CN101514334A - 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了传染性支气管炎弱毒疫苗株LDT3－A株，并公开了该弱毒疫苗株在防制鸡传染性支气管炎中的应用及应用效果。本发明弱毒疫苗株的微生物保藏号是：CGMCC－2902。本发明弱毒疫苗株安全性好，对于鸡传染性支气管炎具有良好的免疫保护效力。本发明弱毒株可应用于制备成防治传染性支气管炎病毒的单苗或联苗等。

Description

鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病。其特征是：病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。

鸡传染性支气管炎于1930年在美国北达科塔州首次发现，1931年由Schalk和Hawn首次报道。早期的研究表明，传染性支气管炎病毒主要侵害雏鸡的呼吸道(呼吸型IB)，也危害育成鸡和产蛋鸡群，使之抵抗力降低、产蛋量及蛋的品质下降。1962年Winterfield和Hitchner在美国报道了致肾脏病变型IB的出现。1956年Jungherr报到了1951年分离的康涅狄格株(Connecticut，以下简称Conn)和1941年分离的马萨诸塞株(Massachusetts，以下简称Mass)可引起类似的疾病，但不能交叉保护或交叉中和，从而证明IBV不只一个血清型。

我国在1953年就有呼吸型IB发生的报道，1972年邝荣禄在广东首次确诊IB在我国的存在。目前，IBV在我国大部分地区流行，而且在我国免疫鸡群和非免疫鸡群中有新基因型的肾致病性IBV在流行。

IBV对所有日龄的鸡均可感染，但感染主要侵害1～4周龄的幼鸡和雏鸡，并可引起死亡，随鸡年龄的增长抵抗力逐渐加强。IBV自然感染常在48小时内出现症状，人工接种后从第24小时到第7天始终可从气管、肾、法氏囊中分离出病毒。雏鸡感染后症状严重，死亡率取决于病毒的毒力及鸡群的抵抗力，一般死亡率为20％～30％。本病主要通过呼吸道排毒，传播速度快，距离远，往往整栋鸡舍同时发病。此外，IBV还可通过泄殖腔传播。IBV能够在呼吸道、肠道、肾脏和输卵管等组织器官中复制。上呼吸道是IBV复制的主要部位，通常不论分离株来自何种组织，都可感染鸡的呼吸道并在气管中产生特征性病变。随后出现病毒血症，病毒从上呼吸道广泛分布到其它组织。

传统的呼吸型IB，感染病鸡的临床症状以咳嗽、喷嚏和气管发生罗音等呼吸道表现为主。嗜肠型IBV毒株，主要引起呼吸道、肾脏及肠炎病变。致肾病变型IBV，病鸡临床剖检主要表现为肾苍白肿大，严重者出现典型的“花斑肾”，有大量的尿酸盐沉积，最后常因肾衰竭而死亡。目前，致肾病变型IBV已成为危害养鸡业的重要病原。

免疫接种是防治该病的最有效手段。目前，市场上已经有一些弱毒疫苗在临床上应用，但由于IBV血清型众多，且流行毒株与疫苗株相比在基因水平上存在较大变异，致使已有疫苗株不能够有效防制IB流行毒株的攻击，IB的防制效果还不理想。因此，研究开发新的具有较好保护力的IB弱毒疫苗显得尤为重要，本发明研究开发了一种新的鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株，解决了以上所述的实际问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有IB疫苗的不足，针对我国目前鸡传染性支气管炎流行毒株而筛选出具有良好免疫保护率的弱毒疫苗株，提供一种新的传染性支气管炎弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对目前中国流行鸡传染性支气管炎病毒的攻击提供良好的免疫保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明提供了鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株(LDT3-A株)，其微生物保藏号是：CGMCC-2902；分类命名：传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)；保藏时间是2009年2月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

本发明IBV弱毒株(LDT3-A株)的培育是采用下述方法进行的：

用传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03强毒株(由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室于2003年分离鉴定并保存)传代致弱。使用9-10日龄SPF鸡胚对tl/CH/LDT3/03株进行连续传代致弱，每个代次通过尿囊腔接种3枚鸡胚，每胚接种100μL，置37℃孵育72h。72h后，将鸡胚取出，观察鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代。连续传至120代，进行致弱评价试验。将P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代毒株分别接种15日龄鸡，每只滴鼻100μL，并设置对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况。P3、P10、P25、P50代毒对SPF雏鸡发病率均为100％，死亡率由8/20逐渐降低至1/20。P80、P100代毒对SPF雏鸡发病率为100％，但死亡率仍然维持在1/20。而P110、P120代毒对SPF雏鸡发病率和死亡率则均为0％，剖检未见气管出血、肾脏肿大等特异性病理变化，与对照组鸡只状态一致。说明该传代毒P110和P120已经致弱，对鸡只没有致病性。选取P120(LDT3-A)代毒作为疫苗研制的候选毒株。

本发明弱毒疫苗株免疫效力评价：40只1日龄SPF鸡随机分为2组(每组20只)，于负压隔离其中饲养。15日龄时，其中一组雏鸡使用鸡胚代次毒LDT3-A株(P120，10⁵EID₅₀)接种，每只滴鼻100μL。另一组雏鸡作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿囊液。自接种之日起，每天观察记录接种鸡群发病情况，死亡情况。并于免疫后15天，采集鸡只血清样品，应用间接ELISA试剂盒检测IBV抗体阳性。同时将2组雏鸡用同源强毒tl/CH/LDT3/03 P3进行滴鼻攻击，每只100μL。对免疫组及对照组鸡攻击后观察5天，发现免疫组鸡状态良好，无发病症状。而对照组发病明显，表现为精神沉郁、拱背、背毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状，其在攻毒后约30％(6-7/20)鸡死亡。以上实验经过2次重复，得到一致的结果，说明LDT3-A株P120代毒具有良好的免疫保护性。

本发明弱毒株的形态学观察：LDT3-A株病毒尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80-120nm的冠状毒，毒病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。

本发明弱毒株的安全性好，安全性试验结果表明，本发明弱毒株对各种鸡只均安全、无副反应。

本发明还提供了一种多肽，序列为SEQ ID NO：1编码所示。本发明还提供了编码上述多肽的核苷酸序列，核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。通过对本发明多肽序列和编码多肽的核苷酸序列进行分析，发现本毒株特有的基因序列特征

IBV S1基因是在病毒演化过程中最容易发生变异的基因，其编码的多肽能够刺激机体产生中和抗体，且其高变区主要位于S1基因内，因此本发明主要展示本发明弱毒株S1基因序列。通过对本发明毒株的S1基因序列进行分析，发现了本疫苗毒株的特有基因序列特征，其特有基因序列特征如下：S1基因序列总长度为1620bp(SEQ ID NO：2)。

将本发明弱毒株LDT3-A株S1基因序列与IBV H120、H52和W93疫苗株S1基因序列进行多重比对，发现本发明弱毒株(LDT3-A)与H120、H52和W93疫苗株S1基因的同源性分别为79.4％、79.5％和79.5％。LDT3-A株在67-69位有3个核苷酸(TCT)插入；在350-351位有2个核苷酸(GT)插入；在357-358位有2个核苷酸(TA)插入；在365-366位有2个核苷酸(CT)插入(如图1所示)。这4个插入位点分别导致了26位天门冬酰胺(Asn，N)的插入以及121-122位色氨酸和丝氨酸(Trp-Ser，W-S)的插入(如图2所示)。此外，本发明弱毒株LDT3-A株S1基因与上述传统疫苗株相比，还存在多处核苷酸替换，并导致了相应氨基酸序列的改变。这是本发明所获得的疫苗具有高效的免疫保护性和低毒性的分子遗传学基础。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种新的疫苗，该疫苗由本发明弱毒株和冻干保护剂组成：取本发明生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释10万倍，接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔内，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育。鸡胚接种24小时照胚，弃去死胚，将于37℃条件下孵育30～72小时的鸡胚气室向上，置于4℃冷却4～24小时。收获病毒尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌瓶中，在2～8℃保存，同时做无菌检验，同时测得病毒含量应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按7∶1(病毒液∶保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃～50℃为宜，(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

本发明疫苗的使用方法：

(1)接种途径：滴鼻。

(2)接种剂量：1羽份。

本发明疫苗免疫后10天产生免疫力，一次免疫持续期为4个月。

本发明弱毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。

本发明还提供了由SEQ ID NO：1编码的多肽——S1蛋白在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的用途。

本发明获得的多肽——S1蛋白具有如下生物学功能：(1)S1蛋白能诱导机体产生病毒中和抗体、血凝抑制抗体、交叉反应ELISA抗体及细胞介导的免疫应答。(2)S1蛋白能诱导抗致病性攻毒的保护作用。(3)S1蛋白的氨基端在决定IBV的组织嗜性及其毒力方面具有一定作用。(4)S1蛋白是决定IBV血清型特异性抗原决定簇的主要蛋白。因此S1可以作为IB亚单位疫苗。

S1蛋白是IBV最主要的免疫原蛋白，它具有诱导鸡体产生病毒中和抗体，血凝抑制抗体的能力，是传染性支气管炎病毒血清分型的主要依据，其N端在病毒的组织嗜性和毒力上具有重要作用，利用S1蛋白作为免疫原研制lBV基因工程亚单位疫苗的热点。用纯化的S1蛋白对鸡进行免疫后用IBV强毒株进行攻毒，不仅诱导产生了抗体而目在肾和支气管水平上保护率分别达80％和71％，说明IBV S1基因是研制传染性支气管炎病毒基因工程疫苗的重要候选基因之一。Tomley等(Expression of the infectious bronchitis virus spike protein byrecombinant vaccinia virus and induction of neutralizing antibodies in vaccinated mice.J Gen Virol，1987，68(Pt 9)：2291-8.)用lBV Beaudette株的S基因和痘苗病毒WR株重组得到了能感染细胞产生S1和S2亚基的108ku纤突蛋白的多肽前体重组病毒，此多肽免疫小鼠可产生针对纤突蛋白的抗体，该抗体可中和IBV的感染，Binns等(Comparison of the spike precursor sequence ofcoronavirus IBV strains M41 and 6/82 with that of IBV Beaudette.J Gen Virol，1986，67：2825-2831.)利用鸡痘病毒作载体，将IBV S1 cDNA插入鸡痘病毒转移载体中，初步研制出的IB基因工程活载体疫苗，其表达产物可产生S1蛋白，并诱导机体产生相应的特异性抗体，激发抗IBV保护性免疫应答能力，均获得了满意的效果。

本发明获得的多肽是针对我国目前鸡传染性支气管炎流行毒株而筛选出具有良好免疫保护率的弱毒疫苗株的S1蛋白，用该多肽制备的疫苗可对目前中国流行鸡传染性支气管炎病毒的攻击提供良好的免疫保护效力。

附图说明

图1本发明弱毒株(LDT3-A)株S1基因与IBVH120、H52和W93株S1基因核苷酸序列比对，图中所示为本发明弱毒株S1基因中的核苷酸插入位点。

图2本发明弱毒株(LDT3-A)株S1与IBVH120、H52和W93株S1氨基酸序列比对，图中所示为本发明弱毒株S1蛋白中的氨基酸插入位点。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株(IBV)的制备

IBV强毒株tl/CH/LDT3/03由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室于2003年分离鉴定并保存。用传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03株传代致弱，使用9-10日龄SPF鸡胚对tl/CH/LDT3/03株进行连续传代致弱，每代次通过尿囊腔接种3枚鸡胚，连续传至120代，进行致弱评价试验。将P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代毒株分别接种15日龄鸡，其中P110和P120接种的雏鸡，未发现发病和死亡，说明该毒株在P100和P120代毒已经完全致弱，对鸡只具有较好的安全性。同时用本发明弱毒株(LTD3-A P120)免疫15日龄雏鸡，于免疫后15天，用同源强毒进行攻击，发现免疫组鸡只状态良好，无发病症状。而对照组发病明显，其在攻毒后约30％(6-7/20)鸡死亡。以上实验经过2次重复，得到一致的结果，说明LDT3-A株P120代毒具有良好的免疫保护性，选取P120(LDT3-A)作为疫苗研制的候选毒株。将所得毒株提交保藏，微生物保藏号是：CGMCC-2902；保藏时间：2009年2月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京中国科学院微生物研究所。

实验例2本发明弱毒疫苗株鸡传染性支气管炎病毒LDT3-A株的培育

1材料与方法

1.1病毒株tl/CH/LDT3/03的传代致弱

使用9～10日龄SPF鸡胚对tl/CH/LDT3/03株进行连续传代致弱。每个代次毒通过尿囊腔接种3枚鸡胚，每胚接种100μL，置37℃孵育72h(弃去24h内死胚)，每日观察鸡胚两次，如果鸡胚在24～72h内死亡，则置4℃保存。72h后将所有鸡胚取出置4℃4～24h，观察记录鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液进行下一次传代。选择72h未死，但病变典型，尿囊液清亮的鸡胚进行传代。

1.2病毒滴度测定

取tl/CH/LDT3/03P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒的鸡胚尿囊液，分别依次作10倍系列稀释；选择4个稀释倍数(10⁴～10⁷或10⁵～10⁸)的病毒悬液分别接种5枚9～10日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚接种100μL，将鸡胚置37℃温箱内孵育1周，每天照胚，记录1周内鸡胚的感染数和生存数，按Reed-Muench法计算EID₅₀。

1.3无菌检验和支原体检验

分别将tl/CH/LDT3/03株在鸡胚传代过程中的P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.4外源病毒检验

分别将tl/CH/LDT3/03株在鸡胚传代过程中的P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒进行外源病毒检测。

1.4.1用鸡胚进行外源病毒检测(病毒的特异性检验)

取病毒样品tl/CH/LDT3/03株各代次毒，稀释成每剂量1×10^2.0EID₅₀/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取9～10日龄SPF鸡胚10枚，每枚鸡胚尿囊腔接种病毒样品悬液0.2ml，另取9～10日龄SPF鸡胚10枚，每枚鸡胚尿绒毛尿囊膜接种病毒样品悬液0.2ml，同时设正常对照组，孵化7日，每日照胚，接种后24小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，每组存活至少8枚鸡胚，对所有接种24小时后存活的鸡胚进行检查，观察有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异常，并对尿囊液进行血凝抗原检测。

1.4.2用细胞培养物进行外源病毒检测

取病毒样品1×10^2.0EID₅₀/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，接种中和后的病毒液0.2ml，在37℃下吸附1小时，观察5日，检查是否出现由接种物引起的CPE；用鸡红细胞进行血吸附试验，弃去培养液，并洗涤单层细胞，加入5％红细胞悬液，在4℃吸附60分钟，用缓冲液洗涤2次细胞后，在显微镜下观察，是否出现CPE和血吸附现象。

1.4.3COFAL试验(禽白血病病毒检验)

取病毒样品，制备成每剂量5×10^5.5EID₅₀/0.2ml，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，各接种病毒样品0.2ml，吸附30分钟，弃去培养液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞和培养液作为对照。培养5～7日，按常规方法收获细胞，其中1/2作标记置-70℃检验用(P1)，其余细胞分在两个瓶中，培养7日后，按同样方法收获细胞，留样(P2)，如此继续传第3代，收获细胞(P3)，所有对照同样处理。将P1、P2、P3和所有对照冻融3次。同时设立阳性对照按照“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”对每份样品进行COFAL试验。

1.5tl/CH/LDT3/03的致弱评价180只1日龄的SPF鸡随机分为9组(每组20只)，分别将9组鸡饲养于9个负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。在15日龄时，1～8组雏鸡分别用鸡胚代次毒P3(10^4.68EID₅₀)、P10(10^4.77EID₅₀)、P25(10^5.23EID₅₀)、P50(10⁵EID₅₀)、P80(10^4.8EID₅₀)、P100(10^4.87EID₅₀)、P110(10^4.8EID₅₀)和P120(10⁵EID₅₀)进行接种，每只滴鼻100μL；第9组雏鸡作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化并于接种后14日，使用同源强毒tl/CH/LDT3/03P3(10^5.68EID₅₀)进行攻击，每只滴鼻点眼100μL；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。

1.6LDT3-A的免疫效力初步评价

1.6.1 15日龄SPF鸡免疫效力试验

40只1日龄SPF鸡随机分为2组(每组20只)，分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。15日龄时，其中一组雏鸡使用LDT3-A(P120，10⁵EID₅₀)进行接种，每只滴鼻100μL；另一组雏鸡则作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，并于免疫后15天，对每组采集血清进行特异性抗体检测，具体方法参照传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒说明书进行；同时将2组雏鸡用同源强毒tl/CH/LDT3/03 P3(10^5.68EID₅₀/0.1ml)进行滴鼻攻击，每只100μL；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况。

1.6.2 3日龄SPF鸡免疫效力试验

方法同1.6.1，SPF鸡日龄为3日龄。

1.7 LDT3-A对雏鸡气管和肾脏的保护试验

试验1.6.1中攻毒后第5天，将2组鸡各处死5只，观察脏器病变情况，采集肾脏及气管，进行病毒分离及RT-PCR检测。

1.8 tl/CH/LDT3/03致病力变化与S1基因的相关性

通过RT-PCR反应扩增得到了代表强毒的第3代病毒tl/CH/LDT3/03 P3及最终致弱的第120代病毒tl/CH/LDT3/03 P120的S1基因，然后进行基因克隆及序列测定，并对P3及P120代次病毒S1基因序列进行对比分析。

2结果

2.1tl/CH/LDT3/03的传代致弱随着对tl/CH/LDT3/03病毒传代次数的增加，其对鸡胚的适应性越来越强，鸡胚死亡率逐渐升高，死亡时间逐渐缩短，鸡胚病变也更加明显。接种病毒的鸡胚呈现明显发育障碍(侏儒胚)，蜷曲成球形，胚体出血，羊膜水肿增厚，紧贴胚体等典型的传染性支气管炎病毒感染的变化。每个代次的鸡胚尿囊液均不能凝集鸡外周血红细胞，说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的禽的其它病毒，如正粘病毒、副粘病毒或腺病毒等。将tl/CH/LDT3/03 P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒的鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镜下均可见到直径约为80-120nm典型的冠状病毒，病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起，而且未观察到有其它病毒。含有tl/CH/LDT3/03 P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒的鸡胚尿囊液通过RT-PCR扩增得到的产物，经0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，结果发现与预期扩增核酸片断大小相符的特异性条带，而在阴性对照中未见此条带。

2.2病毒滴度测定结果tl/CH/LDT3/03毒株可高度适应鸡胚，P3代的EID₅₀高达10^6.68/0.1ml，传代后病毒滴度逐渐升高，P25～P80代≥10⁷EID₅₀/0.1ml，P100～P120趋于稳定，滴度约为10⁷EID₅₀/0.1ml。

表1tl/CH/LDT3/03鸡胚传代毒滴度测定结果

2.3无菌检验和支原体检验

鸡胚传代过程中的P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒经检验无细菌、霉菌和支原体污染。

2.4外源病毒检验

鸡胚传代过程中的P3、P10、P25、P50、P80、P100、P110和P120代次毒经检验无外源病毒的污染。

2.5tl/CH/LDT3/03不同代次毒的致弱评价

tl/CH/LDT3/03毒株在鸡胚上连续传代后对SPF雏鸡的致病力逐渐减弱(见表2)。P3、P10、P25、P50代毒对SPF雏鸡发病率均为100％，死亡率由8/20逐渐降低至1/20。P80、P100代毒对SPF雏鸡发病率为100％，但死亡率仍然维持在1/20。发病鸡表现为精神沉郁、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状。病死鸡剖检可见气管出血，两侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现典型的“花斑肾”，有尿酸盐沉积，部分鸡只盲肠扁桃体肿大、出血。所有对照组鸡接种阴性尿囊液后状态良好，无发病或死亡。而P110、P120代毒对SPF雏鸡发病率和死亡率则均为0％。剖检未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化，与接种阴性尿囊液后的SPF鸡一致。

表2tl/CH/LDT3/03不同代次毒对SPF雏鸡的致病力

2.6LDT3-A免疫效力的初步评价

2个不同日龄的免疫组，在免疫后15天，采集鸡只血清样品，应用间接ELISA试剂盒检测发现，接种过LDT3-A的鸡只血清样品全部转为IBV抗体阳性，而对照组鸡血清样品均为阴性。使用同源强毒tl/CH/LDT3/03P3(10^5.68EID₅₀)对免疫组及对照组鸡攻击后观察5天，发现免疫组鸡状态良好，无发病症状；而对照组发病明显，表现为精神沉郁、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状，且在攻毒后约30％(6-7/20)鸡死亡(见表3)。

表3LDT3-A的免疫效力评价

2.7LDT3-A对雏鸡气管和肾脏的保护效果

攻毒后第5天剖检鸡发现免疫组雏鸡脏器无眼观病理变化，对照组雏鸡可见气管出血，两侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现“花斑肾”变化，个别雏鸡有尿酸盐沉积及盲肠扁桃体出血。通过RT-PCR方法，免疫各组都有1只免疫鸡的肾脏和气管中检测出IBV病毒核酸片断，而对照组鸡肾脏及气管检测结果均为阴性(见表4)。

表4对雏鸡气管和肾脏的保护效果

2.8tl/CH/LDT3/03 P3及P120 S1基因的比较分析

tl/CH/LDT3/03 P3及P120 S1基因及推导氨基酸序列的差异见表5。S1基因有两个核苷酸发生变异(361和656位)，并导致第121位氨基酸残基由G突变为W，第219位氨基酸残基由Q突变为R，其中第121位氨基酸残基位于S1蛋白基因高变区内。

表5IBV tl/CH/LDT3/03 P3及P120 S1基因核苷酸及氨基酸序列的比较

实验例3本发明弱毒疫苗株免疫效力实验

1材料

试验用疫苗：疫苗为哈尔滨兽医研究所研制的鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)，批号为：2006001、2006002、2006003、2006004、2006005。2000羽份/瓶。

疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量按瓶签标注羽份，用生理盐水稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻一滴(约0.03～0.05ml)。

2方法

2.1主动免疫试验

将1～5组3日龄SPF雏鸡分别接种5批次疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第6组3日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后14日，6组鸡滴鼻方法攻击10⁶⁰EID₅₀的tl/CH/LDT3/03株强毒，观察14日，记录发病和死亡情况。

2.2被动免疫试验

将1～5组16～22周龄AA种鸡分别接种5批次疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第6组种鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫14日后，每组随机取鸡胚100枚进行孵化，每组取孵化的小鸡60只分别于7天、9天和14天测定母源抗体并滴鼻方法攻击10^6.0EID₅₀的tl/CH/LDT3/03株强毒，观察14日，记录发病和死亡情况。

3结果

3.1主动免疫试验

各批疫苗免疫组免疫14日后，以强毒攻击，其中生理盐水对照组全部发病，均出现精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内有7/20死亡，解剖发现均有肾脏肿大，“花斑肾”特异病变。而疫苗免疫组中以2006001批次疫苗免疫的鸡有4只鸡出现一过性精神不振症状，1～2天内恢复正常，观察至14天解剖所有鸡，免疫组鸡均未发现特异性病理变化。由此来看，免疫保护率均可达到80％(16/20)以上，大部分疫苗批次保护率达到100％(20/20)，详细结果见表6。

表6鸡传染性支气管炎活疫苗主动免疫效力试验数据

表7鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)的被动免疫试验结果

3.2被动免疫试验

LDT3-A疫苗免疫健康AA种鸡所产鸡蛋孵化的雏鸡均能够在9天内获得保护作用，攻毒保护率在90％以上。抗体检测结果显示，虽然检测结果仍然保持阳性，但是母源抗体在持续下降过程中对强毒攻击的保护率在逐渐降低。这可能一方面与传染性支气管炎主要以上呼吸道局部免疫为主，另一方面在免疫类型方面以细胞免疫为主，以体液免疫为辅有关。抗体检测结果与攻毒保护结果见表7。

实验结果表明，主动免疫保护率为80％，被动免疫在9天内可以获得90％以上的保护，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。

实验例4本发明弱毒疫苗株安全性实验

1材料

试验用疫苗：用于雏鸡安全试验的疫苗为哈尔滨兽医研究所研制的鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)，批号为：2006001、2006002、2006003、2006004、2006005，2000羽份/瓶；用于种鸡安全试验的疫苗为哈尔滨兽医研究所研制的鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)，批号为：2007001、2007002、2007003、2007004、2007005，2000羽份/瓶。

疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量按瓶签标注羽份，用生理盐水进行适当稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻途径接种。

2方法

2.1SPF鸡安全试验

2.1.1单剂量接种试验

单剂量接种安全试验用100只3日龄雏鸡，每批疫苗使用20只，另设对照组鸡20只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，对照组滴鼻等量的生理盐水，观察14日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变如：部分发病鸡气管、鼻窦内有浆液性或卡他性分泌物，有些鸡盲肠扁桃体有明显的出血点，多数鸡肾脏出现肿胀，质地很脆，出现典型的“花斑肾”变化。

2.1.2单剂量重复接种试验：

单剂量重复接种安全试验用100只3日龄雏鸡，每批疫苗使用20只，另设对照组鸡20只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后重复滴鼻接种相同剂量的疫苗。对照组滴鼻等量的生理盐水，观察14日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变。

2.1.3大剂量接种组试验：

大剂量接种试验共用100只3日龄SPF雏鸡，每批疫苗使用20只，另设对照组鸡20只，将疫苗稀释至10羽份/0.1ml的剂量，试验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，对照组注射等量的生理盐水，观察14日。剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变如。

2.2AA种鸡的安全试验

2.2.1单剂量接种试验

单剂量接种安全试验用60只AA种鸡，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，对照组滴鼻等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。

2.1.2单剂量重复接种试验：

单剂量重复接种安全试验用60只AA种鸡，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后重复滴鼻接种相同剂量的疫苗。对照组滴鼻等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。

2.1.3大剂量接种组试验：

大剂量接种试验共用60只AA种鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡10只，将疫苗稀释至10羽份/0.1ml的剂量，试验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，对照组注射等量的生理盐水，观察30日，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。

表8鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量接种安全试验

3结果

3.1SPF雏鸡安全试验从SPF雏鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，鸡传染性支气管炎活疫苗对3日龄的SPF雏鸡安全可靠，生理活动正常，剖检无传染性支气管炎特异病变；证明了该疫苗对疫苗推荐最小日龄鸡安全可靠，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验数据无明显差异。试验数据详见表8、表9和表10。

表9鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量重复接种安全试验

表10鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡大剂量安全试验

3.2AA种鸡安全试验从AA种鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，鸡传染性支气管炎活疫苗对种鸡安全可靠，生理活动正常，鸡的采食、饮水、日常活动不受影响。试验组和对照组试验产蛋数及孵化率无明显差异。试验数据详见表11、表12和表13。

表11鸡传染性支气管炎活疫苗种鸡单剂量接种安全试验

表12鸡传染性支气管炎活疫苗种鸡单剂量重复接种安全试验

表13鸡传染性支气管炎活疫苗种鸡大剂量安全试验

4结论

4.1本发明弱毒株鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)对雏鸡是安全的。

4.2本发明弱毒株鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)对产蛋种鸡是安全的。

实验例5本发明弱毒疫苗株免疫持续期研究

1材料和方法

1.1疫苗 鸡传染性支气管炎活疫苗：批号为2006001。

1.2试验用鸡3日龄SPF雏鸡。

1.3攻击用强毒tl/CH/LDT3/03株强毒(10^6.0EID₅₀/0.1ml)由哈尔滨兽医研究所分离、鉴定、保存和供应。

1.4ELISA抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司。

1.5实验动物分组3日龄SPF雏鸡180只，随机分为18组，其中免疫组9组，对照组9组。

1.6免疫用疫苗免疫3日龄其中9组SPF雏鸡90只，作为免疫组。免疫组免疫疫苗的剂量为一个羽份，对照组鸡滴鼻0.1ml生理盐水。

1.7免疫后抗体动态监测免疫组和对照组鸡在免疫后5、7、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150日采血，用ELISA抗体检测试剂盒检测抗体滴度，统计结果。

1.8不同时期免疫保护监测9组免疫鸡分别于免疫后第5、7、10、20、30、60、90、120、150天进行攻毒试验，在不同时间分别与一组对照鸡10只滴鼻方法攻击10^6.0EID₅₀的tl/CH/LDT3/03株强毒，分别观察14日，记录发病情况，统计结果，结合抗体检测结果得出疫苗免疫提供的免疫保护持续期。

2结果

2.1抗体持续期2006001批次疫苗以1羽份的剂量免疫雏鸡后7日，即可用ELISA方法检出部分免疫鸡血清抗体，抗体阳性率达到7/10，疫苗免疫后10天抗体阳性率达到8/10，疫苗免疫后20～120天抗体阳性率维持在8/10，免疫后150天抗体阳性率则下降至8/10(见表14)。

2.2攻毒保护率免疫后第5、7、10、20、30、60、90、120、150天通过攻毒发现，免疫组在免疫后7天攻毒保护率达到6/10，免疫后10天攻毒保护率达到8/10，免疫后20～120天攻毒保护率均可达到8/10，免疫后150天攻毒保护率仍达到9/10(见表15)。

表14免疫持续期雏鸡攻毒保护结果(2006001批次)

表152006001批次疫苗诱导的抗体滴度

3结论疫苗免疫持续期为4个月。

实验例6本发明弱毒疫苗株S1基因的克隆

1材料和方法

1材料

IBV分离株由本课题组分离、鉴定和保存。SPF鸡胚，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。引物参照已发表的IBV S基因序列设计，宝生物工程(大连)有限公司合成。引物的核有酸序列为：S1上游引物(P1)5’-TTCAAAACTCAACAAAACACACAC-3’下游引物(P2)5’-ACCTTCAACACCACCACCGTAAGCAA-3’。pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。受体菌JM 83由本实验室制备和保存。Ex TaqDNA聚合酶、限制性内切酶DNAMarker(DL2000)均购自宝生物工程(大连)有限公司。鼠源反转录酶(M-MLV)RNasin，Trizol RNA提取试剂盒与DNA片段快速纯化/回收试剂盒购自Cibco BRL公司。其它试剂均为分析纯。

2病毒的增殖与RNA的提取

将IBV接种，10日龄SPF鸡胚，37℃培养48h后(弃去24h内的死胚)，无菌收集尿囊液，4℃以4000r/min离心，收上清，现以26000r/min离心2h后去大部分上清，用剩余的上清重悬尿囊液沉淀，按Trizol试剂盒说明方法提取病毒基因组RNA。

3IBV S1基因的扩增、克隆及鉴定

应用RT-PCR按文献方法扩增IBV S1基因。扩增产物按文献进行克隆。对鉴定为阳性的重组质粒委托宝生物工程(大连)有限公司进行核有酸序列测定。

2结果

1、基因的扩增、克隆及鉴定

用尿囊液中提取的病毒总RNA进行反转录合成cDNA，并以此为模版用S1特异引物进行PCR扩增，得到了与预期相符的大小约为1.6kb的片段.将此片段克隆于pMD18-T载体后，经酶切和PCR扩增鉴定，得到含有外源基因的重组阳性质粒。

2、序列分析

S1基因序列测序结果与IBV H120、H52和W93疫苗株S1基因序列进行多重比对，发现本发明弱毒株(LDT3-A)与H120、H52和W93疫苗株S1基因的同源性分别为79.4％、79.5％和79.5％。LDT3-A株在67-69位有3个核苷酸(TCT)插入；在350-351位有2个核苷酸(GT)插入；在357-358位有2个核苷酸(TA)插入；在365-366位有2个核苷酸(CT)插入(如图1所示)。这4个插入位点分别导致了26位氨基酸(N)的插入以及121-122位氨基酸(WS)的插入(如图2所示)。此外，本发明弱毒株LDT3-A株S1基因与上述传统疫苗株相比，还存在多处核苷酸替换，并导致了相应氨基酸序列的改变。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用

<130>KLPI090077

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>540

<212>PRT

<213>Infectious bronchitis virus

<400>1

Met Leu Gly Lys Ser Leu Phe Leu Val Thr Ile Leu Cys Ala Leu Cys

1               5                   10                  15

Ser Ala Asn Leu Phe Asp Ser Ala Asn Asn Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln

            20                  25                  30

Asn Ala Phe Arg Pro Pro Asn Gly Trp His Leu Gln Gly Gly Ala Tyr

        35                  40                  45

Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Tyr Thr Asn Asn Ala Gly Ser Val Asn

    50                  55                  60

Glu Cys Thr Ile Gly Val Ile Lys Asp Val Tyr Asn Tyr Ser Ala Ala

65                  70                  75                  80

Ala Ile Ala Met Thr Ala Pro Leu Gln Gly Met Ala Trp Ser Lys Ser

                85                  90                  95

Gln Phe Cys Ser Ala His Cys Asn Phe Ser Glu Ile Thr Val Phe Val

            100                 105                 110

Thr His Cys Tyr Ser Ser Gly Ser Trp Ser Cys Pro Ile Thr Gly Met

        115                 120                 125

Ile Pro Gln Gly His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Asn Gly Ser Leu

    130                 135                 140

Phe Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Pro Asn Phe Lys Ser

145                 150                 155                 160

Phe Gln Cys Val Asn Asn Phe Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu

                165                 170                 175

Val Phe Thr Ser Asn Ala Thr Thr Gly Val Lys Ser Ala Gly Val Tyr

            180                 185                 190

Phe Lys Ala Gly Gly Pro Val Asn Tyr Asn Ile Met Lys Glu Phe Lys

        195                 200                 205

Val Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Val Arg Asp Val Ile Leu Cys

    210                 215                 220

Asp Asp Thr Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Asn Gly Asn

225                 230                 235                 240

Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Ser Ser Leu Val Lys Glu

                245                 250                 255

Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Asn Ser Val Asn Thr Thr Leu Thr Leu

            260                 265                 270

Thr Asn Tyr Thr Phe Tyr Asn Val Ala Asn Ala Ser Pro Asn Arg Gly

        275                 280                 285

Gly Val Gln Ser Ile Pro Thr Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly

    290                 295                 300

Tyr Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Ser Phe Val Tyr Lys Glu

305                 310                 315                 320

Ser Asn Tyr Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Ala Cys Asn Phe Arg Leu

                325                 330                 335

Glu Thr Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu

            340                 345                 350

Ala Tyr Gly Pro Phe Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Ser

        355                 360                 365

Arg Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Asn Gly Pro Arg Ala Cys

    370                 375                 380

Lys Gly Val Tyr Ala Gly Glu Leu Leu Gln Asn Phe Glu Cys Gly Leu

385                 390                 395                 400

Leu Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Ala Thr

                405                 410                 415

Val Pro Pro Val Val Thr Gln His Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asn

            420                 425                 430

Thr Cys Val Asp Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Arg Gly Phe Ile

        435                 440                 445

Thr Asn Val Thr Asp Ser Ser Ser Ser Tyr Asn Tyr Leu Ala Asp Ala

    450                 455                 460

Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Ile Phe Val Val

465                 470                 475                 480

Gln Gly Glu His Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp

                485                 490                 495

Val Asn His Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Lys Leu Val Gly Ile Leu

            500                 505                 510

Thr Ser Arg Asn Ala Thr Gly Ser Gln Pro Leu Glu Asn Gln Phe Tyr

        515                 520                 525

Ile Lys Leu Thr Lys Glu Thr Arg Arg Phe Arg Arg

    530                 535                 540

<210>2

<211>1620

<212>DNA

<213>Infectious bronchitis virus

<400>2

atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg  60

tttgattctg ctaataatta tgtgtactac taccaaaatg cctttaggcc tccaaatgga 120

tggcatttgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaattatac taataatgca 180

ggttctgtaa atgagtgcac tattggtgtt attaaggacg tctataatta tagtgcggct 240

gctatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300

gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac attgttatag tagcggtagt 360

tggtcttgtc ctataacagg catgattcca cagggtcata ttcgcatttc tgcaatgaaa 420

aatggctctt tattttataa tttaacagtt agcgtgtcta aataccctaa ttttaaatcg 480

tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttct 540

aacgcaacta ctggtgttaa gtcagcaggt gtgtatttta aggcaggtgg acctgtaaat 600

tataatatta tgaaagaatt taaggttctg gcttattttg tcaatggtac tgtgcgagat 660

gtaattctgt gtgatgacac accgagaggc ttgcttgcat gtcaatataa taatggtaat 720

ttttcagatg ggttttaccc ttttactaat tctagtttag ttaaggaaaa gtttattgtt 780

tatcgtgaga atagtgttaa tactactctt actttaacta actatacttt ttataatgtg 840

gctaatgcct cgcctaatcg aggtggtgtt cagtctattc caacttatca aacacaaaca 900

gctcagagtg gttattataa ttttaattta tcatttctga gtagttttgt gtataaagag 960

tctaattaca tgtatgggtc ttaccaccct gcatgtaatt ttagattaga aactattaat 1020

aatggcttgt ggtttaattc attgtcagtt tcgcttgctt atggaccatt tcaaggtggg 1080

tgtaagcagt cggtttttag tagtagagcc acttgttgtt atgcttattc atataatggt 1140

cctcgcgcat gtaagggtgt ttacgcaggc gagttactac aaaattttga atgtggactg 1200

ttggtttatg ttactaagag cgatggctct cgtatacaaa cagccaccgt tccaccagtt 1260

gtaactcaac acaattataa taatattact ttaaatactt gtgttgatta taatatatat 1320

ggcagagttg gtcgaggttt tattactaat gtaactgact catcatctag ttataattat 1380

ttagcagatg cagggttggc tattttagat acatcaggtg ccatagacat ctttgttgta 1440

caaggtgaac atggtcttaa ttattacaag gttaatccct gtgaagatgt aaaccaccag 1500

tttgtagttt ctggtggtaa attagtaggt attcttacct cacgtaatgc aacaggttct 1560

cagcctcttg agaatcaatt ttacattaaa ctcactaaag agacacgtcg ttttagacgt 1620

Claims (8)

1、传染性支气管炎弱毒疫苗株LDT3-A株，其微生物保藏号是CGMCC-2902。

2、一种多肽，序列为SEQ ID NO：1所示。

3、编码权利要求2所述多肽的核苷酸序列，其特征在于所述序列为SEQ ID NO：2所示。

4、一种传染性支气管炎弱毒疫苗株，其特征在于：所述疫苗株所具有的S1基因编码多肽序列为SEQ ID NO：1所示。

5、根据权利要求4所述的弱毒疫苗株，其特征在于：所述疫苗株所具有的S基因序列与SEQ ID NO：2具有95％的同源性。

6、根据权利要求4所述的弱毒疫苗株，其特征在于所述弱毒疫苗株S1基因核苷酸序列为SEQ ID NO：2编码。

7、一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，由权利要求1、4、5和6中任何一项的弱毒疫苗株和药学上可接受的冻干保护剂组成。

8、权利要求1、4、5和6中任何一项的弱毒疫苗株在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的用途。

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