CN107630008A - 基因ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10‑mHN，所述标记疫苗株为HN基因5’非编码区具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的致弱毒株aSG10。本发明构建的标记疫苗株毒力明显降低且遗传稳定。免疫保护试验结果表明，标记疫苗株对NDV具有良好的免疫保护效果，并能有效抑制排毒，可用于预防当前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒。进一步，通过PCR方法能鉴别野毒感染动物与疫苗免疫动物，对ND的监测、诊断、控制和净化有重要意义，且有广泛的应用价值。

Description

基因Ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN及其应用。

背景技术

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的，以禽类消化道、呼吸道损伤为主要特征的急性、热性、高度接触性传染病。其传播速度快、死亡率高，危害严重，每年给各国养禽业造成巨大的经济损失。疫苗免疫是预防新城疫的重要手段，但国内目前使用的疫苗株多为基因I型或II型，与当前流行基因Ⅶ型毒株存在明显差异。传统疫苗虽然可以诱导产生较高水平的免疫抗体，在一定程度上抵抗新城疫病毒感染，但并不能完全阻止NDV在鸡体内繁殖，不发病的感染鸡群仍然能向外界排毒，使得新城疫病毒在免疫鸡群中得以存活和传播。当鸡群免疫力低下或疫苗免疫失败时暴发新城疫，这是免疫鸡群仍发生非典型新城疫的主要原因。传统疫苗对当前NDV强毒株的攻击并不能提供理想的免疫保护效力，国内外研究已证明：使用与流行株一致的基因Ⅶ型疫苗可以有效降低免疫鸡群中NDV强毒的携带量及感染率，因此，有必要研制新型的替代疫苗以应对新城疫的流行。

我国于2012年颁布了《国家中长期动物疫病防治规划》，将新城疫列为优先防治的一类动物疫病，要求实施种禽场疫病净化计划，并计划在2020年全国所有种鸡场达到净化标准。因此，研制基因Ⅶ型NDV标记疫苗意义重大。基因Ⅶ型NDV标记疫苗不仅可为当前新城疫提供有效的防护，其所携带的核酸标记还能区分疫苗株和野毒株感染，便于实施新城疫的净化措施，可弥补传统疫苗在新防控政策下的诸多不足。

发明内容

本发明的目的在于构建并获得一株基因Ⅶ型NDV标记疫苗株。本发明提供的一种基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN，该疫苗株提供保藏时的名称为NDV-aSG10，事实上其与本发明所述的aSG10-mHN为同一株NDV标记疫苗株。该基因Ⅶ型NDV标记疫苗株已于2016年5月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为新城疫病毒，保藏编号为CGMCC No.11919。

本发明提供的基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN，其为HN基因5’非编码区具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的致弱毒株aSG10，并且SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列位于NDV致弱毒株aSG10株的HN基因ORF终止密码子后第6个核苷酸处。

所述标记疫苗株aSG10-mHN的全基因组核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.11919的基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN在制备生物制品中的应用。

本发明利用已建立的新城疫病毒反向遗传操作平台，在致弱毒株aSG10株的HN基因5’非编码区，即HN基因ORF终止密码子后第6个核苷酸处(位于全基因组第8140位)插入一个分子标签(CACCACCACCAC)，构建了一株毒力高度致弱、遗传稳定的基因Ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株aSG10-mHN。

其中，弱毒株aSG10是在pOK-rSG10的基础上，将F蛋白裂解位点第112-117位的氨基酸由RRQKRF突变为弱毒株La sota的F蛋白裂解位点GRQGRL，而后构建突变全长cDNA克隆质粒pOK-aSG10，与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后拯救出的重组病毒。病毒毒力检测结果表明，aSG10株的毒力高度致弱。

本发明还公开了一种所述的基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建基因Ⅶ型新城疫病毒致弱毒株aSG10株基因组全长cDNA质粒pOK-aSG10；

(2)在pOK-aSG10基础上，在HN基因ORF终止密码子后第6个核苷酸处插入SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，构建重组突变质粒pOK-aSG10-mHN；

(3)将pOK-aSG10-mHN与3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L用转染试剂按比例共转染细胞，并添加TPCK胰酶，孵育3-4d，反复冻融后，将细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9-11日龄SPF鸡胚，收获病毒液。

上述方法中，步骤(1)的pOK-rSG10通过以下方法构建得到：根据NDV基因组的序列特点将SG10株全长cDNA序列分成6段进行克隆，获得全长基因组的各个片段后，设计引物对各个片段进行修饰，以保证克隆所使用的各个酶切位点的单一性，随后依次将各片段克隆至pOK12载体中，将构建的质粒命名为pOK-rSG10。

其中，所述细胞为表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞。

本发明提供了上述基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN在制备生物制品中的应用。

含有上述基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN的生物制品属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明还提供了一种基因Ⅶ型NDV标记疫苗，所述疫苗的活性成分为上述标记疫苗株aSG10-mHN。

本发明还提供了一种鉴别待测样本是否为本发明所述的标记疫苗免疫样本的方法，包括如下步骤：

(1)提取样本总RNA；

(2)进行反转录(RT)得到样本cDNA；

(3)利用检测引物进行目标片段的PCR扩增获得PCR产物；

(4)对PCR产物进行测序分析，根据测序结果，如果样品中含有SEQ ID NO.1所示的序列则证明为标记疫苗免疫样本。

步骤(3)所述检测引物为：

上游引物序列：5’-TCGGGACGATGCTTGATGATG-3’

下游引物序列：5’-GGGCGGGACTCAGAATAATC-3’。

本发明还提供了用于检测标记疫苗株aSG10-mHN的检测引物，

上游引物序列：5’-TCGGGACGATGCTTGATGATG-3’

下游引物序列：5’-GGGCGGGACTCAGAATAATC-3’。

对标记疫苗株aSG10-mHN遗传稳定性进行分析，结果表明aSG10-mHN株在9日龄SPF鸡胚中连续传代至第10代，其第5代和第10代经测序均携带插入的分子标签，分子标签没有突变，遗传稳定性好。

免疫保护实验结果表明，基因Ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株aSG10-mHN对鸡只安全且无副反应；免疫2周龄SPF雏鸡，在免疫14d后即可诱导高水平的保护性抗体，免疫后第21d抗体效价在2⁸以上，与空白对照组差异显著。免疫后21d用基因Ⅶ型新城疫病毒SG10强毒进行攻毒，攻毒后免疫组不出现死亡或者与新城疫相关的临床症状，免疫保护率达到100％，表明免疫组鸡只能完全抵御NDV SG10株攻击。攻毒后5天采集泄殖腔拭子检测排毒，试验结果表明，aSG10-mHN免疫组鸡只泄殖腔拭子均没有排毒，而攻毒对照组排毒率为100％。

本发明拯救的aSG10-mHN株作为疫苗株，其基因型与目前国内流行的基因Ⅶ型NDV相一致，可用于防控目前我国流行的基因Ⅶ型NDV，根据设计的特异性引物，利用PCR方法，经测序分析能鉴别疫苗免疫和野毒感染。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明提供的基因Ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株是在已建立的新城疫致弱病毒aSG10反向遗传系统基础上，在aSG10毒株的HN基因5’非编码区插入分子标签(CACCACCACCAC)，得到的标记疫苗株aSG10-mHN。本发明构建的标记疫苗株毒力高度致弱且遗传稳定，对新城疫病毒具有良好的免疫保护效果，并能有效抑制排毒，可用于防控目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒。通过PCR方法能鉴别野毒感染动物与疫苗免疫动物，对新城疫的监测、诊断、控制和净化具有重要意义和广泛的应用价值。

附图说明

图1为pOK-rSG10全长质粒构建示意图，将cDNA片段在共有的限制性酶切位点进行连接，依次将各片段克隆至pOK12载体中(图中倒三角形状所示为有别与野生型SG10株序列而引入的分子标记)。

图2为全长基因组质粒pOK-aSG10构建示意图，利用融合PCR的方式将片段c处F基因裂解位点的核苷酸序列突变成与La Sota相同的序列，并将突变的片段c与全长质粒pOK-rSG10的c片段进行替换，构建含突变F基因的全长基因组质粒pOK-aSG10，图中倒三角形所指为突变位置。

图3为全长基因组质粒pOK-aSG10-mHN构建示意图，在全长基因组质粒pOK-aSG10的HN基因5’非编码区，即开放阅读框ORF后插入分子标签，核酸序列为CACCACCACCAC，如图中倒三角形状所示。

图4为全长基因组质粒pOK-aSG10-mHN插入的分子标签测序结果。

图5A为转染24h后的BSR-T7/5细胞状态的空白对照细胞，图5B为转染24h后的BSR-T7/5细胞状态pOK-aSG10-mHN的细胞。

图6为标记疫苗株aSG10-mHN插入的分子标签测序结果。

图7为标记疫苗株aSG10-mHN第1代、第5代和第10代HN基因分子标签的测序结果。

图8为标记疫苗株aSG10-mHN免疫鸡只后HI抗体消长情况。

图9为攻毒保护试验的各组鸡只存活曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 aSG10株的拯救

1、SG10株基因组全长cDNA构建

(1)病毒的纯化为了获得单一的病毒克隆，首先用有限稀释法对SG10株(已公开在文献Liu MM,et al.Generation by reverse genetics of an effective attenuatedNewcastle disease virus vaccine based on a prevalent highly virulent Chinesestrain.BIOTECHNOL LETT 2015 2015-06-01；37(6):1287-96.中)进行了纯化，详细步骤如下：对病毒液进行10倍比稀释，稀释后分别取各滴度病毒液100μL接种SPF鸡胚，每个稀释度接4枚，弃掉24h内死亡的鸡胚，4d后收获鸡胚尿囊液测定HA活性。选取具有HA活性的最高稀释倍数的尿囊液做同样的倍比稀释和接种。用该方法对病毒连续传代3次后，分装保存第3代病毒液，将其作为原始毒株用于下一步试验。

(2)病毒序列的测定根据GenBank上已发布的NDV基因Ⅶ型毒株的基因组序列设计扩增SG10株全长序列的引物(表1)，将SG10株基因组分成具有相互重叠区域的14段个片段。

表1 SG10株NDV全基因组测序用引物

(3)SG10株基因组全长cDNA的构建根据基因组的序列特点将SG10株全长cDNA序列分成6段(即片段A-F)，首先设计引物扩增这6个片段(表2)，并将所获得片段连接在pEASY–Blunt载体上，筛选阳性后测序验证，将测序正确的质粒保存备用。

表2 SG10毒株基因组全长cDNA克隆构建所用引物

获得全长基因组的各个片段后，设计引物对各个片段进行修饰(表3)，以保证克隆所使用的各个酶切位点的单一性。随后依次将各片段克隆至pOK12载体中，将构建的质粒命名为pOK-rSG10，克隆策略如图1。完成全基因组的克隆后进行测序鉴定。

表3 SG10毒株基因组全长各片段修饰引物

2、aSG10株基因组全长cDNA构建

F裂解位点位于全长cDNA质粒pOK-rSG10的片段c处。设计引物(表4)，利用融合PCR的方式将片段c处F基因裂解位点的核苷酸序列突变成与La Sota相同的序列，并将突变的片段c与全长质粒pOK-rSG10的c片段进行替换，构建含突变F基因的全长基因组质粒pOK-aSG10。构建示意图见图2。

表4 aSG10毒株基因组全长cDNA克隆构建所用引物

3、辅助质粒的构建

根据测定的SG10株全长基因组序列，设计引物分别扩增其编码核蛋白NP、磷蛋白P和聚合酶蛋白L的开放阅读框(引物见表5)，并将3个ORF的分别克隆至真核表达载体pCI-neo的CMV启动子下游。构建成的辅助质粒分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。其中因L蛋白开放阅读框较长，采用分段克隆的方式将其分为3段，并在克隆载体pOK12中完成拼接，随后转移至表达载体pCI-neo中。

表5 辅助质粒构建所使用的引物

4、aSG10株的拯救

将构建好的全长基因组质粒pOK-aSG10与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞。6h后换成含2％血清的DMEM细胞维持液，并向培养基中加入TPCK-trypsin(1μg/mL)，混合均匀后继续孵育3-4d。收获培养液接种9-11日龄SPF鸡胚，接种后的SPF鸡胚继续培养3d后收集尿囊液进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验测，选取阳性病毒液提取RNA，测定其序列进行验证，将拯救病毒命名为aSG10。将拯救病毒连续传代10次，对第5代和第10代病毒的序列进行测序验证，最后将10代病毒分装保存于-80℃冰箱备用。

5、aSG10株病毒生物学特性分析

选取第10代aSG10病毒测定其鸡胚半数感染量(EID₅₀)、鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)，以及病毒在DF-1细胞中的细胞半数致死量(TCID₅₀)，并以病毒SG10株作为对照，比较病毒aSG10的毒力变化情况。

6、试验结果

(1)SG10株基因组全长cDNA构建

根据获得的SG10株全长序列，设计其分段和各段之间的酶切位点，将SG10株全长序列分成了6段(图1)。同时为了便于克隆，分别将NP基因和L基因的ORF上的两个酶切位点进行突变，使得全长基因组不含有Stu Ι酶切位点，而Sph Ι、MLu Ι和Hind III则在全长中成为单一的酶切位点，从而使得克隆全长所涉及到位于序列内部的酶切位点均为单一酶切位点。随后依次将各片段定向克隆至pOK载体。构建好的全长基因组质粒命名为pOK-rSG10，经测序鉴定序列正确。

(2)aSG10株基因组全长cDNA构建

研究表明NDV F蛋白裂解位点的序列是决定NDV毒力的主要因素，为了将强毒株SG10进行致弱，将SG10株的F基因裂解位点的氨基酸突变成与La Sota相同的序列，构建了全长质粒pOK-aSG10。

(3)aSG10株的拯救

本发明利用反向遗传操作技术成功拯救出了一株重组NDVaSG10株。将拯救病毒连续传代10次，并对第5代和第10代病毒的序列进行测序验证，结果表明病毒序列稳定。

(4)aSG10株病毒生物学特性分析

aSG10株的生物学特性测定结果见表6，试验数据表明，本发明拯救的aSG10株毒力明显降低，aSG10属于弱毒株。其在鸡胚中的生长滴度明显高于原毒株SG10。

表6 拯救病毒与亲本毒的生物学特性

实施例2 aSG10-mHN标记疫苗株的拯救

1、试验方法

1.1 aSG10-mHN株基因组全长cDNA构建

插入的分子标签(CACCACCACCAC)位于全长cDNA质粒pOK-aSG10的片段D处。设计引物(表7)，利用融合PCR的方式在pOK-aSG10的D片段上(HN基因5’非编码区，位于全基因组第8140位)插入一个分子标签，并将突变的片段mD与全长质粒pOK-aSG10的D片段进行替换，构建含分子标签的全长基因组质粒pOK-aSG10-mHN。构建示意图见图3。

表7 用于扩增mD片段的引物

注：加粗部分为HN基因ORF的终止密码子，加下划线部分为插入突变部分。

其中将引物D-U和mHN-L PCR克隆之后的片段命名为mD1，将引物mHN-U和D-L PCR克隆之后的片段命名为mD2。以回收的PCR产物mD1和mD2为模板，以D-U和D-L为上下游引物，进行融合PCR，获得的片段即为mD。

1.2 aSG10-mHN标记疫苗株的拯救

将构建好的全长基因组质粒pOK-aSG10-mHN与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞。6h后换液成含2％血清的DMEM细胞维持液，并向培养基中加入TPCK-trypsin(1μg/mL)，混合均匀后继续孵育3-4d。收获培养液接种9-11日龄SPF鸡胚，接种后的SPF鸡胚继续培养4d后收集尿囊液进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验测，选取阳性病毒液提取RNA，测定其序列进行验证，将拯救病毒命名为aSG10-mHN。

1.3 aSG10-mHN标记疫苗株的遗传稳定性

根据插入的分子标签(CACCACCACCAC)位于全长cDNA的位置，设计特异性引物NDV-U和NDV-L用于测序验证(表8)。将获得的aSG10-mHN标记疫苗株在9-11日龄SPF鸡胚中连续传代10次，选择第1代、第5代和第10代病毒进行插入位点的序列测定，检测拯救病毒分子标签的稳定性。

表8 NDV特异性检测引物

1.4 aSG10-mHN标记疫苗株在鸡胚中的生长特性及致病性

选取第10代aSG10-mHN标记疫苗株测定其鸡胚半数感染量(EID₅₀)和1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)，并以aSG10株作为对照。

2试验结果

2.1 aSG10-mHN标记疫苗株的拯救

本发明利用反向遗传操作技术成功拯救出了一株NDV标记疫苗株aSG10-mHN。其全长cDNA的插入片段测序结果见图5。

2.2 aSG10-mHN标记疫苗株的遗传稳定性

选取标记疫苗株aSG10-mHN的第1代、第5代和第10代尿囊液，抽提RNA，反转录，以特异性引物NDV-U和NDV-L PCR扩增插入分子标签区域，并进行测序分析。结果表明，第1代、第5代和第10代标记疫苗株的分子标签依然存在，没有突变，可以稳定传代(图7)。

2.3 aSG10-mHN标记疫苗株在鸡胚中的生长特性及致病性

经测定，标记疫苗株aSG10-mHN的EID₅₀为10^9.334/0.1mL，aSG10株EID₅₀为10^9.50/mL；标记疫苗株aSG10-mHN的ICPI为0.39，aSG10株的ICPI为0.31。结果表明，本发明利用反向遗传操作技术拯救的aSG10-mHN株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，可用于疫苗生产。

实施例3 aSG10-mHN标记疫苗株对SPF鸡安全性试验和攻毒保护试验

1试验方法

1.1 aSG10-mHN标记疫苗株对SPF鸡安全性试验

为测定本发明实施例2拯救的aSG10-mHN标记疫苗株对SPF鸡的安全性，将饲养于隔离器内的2周龄SPF鸡随机分为4组，每组19只。第一组为aSG10-mHN免疫组，第二组为aSG10免疫组，每只鸡均以10^6.0EID₅₀剂量经滴鼻点眼途径分别接种aSG10-mHN或aSG10。第三组为空白对照组，免疫时以等体积的生理盐水替代。分别于接种后的第3d和第7d每组随机剖杀3只鸡，记录大体病理变化，并无菌采集脾、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、肝、肾、胰腺、盲肠扁桃体、脑、气管、十二指肠、肺、腺胃和心脏样品，一部分组织置于10％甲醛溶液中固定进行组织病理学观察，另一部分利用RT-PCR方法检测NDV核酸在各组织器官的分布情况。同时，分别于免疫接种后的第3d和第7d随机采集第1、2、3组鸡只口咽和泄殖腔拭子各10个，利用RT-PCR方法检测排毒情况。分别于免疫后第7d、14d和21d每组翅静脉采血分离血清10份，以SG10为抗原测定HI抗体。

1.2 aSG10-mHN标记疫苗株对SPF鸡攻毒保护试验

上述实验组鸡只于免疫后21d，aSG10-mHN免疫组、aSG10免疫组和空白攻毒组用强毒株SG10以10^5.0EID₅₀剂量经滴鼻点眼途径攻毒，空白对照组以等体积的生理盐水替代。攻毒后观察10d，每日记录临床症状及死亡情况。攻毒后第3d每组随机剖杀3只鸡，剖检记录大体病理变化，并采集脾、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、肝、肾、胰腺、盲肠扁桃体、脑、气管、十二指肠、肺、腺胃和心脏样品，置于10％甲醛溶液中固定进行组织病理学观察。同时，攻毒后第3d每组随机采集10个口咽和泄殖腔拭子，用10日龄非免疫鸡胚进行滴定，检测病毒的排毒情况。

2实验结果

2.1 aSG10-mHN标记疫苗株对SPF鸡安全性试验

aSG10-mHN和aSG10分别免疫SPF鸡，免疫后观察21d，免疫组和空白对照所有鸡只无任何异常，未见与新城疫相关的临床症状。免疫后第3d和第7d剖检观察各组鸡只，均未见明显病理变化。H.E.染色显示，aSG10-mHN免疫组、aSG10免疫组和空白对照组免疫后3d和7d均无无明显病理组织学变化。

免疫后第3d和第7d检测病毒组织分布情况(表9)。结果显示，aSG10-mHN组自免疫第3d起可在包括脾、腺胃、肺脏和哈德氏腺少数几个器官中检测到，免疫第7d检测到阳性的组织器官数量增多，但阳性率依然很低，说明aSG10-mHN在鸡体内繁殖不高，分布有限。aSG10组免疫后第3d和第7d均只在少数几种器官中以1/3阳性率检测到，说明aSG10在鸡体内分布十分有限。空白对照组鸡未在各器官中检测到病毒。

表9 接种aSG10-mHN和aSG10后动物组织病毒核酸检测汇总

注：数字“n/m”表示检测到的阳性数及相关样品总数。

免疫后第3天和第7天检测排毒情况(表10)。结果显示，aSG10-mHN组免疫后第3天没有检测到排毒，第7天起开始排毒，口咽排毒率为30％，泄殖腔排毒率为70％。aSG10组第3天检测到10％排毒，第7天口咽排毒率为30％，泄殖腔排毒率为40％。空白对照组鸡不排毒。

表10 免疫后重组病毒排毒情况

注：数字“n/m”表示检测到的阳性数及相关样品总数。

HI抗体消长情况见图8。在观察期内，免疫组aSG10-mHN和aSG10的抗体水平呈现缓慢同步上升的趋势。方差分析显示，免疫组和空白对照组间差异显著(P＜0.0001)。

2.2 aSG10-mHN标记疫苗株对SPF鸡攻毒保护试验

aSG10-mHN和aSG10免疫组攻毒后未出现任何发病或死亡，保护率达到100％。攻毒对照组则于攻毒后第4d全部发病死亡。各组存活曲线见图9。

攻毒后第3d剖检观察各组鸡只，SG10攻毒对照组出现了新城疫典型病理变化，aSG10-mHN和aSG10免疫攻毒组无明显病理变化，空白对照组未见病理变化(表11)。

表11 攻毒3d后各组剖检病理变化汇总

注：“—”表示未见明显病理变化。

H.E.染色显示，aSG10-mHN组、aSG10组和空白对照组攻毒后3d均未见明显病理变化，而攻毒对照组有明显病理变化。

对于口咽和泄殖腔拭子样品的排毒检测发现，攻毒后3d，aSG10-mHN组和aSG10组口咽和泄殖腔没有排毒，而空白攻毒对照组排毒率为100％(表12)。

表12 SG10攻毒后3d各组试验鸡排毒检测结果

注：数字“n/m”表示检测到的阳性数及相关样品总数。

以上结果表明，aSG10-mHN标记疫苗株对免疫鸡只具有良好的安全性和保护效果。

Claims (10)

1.一种基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN，其保藏编号为CGMCC No.11919。

2.根据权利要求1所述的基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN，其特征在于，所述标记疫苗株为HN基因5’非编码区具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的致弱毒株aSG10，并且SEQID NO.1所示的核苷酸序列位于NDV致弱毒株aSG10株的HN基因ORF终止密码子后第6个核苷酸处。

3.权利要求1或2所述的基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN在制备生物制品中的应用。

4.权利要求1-3任意一项所述的基因Ⅶ型NDV标记疫苗株aSG10-mHN的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建基因Ⅶ型新城疫病毒致弱毒株aSG10株基因组全长cDNA质粒pOK-aSG10；

(2)在pOK-aSG10基础上，在HN基因ORF终止密码子后第6个核苷酸处插入SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，构建重组突变质粒pOK-aSG10-mHN；

(3)将pOK-aSG10-mHN与3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L用转染试剂按比例共转染细胞，并添加TPCK胰酶，孵育3-4d，反复冻融后，将细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9-11日龄SPF鸡胚，收获病毒液。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述细胞为表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞。

6.含有权利要求1-3中任意一项所述的标记疫苗株aSG10-mHN的生物制品。

7.一种基因Ⅶ型NDV标记疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分为权利要求1-3中任意一项所述的标记疫苗株aSG10-mHN。

8.用于检测标记疫苗株aSG10-mHN的特异性引物对，其特征在于，上游引物序列：5’-TCGGGACGATGCTTGATGATG-3’

下游引物序列：5’-GGGCGGGACTCAGAATAATC-3’。

9.含有权利要求8所述特异性引物对的试剂盒。

10.一种鉴别待测样本是否为权利要求7所述的标记疫苗免疫样本的方法，包括如下步骤：

(1)提取样本总RNA；

(2)进行反转录得到样本cDNA；

(3)利用检测引物进行目标片段的PCR扩增获得PCR产物；

(4)对PCR产物进行测序分析，根据测序结果，如果样品中含有SEQ ID NO.1所示的序列则证明为标记疫苗免疫样本；

所述的检测引物：

上游引物序列：5’-TCGGGACGATGCTTGATGATG-3’

下游引物序列：5’-GGGCGGGACTCAGAATAATC-3’。