CN107865965B - 一种疫苗组合物、及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种一种疫苗组合物,该疫苗组合物包含A型副鸡禽杆菌抗原、C型副鸡禽杆菌抗原、新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原,以及药学上可以接受的载体,本发明的疫苗组合物能针对基因VII型和经典新城疫病毒提供全面的保护;且抗原之间配合良好、免疫效果优异、甚至二种抗原可以相互促进,协同作用。本发明的二联疫苗免疫效果优于单苗,且安全性更佳,避免了多次接种免疫出现的免疫麻痹,减少了对相应鸡群的应激。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗组合物、及其制备方法和应用,其属于兽用生物制品领域。
背景技术
鸡传染性鼻炎(Infectious Coryza)是由副鸡禽杆菌(Haemophilusparagallinarum)引起的一种急性上呼吸道传染病,以面部水肿和流鼻涕为主要临床特征,可引起蛋鸡产蛋率的下降、育成鸡和肉鸡生长不良和淘汰率的增加,给养鸡业造成较大的经济损失。
鸡新城疫(New Castle disease)是由副粘病毒引起的一种高度接触性传染病,急性败血性传染病,俗称“鸡瘟”,即所谓亚洲鸡瘟。该病一年四季均可发生,尤以寒冷和气候多变季节多发。各种日龄的鸡均能感染,其中20~60日龄最易感,死亡率较高。主要特征是呼吸困难,便稀、神经机能紊乱,粘膜、浆膜出血和坏死,对养鸡业危害严重。从近年新城疫的流行特点来看,临床上所分离到的新城疫强毒大多数属于基因Ⅶ型,而常规的新城疫疫苗株的基因型主要为基因Ⅱ型(如LaSota、clone 30、V4等),新城疫流行株与常规疫苗株在遗传距离上相差较远,因此,常规疫苗对当前新城疫病毒强毒株攻击的保护仍存在相当缺陷。
疫苗预防是防控这两种病的有效方式,而现有技术中缺少针对这两种病原共同感染的联苗,尤其是缺少针对新城疫流行株与副鸡禽杆菌病原共同感染的联苗。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供一种用于预防鸡传染性鼻炎以及新城疫的疫苗组合物,所述疫苗组合物由副鸡禽杆菌抗原和基因Ⅶ型新城疫抗原制得,该疫苗组合物不仅对副鸡禽杆菌提供有效的免疫保护,也能对流行基因Ⅶ型新城疫野毒株、基因Ⅱ型经典毒株提供有效的免疫保护,显示出广谱的免疫原性,能对鸡提供全面的保护。
本发明涉及一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括免疫量的副鸡禽杆菌A型和/或C型或其培养物的抗原,免疫量的基因Ⅶ型新城疫病毒株N7a株或其培养物的抗原,以及药学上可接受的载体。
本发明提供的疫苗组合物具有良好的免疫原性,能对副鸡禽杆菌、流行基因Ⅶ型新城疫野毒株和基因II型新城疫毒株的攻击进行完全保护。
本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法,其中,所述制备方法包括:步骤(1),分别培养增殖副鸡禽杆菌或其培养物、和基因Ⅶ型新城疫病毒株或其培养物,步骤(2),分别灭活所述步骤(1)中所述增殖的副鸡禽杆菌或其培养物和基因Ⅶ型新城疫病毒株或其培养物,步骤(3),按比例混合,加入药学上可接受的载体。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防及治疗副鸡禽杆菌感染的相关疾病的药物中的应用。
本发明涉及所述的疫苗组合物在制备预防及治疗新城疫病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性,能够以较低的抗原含量达到较好的免疫保护作用,有效抵抗副鸡禽杆菌的感染;NDV虽然只有一个血清型,但是现有疫苗株和流行株在基因型和抗原位点上都差异较大,本发明的疫苗组合物不仅有效抵抗基因Ⅶ型新城疫病毒的感染,也能有效抵抗基因Ⅱ型新城疫病毒的感染,有利于预防新城疫的爆发和流行。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包含A型副鸡禽杆菌抗原和/或C型副鸡禽杆菌抗原、新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原,以及药学上可以接受的载体;新城疫病毒株N7a株保藏号为CCTCC NO:V201545。
新城疫病毒(基因Ⅶ型)N7a株(Newcastle Disease Virus(genotype Ⅶ),strainN7a),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:V201545,保藏日期为2015年10月19日,保藏地址为中国武汉·武汉大学。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌或其培养物的抗原为灭活的全菌抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述基因Ⅶ型新城疫病毒株或其培养物的抗原为灭活的全病毒抗原。
NDV N7a株为基因Ⅶ型新城疫病毒株,是将基因Ⅶ型新城疫流行野毒株F裂解位点112R-R-Q-K-R-F117突变为弱毒裂解位点112G-R-Q-G-R-L117的新城疫病毒株。
“疫苗组合物”指含有副鸡禽杆菌以及基因Ⅶ型新城疫病毒免疫原性的药物组合物,该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对副鸡禽杆菌和新城疫病毒的免疫反应。所述疫苗组合物可包括免疫量的副鸡禽杆菌的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗和免疫量的基因Ⅶ型新城疫病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原为灭活全病毒抗原、减毒的活病毒抗原或亚单位抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原含量为灭活前≥108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述A型副鸡禽杆菌或其培养物的抗原为副鸡禽杆菌A型HN3株或其培养物灭活全菌抗原、减毒的活的抗原或亚单位抗原,A型副鸡禽杆菌HN3株保藏号为CCTCC NO:M2015051。作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述C型副鸡禽杆菌或其培养物的抗原为副鸡禽杆菌C型SD3株或其培养物灭活全菌抗原、减毒的活的抗原或亚单位抗原,C型副鸡禽杆菌SD3株保藏号为CCTCC NO:M2015052。作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述A型副鸡禽杆菌抗原为A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物灭活全菌抗原、减毒的活的抗原或亚单位抗原,A型副鸡禽杆菌HN3株保藏号为CCTCC NO:M2015051;C型副鸡禽杆菌抗原为C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物灭活全菌抗原、减毒的活的抗原或亚单位抗原,C型副鸡禽杆菌SD3株保藏号为CCTCC NO:M2015052。本发明所用的术语“灭活疫苗”,也称作失活疫苗,指的是用作抗原以产生免疫力的灭活细菌或病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全菌或全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如,通过用甲醛溶液处理病毒可获得全菌或全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的疫苗株N7a株可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。
副鸡禽杆菌A型HN3株(Avibacterium Paragallinarum Serotype A StrainHN3),已于2015年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号:CCTCC NO:M2015051;保藏地址:中国武汉·武汉大学。
副鸡禽杆菌C型SD3株(Avibacterium Paragallinarum Serotype C StrainSD3),已于2015年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号:CCTCC NO:M2015052;保藏地址:中国武汉·武汉大学。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述A型副鸡禽杆菌或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数≥0.5×108.0CFU/ml,所述C型副鸡禽杆菌或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数≥0.5×108.0CFU/ml。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述A型副鸡禽杆菌或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述副鸡禽杆菌C型SD3株或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml。作为本发明的一种优选实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述副鸡禽杆菌A型HN3株或其培养物的灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述副鸡禽杆菌C型SD3株或其培养物的灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述NDVN7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml。本发明的疫苗组合物中,副鸡禽杆菌A型HN3株或其培养物灭活全菌抗原、副鸡禽杆菌C型SD3株或其培养物的灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml范围,NDV N7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml范围,NDVN7a株抗原对副鸡禽杆菌A型、C型抗原产生协同作用,当使用量减半,仍能产生和原使用量的单苗一样的免疫效果。
“培养物”是病毒或细菌的不同代次传代培养物,本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原为新城疫病毒株N7a株或其传代1~60次的培养物抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原为新城疫病毒株N7a株或其传代1~16次的培养物抗原。作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原为新城疫病毒株N7a株或其传代1~60次的培养物灭活全病毒抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原为新城疫病毒株N7a株或其传代1~16次的培养物灭活全病毒抗原。
作为本发明的一种优选实施方式,所述疫苗组合物包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~60代次培养物的抗原。更优选地,所述疫苗组合物包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~55代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~50代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~45代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~40代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~35代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~30代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~25代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~20代次培养物的抗原;或包括免疫量的基因Ⅶ型新城疫疫苗株N7a株或其1~16代次培养物的抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物灭活全菌抗原为A型副鸡禽杆菌HN3株或其传代1~75次的培养物的灭活全菌抗原;所述C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物灭活全菌抗原为C型副鸡禽杆菌SD3株或其传代1~75次的培养物的灭活全菌抗原。
本发明的疫苗组合物可使用常规技术来调配,优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如,油可有助于稳定调配物,且另外充当疫苗佐剂。因此,本发明中,所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂,其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil),以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是天然来源,也可以是经过人工合成获得的。本发明中,所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液,所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。
在本发明的一个实施方式中,所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括,例如,硬脂酸铝,以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括,例如,脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列),司本(SPAN),以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于),例如福尔马林、β-丙内酯等等。所述防腐剂包括,例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述疫苗组合物中,所述药学上可以接受的载体包括佐剂,所述佐剂包括:(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA;(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂;或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物;以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种;
优选地,皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100;
优选地,乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂,或乳剂由油与乳化剂组合形成,乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油,烯烃,特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯);乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯,上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121));
优选地,丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P;
优选地,顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA;
优选地,所述佐剂为铝胶佐剂;
所述佐剂的浓度范围是从5%到50%V/V,优选20%V/V。
基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应,还可以选择本领域的其它佐剂,包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐,来制备混悬液,减少免疫刺激。
优选地,所述载体包括佐剂,所述佐剂包括油佐剂,水溶性佐剂,铝盐佐剂,细胞因子佐剂;进一步优选地,所述佐剂包括铝盐佐剂。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括,但不限于:油佐剂,水溶性佐剂,铝盐佐剂,细胞因子佐剂。
本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”,是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成,用于延缓免疫原在机体内的存留时间,使之持续缓慢释放,增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。
本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”,是一种聚合物水溶性分散体,用于提高水溶性疫苗的功效和安全性,可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。
本发明所用术语“铝盐佐剂”,又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”,包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂,其主要功能为缓释,但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射,能够使抗原保存在注射部位,具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。
本发明所用术语“细胞因子佐剂”,包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等,又称“细胞因子”或“细胞素”,是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞,在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白,也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌,能调节细胞生长、分化,与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称,可以刺激或抑制免疫功能,在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递,在免疫系统中起着非常重要的调控作用。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法,其中,所述制备方法包括:步骤(1),分别培养增殖副鸡禽杆菌或其培养物和基因Ⅶ型新城疫病毒株或其培养物,步骤(2),分别灭活所述步骤(1)中所述增殖的副鸡禽杆菌或其培养物和基因Ⅶ型新城疫病毒株或其培养物,步骤(3),按比例混合,加入药学上可接受的载体。
本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和治疗鸡传染性鼻炎、鸡新城疫的药物中的应用。
本发明涉及所述疫苗组合物在制备预防及治疗副鸡禽杆菌感染的相关疾病的药物中的应用。
本发明涉及所述的疫苗组合物在制备预防及治疗新城疫病毒感染相关疾病的药物中的应用。
术语“预防”指通过其与副鸡禽杆菌或基因Ⅶ型新城疫病毒相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟;术语“治疗”指通过其与副鸡禽杆菌或基因Ⅶ型新城疫病毒相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
作为本发明的一种实施方式,在制备预防和治疗鸡传染性鼻炎、鸡新城疫的药物中的应用中,所述鸡新城疫为新城疫经典毒株或新城疫流行毒株基因VII型导致的鸡新城疫。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯,购自国药集团。
为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1鸡副鸡禽杆菌抗原的制备
1.一级种子繁殖
将菌种划线接种鸡肉汤琼脂平板上,在含5%~10%CO2环境中37℃培养18~24小时,挑选出合适数量的荧光性强的典型半透明露珠样菌苔(菌落),将菌苔接种鸡胚(6~7日龄)黄囊内,置于37℃继续孵育,收集在30小时内死亡的鸡胚卵黄液,经纯粹检验合格后,作为一级种子。
2.二级种子繁殖
取感染的鸡胚卵黄液,划线接种鸡肉汤琼脂平板,在含5%~10%CO2环境中37℃培养18~24小时,选荧光性强的典型菌落接种于肉汤培养基中,置37℃,180rpm培养10~12小时,经纯度检检合格后,作为二级种子。
3.培养基配制
取多价蛋白胨5g、酪蛋白胨5g、谷氨酸钠5g、葡萄糖1g、氯化钠5g、酵母粉3g、加蒸馏水1000ml充分溶解,以氢氧化钠溶液(2mol/L)调pH值至7.2~7.4,115℃灭菌30min。临用前加入灭活鸡血清100ml和1%NADH溶液3ml。
4.制苗用菌液的制备
将副鸡禽杆菌A型菌和C型菌分别单独培养。按发酵罐容积装入适量不含葡萄糖的半合成培养基和0.004%消泡剂,灭菌后,按培养基量加入1%过滤除菌的葡萄糖、10%鸡血清和0.03%过滤除菌的NADH,校正pH值7.2、DO值100和温度37℃。将种子液以2%的比例接种于半合成培养基中,通过自动补酸补碱控制pH值,根据DO值(溶氧值)调整通气量和转速,并采用手动流加补料的方式进行补料。A型HN3株在发酵至7小时收获菌液,C型SD3株在发酵至9小时收获菌液。经计数A型HN3株为1×1011CFU/ml,C型SD3株为1.2×1011CFU/ml,远高于目前按照《兽用生物制品规程》进行生产所制备得到的灭活疫苗的培养菌数2×109CFU/ml~3×109CFU/ml,说明了本发明分离的菌株具有良好的生长特性。
实施例2鸡新城疫抗原的制备
取鸡新城疫病毒N7a株,用灭菌生理盐水作适当稀释(10-4或10-5)接种10~11日龄易感鸡胚,每胚0.1ml,接种后置37℃继续孵育。选接种后48~120小时死亡和存活鸡胚,收获尿囊液,测定病毒含量,为108.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1%的甲醛溶液(v/v),放37℃灭活,其间每隔4~6h搅拌一次,灭活16h,灭活完全后备用。
实施例3疫苗组合物的制备
将实施例1制备的副鸡禽杆菌抗原和实施例2制备的新城疫抗原按不同的组合、含量混合,加入铝胶佐剂中,同时开动电机,以12000r/min乳化5分钟,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,使其最终浓度为0.01%,具体组成见表1。
表1鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗配比
组分 | 疫苗1 | 疫苗2 | 疫苗3 | 疫苗4 | 疫苗5 | 疫苗6 |
HN3株(CFU/ml) | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> | — | — | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> |
SD3株(CFU/ml) | — | — | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> |
N7a株(EID<sub>50</sub>/0.1ml) | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>8.0</sup> | 10<sup>9.0</sup> |
佐剂(V/V) | 20% | 20% | 20% | 20% | 20% | 20% |
实施例4疫苗组合物的免疫效力试验
选取6~8周龄的SPF鸡50只,随机均分为5组,每组10只,分别免疫实施例3制备的疫苗1、疫苗2、疫苗5、疫苗6。第1组免疫疫苗1,第2组免疫疫苗2,第3组免疫疫苗5,第4组免疫疫苗6,按0.5ml/只进行免疫,第5组不免疫。免疫28日后,将各组按眶下窦注射副鸡禽杆菌HN3株鸡肉汤培养物稀释液0.2ml(含至少1个发病剂量)进行攻毒,连续观察7日,以面部肿胀或流鼻涕为发病标准;
表2 A型副鸡禽杆菌部分的效力检验结果
采用实施例3制备的疫苗免疫鸡只后,可阻断细菌感染(不出现临床症状),能为鸡只提供100%(10/10)保护,而对照组鸡只攻毒后3日全部发病。证明了疫苗1、疫苗2、疫苗5、疫苗6针对A型副鸡禽杆菌具有很好的保护力,显示出很好的免疫保护和安全性。
选取6~8周龄的SPF鸡50只,随机均分为5组,每组10只,分别免疫实施例3制备的疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6。第6组免疫疫苗3,第7组免疫疫苗4,第8组免疫疫苗5,第9组免疫疫苗6,按0.5ml/只进行免疫,第10组不免疫。在免疫28日后,将各组依次进行眶下窦注射副鸡禽杆菌SD3株鸡肉汤培养物稀释液0.2ml(含至少1个发病剂量),连续观察7日,以面部肿胀或流鼻涕为发病标准;
表3 C型副鸡禽杆菌部分的效力检验结果
采用实施例3制备的疫苗免疫鸡只后,可阻断细菌感染(不出现临床症状),能为鸡只提供100%(10/10)保护,而对照组鸡只攻毒后3日全部发病。证明了疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6针对C型副鸡禽杆菌具有很好的保护力,显示出很好的免疫保护和安全性。
选取30日龄的SPF鸡70只,随机均分为7组,每组10只。疫苗1~6依次对11~16组按20μl/只进行免疫,第17组不免疫。在免疫21日后,连同对照组采血分离血清,测定HI抗体效价。同时用HN1101株105EID50/只的剂量肌肉注射攻击,观察14日,记录发病、死亡及保护数。结果见表4。
表4新城疫部分的效力检验结果
注:HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数,标示为X±SD,X代表平均数,SD代表标准差。
结果显示,疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6在免疫后21天均能产生较高的抗体,与对照组相比,可以完全保护强毒的攻击。
证明了疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6均能保护致死剂量的强毒攻击,可对鸡群提供完全的保护作用。
上述各部分效力试验结果显示,本发明提供的鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗能抵抗副鸡禽杆菌、基因Ⅶ型新城疫的攻击,可提供完全的保护,显示出良好的免疫保护作用。
实施例5含量减半的验证疫苗的制备
将实施例1制备的副鸡禽杆菌抗原中加入铝胶佐剂,同时开动电机,以12000r/min乳化5分钟,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液,使其最终浓度为0.01%,具体配比见表5。
表5鸡传染性鼻炎灭活疫苗制备
组分 | 疫苗7 | 疫苗8 | 疫苗9 | 疫苗10 | 疫苗11 |
HN3株(CFU/ml) | 10<sup>8.0</sup> | 0.5×10<sup>8.0</sup> | — | — | 0.5×10<sup>8.0</sup> |
SD3株(CFU/ml) | — | — | 10<sup>8.0</sup> | 0.5×10<sup>8.0</sup> | 0.5×10<sup>8.0</sup> |
佐剂(V/V) | 20% | 20% | 20% | 20% | 20% |
实施例6鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗的免疫效力比较试验
选取6~8周龄的SPF鸡50只,随机均分为5组,每组10只,分别免疫实施例5制备的疫苗7、疫苗8、疫苗11,以及实施例3制备的疫苗5。第18组免疫疫苗7,第19组免疫疫苗8,第20组免疫疫苗11,按0.5ml/只进行免疫,第21组免疫疫苗5,按0.25ml/只进行免疫,第22组不免疫。免疫28日后,将各组按眶下窦注射副鸡禽杆菌HN3株鸡肉汤培养物稀释液0.2ml(含至少1个发病剂量)进行攻毒,连续观察7日,以面部肿胀或流鼻涕为发病标准。结果见表6。
表6 A型副鸡禽杆菌部分的效力检验比较结果
采用实施例5制备的疫苗免疫鸡只后,正常剂量(灭活前活菌数108.0CFU/ml,注射0.5ml)可阻断细菌感染(不出现临床症状),能为鸡只提供100%(10/10)保护,而当免疫剂量减半(灭活前活菌数0.5×108.0CFU/ml)后,保护率也相应下降,对鸡群仅能达到7/10的保护作用。本发明提供的鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗虽然免疫量减半,但依然能抵抗副鸡禽杆菌A型的攻击,可提供完全的保护,显示出良好的免疫保护作用。
证明了本发明提供的鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗新城疫抗原对副鸡禽杆菌抗原产生了协同作用,增强了副鸡禽杆菌的免疫效果。
选取6~8周龄的SPF鸡50只,随机均分为5组,每组10只,分别免疫实施例5制备的疫苗9、疫苗10、疫苗11,以及实施例3制备的疫苗5。第23组免疫疫苗9,第24组免疫疫苗10,第25组免疫疫苗11,按0.5ml/只进行免疫,第26组免疫疫苗5,按0.25ml/只进行免疫,第27组不免疫。免疫28日后,将各组按眶下窦注射副鸡禽杆菌SD3株鸡肉汤培养物稀释液0.2ml(含至少1个发病剂量)进行攻毒,连续观察7日,以面部肿胀或流鼻涕为发病标准。结果见表7。
表7 C型副鸡禽杆菌部分的效力检验比较结果
采用实施例5制备的疫苗免疫鸡只后,正常剂量(灭活前活菌数108.0CFU/ml,注射0.5ml)可阻断细菌感染(不出现临床症状),能为鸡只提供100%(10/10)保护,而当免疫剂量减半(灭活前活菌数0.5×108.0CFU/ml)后,对鸡群仅能达到7/10的保护作用。本发明提供的鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗虽然免疫量减半,但依然能抵抗副鸡禽杆菌C型的攻击,可提供完全的保护,显示出良好的免疫保护作用。
证明了本发明提供的鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗新城疫抗原对副鸡禽杆菌抗原产生了协同作用,增强了副鸡禽杆菌的免疫效果。
实施例7鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗对新城疫病毒感染的广谱性试验
选取30日龄的SPF鸡20只,随机均分为两组,每组10只。实施例3制备的疫苗5免疫第21组,按20μl/只进行免疫,第29组不免疫。在免疫28日后,用新城疫标准强毒株F48E9株攻毒,攻毒剂量105EID50/只,观察14日,记录发病、死亡及保护数。结果见表8。
表8新城疫标准强毒株F48E9株攻毒试验结果
表8结果显示,疫苗5在免疫后21天可以完全保护新城疫标准强毒株F48E9株的攻击。证明了本发明提供的的鸡传染性鼻炎、鸡新城疫二联灭活疫苗不仅能抵抗基因Ⅶ型新城疫的攻击,也能抵抗新城疫标准强毒株的攻击,显示出本发明疫苗组合物全面的免疫保护作用,具有免疫广谱性。
以上全面描述了本发明的优选实施例,但是可对它们进行各种替代和修改。因此,不应参照以上描述来决定本发明的范围,而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征,(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制,除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。
Claims (11)
1.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包含新城疫病毒株N7a株或其培养物的灭活全病毒抗原,以及A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物灭活全菌抗原和/或C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物灭活全菌抗原,以及药学上可以接受的载体;新城疫病毒株N7a株保藏号为CCTCC NO:V201545;A型副鸡禽杆菌HN3株保藏号为CCTCC NO:M2015051;C型副鸡禽杆菌SD3株保藏号为CCTCC NO:M2015052;所述A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数≥0.5×108.0CFU/ml,所述C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数≥0.5×108.0CFU/ml;所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原含量为灭活前≥108.0EID50/0.1ml,所述药学上可以接受的载体为铝胶佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物的灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml,所述C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物的灭活全菌抗原含量为灭活前活菌数108.0CFU/ml~109.0CFU/ml;所述新城疫病毒N7a株或其培养物灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml~109.0EID50/0.1ml。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物的灭活全病毒抗原为新城疫病毒株N7a株或其传代1~60次的培养物灭活全病毒抗原。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述新城疫病毒株N7a株或其培养物的灭活全病毒抗原为新城疫病毒株N7a株或其传代1~16次的培养物灭活全病毒抗原。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述A型副鸡禽杆菌HN3株或其培养物灭活全菌抗原为A型副鸡禽杆菌HN3株或其传代1~75次的培养物的灭活全菌抗原;所述C型副鸡禽杆菌SD3株或其培养物灭活全菌抗原为C型副鸡禽杆菌SD3株或其传代1~75次的培养物的灭活全菌抗原。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述铝胶佐剂的浓度范围是从5%到50%V/V。
9.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述铝胶佐剂的浓度是20%V/V。
10.根据权利要求1~9所述的疫苗组合物在制备预防鸡传染性鼻炎、鸡新城疫的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用,其中,所述鸡新城疫为新城疫经典毒株或新城疫流行毒株基因VII型导致的鸡新城疫。
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