CN101182494A - 基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
基因VII型新城疫病毒致弱株A－NDV－VII及其构建方法，涉及应用反向遗传技术，本发明利用已建立的鹅源新城疫病毒ZJ1株的反向遗传操作平台，将具有高繁殖性能的新城疫病毒分离株JS－5－05－Go的两个囊膜糖蛋白F和HN基因片段对ZJ1株基因组的对应部分进行替换，得到重组病毒NDV－VII，对重组病毒的F基因进行致弱突变后拯救出高度致弱的基因VII型新城疫病毒株A－NDV－VII。同时该病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及应用反向遗传技术，产生一种基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII，用于制造疫苗。
背景技术
反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Neumann G，Whitt M A，Kawaoka Y.Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus fromcloned cDNA-what have we learned？Journal of General Virology，2002，83(11)：2635-2662.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Huang Z，Elankumaran S，Panda A，et al.Recombinant Newcastle disease virus as a vaccinevector.Poultry Science，2003，82：899-906.]。
新城疫病毒(NDV)的基因组结构模式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白(Fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN)和大分子蛋白(Large protein，L)，此外，P基因转录过程中在484位特定的编辑位点(AAAAAGG↓G)插入一或两个额外的非模板鸟嘌呤核苷酸(G碱基)发生RNA编辑现象而产生具有相同N末端不同C末端的V和W蛋白[Steward M，Vipond I B，Millar，et al.RNA editing in Newcastle disease virus.Journal of Genera1 Virology，1993，74：2539-2547.]。
不同新城疫病毒分离株之间的毒力差异很大，根据对鸡和鸡胚的致病性及毒力不同，可将NDV分成三类：即强毒型(速发型)、中等毒力型(中发型)和弱毒型(缓发型)。也可根据人工感染鸡的临诊症状，将NDV分为嗜内脏速发型、嗜神经速发型、中发型、缓发型和无症状嗜肠型五种。在感染过程中，NDV吸附蛋白HN首先与敏感细胞表面的唾液酸受体结合，这种结合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F构象发生变化；于是后者的融合肽被释放出来，使病毒的包膜与细胞膜发生融合[McGinnes L W，Sergel T，ChenH.et al.Mutational Analysis of the Membrane Proximal Heptad Repeat of theNewcastle Disease Virus Fusion Protein.Virology，2001，289：343-352.1，强毒F蛋白的裂解位点为多个碱性氨基酸连续排列，可被机体多个组织器官的多种蛋白酶裂解，因此，可导致全身性感染。弱毒株在该区域的碱性氨基酸则被中性氨基酸所代替，使相应序列由R/K112-R-Q-K/R115-R-L117变为G/E112-R-Q-G/E115-R-L117，这种F蛋白前体仅能被有限的组织或器官分泌的胰样蛋白酶裂解，感染性很低或无感染性。因此，F蛋白是NDV毒力和致病性的主要决定因素[Peeters BPH，Olays oe leeuw，Koch G，et al.Rescue ofNewcastle disease virus from cloned cDNA：Evidence that cleavability of thefusion protein is a major determinant for virulence.Journal of Virology，1999，73(6)：5001-5009.]。
自1926年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看，临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu XF，Wan HQ，Ni XX，et al.Pathotypical and genotypical characterization of strain ofNewcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in someregions of China during 1985-2001.Archives of Virology，2003，148(7)：1387-1403.]，而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。
2005年Kapczynski等用基因II型疫苗株NDV B1株作为疫苗，分别免疫2周龄和8周龄的SPF鸡，免疫2周后以2002年的一株NDV分离株进行攻毒试验，研究结果表明：虽然免疫鸡攻毒后没有发生死亡，但是不能抵抗NDV强毒的感染，免疫鸡在攻毒后仍能排毒，因此，Kapczynski等认为常规疫苗在防制当前NDV感染中，还存在明显的不足，应当进一步改善疫苗当前的生产工艺或者研制新型的替代疫苗[Kapczynski D R，King D J.Protection of chickens against overt clinical disease and determination of viralshedding following vaccination with commercially available Newcastle diseasevirus vaccines upon challenge with highly virulent virus from the Califomia 2002exotic Newcastle disease outbreak.Vaccine，2005，23：3424-3433.]。
2000年黄勇等在发病的鹅群中，成功分离到了基因VII型新城疫强毒ZJ1株，并进行了全基因组测序，登录号为AF431744[Huang Y，Wang H Q，Liu HQ，et al.Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated froman out break in geese：a novel six nucleotide insertion in the non-coding region ofthe nucleoprotein gene.Archives of Virology，2004，149：1445-1457.]。在此基础上，2005年胡顺林等建立了NDV强毒株的反向遗传操作平台，成功拯救出了鹅源强毒ZJ1株，并对该毒株进行了致弱，但是获救病毒的EID50和HA效价均较低，不适合于大规模的生产[胡顺林，孙庆，吴艳涛，等.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJ1株.微生物学报，2007，47(2)：197-200.]。
2005年姚春峰等从发病鹅群中分离到基因VII型NDV毒株JS-5-05-Go，其尿囊液的HA价为8log2明显高于ZJ1株[姚春峰.我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子流行病学研究.扬州大学硕士学位论文.扬州，2007，6.]，目前已有报道NDV的HN蛋白与病毒的繁殖和HA等生物学特性密切相关[Huang Z H，Panda A，Elankumaran S，et al.TheHemagglutinin-Neuraminidase Protein of Newcastle Disease Virus DeterminesTropism and Virulence.Joumal ofVirology，2004，74(8)：4176-4184.]。
发明内容
本发明的第一个目的在于发明一种基因VII型新城疫病毒致弱株，从而解决当前所用疫苗株与流行株基因型不一致的问题。
本发明基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII，于2007年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO：2141。
本发明的第二个目的在于发明一种基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII的构建方法：
本发明利用已建立的鹅源新城疫病毒ZJ1株的反向遗传操作平台，将具有高繁殖性能的新城疫病毒分离株JS-5-05-Go的两个囊膜糖蛋白F和HN基因片段对ZJ1株基因组的对应部分进行替换，得到重组病毒NDV-VII，对重组病毒NDV-VII的F基因进行致弱突变后，拯救出高度致弱的基因VII型新城疫病毒株A-NDV-VII。
将重组病毒NDV-VII株F基因的裂解位点突变为弱毒株特征的序列后，成功拯救出了高度致弱的基因VII型毒株A-NDV-VII且其在鸡胚中具有较高的繁殖滴度。
本发明利用反向遗传技术成功拯救出了囊膜糖蛋白基因发生替换后的重组致弱病毒A-NDV-VII，该病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，适合于疫苗的大规模生产，另外，该致弱毒株为基因VII型与当前我国NDV流行株的基因型相一致，因此，同常规疫苗(基因I和II型)相比，致弱株A-NDV-VII在控制当前新城疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。
本发明包括以下具体步骤：
1)新城疫病毒ZJ1株基因组的修饰：
构建阳性质粒R1R2R3：分别从ZJ1株基因组的2849nt～5223nt、2849nt～5223nt、2849nt～5223nt位置克隆出基因片段R1、R2、R3，将基因片段R1、R2、R3在质粒pCR2.1载体中相连，获得阳性质粒R1R2R3；
以含有ZJ1株基因组全长的克隆pNDV/ZJ1作模板，用引物Sal I-1和Sal I-2扩增分离株ZJ1株基因组3602～4505nt之间的片段；用引物Sal I-3和Sal I-4扩增ZJ1株基因组4501-4861nt之间的片段；
再将克隆出的上述两片段在pCR2.1载体中相连，将相连的片段亚克隆至阳性质粒R1R2R3中，获得质粒S-R123；
上述用于扩增的引物序列如下：
SalI-1：5’-TTCCGCAATGCTCTGCTTAGGGAGTGT-3’
SalI-2：5’-TCGTCGACATGGATCATTGTCTGGTGT-3’
SalI-3：5’-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACC-3’
SalI-4：5’-GTAGTCAGTGTTCTGTTATACGCCTC-3’；
2)以分离株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白基因替换ZJ1株基因组的对应部分
根据Gen Bank中发表的多株新城疫病毒的F和HN基因序列，利用DNAStar中MegAlign基因比较分析软件进行分析后设计sF1、sF2和sHN1、sHN2两对引物，分别扩增分离株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白F和HN基因，利用片段中存在的酶切位点将两扩增片段相连，得到质粒pF-HN；
再将质粒pF-HN中的F和HN基因一起替换到质粒S-R123上，获得中间质粒mS-R123；
然后将JS-5-05-Go株的F和HN基因从质粒mS-R123上导入到转录载体pNDV/ZJ1中，从而获得新的转录载体pNDV-VII；
所述引物sF1、sF2、sHN1、sHN2序列如下：
sF1：5’-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3’
sF2：5’-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG-3’
sHN1：5’-GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT-3’
sHN2：5’-CTA CCCGTGTTCTCCCTTGTTG-3’；
3)重组病毒NDV-VII株的拯救
将pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与转录载体pNDV-VII共转染BSR-T7/5细胞，60h后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0.4mL/枚，37℃孵育，即获得重组病毒NDV-VII。
4)致弱毒株A-NDV-VII的拯救
通过引物经Overlap PCR方法，将重组病毒NDV-VII的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，从而使相应编码的氨基酸由R112-R-Q-K115-R-F117变为弱毒特征的氨基酸序列：G112-R-Q-G115-R-L117，突变后的质粒命名为pA-NDV-VII；
将质粒pA-NDV-VII与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10％的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9～11日龄SPF鸡胚，即获得基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII；
两对突变引物分别是：
AF1：5′-GCGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACCTGTCT-3′
AF2：：5′-GAGGGAGACAAGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGG-3′
AF3：5′-AAGGCGTTCTTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGAC-3′
AF4：5′-GGTTATAAAGTGCCTGGATGGTCAGATGAGTTAA-3′。
另，步骤4)中通过AF1+AF2和AF3+AF4两对突变引物分别扩增片段AFa和AFb两个片段，凝胶电泳回收AFa和AFb，用引物AF1和AF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段AF，利用该片段中含有的Sal I和Psi I，替换转录载体pNDV-VII上的对应部分从而获得了突变后的质粒pA-NDV-VII。
步骤1)中，
从ZJ1株基因组中克隆R1片段的引物为：
5’-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTC-3’
5’-ATGGTCTCATCTGTGGCCCGAATACT-3’
从ZJ1株基因组中克隆R2片段的引物为：
5’-ATACGTCTCACAGATCACCTCCCCTGCATTAAC-3’
5’-GTCA GATCTCTGCAACCGGATAGTATCACA-3’
从ZJ1株基因组中克隆R3片段的引物为：
5’-TCCGTCTCAGATCACTCACACTCACATCAAT-3’
5’-TCACGACCATCATATCGAAATCTACCATC-3’。
附图说明
图1重组质粒pNDV-VII构建模式图。
图2重组质粒pNDV-VII的HindIII酶切鉴定。
图3F蛋白裂解位点突变模式图。
图4致弱株的RT-PCR鉴定。
图5致弱株的细胞感染试验结果。
具体实施方式
构建步骤一：ZJ1株基因组的修饰
生物材料准备：
新城疫病毒ZJ1株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、保存。
pNDV/ZJ1：由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建，公开对外销售。
pCR2.1载体：购自Invitrogen公司。
设计3对引物用于扩增ZJ1株基因组2849-9552nt约6700bp大小的片段，引物序列如下：
| 引物编号(扩增片段的位置) | 引物序列(内切酶) |
| R1(2849-5223nt)R2(5218-7012nt)R3(7008-9552nt) | 5’-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTC-3’5’-ATGGTCTCATCTGTGGCCCGAATACT-3’(Bsa I)5’-ATACGTCTCACAGATCACCTCCCCTGCATTAAC-3’(Bsm B I)5’-GTC4GATCTCTGCAACCGGATAGTATCACA-3’(Bgl II)5’-TCCGTCTCAGATCACTCACACTCACATCAAT-3’(Bsm B I)5’-TCACGACCATCATATCGAAATCTACCATC-3’ |
根据引物中所加酶切位点，将扩增片段R1、R2和R3在pCR2.1载体中相连，得了阳性质粒R1R2R3。
以含有NDV ZJ1株基因组全长的克隆pNDV/ZJ1作模板，用引物Sal I-1和Sal I-2扩增基因组3602-4505nt之间的片段；用引物Sal I-3和Sal I-4扩增基因组4501-4861nt之间的片段，将两片段在pCR2.1载体中相连，利用两端的酶切位点将相连片段亚克隆至质粒R1R2R3中，获得了质粒S-R123，从而在全长克隆4502nt的位置引入了1个Sal I酶切位点。
用于扩增的引物序列如下：
Sal I-1：5’-TTCCGCAATGCTCTGCTTAGGGAGTGT-3’3602-3628nt
Sal I-2：5’-TCGTCGACATGGATCATTGTCTGGTGT-3’4438-4462nt
Sal I-3：5’-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACC-3’4457-4481nt
Sal I-4：5’-GTAGTCAGTGTTCTGTTATACGCCTC-3’4836-4861nt
步骤二：以分离株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白基因替换ZJ1株基因组的对应部分
生物材料准备：
分离株JS-5-05-Go：扬州大学农业部畜禽传染病实验室保存。
1、JS-5-05-Go株的囊膜糖蛋白基因的扩增：
将分离株JS-5-05-Go毒种接种于SPF鸡胚，收集尿囊液300ml，6000rpm(30#转子)离心15min，取上清；18000rpm 4℃离心1.5h，用40ml STE(10mMpH8.0 Tris-HCl，100mM NaCl，5mM pH8.0 EDTA)悬浮沉淀。用10％蔗糖垫底，小心加入悬浮液，18000rpm 4℃离心1.5h去杂蛋白，弃上清，沉淀用30mL STE悬浮，18000rpm 4℃离心1h去蔗糖，沉淀用7mL STE悬浮，分装指形管，每管450μL。
用上海生物工程技术服务有限公司的RNA抽提试剂盒提取RNA。取300μL上述制备的病毒液，加入400μLT rizol充分混匀，再加入100μL氯仿/异戊醇(24∶1)，震摇30秒后，12,000rpm离心5分钟；移上清至无菌的1.5mLRNase-free离心管中，加入150μL无水乙醇，混匀；置于MNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8,000rpm离心1分钟；弃去废液，在柱子中加入450μL Solution RPE，10,000rpm，离心30秒；重复前步一次；弃去废液，10,000rpm，离心15秒；移柱子入无菌、RNase-free离心管中，在柱子中央加入50μL DEPC-H2O，55-80℃放置2分钟，10,000rpm，离心1分钟，收集管内的溶液即为RNA样品。
取以上抽提的病毒基因组RNA 17μL，加入六聚体随机引物1μL(50ng)，轻轻混匀后置于70℃恒温金属浴中变性5min破坏RNA二级结构，立即冰浴5min，然后依次加入以下试剂：
5×RTBuffer 5μL
dNTPs(10mmol/L) 1μL
RNasin(40U/μL) 0.5μL
AMV reverse transcriptase(10U/μL)0.5μL
用手指轻拨(flipping)混匀，瞬时低速离心，置于42℃水浴中反转录1.5h后取出95℃作用5min以灭活残余的反转录酶，RT产物冷却至4℃后直接进行以下PCR反应或暂存于-20℃冰箱备用。
PCR扩增F和HN基因全长片段(50μL反应体系)：上述RT产物(cDNA)5μL至0.5mL PCR反应管中，以引物sHN1和sHN2扩增JS-5-05-Go株的HN基因，以引物sF1和sF2扩增JS-5-05-Go株的F基因，具体操作方法如下：
10×Reaction Buffer 5μL
sHN1/sF1(50pmol/μL) 1μL
sHN2/sF2(50pmol/μL) 1μL
dNTPs(10mmol/L) 1μL
Expand Long Template Polymerase(3.5U/μL) 1μL
上述RT产物(cDNA) 5μL
SW 36μL
PCR反应循环参数：94℃预变性2min；94℃ 20s，56℃30s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，20个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
根据GenBank中发表的多株新城疫病毒的F和HN基因序列，利用DNAStar中MegAlign基因比较分析软件进行分析后设计用于扩增F和HN基因的引物序列如下：
sF1：5’-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3’4457-4479nt
sF2：5’-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG-3’6299-6322nt
sHN1：5’-GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT-3’6243-6265nt
sHN2：5’-CTACCCGTGTTCTCCCTTGTTG-3’8362-8383nt
PCR产物经电泳后切割含目的大小片段的凝胶，用Agrose Gel DNAExtraction Kit回收纯化后与pCR2.1 T载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经EcoR I酶切鉴定正确后送上海联合基因科技有限公司测序，插入片段F和HN基因的序列测定结果如下：
F基因的序列(其长度为：1662 bp)：
atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg 60
ctgatattga gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagcccca 240
ttggaggcat gtaacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300
aagatccaag ggtctgtgtc cacgtccgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctaatacaag ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagtta aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780
agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840
caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960
aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgcaga 1200
tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcat gcaatgtctt atcattagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ttagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440
ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatctgct 1500
ctcattacct atattgttct aactgtcatt tccctaattt tcggtgcact tagtctggtt 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gtacaacaga agaccttgct atggcttggg 1620
aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagcat ga
HN基因测定序列与GenBank中公布的JS-5-05-Go株的HN基因序列(登录号为：EU044816)完全一致。
上述序列测定正确的阳性质粒分别命名为T-sF和T-sHN。
2、囊膜糖蛋白基因的替换：
利用上述两质粒中所含的酶切位点将两扩增片段相连得到了质粒pF-HN。利用该质粒中所含有的两个单一酶切位点Sal I和Ssp I将JS-5-05-Go株的F和HN基因同时替换到质粒S-R123上，构建了中间质粒mS-R123，中间质粒mS-R123经Age I和FspA I酶切后替换转录载体pNDV/ZJ1上的对应序列，构建了重组质粒pNDV-VII(见图1)。
3、重组质粒pNDV-VII的酶切鉴定：
由于分离株JS-5-05-Go基因组中HN基因序列中含有Hind III酶切位点(相当于ZJI全长cDNA 8033nt处)，而pNDV/ZJ1上HN基因的cDNA序列上却不含此位点，但NDV ZJ1株全长cDNA 14056nt和转录载体的292nt处也存在此酶切位点，因此，HN基因被成功替换的阳性质粒，经Hind III酶切后会出现10.8kb、6.0kb和1.4kb大小的3条目的片段，而经同样酶切的pNDV/ZJ1，电泳后仅出现16.8kb和1.4kb左右的2条带(见图2)。
步骤三：重组病毒NDV-VII株的拯救
生物材料准备：
pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表达质粒：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存，公开销售。
BSR-T7/5细胞：购自哈尔滨兽医研究所。
将5×105BSR-T7/5细胞接种于35mm dish中，用含1mg/mL G418和10％小牛血清的DMEM培养过夜，约60％～80％铺满时用于转染。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个真核表达质粒与含有NDV基因组cDNA全长的转录载体(pNDV-VII)共转染BSR-T7/5细胞，60h后将转染样品用封口膜(parafilm)封好，转移到-70℃低温冰箱反复冻融2次，然后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0.4mL/枚，37℃孵育。定时照胚，弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4℃充分冷却，待鸡胚血管收缩后收集尿囊液。
收集的尿囊液均按OIE标准所测HA效价为8log2，与亲本毒株ZJ1相比上升了4个滴度，且HA特性能被针对NDV HN蛋白的单克隆抗体(6B1)所抑制。
步骤四：致弱毒A-NDV-VII株的拯救
1、引物设计与合成：
AF1：5′-GCGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACCTGTCT-3′
AF2：5′-GAGGGAGACAAGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGG-3′
AF3：5′AAGGCGTTCTTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGAC-3′
AF4：5′-GGTTATAAAGTGCCTGGATGGTCAGATGAGTTAA-3′
引物外带Sal I和Psi I酶切位点用斜体和下划线标注；突变碱基由黑体标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。
2、F裂解位点的突变：
PCR反应：以转录载体pNDV-VII为模板配制如下PCR反应体系：
10×Reaction Buffer 5μL
上游Primer(50pmol/μL) 1μL
下游Primer(50pmol/μL) 1μL
dNTPs(10mmol/L) 1μL
Expand Long Template Polymerase(3.5U/μL) 1μL
cDNA 1μL
SW 40μL
PCR反应循环参数：94℃预变性2min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，20循环后72℃延伸10min，4℃保存。
用引物AF1和AF2扩增病毒基因组的4457～4917nt区域，用引物AF3和AF4扩增基因组的4864～5270nt区域。
Overlap PCR反应体系及条件：
10×Reaction Buffer 5μL
Primer AF1(50pmol/μL) 1μL
Primer AF4(50pmol/μL) 1μL
dNTPs(10mmol/L) 1μL
Expand Long Template Polymerase(3.5 U/μL) 1μL
AF1和AF2扩增片段(AFa) 1μL
AF3和AF4扩增片段(AFb) 1μL
SW 39μL
PCR反应循环参数：94℃预变性4min；50℃退火1min，72℃延伸5min，之后再94℃20s，56℃ 30s，72℃延伸2min30s，20循环后72℃延伸10min，4℃保存。
用引物AF1和AF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连(Overlap部分在上述引物中以下划线标注)，得到裂解位点发生3个氨基酸突变的F基因片段AF，突变模式见图3。
PCR产物经回收纯化后与pCR2.1载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，质粒提取后送上海联众科技研究院进行测序验证，阳性质粒命名为T-AF，最后将目的片段AF经Sal I和Psi I酶切后替换转录载体pNDV-VII上的对应序列。重组质粒用酶切和PCR方法鉴定，阳性克隆命名为pA-NDV-VII。
3、共转染与HI鉴定
将pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与含有NDV基因组cDNA全长的转录载体pA-NDV-VII共转染BSR-T7/5细胞，转染方法参照SuperFecttransfection Reagent说明书进行。转染样品于60h后接种9～11日龄SPF鸡胚，120h后将所接种鸡胚冻死，收取鸡胚尿囊液进行HA测定，其效价为9log2，且能被针对NDV HN蛋白的单克隆抗体(6B1)所抑制。
4、基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII的PCR鉴定
将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液，抽提RNA用于RT-PCR反应，扩增F基因长度约为1700bp左右大小的片段，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示F基因的裂解位点已突变成功(图4)。
用于扩增新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII中F基因的引物序列为：
FP1：5’-TCTAGAGATCCCGACCGGCACATTCA-3’
FP2：5’-GTCGACATCCACCTCTTATCTGCATTCAT-3’
步骤五、致弱毒株的生物学特性鉴定
1、MDT与ICPI的测定
用灭菌生理盐水分别连续10倍(10-3、10-4......10-7)递增稀释致弱病毒A-NDV-VII，每个稀释度接种5只9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育5d，按OIE标准方法计算病毒的MDT；致弱病毒的尿囊液以灭菌生理盐水10倍稀释后经脑内接种10只1日龄的SPF鸡，按OIE标准方法计算病毒的ICPI。
病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有发生死亡，说明该毒株的MDT值大于120h；尿囊液经脑内接种SPF鸡后，接种鸡没有发生死亡，ICPI的测定值仅为0.16，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。
2、细胞感染性试验
致弱病毒A-NDV-VII株作10-3稀释后，接种鸡胚成纤维细胞48h后，细胞没有出现病变，见图5中A，而母本病毒感染细胞则出现了拉网和脱落现象，形成了明显的空斑，见图5中B。
说明拯救后病毒的F蛋白在CEF上不能有效裂解，进一步表明获救病毒的毒力已明显减弱。
本发明构建的基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII于2007年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：2141，其长度为：15192bp。
步骤六：致弱毒株的免疫效力试验
将1日龄商品蛋鸡和SPF鸡随机分组，10只/组，进行隔离饲养，2周龄时经滴鼻点眼分别接种致弱毒株A-NDV-VII和LaSota，106EID50/只；经颈部皮下接种A-NDV-VII油苗，同时设PBS接种组作为对照。每只试验鸡于免疫后4周接种106 ELD50的新城疫VII型强毒YZ株。攻毒后连续观察14天，统计发病和死亡情况，并于攻毒后第4d采集气管与泄殖腔棉拭样品用于病毒的分离。
LaSota、A-NDV-VII及A-NDV-VII油苗免疫组鸡均未发病，而攻毒对照组鸡在攻毒后5d全部死亡(见表1)。SPF鸡的情况大致相同。
表1免疫效力试验结果
| 组别 | 攻毒剂量(ELD50/只) | 攻毒途径 | 发病率发病数/总数 | 死亡率死亡数/总数 | 保护率(％) |
| A-NDV-VIIA-NDV-VII-油苗LaSotaPBS | 106106106106 | 滴鼻点眼肌注滴鼻点眼滴鼻点眼 | 0/100/100/1010/10 | 0/100/100/1010/10 | 100100100- |
虽然三种疫苗的免疫保护率均达到100％，但在病毒分离率上，各免疫组的情况却不相同，LaSota免疫组鸡的病毒分离率明显高于A-NDV-VII免疫组(见表2)，另外，攻毒对照组鸡喉气管和泄殖腔的病毒分离率均为10/10。
表2攻毒后第4d病毒分离结果
| 组别 | SPF鸡病毒分离率(阳性数/总数) | 商品鸡病毒分离率(阳性数/总数) | ||
| 喉气管 | 泄殖腔 | 喉气管 | 泄殖腔 | |
| A-NDV-VIIA-NDV-VII-油苗LaSota | 0/100/101/10 | 0/100/103/10 | 0/100/104/10 | 0/100/102/10 |
综上所述，经过囊膜糖蛋白基因的替换和F基因裂解位点的突变，成功拯救出一株毒价高且高度致弱的新城疫病毒A-NDV-VII株。
且，经试验表明：本发明构建的致弱病毒A-NDV-VII免疫试验鸡两周后，弱毒苗免疫组鸡血清HI的平均效价为25，而油苗组的HI平均效价则达到了27；攻毒4天后，LaSota免疫组的SPF鸡口腔和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为10％和30％；商品鸡口腔和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为40％和20％，上述病毒的分离率均显著高于A-NDV-VII活苗及A-NDV-VII油苗免疫组，从而证明：与常规疫苗相比，致弱后的疫苗能够提供更加坚实的免疫保护效率。
gggtgaaatg acgctcaata aactctc
atggtctcat ctgtggcccg aatact
atacgtctca cagatcacct cccctgcatt aac
gtcagatctc tgcaaccgga tagtatcaca
tccgtctcag atcactcaca ctcacatcaa t
tcacgaccat catatcgaaa tctaccatc
ttccgcaatg ctctgcttag ggagtgt
tcgtcgacat ggatcattgt ctggtgt
cgtcgactgc ttatagttag ttcacc
gtagtcagtg ttctgttata cgcctc
atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg 60
ctgatattga gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagcccca 240
ttggaggcat gtaacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300
aagatccaag ggtctgtgtc cacgtccgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctaatacaag ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagtta aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780
agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840
caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960
aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgcaga 1200
tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcat gcaatgtctt atcattagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ttagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440
ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatctgct 1500
ctcattacct atattgttct aactgtcatt tccctaattt tcggtgcact tagtctggtt 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gtacaacaga agaccttgct atggcttggg 1620
aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagcat ga
cgtcgactgc ttatagttag ttc
tgctctttgg ttgcttgttc ccag
gcagcctgtg tgtcaattcc gat
ctacccgtgt tctcccttgt tg
gcgtcgactg cttatagtta gttcacctgt ct
gagggagaca agaacgcctt ataggtgctg ttattgg
aaggcgttct tgtctccctc ctccagacgt ggac
ggttataaag tgcctggatg gtcagatgag ttaa
tctagagatc ccgaccggca cattca
gtcgacatcc acctcttatc tgcattcat
Claims (5)
1.基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII，其特征在于：保藏号为CGMCC No：2141。
2.如权利要求1所述基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII株的构建方法，其特征在于：以分离株JS-5-05-Go的两个囊膜糖蛋白F基因和HN基因片段对新城疫病毒ZJ1株基因组的对应部分进行替换，得到重组病毒NDV-VII，对重组病毒NDV-VII的F基因进行致弱突变后获得高度致弱的基因VII型新城疫病毒株A-NDV-VII。
3.根据权利要求2所述基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤：
1)新城疫病毒ZJ1株基因组的修饰：
构建阳性质粒R1R2R3：分别从ZJ1株基因组的2849nt～5223nt、2849nt～5223nt、2849nt～5223nt位置克隆出基因片段R1、R2、R3，将基因片段R1、R2、R3在质粒pCR2.1载体中相连，获得阳性质粒R1R2R3；
以含有ZJ1株基因组全长的克隆pNDV/ZJ1作模板，用引物Sal I-1和Sal I-2扩增分离株ZJ1株基因组3602-4505nt之间的片段；用引物Sal I-3和Sal I-4扩增ZJ1株基因组4501-4861nt之间的片段；
再将克隆出的上述两片段在pCR2.1载体中相连，将相连的两片段亚克隆至阳性质粒R1R2R3中，获得质粒S-R123；
上述用于扩增的引物序列如下：
Sal I-1：5’-TTCCGCAATGCTCTGCTTAGGGAGTGT-3’
Sal I-2：5’-TCGTCGACATGGATCATTGTCTGGTGT-3’
Sal I-3：5’-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACC-3’
Sal I-4：5’-GTAGTCAGTGTTCTGTTATACGCCTC-3’；
2)以分离株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白基因替换ZJ1株基因组的对应部分
通过两对引物sF1、sF2和sHN1、sHN2分别扩增分离株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白F和HN基因，利用片段中存在的酶切位点将两扩增片段相连，得到质粒pF-HN；
再将质粒pF-HN中的F和HN基因一起替换到质粒S-R123上，获得中间质粒mS-R123；
然后将JS-5-05-Go株的F和HN基因从质粒mS-R123上导入到转录载体pNDV/ZJ1中，从而获得新的转录载体pNDV-VII；
用于扩增的引物序列如下：
sF1： 5’-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3’
sF2： 5’-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG-3’
sHN1：5’-GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT-3’
sHN2：5’-CTACCCGTGTTCTCCCTTGTTG-3’；
3)重组病毒NDV-VII株的拯救
将pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与转录载体pNDV-VII共转染BSR-T7/5细胞，60h后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0.4mL/枚，37℃孵育，即获得重组病毒NDV-VII。
4)致弱毒株A-NDV-VII的拯救
通过引物经Overlap PCR方法，将重组病毒NDV-VII的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，从而使相应编码的氨基酸由R112-R-Q-K115-R-F117变为弱毒特征的氨基酸序列：G112-R-Q-G115-R-L117，突变后的质粒命名为pA-NDV-VII；
将质粒pA-NDV-VII与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10％的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9～11日龄SPF鸡胚，即获得基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII；
两对突变引物分别是：
AF1：5′-GC GTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACCTGTCT-3′
AF2：：5′-GAGGGAGACAAGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGG-3′
AF3：5′-AAGGCGTTCTTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGAC-3′
AF4：5′-GGTTATAAAGTGCCTGGATGGTCAGATGAGTTAA-3′。
4.根据权利要求3所述基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII的构建方法，其特征在于步骤4)中通过AF1+AF2和AF3+AF4两对突变引物分别扩增AFa和AFb两个片段，凝胶电泳回收AFa和AFb，用引物AF1和AF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段AF，利用该片段中含有的Sal I和Psi I，替换转录载体pNDV-VII上的对应部分从而获得了突变后的质粒pA-NDV-VII。
5.根据权利要求3所述基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII的构建方法，其特征在于步骤1)中，
从ZJ1株基因组中克隆R1片段的引物为：
5’-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTC-3’
5’-ATGGTCTCATCTGTGGCCCGAAIACT-3’
从ZJ1株基因组中克隆R2片段的引物为：
5’-ATACGTCTCACAGATCACCTCCCCTGCATTAAC-3’
5’-GTCAGATCTCTGCAACCGGATAGTATCACA-3’
从ZJ1株基因组中克隆R3片段的引物为：
5’-TCCGTCTCAGATCACTCACACTCACATCAAT-3’
5’-TCACGACCATCATATCGAAATCTACCATC-3’。
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