CN107513507A - 一种猪肺炎支原体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种猪肺炎支原体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪肺炎支原体的制备方法，该制备方法包括在扩增培养猪肺炎支原体进入稳定期后，调节液体培养基pH值并继续培养所述液体培养基的步骤。本发明还涉及使用该猪肺炎支原体的抗原制备的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，免疫效果大大提高。

Description

一种猪肺炎支原体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种猪肺炎支原体的制备方法，以及其制备的疫苗组合物和应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引发的一种慢性肺炎，长期以来，本病一直被认为是对养猪业造成重大经济损失、且最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。当猪肺炎支原体伴有其他病原混合感染或继发感染时，表现为呼吸困难、发热、死亡等；反之，未伴有其他病原体时，病情显得较为简单，呈现亚临床症状，表现为慢性无痰干咳、平均日增重下降和饲料转化率降低。近几年来，通过使用药物和疫苗以及合理的管理方法大大的减轻了猪地方性肺炎对猪群肺组织的损害，但本病仍然广泛流行于世界各地，给全球养猪业仍然造成了非常严重的经济损失。国外许多养猪业发达的国家已对猪肺炎支原体的流行病学进行了调查，表明30％-100％的育肥猪都表现为猪肺炎支原体血清抗体阳性，屠宰场的流行病学资料显示38％-100％猪群都感染了猪肺炎支原体。
采用疫苗进行免疫预防是国内外控制猪肺炎支原体感染的根本手段。猪肺炎支原体的培养困难较大，传统培养方式耗时长、抗原滴度低，是目前猪肺炎支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。
发明内容
针对现有技术中猪肺炎支原体疫苗生产的难题，本发明对猪肺炎支原体的培养方式和疫苗制备方法进行研究，实现了在不增加成本的情况下，大大提高了疫苗的免疫效果，能够有效地预防猪肺炎支原体的感染。
本发明涉及一种猪肺炎支原体的制备方法，其制备的猪肺炎支原体的抗原，具有大大提高疫苗的免疫效力的效果，所述猪肺炎支原体的制备方法包括：步骤(1)使用液体培养基扩增培养猪肺炎支原体或其培养物进入稳定期；步骤(2)调节所述液体培养基pH值为7.2-7.6；以及步骤(3)继续培养所述猪肺炎支原体至液体培养基pH值下降为6.8-7.0。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述制备方法制备的猪肺炎支原体的抗原和药学上可接受的载体。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪支原体肺炎和猪肺炎支原体感染相关疾病的药物中的应用。
附图说明
图1为根据不同培养时间点活菌含量绘制的猪肺炎支原体的生长曲线。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
“稳定期”意指微生物在恒定体积的液体培养基中培养，以细胞对数值为纵坐标，培养时间为横坐标的生长曲线上，生长速率常数等于0的时期，体系处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡中。
“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
本发明涉及一种猪肺炎支原体的制备方法，其中，所述猪肺炎支原体的制备方法包括：步骤(1)使用液体培养基扩增培养猪肺炎支原体或其培养物进入稳定期；步骤(2)调节所述处于稳定期的液体培养基pH值为7.2-7.6；以及步骤(3)继续培养所述猪肺炎支原体至液体培养基pH值下降为6.8-7.0。
作为本发明的一种实施方式，所述液体培养基的配方为(按1065mL计)：牛心浸液(BD公司)300mL，ddH2O 360mL，调pH值到7.4，121℃高压灭菌15min。再加入下列过滤除菌的成分：Hank’s平衡盐溶液(10×)40mL，0.25％(W/V)酚红10mL，灭活马血清200mL，5％(W/V)水解乳蛋白100mL，25％(W/V)酵母浸出液20mL，10000IU/mL青霉素10mL，1％醋酸铊溶液25mL。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，所述步骤(1)中所述扩增培养猪肺炎支原体进入稳定期时所述液体培养基pH值下降为6.8-7.0。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，所述步骤(2)中调节所述处于稳定期的液体培养基pH值为7.4。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，所述步骤(3)中继续培养所述猪肺炎支原体0.5天以上。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，所述步骤(3)中继续培养所述猪肺炎支原体0.5天-2天。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，所述步骤(1)中使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物为多级培养。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，所述步骤(1)中使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物为三级培养。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物制备一级种子的菌种接种量为5％-15％，所述制备一级种子的培养完成时液体培养基pH值为6.8-7.0，制备二级种子的一级种子接种量为3％-8％，所述制备二级种子的培养完成时液体培养基pH值为6.8-7.0，使用二级种子扩增猪肺炎支原体的接种量为3％-8％，所述扩增猪肺炎支原体的培养完成时液体培养基pH值为6.8-7.0。
作为本发明的一种实施方式，本发明的猪肺炎支原体的制备方法中，使用液体培养基扩增培养猪肺炎支原体或其培养物制备一级种子的菌种接种量为10％，制备一级种子的培养时间为3-7天，制备二级种子的一级种子接种量为5％，制备二级种子的培养时间为3-7天，使用二级种子扩增猪肺炎支原体的接种量为5％，扩增猪肺炎支原体的的培养时间为3-7天。
本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述制备方法制备的猪肺炎支原体的抗原和药学上可接受的载体。
本发明所用术语“疫苗组合物”指含有猪肺炎支原体免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对肺炎支原体的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体的抗原包括灭活的全支原体抗原和裂解的支原体抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体的抗原包括所述猪肺炎支原体HN0613株或GZ株灭活的全支原体抗原和裂解的支原体抗原。
本发明所述的猪肺炎支原体GZ株，也称为猪肺炎支原体GZ(Mycoplasmahyopneumoniae strain GZ)，保藏号为：CCTCC NO：M2016212，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年4月20日。
猪肺炎支原体HN0613株公开于中国专利申请CN103031258A。
本发明所用的术语“灭活抗原”，也称作失活抗原，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活抗原。裂解型抗原可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的猪肺炎支原体GZ株可以通过灭活的方法制备成灭活抗原。
优选地，所述疫苗组合物中猪肺炎支原体抗原为灭活的所述猪肺炎支原体GZ株的全病毒抗原；所述疫苗组合物进一步包含佐剂。
作为本发明的一种实施方式，所述猪肺炎支原体的抗原含量为灭活前≥107.0CCU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪肺炎支原体的抗原含量为107.0～1010.0CCU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的GZ株全病毒抗原；所述灭活的GZ株全病毒抗原含量为灭活前≥107.0CCU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中所述灭活的GZ株全病毒抗原含量为107.0～1010.0CCU/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体HN0613株的灭活全病毒抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的HN0613株全病毒抗原；所述灭活的HN0613株全病毒抗原含量为灭活前≥107.0CCU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中所述灭活的HN0613株全病毒抗原含量为107.0～109.0CCU/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种。
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))。
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P。
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA。
优选地，所述佐剂包括Gel 01、ISA206、ISA760VG、卡波姆、氢氧化铝。
所述佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选10％V/V。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
本发明所用的佐剂还包括Gel 01(法国SEPPIC)、ISA206(法国SEPPIC)、ISA760VG(法国SEPPIC)的一种或几种的组合。
优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01(法国SEPPIC)、氢氧化铝。
最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel 01(法国SEPPIC)。
在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选10％V/V。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明还涉及一种猪肺炎支原体灭活疫苗的培养方法：将本发明制备的猪肺炎支原体灭活，加入佐剂制备猪肺炎支原体灭活疫苗。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪支原体肺炎和猪肺炎支原体感染相关疾病的药物中的应用。
术语“预防”指通过其与猪肺炎支原体相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与猪肺炎支原体相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
下面结合具体实施实例对本发明做进一步的描述。
本发明所用液体培养基配方(按1065mL计)：牛心浸液(BD公司)300mL，ddH2O360mL，调pH值到7.4，121℃高压灭菌15min。再加入下列过滤除菌的成分：Hank’s平衡盐溶液(10×)40mL，0.25％(W/V)酚红10mL，灭活马血清200mL，5％(W/V)水解乳蛋白100mL，25％(W/V)酵母浸出液20mL，10000IU/mL青霉素10mL，1％醋酸铊溶液25mL。
本发明实施例中以猪肺炎支原体GZ株、HN0613株为例说明本发明。
实施例1、猪肺炎支原体的培养与含量测定
本实施例所选用猪肺炎支原体为猪肺炎支原体GZ株。
1.猪肺炎支原体的培养
1.1一级种子的制备
取猪肺炎支原体GZ株冻干菌种，用液体培养基稀释后，按10％接种量接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7天，待pH降至6.8～7.0时，经纯粹检验合格后作为一级种子。
1.2二级种子的制备
取一级种子按5％的接种量接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7天，待pH降至6.8～7.0时，经纯粹检验合格后作为二级种子。
1.3使用二级种子扩增猪肺炎支原体
取二级种子按5％的接种量接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7天。
1.4扩增后的猪肺炎支原体的继续培养
在上述步骤二级种子增殖过程中，待pH降至6.8-7.0时，调整pH至7.4，继续培养0.5-2天。
1.5收获
继续培养扩增后的猪肺炎支原体至pH再次降至6.8-7.0时，收获。
2.猪肺炎支原体活菌含量测定
将含酚红指示剂的液体培养基分装至小试管中，设两排，每排13管，1.8mL/管，取200μL待检培养物接种于第一支小试管，混匀后依次10倍稀释至第12支小试管，第13管作为对照管，置37℃振荡培养，记录21天为止产生颜色变化的最高管数，以判定待检培养物的CCU滴度，取两排结果的平均值。
每隔六个小时取样测定猪肺炎支原体活菌含量，结果见表1。
表1 不同培养时间点活菌含量测定结果
根据不同培养时间点活菌含量绘制的Mhp生长曲线见图1。
实施例2、猪肺炎支原体灭活疫苗的制备
1.制苗用菌液的制备
按照实施例1中的方法，用同一批二级种子、同一批液体培养基在相同条件下同时扩大培养3批等体积的的Mhp菌液，3批菌液不同时间点收获，收获时取样测定猪肺炎支原体活菌含量。3批培养物均用作猪肺炎支原体灭活疫苗的制备，3批培养物收获时CCU测定结果见表2。
表2 3批猪肺炎支原体培养CCU测定结果
GZ培养物 培养时间 CCU
Mhp1 72h 1011CCU/mL
Mhp2 78h 1011CCU/mL
Mhp3 84h 1011CCU/mL
2.菌液的灭活
将步骤1中培养的3批Mhp抗原按0.3％(V/V)的比例加入甲醛溶液，37℃灭活24h，期间每隔4h摇匀一次。24h后，取样进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。灭活后的菌液置于2～8℃备用。
3.疫苗配制
将步骤2中灭活的3批Mhp菌液分别稀释，然后分别与Gel 01佐剂(法国赛比克公司)按9:1(V/V)的比例混合，以500r/min的转速搅拌30min，在终止搅拌前加入1％(V/V)的硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分搅拌均匀后分装至疫苗瓶。取样进行无菌检验，结果3种疫苗无菌检验均合格。疫苗2～8℃保存备用。疫苗配比见表3。
表3 猪肺炎支原体灭活疫苗的制备
疫苗 Mhp抗原(CCU/ml) Gel 01佐剂(V/V)
疫苗1 108 10％
疫苗2 108 10％
疫苗3 108 10％
实施例3、猪肺炎支原体灭活疫苗(GZ株)免疫效力试验
1.免疫
选取14～21日龄Mhp抗体、PRRSV抗原、PCV2抗原阴性仔猪20头，分为4组，5头/组。3组为免疫组，分别免疫实施例2中的疫苗1、疫苗2、疫苗3，第4组为对照组，不免疫。3个免疫组每头猪分别颈部肌肉注射相应的Mhp灭活疫苗1mL。
2.免疫后攻毒
免疫后35天，进行猪肺炎支原体攻毒试验，3个免疫组和对照组仔猪均用MhpCVCC354株(购自中国兽医药品监察所)气管注射5mL/头(100MID)，攻毒后连续观察28天。攻毒后第28天，对所有试验猪进行剖检，观察肺病变，根据猪肺炎支原体肺病变指数评分标准对试验猪的肺病变进行评分，计算各免疫组的肺病变减少率：
肺病变减少率＝(攻毒对照组试验猪平均肺病变得分—免疫组试验猪平均肺病变得分)/攻毒对照组试验猪平均肺病变得分×100％。
3.攻毒后结果
试验猪攻毒后肺病变得分和肺病变减少率结果见表4。结果显示：疫苗3免疫组仔猪与疫苗1、疫苗2免疫组相比，肺病变得分最低，肺病变减少率最高；3个免疫组相对于攻毒对照组，肺病变差异显著。
表4 各试验组仔猪肺病变得分和肺病变减少率
组别 仔猪头数 平均肺病变指数±标准差 肺病变减少率
疫苗1免疫组 5头 2.1±1.48Bb 81.2％
疫苗2免疫组 5头 1.7±1.28Bb 86.7％
疫苗3免疫组 5头 1.0±1.08Bc 92.6％
攻毒对照组 5头 15.8±4.48Aa /
注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
结果表明，疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在极显著差异，尤以疫苗3的免疫效果优于疫苗2和疫苗1。说明相同CCU测定结果的Mhp菌液，当培养时长不同、Mhp处于不同生长阶段时菌液中的有效Mhp抗原的含量是不同的。选择CCU测定结果最高、且总菌量达到最大时收获菌液(理论上为Mhp生长平稳期的后期)，所配制的疫苗免疫效果最好。
实施例4猪肺炎支原体HN0613株的培养
为验证本发明猪肺炎支原体培养方法是否具有普遍性，本实施例选用另外一株猪肺炎支原体HN0613株进行培养验证。
1.制苗用菌液的制备
按照实施例1中的方法，用同一批二级种子、同一批液体培养基在相同条件下同时扩大培养3批等体积的Mhp菌液，3批菌液不同时间点收获，收获时取样测定猪肺炎支原体活菌含量。3批培养物均用作猪肺炎支原体灭活疫苗的制备，3批培养物收获时CCU测定结果见表5。
表5 3猪肺炎支原体HN0613株培养物CCU测定结果
HN0613培养物 培养时间 CCU
Mhp4 72h 1010CCU/ml
Mhp5 78h 1010CCU/ml
Mhp6 84h 1010CCU/ml
2.菌液的灭活
将步骤1中培养的3批Mhp抗原按0.3％(V/V)的比例加入甲醛溶液，37℃灭活24h，期间每隔4h摇匀一次。24h后，取样进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。灭活后的菌液置于2～8℃备用。
3.疫苗配置
将步骤2中灭活的3批Mhp菌液分别稀释，然后分别与Gel 01佐剂(法国赛比克公司)按9:1(V/V)的比例混合，以500r/min的转速搅拌30min，在终止搅拌前加入1％(V/V)的硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分搅拌均匀后分装至疫苗瓶。取样进行无菌检验，结果3种疫苗无菌检验均合格。疫苗2～8℃保存备用。
表6 猪肺炎支原体HN0613株灭活疫苗的制备
疫苗 Mhp抗原(CCU/ml) Gel 01佐剂(V/V)
疫苗4 108 10％
疫苗5 108 10％
疫苗6 108 10％
实施例5猪肺炎支原体灭活疫苗HN0613株免疫效力试验
1.免疫
选取14～21日龄Mhp抗体、PRRSV抗原、PCV2抗原阴性仔猪20头，分为4组，5头/组。3组为免疫组，分别免疫实施例4中的疫苗4、疫苗5、疫苗6，第4组为对照组，不免疫。3个免疫组每头猪分别颈部肌肉注射相应的Mhp灭活疫苗1mL。
2.免疫后攻毒
免疫后35天，进行猪肺炎支原体攻毒试验，3个免疫组和对照组仔猪均用MhpCVCC354株(购自中国兽医药品监察所)气管注射5mL/头(100MID)，攻毒后连续观察28天。攻毒后第28天，对所有试验猪进行剖检，观察肺病变，根据猪肺炎支原体肺病变指数评分标准对试验猪的肺病变进行评分，计算各免疫组的肺病变减少率：
肺病变减少率＝(攻毒对照组试验猪平均肺病变得分—免疫组试验猪平均肺病变得分)/攻毒对照组试验猪平均肺病变得分×100％。
3.攻毒后结果
试验猪攻毒后肺病变得分和肺病变减少率结果见表7。结果显示：疫苗6免疫组仔猪与疫苗4、疫苗5免疫组相比，肺病变得分最低，肺病变减少率最高；3个免疫组相对于攻毒对照组，肺病变差异显著。
表7 HN0613株免疫试验结果
组别 仔猪头数 平均肺病变指数±标准 肺病变减少率
疫苗4免疫组 5头 4.4±1.42Bb 69.2％
疫苗5免疫组 5头 3.9±1.24Bb 73.6％
疫苗6免疫组 5头 2.2±1.02Bc 82.3％
攻毒对照组 5头 14.6±4.36Aa /
注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
结果表明，疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在极显著差异，尤以疫苗6的免疫效果优于疫苗4和疫苗5。说明相同CCU测定结果的Mhp菌液，当培养时长不同、Mhp处于不同生长阶段时菌液中的有效Mhp抗原的含量是不同的。选择CCU测定结果最高、且总菌量达到最大时收获菌液(理论上为Mhp生长平稳期的后期)，所配制的疫苗免疫效果最好。
实施例6不同含量的猪肺炎支原体灭活疫苗(GZ株)免疫效力试验
取实施例2培养的Mhp3抗原按0.3％(V/V)的比例加入甲醛溶液，37℃灭活24h，期间每隔4h摇匀一次。24h后，取样进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。灭活后的菌液进行稀释，然后与Gel 01佐剂(法国赛比克公司)按9:1(V/V)的比例混合，以500r/min的转速搅拌30min，在终止搅拌前加入1％(V/V)的硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分搅拌均匀后分装至疫苗瓶。取样进行无菌检验，结果显示无菌检验合格。疫苗2～8℃保存备用。疫苗配比见表8。
表8 不同含量猪肺炎支原体GZ株灭活疫苗的制备
疫苗 Mhp抗原(CCU/ml) Gel 01佐剂(V/V)
疫苗7 107 10％
疫苗8 108.5 10％
疫苗9 1010 10％
实施例7不同含量猪肺炎支原体GZ株灭活疫苗免疫效力试验
1.免疫
选取14～21日龄Mhp抗体、PRRSV抗原、PCV2抗原阴性仔猪20头，分为4组，5头/组。3组为免疫组，分别免疫实施例六中的疫苗7、疫苗8、疫苗9，第4组为对照组，不免疫。3个免疫组每头猪分别颈部肌肉注射相应的Mhp灭活疫苗1mL。
2.免疫后攻毒
免疫后35天，进行猪肺炎支原体攻毒试验，3个免疫组和对照组仔猪均用MhpCVCC354株(购自中国兽医药品监察所)气管注射5mL/头(100MID)，攻毒后连续观察28天。攻毒后第28天，对所有试验猪进行剖检，观察肺病变，根据猪肺炎支原体肺病变指数评分标准对试验猪的肺病变进行评分，计算各免疫组的肺病变减少率：
肺病变减少率＝(攻毒对照组试验猪平均肺病变得分—免疫组试验猪平均肺病变得分)/攻毒对照组试验猪平均肺病变得分×100％。
3.攻毒后结果
试验猪攻毒后肺病变得分和肺病变减少率结果见表9。结果显示：3个免疫组相对于攻毒对照组，肺病变差异显著。
表9 不同含量免疫组仔猪肺病变得分和肺病变减少率
组别 仔猪头数 平均肺病变指数±标准差 肺病变减少率
疫苗7免疫组 5头 2.2±1.32Bb 71.2％
疫苗8免疫组 5头 1.2±1.14Bc 92.7％
疫苗9免疫组 5头 1.0±1.02Bc 93.4％
攻毒对照组 5头 15.4±4.36Aa /
注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
结果表明，疫苗7、疫苗8、疫苗9免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在显著差异，且随着抗原含量的增大，免疫效果更好。
采用本发明中的Mhp培养方式和Mhp疫苗制备方式，可以在不增加成本的情况下，大大提高疫苗的免疫效果，能够有效地预防猪肺炎支原体的感染。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种猪肺炎支原体的制备方法，其中，所述猪肺炎支原体的制备方法包括：
步骤(1)使用液体培养基扩增培养猪肺炎支原体或其培养物进入稳定期；
步骤(2)调节所述处于稳定期的液体培养基pH值为7.2-7.6；以及
步骤(3)继续培养所述猪肺炎支原体至液体培养基pH值为6.8-7.0。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述扩增培养猪肺炎支原体或其培养物进入稳定期时所述液体培养基pH值下降为6.8-7.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中调节所述处于稳定期的液体培养基pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中继续培养所述猪肺炎支原体0.5天以上；优选地，所述步骤(3)中继续培养所述猪肺炎支原体0.5天-2天。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物为多级培养；优选地，所述步骤(1)中使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物为三级培养。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物制备一级种子的菌种接种量为5％-15％，所述制备一级种子的培养完成时液体培养基pH值为6.8-7.0，制备二级种子的一级种子接种量为3％-8％，所述制备二级种子的培养完成时液体培养基pH值为6.8-7.0，使用二级种子扩增猪肺炎支原体的接种量为3％-8％，所述扩增猪肺炎支原体的培养完成时液体培养基pH值为6.8-7.0；优选地，使用液体培养基扩增培养所述猪肺炎支原体或其培养物制备一级种子的菌种接种量为10％，制备一级种子的培养时间为3-7天，制备二级种子的一级种子接种量为5％，制备二级种子的培养时间为3-7天，使用二级种子扩增猪肺炎支原体的接种量为5％，扩增猪肺炎支原体的的培养时间为3-7天。
7.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1～5任一项所述制备方法制备的猪肺炎支原体的抗原和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体的抗原包括灭活的全支原体抗原和裂解的支原体抗原；优选地，所述猪肺炎支原体的抗原包括所述猪肺炎支原体HN0613株或GZ株灭活的全支原体抗原和裂解的支原体抗原；优选地，所述猪肺炎支原体的抗原含量为灭活前≥107.0CCU/ml，更优选地含量为107.0～1010.0CCU/ml。
9.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，所述佐剂包括Gel 01、ISA206、ISA760VG、卡波姆、氢氧化铝；
所述佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选10％V/V。
10.根据权利要求7～9任一项所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪支原体肺炎和猪肺炎支原体感染相关疾病的药物中的应用。
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