CN1763085A

CN1763085A - 鸡传染性支气管炎病毒s1重组蛋白抗原、制备方法及用途

Info

Publication number: CN1763085A
Application number: CN 200510061375
Authority: CN
Inventors: 周继勇; 吴建祥; 胡金强; 张德勇
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2006-04-26

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原、制备方法及其用途。这些核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1～3所示。本发明提供了含有编码3种截短S1蛋白的原核表达方法，分别能够表达三株IBV(ZJ971株，M41株，J株)S1蛋白氨基端288bp或309bp部分片段，提供了三株IBV S1蛋白表达产物的纯化方法。用IBV阳性血清检测，表达的部分S1蛋白具有很好的抗原反应性，可作为诊断抗原应用于琼脂扩散诊断技术，酶联免疫吸附试验，免疫荧光检测，免疫组织化学检测等检测IBV感染或免疫产生的抗体。此外，表达的部分S1蛋白还可进一步制备单克隆抗体、多克隆抗体利用ELISA等实验方法来检测IBV抗原的存在或配以适当疫苗佐剂制备亚单位疫苗。

Description

鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原、制备方法及其用途。

背景技术

传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(infectiou bronchitis virus，IBV)引起的家禽的一种急性，高度接触性传染病，传染性支气管病毒为单链正义，不分节段的RNA病毒，是当前危害世界养禽业的主要病原之一。自1931年在美国被发现以来，分离到的传染性支气管病毒已达100多株，30多种血清型，而且它们在组织嗜性、毒力等方面存在较大的差异，给诊断和预防该病带来极大的难度。目前，防制该病的主要措施就是应用灭活疫苗和减毒活疫苗对鸡群进行免疫接种。实践表明，这三种疫苗都在一定程度上存在着不足，原因是传支病毒血清型众多且各血清型间缺乏或仅有较弱的交叉保护，用此三类疫苗只能针对一种血清型，不能有效的控制该病的发生和流行。再加上灭活疫苗的免疫效果不佳，致弱苗容易散毒且可能与野毒发生基因重组而产生新的变异株，因而存在着潜在的危险性。核酸疫苗的研究还刚刚起步，在短期内不可能推广应用，而且其免疫效果和安全性还有待于进一步的深入研究。因而，建立特异敏感的诊断方法及研制开发有效基因工程亚单位蛋白疫苗预防该病显得十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原、制备方法及其用途。

鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原：IBV核糖核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得截短IBV S1核苷酸序列，并克隆于大肠杆菌原核表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌BL21宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTA Argarose纯化，获得截短表达的IBVS1蛋白抗原；

所述的IBV S1核苷酸序列具有SEQ ID No.1～3所示的核苷酸序列；

鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原的制备方法的步骤如下：

1)分别以IBV ZJ971株或M41株或J株的核糖核酸为模板，分别以pIBV-ZJ971-S1D：5’-GGAATTCGTTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；pIBV-ZJ971-S1D：5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；或pIBV-M41-S1D：5’-GGGATCCGCTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；pIBV-M41-S1D：5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；或pIBV-J-S1D：5’-GGGATCCAATTTGTTTGATTCTGATAAT-3’；pIBV-J-S1D：5’-GAAGCTTTTAACAATGTGTAGCAAACAC-3’；为引物，通过反转录聚合酶链式反应方法扩增分别获得三株IBV截短的S1核苷酸序列；

2)将上述三株IBV截短S1核苷酸序列分别插入到原核表达载体pET-28a，分别获得含有三株IBV截短的S1核苷酸序列的重组原核表达载体；

3)将含上述三株IBV截短的S1核苷酸序列的重组载体分别转化宿主细胞BL21(DE3)，并用IPTG诱导表达；

4)诱导表达的蛋白分别经Ni-NTA Argarose纯化得到纯的三株IBV截短表达S1蛋白抗原。

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原应用于酶联免疫吸附试验检测IBV感染产生的抗体或者用于制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗。

本发明的优点：

1)经用IBV阳性血清检测，表达的三种截短的IBV S1蛋白均具有良好的抗原反应性，可作为诊断抗原应用于琼扩诊断技术，酶联免疫吸附试验，免疫荧光检测，免疫组织化学和免疫印迹等检测IBV感染后产生的抗体。此外，这三种截短的IBV S1蛋白还可用于制备单克隆抗体或多克隆抗体以检测IBV抗原的存在以及配以适当疫苗佐剂制备基因工程亚单位蛋白疫苗；

2)国内对于IBV诊断和流行病学调查多采用传统的血凝实验，血凝抑制实验，琼脂扩散实验以及PCR、RFLP等方法等对病原进行检测。这些方法有的耗时耗力，有的容易造成假阳性结果，所以用ELISA对IBV病原和血清中抗体进行检测具有上述实验方法不可替代的优势；

3)S1蛋白是IBV主要的宿主保护性抗原，具有很强的免疫原性。通过软件预测得知，S1蛋白的抗原表位和亲水区域主要位于S1蛋白基因的氨基末端，尤其是S1基因信号肽后的288bp和309bp的区域。本发明在此方面取得了进步；

4)此三种重组蛋白具有显著的抗原反应性，通过PCR技术从以前构建好的重组载体上拉出288bp和309bp目的序列，利用原核表达载体pET-28a克隆并表达了三株IBV部分S1基因，并通过鸡IBV阳性血清的间接ELISA，证实了重组蛋白的抗原反应性；

5)此三种重组蛋白具有良好的免疫原性。利用原核表达系统表达的三株IBV部分S1蛋白经纯化后制备鼠源单克隆抗体，将此单克隆抗体和IBV混合接种9～11日龄鸡胚，多数鸡胚未发生病变和死亡，进一步证明了所表达的重组S1部分蛋白具有较强的免疫原性。

附图说明

图1ZJ971 S1288表达载体构建图，S1288代表插入到载体pET-28a中的ZJ971 S1288基因；

图2M41 S1288表达载体构建图，S1288代表插入到载体pET-28a中的J S1288基因；

图3 J S1309表达载体构建图，S1309代表插入到载体pET-28a中的J S1309基因；

图4重组质粒pET-ZJ971-S1288的PCR和双酶切鉴定图；

图5重组质粒pET-M41-S1288的PCR和双酶切鉴定图；

图6重组质粒pET-J-S1309的PCR和双酶切鉴定图；

图7 ZJ971S1288蛋白SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)及Western-blotting(蛋白印迹)。ohr代表没有加入诱导剂IPTG所取的样品。1hr，2hr，3hr，4hr分别代表加入诱导剂后1，2，3，4小时所取样品。蛋白印迹所用的一抗为鼠源抗His的单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体。HRP的显色底物为TMB.；

图8 M41 S1288 SDS-PAGE(蛋白聚丙烯凝胶电泳)及Western-blotting(蛋白印迹)。ohr代表没有加入诱导剂IPTG所取的样品。1hr，2hr，3hr，4hr分别代表加入诱导剂后1，2，3，4小时所取样品。蛋白印迹所用的一抗为鼠源抗His的单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体。HRP的显色底物为TMB.；

图9J S1309 SDS-PAGE(蛋白聚丙烯凝胶电泳)及Western-blotting(蛋白印迹)。ohr代表没有加入诱导剂IPTG所取的样品。1hr，2hr，3hr，4hr分别代表加入诱导剂后1，2，3，4小时所取样品。蛋白印迹所用的一抗为鼠源抗His的单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体。HRP的显色底物为TMB。

具体实施方式：

截短表达的三株鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原，利用原核表达系统表达了三株IBVS1蛋白基因氨基端288bp、309bp部分，S1基因前的信号肽序列以及部分羧基端被去除，只保留靠近氨基端的288bp和309bp部分，并在大肠杆菌中得到表达。

截短表达的三株鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的用途：该三种截短的重组S1蛋白抗原可应用于琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验，免疫荧光检测、免疫组织化学、免疫印迹等检测IBV感染后产生的抗体；截短表达的三株鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原可用于制备鼠源单克隆抗体或其他动物来源的多克隆抗体，应用血凝抑制实验等来检测IBV抗原的存在；截短表达的三株鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原可用于制备预防IBV的发生和流行的亚单位蛋白疫苗。

实施例1

IBV S1蛋白抗原的截短表达与纯化过程；

一、IBV ZJ971(M41、J)培养及RNA的提取

取ZJ971(M41、J)株种毒经尿囊腔途径接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃温箱孵育，收集24h-72h之间鸡胚尿囊液，粗离后去除杂质，上清用30％PEG6000(含7.85％NaCl)沉淀，沉淀再用TEN(pH8.0)悬浮，RNA提取按Trizol试剂盒说明书进行；提取的RNA用于RT-PCR。

二、ZJ971-S1D(M41-S1D、J-S1D)基因的RT-PCR

1、IBV ZJ971(M41、J)反转录

取上述病毒RNA，加入12μmol/L的IBV ZJ971-S1D(M41-S1D、J-S1D)下游引物1μl，置70℃孵育5分钟，取出置冰上；然后加入5×reaction buffer 4μl、20U/μl Rnasin 1μl、10mM dNTPs2μl，混匀后置37℃孵育5分钟，取出置冰上；再加入200U/μlAMV-Rnase 1μl，混匀后置42℃孵育1小时。最后置70℃水浴10分钟灭活AMV-Rnase，取出后立即用于PCR。

2、ZJ971-S1D(M41-S1D、J-S1D)基因的PCR

PCR反应体系(25μl体系)：

10×PCR Buffer： 2.5μl

dNTPs Mixture： 0.5μl

上游引物： 0.5μl

下游引物： 0.5μl

cDNA模板： 2ul

ddH₂O： 19μl

PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃25s，45℃25s、72℃45，进行30个循环，最后72℃延伸10min结束。

pIBV-ZJ971-S1D(P1)：5’-GGAATTCGTITTGTATGACAGTAGTTCT-3’

pIBV-ZJ971-S1D(P2)：5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’

pIBV-M41-S1D(P3)：5’-GGGATCCGCTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’

pIBV-M41-S1D(P4)：5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’

pIBV-J-S1D(P5)：5’-GGGATCCAATTTGTITGATTCTGATAAT-3’

pIBV-J-S1D(P6)：5’-GAAGCTTTTAACAATGTGTAGCAAACAC-3’

三、pET-ZJ971-S1D(pET-M41-S1D、pET-J-S1D)表达载体的构建

1.PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pMD18-T载体，连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，挑取单克隆，进行PCR鉴定。

2.以PCR鉴定正确的阳性克隆再进行PCR扩增，PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化后，经EcoR I(BamH I)、Hind III双酶切，回收目的片段并亚克隆于表达质粒pET-28a的EcoR I(BamH I)+Hind III酶切位点之间，构建重组表达质粒pET-ZJ971-S1D(pET-M41-S1D、pET-J-S1D)，转化感受态宿主菌TOP10，抽取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。

四、IBV S1蛋白抗原基因的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆接种到含Kan抗性LB液体培养基中，37℃培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于含Kan抗性的液体LB培养基中，250rpm/min振荡培养2小时左右，使OD600≈0.5，再按1∶100的比例加入终浓度为1mMIPTG诱导表达4小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液，采用15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，考马斯亮兰染色，观察结果。结果在带有pET-28a质粒的细菌经诱导后表达了约14kD的融合蛋白。而对照细菌没有相应的条带。薄层扫描分析，该蛋白可占菌体蛋白总量的20-25％。

五、重组蛋白的测定

Western-blotting分析：表达蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NC)上，用含有5％(w/v)脱脂奶粉的PBS(PH＝7.4)37℃温育1-2小时封闭NC膜；然后加入用5％脱脂奶粉稀释的抗His鼠源单克隆抗体于37℃温育1小时；PBST洗涤膜3次后，再加入用含5％(w/v)脱脂奶粉稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗于37℃温育1小时；PBST洗涤膜3次后，加入TMB显色液进行显色，结果能观察到特异性的反应条带。

截短表达的三株鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原，利用原核表达系统克隆表达了三株禽传染性支气管炎S1蛋白基因氨基端288bp和309bp部分，表达产物经纯化后用作诊断IBV感染的抗原，S1基因信号肽序列和部分羧基端去除，只保留了位于信号肽序列后的近氨基端部分S1基因，并在大肠杆菌中表达。

六、重组蛋白的纯化

按已经优化的表达条件，表达IBV-ZJ971-S1D(IBV-M41-S1D、IBV-J-S1D)菌液100ml，收获菌液4℃，以8000rpm/min，离心20min，菌体沉淀用裂解液Buffer B(pH8.0)重悬，超声波处理40次，冰上放置10分钟，然后转入细胞培养瓶中振摇1.5小时，然后4℃，10000rpm，离心15min，弃沉淀保留上清。将上清过装有1mL琼脂糖填料的Ni-NTA Argarose纯化柱中，依次用洗涤液Buffer C(pH6.3)、洗脱液Buffer D(pH5.9)和Buffer E(pH4.5)，分别收集用洗脱液洗下来的样品D1、D2、D3、D4和E1、E2、E3、E4然后进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析表明，目的蛋白在洗脱下来的E1～E4中，其中以E2和E3中的含量最高。

实施例2

截短表达的三株鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白作为诊断抗原具体过程：

将重组菌诱导大量表达后，离心收集菌体用裂解液Buffer B(pH8.0)重悬沉淀，超声波破碎后离心，上清用Ni-NTA Argarose柱纯化，用此纯化的表达产物用PH8.5 Tris-Cl包被缓冲液稀释后包被酶标反应板，先在37℃孵育2小时，然后在4℃吸附16～18小时。PBST洗涤3次，每次10分钟。用含5％脱脂奶粉的PBST封闭2小时，同上洗涤。将待测IBV阳性血清和SPF鸡的阴性血清分别用PBS作2倍倍比连续稀释后加入孔中，在37℃作用1小时，同上洗涤。用辣根过氧化物标记的羊抗鸡IgG的二抗(1∶3000)加入各孔中，作用1小时，同上洗涤。然后加入用底物缓冲溶液稀释的TMB，显色10～15分钟。最后每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应。酶标检测仪在450nm波长下读取各孔的光密度值，P/N比值＞2.1判为阳性。结果重组表达的蛋白可与待检鸡阳性血清发生反应，但与阴性血清不反应。本项发明可取代IBV全病毒用于检测IBV感染以及IBV疫苗免疫所产生的抗体水平。

实施例3

三种截短的重组S1蛋白抗原具有较强的免疫原性，可制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗：

利用此三种截短的重组S1蛋白抗原制备的鼠源单抗和IBV共同接种9～11日龄的SPF鸡胚，同时设单独接种IBV实验对照组，每组6枚鸡胚，结果接种有鼠源单克隆抗体组中有4枚得到了有效保护，而实验对照组的鸡胚发生传染性支气管炎特征性的病变或死亡，有力地证实了所表达的重组蛋白抗原具有较强的免疫原性，能产生中和IBV感染的中和抗体，从而可用截短的重组S1蛋白抗原可制备IBV的基因工程亚单位蛋白疫苗。

序列表

(1)SEQ ID NO.1的信息：

(a)序列特征：

长度：288个碱基

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)最初来源：鸡传染性支气管炎病毒

(d)序列描述：SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.1

GTTTTGTATGACAGTAGTTCTTACGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTCAGACCACCTGATGATTGGCATTTACATGGGGG

TGCGTATGCGGTTGTTAATATTTCTAGTGAATCTAATAATGCAGGCTCTTCATCTGGGTGTACTGTTGGTATTATTGATG

GTGGTCGTGTTGTTAATGCTTCTTCTATAGCTATGACGGCACCGTCATCAGGTATGGCTTGGTCTAGCAGTCAGTTTTGT

ACTGCATACTGTAACTTTTCAGATACTACAGTGTTTGTTACACATTGT

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(a)序列特征：

长度：288个碱基

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)最初来源：鸡传染性支气管炎病毒

(d)序列描述：SEQ ID NO.2：

SEQ ID NO.2

GCTTTGTATGACAGTAGTTCTTACGTTTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGACCACCTAATGGTTGGCATTTACACGGGGG

TGCTTATGCGGTAGTTAATATTTCTAGCGAATCTAATAATGCAGGCTCTTCACCTGGGTGTATTGTTGGTACTATTCATG

ACTGCACACTGTAACTTTTCAGATACTACAGTGTTTGTTACACATTGT

(3)SEQ ID NO.3的信息：

(a)序列特征：

长度：309个碱基

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)最初来源：鸡传染性支气管炎病毒

(d)序列描述：SEQ ID NO.3：

SEQ ID NO.3

AATTTGTTTGATTCTGATAATTATGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGACCACCAAATGGATGGCATTTGCATGGGGG

TGCTTATGCAGTAGTGAATTCTACTACTAAAACTAACAATGCAGGCGACGCTGCCGAGTGTTCTGTAGGTGTTCTTTTTA

ATTATACTAACGGAAAAGACGTTGGTTATAATAATAATGCTTCTTCCGTAGCCATGACAGCACCGTTGTCTGGTATGTCT

TGGTCTAAATCAGAATTTTGTACTGCCCACTGTAACTTTTCGGATTTTACAGTGTTTGCTACACATTGT

(4)SEQ ID No.4的信息：

(a)序列特征：

长度：96个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

(b)分子类型：多肽

(c)序列描述：SEQ ID No.4：

SEQ ID NO.4

VLYDSSSYVYYYQSAFRPPDDWHLHGGAYAVVNISSESNNAGSSSGCTVGIIDGGRVVNASSIAMTAPSSGMAWSSSQFC

TAYCNFSDTTVFVTHC

(5)SEQ ID No.5的信息：

(a)序列特征：

长度：96个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

(b)分子类型：多肽

(c)序列描述：SEQ ID No.5：

SEQ ID NO.5

ALYDSSSYVYYYQSAFRPPNGWHLHGGAYAVVNISSESNNAGSSPGCIVGTIHGGRVVNASSIAMTAPSSGMAWSSSQFC

TAHCNFSDTTVFVTHC

(6)SEQ ID No.6的信息：

(a)序列特征：

长度：96个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

(b)分子类型：多肽

(c)序列描述：SEQ ID No.6：

SEQ ID NO.6

NLFDSDNYVYYYQSAFRPPNGWHLHGGAYAVVNSTTKTNNAGDAAECSVGVLFNYTNGKDVGYNNNASSVAMTAPLSGMS

WSKSEFCTAHCNFSDFTVFATHC

Claims

1.一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原、其特征在于：IBV核糖核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得截短IBV S1核苷酸序列，并克隆于大肠杆菌原核表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌BL21宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTA Argarose纯化，获得截短表达的IBV S1蛋白抗原。

2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原，其特征在于：所述的IBV S1核苷酸序列具有SEQ ID No.1～3所示的核苷酸序列，并分别编码具有SEQ IDNo.1～3所示的多肽序列。

3.一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，方法的步骤如下：

1)分别以IBV ZJ971株或M41株或J株的核糖核酸为模板，分别以

pIBV-ZJ971-S1D：5’-GGAATTCGTTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；

pIBV-ZJ971-S1D：5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；

或pIBV-M41-S1D：5’-GGGATCCGCTTTGTATGACAGTAGTTCT-3’；

pIBV-M41-S1D：5’-GCCAAGCTTTTAACAATGTGTAACAAACAC-3’；

或pIBV-J-S1D：5’-GGGATCCAATTTGTTTGATTCTGATAAT-3’；

pIBV-J-S1D：5’-GAAGCTTTTAACAATGTGTAGCAAACAC-3’；为引物，通过反转录聚合酶链式反应方法扩增分别获得三株IBV截短的S1核苷酸序列；

4.一种鸡传染性支气管炎病毒S1重组蛋白抗原的用途，其特征在于，鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原应用于酶联免疫吸附试验检测IBV感染产生的抗体或者用于制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗。