CN105543180B - 一株基因vii型鸡新城疫病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 - Google Patents

一株基因vii型鸡新城疫病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株基因VII型鸡新城疫病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用，具体提供了一株基因VII型(Class II)的鸡新城疫病毒株Chicken/China/SD06/2014，其保藏编号为：CCTCC NO：V201544，并提供了该毒株的分离、鉴定和纯化的方法以及该毒株的部分生物学性质，分析了该毒株的系统进化和蛋白变异情况，以明确其作为新城疫疫苗侯选毒株和HA‑HI实验抗原的可行性，从而为新城疫病毒的分子进化和流行病学研究提供资料。

Description

一株基因VII型鸡新城疫病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及 其应用
技术领域
本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株基因VII型鸡新城疫病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用。
背景技术
新城疫病毒(NDV)隶属于副粘病毒科中的I型禽副粘病毒，是一组单股负链的RNA病毒。该病毒可导致家禽和野鸟的新城疫，对养禽业造成严重的危害。NDV基因组全长15.2kb，编码6个主要的结构蛋白(3’-NP-P-M-F-HN-L-5’)和2个非结构蛋白(V和W)。HN和F蛋白位于病毒的表面，与病毒的感染性、致病性和抗原性密切相关。F蛋白还被广泛的用于NDV的系统进化分类。目前NDV统一的基因型分类系统将该病毒分为2个群(Class)，其中Class I分为2个基因型，多为野鸟中分离的毒株；Class II分为18个基因型。
根据致病性和感染宿主后临床症状的差异，可以将NDV分为强毒毒株，中等毒力毒株和弱毒株。F蛋白裂解位点的氨基酸序列是NDV毒力划分的分子基础。若F蛋白裂解位点存在多碱性氨基酸序列，则可被宿主的泛素样蛋白酶所裂解，从而促进病毒在宿主体内的复制和系统性感染。此外，鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)可用作NDV对鸡致病性的判断标准。分子流行病学的资料表明，我国鸡群和鸭群中流行的NDV强毒株主要属于Class II中的基因VII型，鸽群中流行的NDV强毒株主要是Class II中的基因VI型，而野鸟中流行的主要是Class I弱毒株。
中国以及其他很多国家采用疫苗免疫的方式来防控家禽新城疫。LaSota属于Class II中的基因II型，是目前应用最为广泛的NDV疫苗株。随着NDV持续不断的变异，有报道表明该疫苗虽然能防止感染NDV后免疫家禽的发病，但是不能抑制排毒：病毒仍然能够在感染后数天内通过喉头/泄殖腔排泄到环境中，从而导致病毒的持续传播和感染；也有报道称在某些基因VII型NDV强毒株感染后，LaSota免疫的鸡群仍然会有发病和死亡。因此，通过持续的新城疫病毒流行病学研究及时的发现优势流行毒株，研究其特性，并最终筛选出可以作为疫苗株的毒株是保证新城疫疫苗效果的最重要方式之一。
发明内容
本发明的发明人提供了一株基因VII型(Class II)的鸡新城疫病毒株Chicken/China/SD06/2014，提供了该毒株的分离、鉴定和纯化的方法以及该毒株的部分生物学性质，分析了该毒株的系统进化和蛋白变异情况，以明确其作为新城疫疫苗侯选毒株和HA-HI实验抗原的可行性，从而为新城疫病毒的分子进化和流行病学研究提供资料。
发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V201544。
该病毒的HN和F相关基因序列如序列表中所示(HN核苷酸序列如Seq ID No:1所示，其氨基酸序列如Seq ID No:3所示；F基因核苷酸序列如Seq ID No:2所示，其氨基酸序列如Seq ID No:4所示)。该毒株推导的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为RRQKRF，含有多个碱性氨基酸，因此可判定为一株NDV强毒株。该病毒在系统进化上隶属于Class II中的基因VII型。病毒与国内NDV优势流行株具有相似的的表面蛋白特征，而与LaSota相比，其在F蛋白功能域的多个区域存在氨基酸的变异，在HN蛋白的跨膜功能域和中和抗原表位也存在氨基酸突变，因此与LaSota相比更适合作为疫苗株。
针对该病毒遗传背景，发明人采用的分离及鉴定方法如下：
取发病鸡(山东省某肉鸡养殖场)的内脏器官(肝、脾、肾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心15分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心15分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天照胚两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通过血凝试验检测尿囊液的HA效价，并据此制备4单位病毒，用标准的NDV阳性血清以及H5和H9亚型AIV阳性血清进行HI试验，鉴定病毒为NDV。
另外的，发明人提取上述病毒RNA，然后反转录为cDNA；分别使用NDV、AIV、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的特异性扩增引物进行PCR扩增，结果仅在使用NDV的特异性引物时出现PCR扩增产物，测序结果表明该产物为NDV的F基因核酸片段。
为了去除尿囊液中可能存在的未知病毒，从而得到尽量纯化的病毒，本发明采用了有限稀释和噬斑纯化相结合的技术方案对该病毒做了进一步纯化。最终收获的含毒尿囊液再次通过HA-HI和PCR方法进行鉴定，表明获得了纯化的NDV。通过上述方法得到的纯化毒，可以进行下述的各种操作，以确定其各种性质：
1.病毒在鸡胚中的生长特性该病毒在鸡胚中可高滴度增殖，血凝素效价稳定在210左右。
2.病毒EID50的测定将毒株10倍系列稀释后，各取0.2ml接种11日龄SPF鸡胚。收集96小时内死亡的鸡胚尿囊液，测定HA效价，确定鸡胚感染病毒的情况。计算EID50，确定毒株对鸡胚的毒力。该病毒对鸡胚的半数感染量(EID50)为10-8.12/0.2ml，是一株NDV强毒株。
3.病毒的系统进化和表面蛋白分析参考已发表的新城疫病毒基因序列资料，设计并合成了NDV的两个表面蛋白基因片段(HN和F)的RT-PCR引物。通过优化RT-PCR反应体系和循环参数，分别扩增HN和F基因。RT-PCR产物进行胶回收，与pEASY-T3载体连接，转化DH5α感受态细胞。挑取白色菌落扩增后提取质粒，酶切鉴定为阳性者进行双向测序。
其具体的HN和F相关基因序列如序列表中所示(HN核苷酸序列如Seq ID No:1所示，其氨基酸序列如Seq ID No:3所示；F基因核苷酸序列如Seq ID No:2所示，其氨基酸序列如Seq ID No:4所示)。据F基因所做的系统进化分析表明，该NDV分离株隶属于Class II中的基因VII型，是目前国内鸡群和鸭群中的NDV优势流行基因型。该毒株推导的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为RRQKRF，含有多个碱性氨基酸，表现出NDV强毒株的分子特征。该病毒与国内的基因VII型NDV流行株具有相似的HN和F蛋白特征；而与LaSota相比，其F蛋白功能域存在广泛的氨基酸变异，HN蛋白功能域的跨膜区以及HN中和保护抗原位点也有多处氨基酸的突变。
通过该毒株生物学性质的测定可知Chicken/China/SD06/2014属于国内鸡/鸭群中NDV的优势流行株。病毒在鸡胚中高滴度增殖，可以作为新城疫疫苗侯选毒株用于灭活疫苗或基因工程疫苗的研发，可采用现有的疫苗加工方法；也可以用作HA-HI实验抗原，检测待检血清中是否存在针对新城疫HN抗原的抗体。
发明人对本发明所公开的基因VII型(Class II)的鸡新城疫病毒株Chicken/China/SD06/2014进行了生物保藏，具体保藏信息如下：
保藏信息
保藏时间：2015年10月20日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC
保藏编号：CCTCC NO：V201544
保藏单位地址：中国武汉武汉大学
分类命名:新城疫病毒Chicken/China/SD06/2014(基因VII型)
附图说明
图1为本发明涉及毒株F基因的系统进化树。
具体实施方式
实施例1
一株基因VII型鸡源新城疫病毒毒株Chicken/China/SD06/2014，该病毒的分离和鉴定方法如下：
1.病毒的分离
取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融3次，8000转/分钟(rpm)离心15分钟，弃去上层脂肪，吸取中间的液体。加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，再次8000转/分钟离心15分钟，取上清经尿囊腔接种11日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养72小时。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取其余鸡胚的尿囊液。
2.病毒的鉴定
采用了HA-HI试验和PCR两种方法进行了NDV的鉴定。
(1)制备1％的鸡红血球，通过血凝试验(HA)检测尿囊液的HA效价，对于HA效价大于4者，制备4单位病毒。以4单位病毒为待检抗原，与新城疫病毒(NDV)阳性血清以及标准的H5和H9亚型禽流感病毒阳性血清进行血凝抑制试验(HI)，鉴定病毒的类型。
(2)提取含毒尿囊液的总RNA并反转录为cDNA。参照文献报道，分别使用NDV、AIV、IBV和IBDV的特异性扩增引物和退火温度进行PCR扩增，对阳性扩增产物进行克隆和测序鉴定：具体参考技术文献为：
NDV特异性扩增PCR方法参考文献：
Kant A,Koch G,Van Roozelaar DJ et al,Differentiation of virulent andnon-virulent strains of Newcastle disease virus within 24hours by polymerasechain reaction.Avian pathology:journal of the WVPA.1997,26:837-849.
AIV特异性扩增PCR方法参考文献：
Erica S,Dennis AS,T.JM,et al.Development of a Real-Time ReverseTranscriptase PCR Assay for Type A Influenza Virus and the Avian H5andH7Hemagglutinin Subtypes.J Clin Microbiol.2002,40(9):3256-3260.
IBV特异性扩增PCR方法参考文献：
Roh HJ,Hilt DA and Jackwood MW.Detection of infectious bronchitisvirus with the use of real-time quantitative reverse transcriptase-PCR andcorrelation with virus detection in embryonated eggs.Avian Dis.2014,58(3):398-403.
IBDV特异性扩增PCR方法参考文献：
Kong LL,Omar AR,Hair Bejo M,et al.Development of SYBR green I basedone-step real-time RT-PCR assay for the detection and differentiation of veryvirulent and classical strains of infectious bursal disease virus.J VirolMethods.2009,161(2):271-279.
结果表明，收获的鸡胚尿囊液HA效价(lg2)为9-10，据此制备的4单位病毒对标准NDV、H5和H9阳性血清的HI效价(lg2)分别为：9，0，0。说明该鸡胚尿囊液中含有NDV，没有H5和H9亚型AIV。
PCR试验表明，仅在使用NDV的特异性引物对病毒cDNA进行扩增时出现PCR扩增产物，测序结果表明该产物为NDV的F基因核酸序列。
3.病毒的纯化
上述病毒鉴定的结果表明，病毒尿囊液中含NDV，而不含H5和H9亚型的AIV、IBV和IBDV。为了去除分离物中可能含有的未知病毒，本发明通过有限稀释和噬斑纯化法进行了病毒的进一步纯化。
(1)有限稀释法：含毒的鸡胚尿囊液做10-4-10-9倍的倍比稀释，取各稀释度的尿囊液分别接种11日龄的SPF鸡胚尿囊腔。收获的病毒通过HA和HI实验检测是否含有NDV。取稀释倍数最低的含NDV尿囊液同上法连续传代2次进行纯化，最终收获的含毒尿囊液再次通过HA和HI实验检测是否含有NDV。
(2)噬斑纯化：经有限稀释法纯化得到的NDV进而使用鸡胚成纤维细胞(CEF)进行3次噬斑纯化。将最后一次的病毒噬斑液接种于一瓶25ml的CEF，72h后收取病变细胞液，反复冻融3次后，接种11日龄的鸡胚培养扩增。收获的含毒尿囊液再次通过上述病毒鉴定的方法(HA-HI和PCR)进行鉴定，结果表明得到了纯化的NDV毒株，发明人对其进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V201544。
实施例2病毒的系统进化和表面蛋白(HN和F)分析
1.病毒RNA的提取和RT-PCR
采用Trizol法(Invitrogen)提取NDV鸡胚尿囊液的总RNA。用于HN和F基因扩增的引物参考已有报道合成(杨少华，胡北侠，许传田等。三株新城疫病毒强毒株的生物学特性及全基因组序列分析。病毒学报，2012,28(2)：143-150.)。RT-PCR使用大连宝生物技术有限公司的PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit，
反应体系为50ul：2×step-buffer 25μl，RNase Free dH2O 14μl,Enzyme mix 2μl,RNA样品6μl，上下游引物各1.5μl；
RT-PCR反应条件为：50℃30min进行反转录，94℃5min预变性，然后94℃50s变性,52℃退火1min，72℃延伸2min，进行,30个循环。最后72℃延伸10min,4℃结束反应。RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，按Qiagen胶回收试剂盒的说明回收和纯化核酸。
2.基因的克隆和测序
RT-PCR产物经回收纯化后与pEasy-T3载体(TransGen公司)连接并转化到DH5α感受态细胞(自制)。挑取在Amp+的LB培养基上生长的白色菌落，37℃摇震过夜培养，按Qiagen质粒提取试剂盒的说明提取质粒。提取的质粒通过菌液PCR进行初步鉴定。F和HN基因各取鉴定为阳性的克隆菌3个，送公司做双向测序(北京华大)。获得的F和HN基因序列使用DNAstar的Lasergene v7.1软件包进行序列编辑及氨基酸的翻译，结果HN核苷酸序列如SeqID No:1所示，其氨基酸序列如Seq ID No:3所示；F基因核苷酸序列如Seq ID No:2所示，其氨基酸序列如Seq ID No:4所示。
3.病毒的系统进化分析
使用1662bp的F基因CDS全序列对Chicken/China/SD06/2014进行了系统进化分析。如图1所示，系统进化分析中采用的NDV参考毒株包括Genbank数据库中收录的所有山东NDV参考株(截至2014年10月)，以及来自发表论文的其他已知基因型的NDV参考株。病毒序列的比对使用了DNAstar的Lasergene v7.1软件包，系统进化树的绘制使用了MEGA6.0软件中的邻近法(Neighbor-joining method)和K-2D模型，共进行了1000个重复的bootstrap统计分析。
结果表明，Chicken/China/SD06/2014(圆点标注)属于Class II中的基因VII型(图1)。基因VII型是目前中国鸡/鸭群中NDV流行株的优势基因型。
4.病毒的表面蛋白特征分析
Chicken/China/SD06/2014的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为RRQKRF，含有多个碱性氨基酸，是一株NDV强毒株。将该毒株的HN和F蛋白氨基酸序列与LaSota以及已知的多株基因VII型NDV分离株进行了比较。分析内容包括了HN和F的功能域，以及HN的中和抗原表位。结果表明该病毒与目前国内广泛流行的基因VII型NDV分离株具有相似的的表面蛋白特征；而与LaSota相比，基因VII型NDV毒株在F蛋白功能域的信号肽、融合肽、七肽重复区和跨膜区均存在多处点突变(表1)，其HN蛋白功能域的跨膜区(表2)以及多处中和抗原表位也存在氨基酸突变(表3)，因此，该病毒与LaSota相比更适合作为国内新城疫疫苗毒株。
表1基因VII型新城疫病毒分离株与LaSota疫苗株F蛋白功能域的氨基酸序列比较
表2基因VII型新城疫病毒分离株与LaSota疫苗株HN蛋白功能域的氨基酸序列比较
“-“表示该氨基酸位点特征与LaSota相同.。
表3基因VII型新城疫病毒分离株与LaSota疫苗株HN蛋白中和抗原表位的氨基酸序列比较
“-“表示该氨基酸位点特征与LaSota相同.
实施例3该毒株用于HA-HI实验用抗原的制备方法和实验方法
1.抗原的制备方法：以Chicken/China/SD06/2014为种毒，接种11日龄SPF鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，无菌收取24-120h内的鸡胚尿囊液，加入0.2％甲醛溶液37℃灭活24h。灭活的抗原中加入0.02％叠氮钠作为防腐剂，以及0.1％的牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，置4℃冰箱保存备用。
2.Chicken/China/SD06/2014抗原HA效价测定：取96孔血凝板，前3排每孔加入0.01M pH7.4PBS缓冲液25ul，每排第一孔加入25ul抗原，以2倍倍比稀释至第12孔。96孔血凝板第4排的12个孔作为阴性对照(病毒对照)，仅加入0.01M pH7.4PBS缓冲液和1％鸡红细胞悬液。然后1-4排的各孔加入1％鸡红细胞悬液，混匀后置室温(20-25℃)作用30min，判定HA效价。结果阴性对照红细胞无凝集(拖尾)，即其HA效价为0，而抗原(前三排)的HA效价均为10lg2。
3.一份鸡血清的HI抗体检测实例：(1)血清稀释：待检血清来自经某生物制品厂生产的基因VII型NDV油乳剂灭活苗免疫的SPF鸡。取96孔血凝板，前六排每孔加入0.01MpH7.4PBS缓冲液25ul,每排第一孔加入25ul待捡血清样品，以2倍倍比稀释至11孔，第12孔作为血清对照。(2)加入4单位抗原：分别以Chicken/China/SD06/2014(HA＝10lg2)和LaSota疫苗株的鸡胚尿囊液(HA＝10lg2)配制4单位抗原(将抗原做1:256稀释)，前三排每孔加入Chicken/China/SD06/2014的4单位抗原25ul，第四至六排每孔加入LaSota的4单位抗原25ul，混匀后置室温作用30min。(3)加入红细胞：加入1％鸡红细胞悬液混匀后置室温作用30min，判定血清样品的HI效价。结果第12孔(对照)红细胞均出现凝集，表明4单位抗原制备合格；前三排的第1-9孔的红细胞均无凝集(拖尾)，第10-11孔的红细胞凝集，判断该待检血清以Chicken/China/SD06/2014为抗原时的HI效价(lg2)为9；第四至六排第1-7孔的红细胞无凝集，第8-11孔红细胞凝集，判断该待检血清以LaSota为抗原时的HI效价(lg2)为7.
上述HI检测结果表明，使用Chicken/China/SD06/2014制备的HA抗原进行基因VII型疫苗免疫后的鸡血清检测，其HI效价比使用以LaSota制备的HA抗原检测的HI效价高出2lg2。表明两个NDV毒株存在抗原性的差异。因此，该基因VI I型NDV抗原可用于病毒抗原性变异分析。同时，从生产应用的角度来说，基因VII型NDV制备的HA抗原比LaSota检测灵敏度高，更适用于基因VII型新城疫疫苗免疫后鸡群的抗体检测。
实施例4Chicken/China/SD06/2014油乳剂灭活疫苗的免疫试验
试验方法如下:
疫苗制备和免疫：以甲醛灭活的Chicken/China/SD06/2014尿囊液(HA＝10lg2)为抗原，按常规方法制备油乳剂灭活疫苗。选择20只4周龄的白色来航SPF鸡进行免疫实验，其中10只为疫苗免疫组，另外10只为PBS免疫对照组。免疫共进行2次，相隔一周。各组的鸡只饲养在不同的生物安全隔离器中。
攻毒试验：分别在初免后一周(再免前)和再免后一周经鸡翅下静脉采血，分离血清。以Chicken/China/SD06/2014制备的HA抗原检测免疫鸡的血清HI抗体效价，据HI抗体产生的情况决定NDV攻毒的时间。试验组的鸡只使用病毒含量为105EID50的Chicken/China/SD06/2014鸡胚尿囊液经腿部肌肉注射攻毒。将PBS免疫对照组的鸡只一分为2，其中5只同上法攻毒作为不免疫/攻毒对照，另外5只以PBS注射代替攻毒作为健康对照。攻毒后观察7天，记录鸡只的发病死亡情况，并于攻毒后第3，5和7天采集存活鸡的喉头/泄殖腔棉拭子，进行病毒的分离和鉴定。
实验结果如下：
免疫后HI抗体检测：试验期间，对照组和免疫组的鸡只健康，采食和饮水正常。由HI抗体检测结果(表4)可知，在二次免疫后的7天，免疫鸡的ND血清HI抗体已升高至6-8lg2，选择在此时进行攻毒试验。
表4疫苗株免疫SPF鸡后血清HI抗体效价
攻毒结果：试验期间，健康对照组的5只鸡采食饮水正常；咽喉/泄殖腔棉拭子样品的病毒分离均为阴性(表5)；攻毒对照组的5只鸡在NDV攻毒后1-2天内发病，表现为：精神沉郁，缩头耷翅，饮水和进食量锐减，拉黄绿色稀粪，病情发展迅速，在攻毒后4天内鸡只全部死亡。对于第3天存活鸡的咽喉/泄殖腔棉拭子(3/5)样品，其NDV分离结果均为阳性(表5)。免疫组的10只鸡在NDV攻毒后，均无明显的临床症状，无死亡，咽喉/泄殖腔棉拭子样品的病毒分离均为阴性(表5)。
表5攻毒后的观察及病毒/抗体检测
注：#在攻毒后3，5，7和9天(DPI)分别采集鸡咽喉/泄殖腔棉拭子进行病毒分离；
NA:not appl icable的缩写，即不适用于该项。
由结果可见，以Chicken/China/SD06/2014为抗原制备的油乳剂疫苗，可为免疫鸡提供有效的攻毒保护。在免疫后HI抗体效价不低于6lg2时进行NDV攻毒，保护率可达100％。

Claims (3)

1.一株基因VII型鸡新城疫病毒毒株，其保藏编号为：CCTCC NO：V201544，其在鸡胚中高滴度增殖，血凝素效价稳定在10 log2。
2.权利要求1所述的新城疫病毒毒株在制备新城疫疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的新城疫病毒毒株在制备新城疫病毒血凝和血凝抑制实验HA-HI用抗原上的应用。
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