CN103275939B - 适于细胞培养的嵌合ibv h120 s1基因膜外区的重组病毒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适于细胞培养的嵌合IBV H120 S1基因膜外区的重组病毒及其构建方法和应用。本发明的重组病毒是通过以下方法构建得到：用IBV H120株的S1基因膜外区片段置换IBV Beaudette毒株S1基因膜外区片段来构建重组病毒，经病毒拯救成功后在Vero细胞上传代，当细胞病变区域达到90%以上时收毒，反复冻融3次后继续传代，获得了适于细胞培养的嵌合IBV H120株S1基因膜外区的重组病毒。将本发明所述的重组病毒作为疫苗毒株免疫SPF雏鸡，攻毒后对免疫组和对照组鸡群进行连续观察，发现本发明的重组病毒作为疫苗毒株可以为接种鸡只提供良好的免疫保护力，且对各种鸡只均安全、无副反应。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组病毒及其构建方法和应用，特别涉及一种适于细胞培养的嵌合IBV H120S1基因膜外区的重组病毒及其构建方法和在预防和治疗鸡传染性支气管炎中应用，本发明属于兽用药物研究技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)。IBV对不同日龄的鸡均可感染，但感染主要侵害4周龄以下的雏鸡，临床以病鸡气管啰音、咳嗽、打喷嚏；肾脏苍白肿大、有大量尿酸盐沉积以及输卵管充血为主要特征，并可引起死亡，随鸡日龄的增长其抵抗力逐渐提高。该病自20世纪30年代在美国爆发以来，目前已成为世界性流行的主要禽病之一，对养鸡业造成了极大危害，它不仅可造成鸡的生长缓慢，而且容易导致继发感染，在伴有支原体和大肠杆菌混合感染时，该病表现得更为严重。近些年来，随着养殖规模的不断扩大，本病的流行呈上升趋势，造成了严重的经济损失，已成为继禽流感和新城疫之后危害养鸡业健康发展的重要传染病。
IBV基因组较大并且可由于点突变和基因重组而发生变异，因此IBV血清型较多，不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用，从而给本病的防控带来困难。疫苗接种仍是防控本病的最有效手段。当前市场上主要以一些鸡胚制备的弱毒疫苗在生产临床上应用，7-10日龄的雏鸡首次免疫主要用IBV H120弱毒株经滴鼻、点眼或饮水途径进行。但由于鸡胚生产弱毒疫苗存在其他病毒污染的风险、成本高、产毒量小、生产周期长等缺点。因此，研究开发具有IBV H120弱毒株同等免疫效力的新型重组病毒疫苗显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有疫苗生产过程中存在的外源病毒污染的风险以及成本高、产毒量小、生产周期长等缺点，将目前免疫用IBV H120疫苗株主要抗原表位区S1基因膜外区片段置换适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株相应基因区段，进而构建重组病毒BeauR-H120(S1)。该重组病毒经Vero细胞传代后生产疫苗用毒种，用该重组病毒所制备的弱毒疫苗免疫SPF鸡所产生的抗体滴度与现有IBV H120弱毒疫苗株无显著差异。此外，本发明还提供了一种用于构建呼吸性鸡传染性支气管炎免疫用毒株的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
本发明的一种适于细胞培养的嵌合IBV H120S1基因膜外区的重组病毒，其特征在于通过以下方法构建得到：用禽传染性支气管炎病毒疫苗株H120株（IBVH120）的S1基因膜外区片段置换禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株（IBVBeaudette）的S1基因膜外区片段来构建重组病毒，经病毒拯救成功后在Vero细胞上传代，当细胞病变区域达到90%以上时收毒，反复冻融3次后继续传代，获得了适于细胞培养的嵌合IBV H120S1基因膜外区片段的重组病毒。
在本发明中，优选的，所述的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株为适应Vero细胞培养的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株。
在本发明中，优选的，所述的禽传染性支气管炎病毒疫苗株H120株的S1基因膜外区片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的S1基因膜外区片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明中，优选的，所述的重组病毒是通过以下方法构建得到：
（1）分别从IBV H120疫苗株和适应vero细胞培养的p65代IBV Beaudette毒株（GenBank号为DQ001339.1）中提取总RNA，用以下引物进行反转录，其中引物Beau-H21711R用于IBV H120疫苗株S1基因膜外区片段的反转录，引物Beau-5752R、Beau-8693R、Beau-15520R、Beau-20422R、Beau-27608R分别用于亲本病毒IBV Beaudette毒株骨架片段的反转录；
Beau-H21711R：5-CAGGTCTCCACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-5752R：5-CGCTAGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-8693R：5-GACCGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-15520R：5-CGATATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-20422R：5-CAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-27608R：5-GTGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
（2）利用引物对Beau-H20421F和Beau-H21711R扩增IBV H120疫苗株S1基因膜外区片段H120(S1e)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用其它5对引物扩增IBV Beaudette毒株的骨架片段1—5，即引物对T7-leading head和Beau-5752R用于扩增骨架片段1，引物对Beau-5749F和Beau-8693R用于扩增骨架片段2，引物对Beau-8690F和Beau-15520R用于扩增骨架片段3，引物对Beau-15510F和Beau-20422R用于扩增骨架片段4，引物对Beau-21707F和Beau-27608R用于扩增骨架片段5，所得到的大小正确的片段进行切胶回收纯化，然后利用T4DNA连接酶将H120(S1e)和Beaudette株骨架片段1—5分别与pGEM-T Easy载体或者pCR-XL-TOPO载体进行连接，连接产物分别转化感受态细胞JM109，抗性筛选后挑斑摇菌，提取对应的质粒，然后进行PCR鉴定和测序鉴定，分别标记为pT-H120(S1e)、pL-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pL-rBeau-4、pL-rBeau-5，保存备用；
T7-leading head：
5-CGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3
Beau-5752R：5-CGCTAGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-5749F：5-AATCTCGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG-3
Beau-8693R：5-GACCGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-8690F：5-GATCCGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG-3
Beau-15520R：5-CGATATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-15510F：5-GCAGTGATTCATTGAGACGTTTTGC-3
Beau-20422R：5-CAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-H20421F：5-GTGGTCTCTGCTGTTTTGTATGACAGTAG-3
Beau-H21711R：5-CAGGTCTCCACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-21707F：5-GAGGTCTCAATGTGACCGACTCAGCTG-3
Beau-27608R：5-GTGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
（3）将步骤2所得6种阳性质粒进行酶切：
pL-rBeau-1用Bsa I和Nhe I双酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-1；pL-rBeau-2用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-2；pL-rBeau-3用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-3；pL-rBeau-4用Bsa I和BsmB I双酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-4；pT-H120(S1e)用Bsa I酶切，其切胶回收产物标记为rH120(S1e)；pL-rBeau-5用Bsa I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-5。
（4）基因片段的连接：
将酶切后的基因片段rBeau-1、rBeau-2和rBeau-3用T4DNA连接酶进行4℃过夜连接，同时将酶切后的基因片段rBeau-4、rH120(S1e)和rBeau-5采用同样的方法进行4℃过夜连接，然后将上述两种连接产物混合，利用T4DNA连接酶进行进一步的连接，并纯化得到全长cDNA；
（5）将全长cDNA利用mMessage mMachine T7试剂盒进行体外转录，全长cDNA转录本纯化后电转化入Vero细胞，电转化12h后的Vero细胞换成含5%胎牛血清的DMEM继续培养，36h后将细胞培养平板密封后放于-70℃冰箱中反复冻融3次，连续盲传，至出现细胞病变后，利用RT-PCR方法检测IBV基因组的存在，获得拯救成功的重组病毒；
（6）病毒拯救成功后在Vero细胞上传代，当细胞病变区域达到90%以上时收毒，反复冻融3次后继续传代，获得了适于细胞培养的嵌合IBV H120S1基因膜外区片段的重组病毒。
在本发明中，所述的禽传染性支气管炎病毒疫苗株H120株（IBV H120）已记载在第十三次学术研讨会会议论文集题目为“禽传染性支气管炎病毒疫苗株H120全基因组序列测定分析”一文中，作者张毅，王红宁等，所述疫苗株可购买自中国兽医药品监察所。
在本发明中，所述的适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株（Vero cell-adaptedIBV Beaudette strain）记载在文献：An arginine-to-proline mutation in a domain withundefined functions within the helicase protein(Nsp13)is lethal to the coronavirusinfectious bronchitis virus in cultured cells，Shouguo Fang，et al.,Virology358(2007)136-147中。
在本发明的一个具体实施例中，所述的适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株为IBV Beaudette毒株的p65代毒（Vero cell-adapted IBV strain Beaudette(p65)），其GenBank号为DQ001339.1。记载在文献：The Cellular RNA Helicase DDX1Interacts with Coronavirus Nonstructural Protein14and Enhances Viral Replication，Linghui Xu et al,JOURNAL OF VIROLOGY,Sept.2010,p.8571–8583中，现由中国农业科学院兰州兽医研究所保存，提供。
在本发明的一个具体实施例中，本发明的一种适于细胞培养的嵌合IBV H120S1基因膜外区的重组病毒，命名为BeauR-H120(S1)，分类命名为鸡传染性支气管炎病毒，其为病毒拯救成功后在Vero细胞上传代的第21代细胞毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏编号为：CGMCC No.7103，保藏时间为2013年1月18日。
本发明重组病毒BeauR-H120(S1)的形态学观察：重组病毒BeauR-H120(S1)由TCID50稳定的细胞毒扩大培养所得，经低温（4℃）高速离心、磷钨酸负染后在电镜下可看到直径约为80-120nm的病毒粒子，呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有松散的均匀分布的冠状突起。
本发明重组病毒BeauR-H120(S1)作为疫苗毒株的免疫效力评价：30只1日龄SPF雏鸡饲养于负压隔离环境中，并随机分成A、B两组（每组15只）。7日龄时，A组接种BeauR-H120(S1)重组病毒（106.25EID50/0.1mL），滴鼻或点眼100μL/只。B组接种正常Vero细胞裂解液作为对照组，滴鼻或点眼100μL/只。自接种后18h起，每天观察记录接种鸡群发病情况。并于免疫后14天和21天分别采集鸡血，分离血清，应用传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒检测IBV抗体水平。14天时部分鸡只IBV抗体阳性，21天时全部鸡只IBV抗体阳性。然后将两组鸡同时用呼吸性IBV标准强毒株M41进行滴鼻攻击，每只0.1mL（103EID50）。攻毒后对免疫组和对照组鸡群连续观察2周，发现免疫组A组鸡只精神状态良好，采食量正常，无发病症状。对照组B组鸡只出现精神沉郁、被毛粗乱、眼睛流泪、流鼻涕、气管啰音等症状。本实验经过两次重复，得到了一致的结果，说明重组病毒BeauR-H120(S1)作为疫苗毒株可以提供良好的免疫保护力。
此外，本发明重组病毒BeauR-H120(S1)接种鸡只后安全性好，安全性实验结果表明，本发明重组病毒对各种鸡只均安全、无副反应。
因此，进一步的，本发明提供了所述的重组病毒在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎药物中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种疫苗组合物，其特征在于含有本发明所述的重组病毒。
附图说明
图1为重组IBV BeauR-H120(S1)的基因组结构及构建全长cDNA时基因组的拆分；
A：IBV Beaudette株基因组结构及重组IBV BeauR-H120(S1)置换基因位置；
B：构建重组IBV BeauR-H120(S1)全长cDNA时基因组的拆分；
图2为IBV重组病毒BeauR-H120(S1)感染Vero细胞后产生的细胞病变；
A为正常Vero细胞；B为BeauR-H120(S1)感染Vero细胞24h时的细胞病变。
图3为IBV重组病毒BeauR-H120(S1)与市售H120弱毒疫苗抗体产生规律比较。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步描述本发明，本发明的创新之处将会随着实施方案而更为清晰。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1本发明IBV重组病毒BeauR-H120(S1)的构建
具体的构建方法是采用下述步骤来完成的：
1.用Trizol试剂(Invitrogen,USA)分别从IBV H120疫苗株和Beaudette P65代细胞毒中提取总RNA。用表1中下游引物进行反转录，其中引物Beau-H21711R用于IBV H120株S1基因膜外区片段的反转录。引物Beau-5752R、Beau-8693R、Beau-15520R、Beau-20422R、Beau-27608R用于亲本病毒Beaudette毒株骨架片段的反转录。
表1重组病毒BeauR-H120(S1)构建时所用到的引物对
2.利用表1中引物对Beau-H20421F和Beau-H21711R扩增IBV H120株S1基因膜外区片段，所得片段标记为H120(S1e)。利用其它5对引物扩增IBV Beaudette株骨架片段1—5(如图1所示)，即引物对T7-leading head和Beau-5752R用于扩增骨架片段1，引物对Beau-5749F和Beau-8693R用于扩增骨架片段2，引物对Beau-8690F和Beau-15520R用于扩增骨架片段3，引物对Beau-15510F和Beau-20422R用于扩增骨架片段4，引物对Beau-21707F和Beau-27608R用于扩增骨架片段5。所用DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。经10min加尾反应(在原50μL扩增体系中加入1μL EX Taq酶和4μL dNTP，然后置于72℃延伸10min)后，琼脂糖凝胶电泳检查RT-PCR产物的特异性和大小，若片段大小与预期扩增大小一致，进行切胶回收纯化，然后利用T4DNA连接酶将H120(S1e)和Beaudette株骨架片段1—5分别与pGEM-T Easy载体(Promega)或者pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen)进行连接，连接产物分别转化感受态细胞JM109，抗性筛选后挑斑摇菌16-18h，提取对应的质粒，然后进行PCR鉴定或者酶切鉴定。将上述鉴定为阳性的质粒取少量送于Invitrogen公司进行测序，其中测序结果为阳性(无缺失、无突变等)的质粒才确定为最终阳性质粒，分别标记为pT-H120(S1e)、pL-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pL-rBeau-4、pL-rBeau-5并保存备用。
3.将上述pL-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pL-rBeau-4、pL-rBeau-5和pT-H120(S1e)6种阳性质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109后，挑斑摇菌，扩大培养16-18h，大量提取质粒备用。
4.将步骤3所得阳性质粒进行酶切：
(1)Beaudette株骨架片段1rBeau-1酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-120μL；Bsa I1.5μL；Nhe I1.5μL；BSA1μL；dH2O21μL。置于37℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-1，备用。
(2)Beaudette株骨架片段2rBeau-2酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-220μL；BsmB I2.5μL；dH2O22.5μL。55℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-2，备用。
(3)Beaudette株骨架片段3rBeau-3酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-320μL；BsmB I2.5μL；dH2O22.5μL。55℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-3，备用。
(4)Beaudette株骨架片段4rBeau-4酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-420μL；Bsa I1.5μL；dH2O22μL。37℃温育3h后加入BsmB I1.5μL，置于55℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-4，备用。
(5)IBV H120株S1基因膜外区片段酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pT-H120(S1e)20μL；Bsa I2.5μL；dH2O22.5μL。37℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rH120(S1e)，备用。其大小为1302bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(6)Beaudette株骨架片段5rBeau-5酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-520μL；Bsa I2.5μL；dH2O22.5μL。37℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-5，备用。
5.基因片段的连接：首先将酶切后的基因片段rBeau-1、rBeau-2和rBeau-3用T4DNA连接酶进行4℃过夜连接。同时将酶切后的基因片段rBeau-4、rH120(S1e)和rBeau-5采用同样的方法进行4℃过夜连接。然后将上述两种连接产物混合，利用T4DNA连接酶进行进一步的连接，最终产物用苯酚\氯仿\异戊醇纯化，用乙醇进行沉淀，RNase-free H2O溶解，0.5%琼脂糖凝胶电泳检查连接效果，并纯化全长cDNA。
6.体外转录：将上述纯化后的全长cDNA利用mMessage mMachine T7试剂盒进行体外转录并用DNase I处理后，苯酚\氯仿纯化。
7.全长cDNA转录本电转化入Vero细胞：将铺满90%35mm细胞培养平板的Vero细胞用0.3%胰酶消化。500×g离心后用预冷的PBS重悬，重复此操作1次后用1mL PBS最终制成Vero细胞悬液。取其中的300μL Vero细胞悬液与纯化后的转录本一同加入电转杯中，电转脉冲条件为：450V，50μF。电转后的Vero细胞重新铺板，加入含2%胎牛血清的DMEM，37℃培养过夜。
8.拯救病毒的收获：将步骤7中电转化12h后的Vero细胞换成含5%胎牛血清的DMEM继续培养，36h后将细胞培养平板密封后放于-70℃冰箱中反复冻融3次。连续盲传至出现细胞病变后，利用RT-PCR方法(所用引物对为：IBV-S-LOW21980(5’-CTTACCATAACTAACATAAGGGC-3’)和IBV-S-UP20368(5’-TGAGATTGAAAGCAACGCCAGTTG-3’)，扩增片段预期大小约1600bp)检测IBV基因组的存在，若扩增得到IBV基因组特异性条带，即说明病毒拯救成功。
9.拯救成功的重组病毒的遗传稳定性及置换片段的完整性检测：
将拯救成功的重组病毒在Vero细胞上连续传代10次，分别取第5代和第10代细胞病毒液，用Trizol试剂提取总RNA后进行反转录,反转录引物为：IBV-S-LOW21980。取反转录的产物3.5μL直接作为PCR的模板进行PCR扩增，所用到的上游引物为：IBV-S-UP20368。扩增片段纯化后送于Invitrogen公司进行测序。重组病毒的遗传稳定性及置换片段完整性的最终判断是根据PCR产物纯化后的测序结果来判定的。
实施例2本发明IBV重组病毒BeauR-H120(S1)的培育
1方法
1.1拯救成功的IBV重组病毒的稳定传代
拯救成功的重组病毒在Vero细胞上进行连续传代。待Vero细胞刚刚铺满细胞瓶时接种反复冻融3次的重组病毒液1mL，另外补加4mL不含血清的DMEM细胞维持液，置37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。当90%细胞出现细胞病变时收获病毒，将整个细胞瓶放于-70℃冰箱中反复冻融3次，等待下一次接毒用。每一代次吸取1mL细胞毒提取RNA，用RT-PCR的方法检测IBV基因组的存在。
1.2病毒滴度测定
取拯救成功的重组病毒的第5代、10代、15代、18代、21代细胞毒分别依次做10倍稀释，每一代次的稀释倍数从10-1到10-8。然后接种生长24h的96孔细胞板。每一稀释倍数的细胞毒接种每排的前10孔，第11和12孔接种维持液DMEM，100μL/孔。接种的96孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。第24h、48h和72h观察细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。
取细胞病变时间稳定的第21代细胞毒测定EID50。其测定方法与上述TCID50测定方法类似，将第21代细胞毒做10倍稀释，选择10-4到10-74个稀释倍数分别接种5枚10日龄的SPF鸡胚，0.1mL/枚。对照鸡胚接种正常Vero细胞裂解液0.1mL/枚。将鸡胚置于37℃温箱内孵化7天，每日照胚，记录7天内鸡胚的感染数和生存数，按Reed-Muench法计算EID50。
1.3外源病毒检测
分别对重组病毒的第5代、10代、15代、18代、21代次细胞毒进行外源病毒的检测。
1.3.1用细胞培养物进行外源病毒检测（病毒的特异性检验）
将0.1mL的细胞毒与抗传染性支气管炎病毒的特异性抗血清混合进行中和反应。然后把中和后的病毒液0.2mL接种于2个接近铺满鸡胚成纤维细胞的细胞瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中吸附1h后换成维持液。连续观察5天，检查有无细胞病变出现。用鸡红细胞做血吸附实验，弃去维持液并洗涤细胞，加入5%红细胞悬液后置于4℃吸附1h，用缓冲液洗涤细胞2次后，在显微镜下观察有无血吸附现象出现。
1.3.2用鸡胚进行外源病毒检测
取不同代次的细胞毒与抗传染性支气管炎病毒的特异性抗血清混合进行中和反应后接种10日龄的SPF鸡胚10枚，0.1mL/枚。同时设正常对照组，置于37℃温箱内孵化1周，每天照胚。每组存活鸡胚数应不少于8枚，其中接种后24h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，弃去不计。对所有接种24h以后存活的鸡胚进行检查，观察鸡胚有无异常，并对尿囊液进行血凝抗原检测。
1.4无菌检验和支原体检验
分别对重组病毒的第5代、10代、15代、18代、21代次毒按照最新《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。
2结果
2.1IBV重组病毒的稳定传代
第1-7代，细胞病变程度达到90%以上时需要48h。第8-12代，细胞病变程度达到90%以上时需要40h左右。第13-16代，细胞病变程度达到90%以上时需要36h左右(见图2)。第17-19代，细胞病变程度达到90%以上时需要32h左右。第20代及其以上代次，细胞病变程度达到90%以上时所需时间稳定在32h。每一代次细胞毒用RT-PCR方法扩增IBV基因组片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后，其结果均是阳性。
2.2病毒滴度测定结果
拯救成功后的重组病毒可以在Vero细胞上增殖，第5代TCID50为103.67/0.1mL，继续传代后病毒滴度逐渐升高，第18代和21代趋于稳定，滴度分别达到104.96/0.1mL、105.0/0.1mL。测得细胞病变时间稳定的第21代细胞毒的EID50为106.25/0.1mL，详见表2。
表2不同代次的细胞毒的滴度测定结果
2.3外源病毒检测结果
分别对重组病毒的第5代、10代、15代、18代、21代次毒进行外源病毒的检测，其结果是均无外源病毒的污染。
2.4无菌检验和支原体检验结果
经Vero细胞传代获得的第5代、10代、15代、18代、21代次的重组病毒，其无菌检验和支原体检验结果均是阴性。
得到的适于细胞培养的嵌合IBV H120S1基因膜外区的重组病毒，命名为BeauR-H120(S1)，其为病毒拯救成功后在Vero细胞上传代的第21代细胞毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.7103，保藏时间为2013年1月18日。
实施例3IBV重组病毒BeauR-H120(S1)的免疫效力评价
1方法
1.1IBV重组病毒BeauR-H120(S1)的免疫保护试验
随机将40只1日龄SPF雏鸡分成A、B两组（20只/组），分别饲养于负压隔离器中。7日龄时，A组接种IBV BeauR-H120(S1)细胞毒（第21代）(106.25EID50/0.1mL)，每只滴鼻点眼0.1mL。B组作为对照组，每只滴鼻点眼0.1mL正常Vero细胞裂解液。自接种之日起，每天观察、记录接种鸡群的发病情况，并于免疫后14天和21天，对两组鸡群采血，分离血清后进行特异性抗体的检测。具体方法参照美国IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒说明书进行。免疫后21天将两组雏鸡用同源经典强毒株M41进行滴鼻攻击，0.1mL/只。攻毒后每天观察、记录鸡群的发病情况。
1.2重组病毒BeauR-H120(S1)对雏鸡气管的保护试验
试验1.1中攻毒后第5天，将两组鸡各处死5只，观察脏器病变情况，采集气管进行病毒分离及RT-PCR检测。
2结果
2.1IBV重组病毒BeauR-H120(S1)的免疫效力
免疫后14天和21天，分别对两组鸡群采血并分离血清后应用间接ELISA试剂盒检测鸡只抗体时发现，A组免疫后14天时16/20(80%)鸡只IBV抗体阳性，至21天时A组所有鸡只血清均为阳性。B组作为对照组，鸡血清中IBV抗体一直为阴性(表3)。使用同源经典强毒株M41对免疫组及对照组鸡群进行滴鼻攻毒后观察至第5天，发现免疫组A组鸡只精神状态良好，采食量和饮水量正常，呼吸正常，没有发病症状；而对照组B组鸡只表现为精神沉郁，采食、饮水量下降，咳嗽、气管啰音、眼睛湿润、流鼻液；攻毒后第7天剖检所有鸡只，对照组鸡只的病理变化表现为喉头及气管前段有出血点，喉头浑浊、黏液增多。
表3IBV重组病毒BeauR-H120(S1)的免疫效力评价
2.2重组病毒BeauR-H120(S1)对雏鸡气管的保护效果
攻毒后第5天剖检免疫组和对照组各5只，可见对照组雏鸡喉头及气管前段有出血点，并且喉头浑浊、黏液增多。免疫组雏鸡气管湿润，无出血点等病理变化，采集气管进行病毒分离及RT-PCR检测后发现对照组扩增到IBV基因片段，而免疫组没有扩增到该基因片段，与剖检后观察到的病理变化的结果一致。
实施例4IBV重组病毒BeauR-H120(S1)安全性试验
1方法
1.13日龄SPF雏鸡安全性试验
将80只3日龄SPF雏鸡随机分成A、B、C、D4组，20只/组。A组滴鼻接种BeauR-H120(S1)重组病毒0.1mL(单剂量接种)；B组滴鼻接种重组病毒0.1mL，一周后每只鸡重复接种相同剂量的重组病毒(单剂量重复接种)；C组滴鼻接种重组病毒1mL(大剂量接种)，D组作为对照组，滴鼻正常vero细胞裂解液0.5mL。观察2周后剖检，观察是否出现IBV特异性临床症状及病理变化。
1.2AA种鸡安全性试验
将40只AA种鸡随机分成A、B、C、D4组，10只/组，各组接种剂量与3日龄SPF鸡安全性试验相同，观察4周，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。
2结果
2.13日龄SPF雏鸡安全性试验结果
从单剂量接种、单剂量重复接种和大剂量接种试验结果可见，IBV重组病毒BeauR-H120(S1)接种3日龄SPF雏鸡后精神状态及采食饮水量正常，没有出现IBV特异性临床症状及病理变化。由此证明了该重组病毒对SPF雏鸡安全可靠。试验组和对照组所得实验数据无明显差异。实验数据详见表4。
表4IBV重组病毒BeauR-H120(S1)对3日龄SPF雏鸡的安全性试验
2.2AA种鸡安全性试验结果
各组AA种鸡分别单剂量接种、单剂量重复接种和大剂量接种IBV重组病毒BeauR-H120(S1)后精神状态及采食饮水量正常，没有出现IBV特异性临床症状及病理变化。对照组和各试验组AA种鸡产蛋数及孵化率无显著差异，证明了该重组病毒对AA种鸡安全可靠。实验数据详见表5。
表5IBV重组病毒BeauR-H120(S1)对AA种鸡的安全性试验
实施例5IBV重组病毒BeauR-H120(S1)免疫持续期试验
1方法
将120只3日龄SPF雏鸡随机分成12组，10只/组。其中6组为免疫组，其余6组为对照组。7日龄时将6个免疫组接种IBV BeauR-H120(S1)细胞毒（第21代）(106.25EID50/0.1mL)，每只滴鼻点眼0.1mL。6个对照组，每只滴鼻点眼0.1mL正常Vero细胞裂解液。免疫后监测抗体动态变化，在免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d时对所有免疫组和对照组鸡只采血并分离血清，用美国IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒检测抗体滴度。每次采血的第二天，抽取免疫组和对照组各一组进行攻毒保护试验，用同源经典强毒株M41进行滴鼻攻击，0.1mL/只。攻毒后每天观察、记录鸡群的发病情况。
2结果
2.1抗体持续期
IBV BeauR-H120(S1)细胞毒（第21代）免疫雏鸡后，7d时免疫组抗体阳性率仅为15%，14d时免疫组抗体阳性率上升到70%，21d时免疫组抗体阳性率达到95%，28d时免疫组抗体阳性率上升到100%，35d、42d时免疫组抗体阳性率均为100%，详见表6。
表6BeauR-H120(S1)免疫后抗体持续期SPF鸡攻毒保护结果
2.2攻毒保护率
在免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d时，对其中一对免疫组和对照组进行攻毒试验时发现，免疫组在免疫后7d时攻毒保护率为0/10，免疫后14d时攻毒保护率为5/10，免疫后21d时攻毒保护率为9/10，免疫后28d时攻毒保护率为10/10，免疫后35d和42d时攻毒保护率也达到10/10，详见表6。
实施例6IBV重组病毒BeauR-H120(S1)与市售H120弱毒疫苗抗体产生规律比较
1方法
将饲养于生物安全3级的60只1日龄SPF雏鸡随机分成A、B、C三组（20只/组）。7日龄时，A组接种IBV BeauR-H120(S1)细胞毒（第21代）(106.25EID50/0.1mL)，每只滴鼻点眼0.1mL。B组接种市售IBV H120弱毒疫苗，1羽份/只(约104EID50/羽份)。C组作为对照组，每只滴鼻点眼0.1mL正常Vero细胞裂解液。免疫后监测抗体动态变化，在免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d时对3组鸡群采血，分离血清后用美国IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒检测抗体滴度。
2结果
将IBV重组病毒BeauR-H120(S1)与市售IBV H120弱毒疫苗分别免疫SPF鸡后，于指定的时间点检测抗体滴度，其结果如图3所示。由图可知，免疫后第7天，BeauR-H120(S1)组的抗体滴度与H120弱毒疫苗组几乎相同，14天至28天时H120组的抗体滴度要高于BeauR-H120(S1)组，28天时H120组的抗体滴度达到最高，而BeauR-H120(S1)组到35天时才达到峰值。35天以后，两组抗体滴度逐渐下降，其中BeauR-H120(S1)组下降速度更快。总之，免疫H120弱毒疫苗组的抗体产生速度和峰值都高于免疫BeauR-H120(S1)组，但二者没有显著差异(P>0.05)。因此，本重组毒株BeauR-H120(S1)可以替代H120毒株作为生产疫苗用毒种。
Claims (4)
1.一种适于细胞培养的嵌合IBV H120 S1基因膜外区的重组病毒，其特征在于通过以下方法构建得到：
(1)分别从IBV H120疫苗株和适应Vero细胞培养的p65代IBV Beaudette毒株中提取总RNA，用以下引物进行反转录，其中引物Beau-H21711R用于IBV H120疫苗株S1基因膜外区片段的反转录，引物Beau-5752R、Beau-8693R、Beau-15520R、Beau-20422R、Beau-27608R分别用于亲本病毒IBV Beaudette毒株骨架片段的反转录；
Beau-H21711R：5-CAGGTCTCCACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-5752R：5-CGCTAGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-8693R：5-GACCGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-15520R：5-CGATATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-20422R：5-CAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-27608R：5-GTGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
(2)利用引物对Beau-H20421F和Beau-H21711R扩增IBV H120疫苗株S1基因膜外区片段H120S1e，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用其它5对引物扩增IBV Beaudette毒株的骨架片段1—5，即引物对T7-leading head和Beau-5752R用于扩增骨架片段1，引物对Beau-5749F和Beau-8693R用于扩增骨架片段2，引物对Beau-8690F和Beau-15520R用于扩增骨架片段3，引物对Beau-15510F和Beau-20422R用于扩增骨架片段4，引物对Beau-21707F和Beau-27608R用于扩增骨架片段5，所得到的大小正确的片段进行切胶回收纯化，然后利用T4DNA连接酶将H120S1e和Beaudette株骨架片段1—5分别与pGEM-T Easy载体或者pCR-XL-TOPO载体进行连接，连接产物分别转化感受态细胞JM109，抗性筛选后挑斑摇菌，提取对应的质粒，然后进行PCR鉴定和测序鉴定，分别标记为pT-H120S1e、pL-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pL-rBeau-4、pL-rBeau-5，保存备用；
T7-leading head：
5-CGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3
Beau-5752R：5-CGCTAGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-5749F：5-AATCTCGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG-3
Beau-8693R：5-GACCGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-8690F：5-GATCCGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG-3
Beau-15520R：5-CGATATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-15510F：5-GCAGTGATTCATTGAGACGTTTTGC-3
Beau-20422R：5-CAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-H20421F：5-GTGGTCTCTGCTGTTTTGTATGACAGTAG-3
Beau-H21711R：5-CAGGTCTCCACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-21707F：5-GAGGTCTCAATGTGACCGACTCAGCTG-3
Beau-27608R：5-GTGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
(3)将步骤2所得6种阳性质粒进行酶切：
pL-rBeau-1用Bsa I和Nhe I双酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-1；pL-rBeau-2用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-2；pL-rBeau-3用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-3；pL-rBeau-4用Bsa I和BsmB I双酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-4；pT-H120S1e用Bsa I酶切，其切胶回收产物标记为rH120S1e；pL-rBeau-5用Bsa I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-5；
(4)基因片段的连接：
将酶切后的基因片段rBeau-1、rBeau-2和rBeau-3用T4DNA连接酶进行4℃过夜连接，同时将酶切后的基因片段rBeau-4、rH120S1e和rBeau-5采用同样的方法进行4℃过夜连接，然后将上述两种连接产物混合，利用T4DNA连接酶进行进一步的连接，并纯化得到全长cDNA；
(5)将全长cDNA利用mMessage mMachine T7试剂盒进行体外转录，全长cDNA转录本纯化后电转化入Vero细胞，电转化12h后的Vero细胞换成含5％胎牛血清的DMEM继续培养，36h后将细胞培养平板密封后放于-70℃冰箱中反复冻融3次，连续盲传，至出现细胞病变后，利用RT-PCR方法检测IBV基因组的存在，获得拯救成功的重组病毒；
(6)病毒拯救成功后在Vero细胞上传代，当细胞病变区域达到90％以上时收毒，反复冻融3次后继续传代，获得了适于细胞培养的嵌合IBV H120 S1基因膜外区片段的重组病毒。
2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7103。
3.权利要求1或2所述的重组病毒在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎药物中的应用。
4.一种疫苗组合物，其特征在于含有权利要求1或2所述的重组病毒。
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