气，每隔6小时进行深层通气补氧至50％一次，48小时后即4小时通气补溶氧至50％一次，直至培养程序结束。
(11)培养过程中检测并记录培养参数，0小时、12小时、24小时、60小时取样做纯粹检验，检验合格则继续运行培养参数，纯粹检验不合格则说明罐内培养物污染杂菌，立即停止培养(本批培养过程失败)。
(12)以间歇性供氧培养方式连续培养至80小时左右结束培养程序，关闭补料、通气等阀门。
(13)出罐:利用82#硅胶管无菌操作方法连接好罐底出料阀门与抗原收获桶进料口阀门，检查管道无漏点合格后，开启罐底出料阀和微开表层通气阀门，利用压力降罐内抗原灌流入抗原收获桶中，同时留样做纯粹检验和菌数CCU检测。
(14)抗原检查结果合格(抗原纯粹和抗原效价达到3*109-1010CCU/ml)则交接至成品生产班组进行配苗冻干程序。
本发明的方法利用200L发酵罐系统培养高效的的猪支原体肺炎抗原，且发酵工艺稳定生产。本发酵培养工艺具有以下优点：
(1)能够节约产品主要原材料——猪支原体阴性血清使用量5％；
(2)人员操作减员60％以上，30瓶转瓶培养需要人员6-8人，而本发明发酵工艺培养仅需2-3人；
(3)抗原活菌数均有10倍以上提高；
(4)培养周期稳定，大大减少了人的行为操作方面的误差；
(5)实验充分表明发酵自动培养工艺同时能够保证批内、批间产品质量稳定，适于推广生产应用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法，包括以下步骤：
(1)准备培养用培养基、筛选好培养使用的猪肺炎支原体阴性血清(24L)、发酵罐等。
(2)菌种复苏培养：取10支冻干猪肺炎支原体菌种按1:10比例接种于150ml含有20％猪支原体阴性血清的培养基中，调整培养物pH值至7.5，在37℃温室中培养48-72小时后，待pH值下降0.5以上进行收获，再以10％菌种接种量进行传代培养2代，每代次培养72-96小时，pH值下降0.5以上收获，至菌种量为15000ml，检验合格后备发酵罐接种使用。
(3)检查发酵罐系统水、电、气管路正常供应，且罐体、管道无漏点、清洁验证合格。
(4)发酵罐pH电极、溶氧电极校准、安装，进行罐体气密性验证合格后，以121℃ 30分钟进行空罐灭菌。
(5)在已灭菌的罐内进行培养基配制(115L)，并立即以115℃40分钟进行在线灭菌后及时降温至37℃，对罐内培养基进行保温、保压24小时无菌测试合格后准备接种。
(6)发酵罐接种：利用36#硅胶管道无菌操作方法连接好血清瓶出料管口与发酵罐进料管口1号阀门；及菌种出料管口与发酵罐进料管口2号阀门，并检查管路间有无漏点，检查合格后安装好蠕动泵将23L血清(15％)和15L菌种接种入发酵罐内。
(7)利用24#硅胶管无菌操作方法将罐体消泡剂补料口与消泡瓶出液口连接，并安装好补料蠕动泵；以同样方法接好NaOH补料瓶。
(8)设定联动培养参数---温度37℃、pH值7.8、罐内压力0.02MPa、搅拌频率60转 /分钟。
(9)关闭深层通气系统，启动温度、pH、表层通气、转速、消泡联动程序进行系统自动培养。
(10)溶氧程序单独控制：在培养24小时内关闭深层通气，24小时后观察溶氧消耗情况，正常耗氧至30％以下，进行深层通气补养至50％关闭通气，每隔6小时进行深层通气补氧至50％一次，48小时后即4小时通气补溶氧至50％一次，直至培养程序结束。
(11)培养过程中检测并记录培养参数，0小时、12小时、24小时、60小时取样做纯粹检验，检验合格则继续运行培养参数，纯粹检验不合格则说明罐内培养物污染杂菌，立即停止培养(本批培养过程失败)。
(12)以间歇性供氧培养方式连续培养至80小时左右结束培养程序，关闭补料、通气等阀门。
(13)出罐：利用82#硅胶管无菌操作方法连接好罐底出料阀门与抗原收获桶进料口阀门，检查管道无漏点合格后，开启罐底出料阀和微开表层通气阀门，利用压力降罐内抗原灌流入抗原收获桶中，同时留样做纯粹检验和菌数CCU检测。
(14)抗原检查结果合格(抗原纯粹和抗原效价达到3*109-1010CCU/ml)则交接至成品生产班组进行配苗冻干程序。
将上述发酵培养工艺与转瓶培养生产的抗原CCU计数结果进行对照：
结果充分说明：本发明的猪肺炎支原体发酵培养工艺比常规转瓶培养效果更优。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)准备培养用培养基、筛选好培养使用的猪肺炎支原体阴性血清、发酵罐；
(2)菌种复苏培养：取10支冻干猪肺炎支原体菌种按1:10比例接种于150ml含有20％猪支原体阴性血清的培养基中，调整培养物pH值至7.5，在37℃温室中培养48-72小时后，待pH值下降0.5以上进行收获，再以10％菌种接种量进行传代培养2代，每代次培养72-96小时，pH值下降0.5以上收获，至菌种量为15000ml，检验合格后备发酵罐接种使用；
(3)在已灭菌的罐内进行培养基配制，并立即以115℃40分钟进行在线灭菌后及时降温至37℃，对罐内培养基进行保温、保压24小时无菌测试合格后准备接种；
(4)发酵罐接种；
(5)利用24#硅胶管无菌操作方法将罐体消泡剂补料口与消泡瓶出液口连接，并安装好补料蠕动泵；以同样方法接好NaOH补料瓶；
(6)设定联动培养参数：温度37℃、pH值7.8、罐内压力0.02MPa、搅拌频率60转/分钟。
(7)关闭深层通气系统，启动温度、pH、表层通气、转速、消泡联动程序进行系统自动培养；
(8)溶氧程序单独控制：在培养24小时内关闭深层通气，24小时后观察溶氧消耗情况，正常耗氧至30％以下，进行深层通气补养至50％关闭通气，每隔6小时进行深层通气补氧至50％一次，48小时后即4小时通气补溶氧至50％一次，直至培养程序结束；
(9)以间歇性供氧培养方式连续培养至80小时左右结束培养程序，关闭补料、通气阀门；
(10)出罐；
(11)抗原检查结果合格则交接至成品生产班组进行配苗冻干程序。
2.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：在菌种复苏培养之后，先检查发酵罐系统水、电、气管路正常供应，且罐体、管道无漏点、清洁验证合格。
3.根据权利要求2所述的猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：发酵罐检查之后，进行发酵罐pH电极、溶氧电极校准、安装，进行罐体气密性验证合格后，以121℃、30分钟进行空罐灭菌。
4.根据权利要求3所述的猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：发酵罐接种步骤具体为，利用36#硅胶管道无菌操作方法连接好血清瓶出料管口与发酵罐进料管口1号阀门；连接好菌种出料管口与发酵罐进料管口2号阀门，并检查管路间有无漏点，检查合格后安装好蠕动泵将血清和菌种接种入发酵罐内。
5.根据权利要求4所述的猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：培养过程中检测并记录培养参数，0小时、12小时、24小时、60小时取样做纯粹检验，检验合格则继续运行培养参数，纯粹检验不合格则说明罐内培养物污染杂菌，立即停止培养。
6.根据权利要求5所述的猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：出罐步骤具体为，利用82#硅胶管无菌操作方法连接好罐底出料阀门与抗原收获桶进料口阀门，检查管道无漏点合格后，开启罐底出料阀和微开表层通气阀门，利用压力降罐内抗原灌流入抗原收获桶中，同时留样做纯粹检验和菌数CCU检测。
7.根据权利要求6所述的猪支原体肺炎抗原高效培养方法，其特征在于：抗原纯粹和抗原效价达到3*109-1010CCU/ml，即抗原检查结果合格。
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