CN1438896A - 含有一种蜱粘合蛋白的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到蜱粘合蛋白在疫苗生产中的用途，该疫苗用于保护动物免受吸血性外寄生虫的叮咬并且对抗由该寄生虫造成的病毒、细菌和其它病原体的传播。当被用作为疫苗成分时，本发明的蜱粘合蛋白带来了对抗多种外寄生虫的广泛的交叉反应性。

Description

含有一种蜱粘合蛋白的疫苗
本发明涉及到一种蜱粘合蛋白在疫苗生产中的应用，该疫苗用于保护动物免受吸血体外寄生虫的叮咬并且免于由这些体外寄生虫进行的病毒、细菌及其它病原体的传播。
吸血体外寄生虫，例如蚊子和蜱，是疾病的极端高效的传染者。例如，蜱R.appenddiculatus为在亚撒哈拉(sub-saharan)地区发展畜牧的一个主要障碍，它传播原生类寄生虫Theileria parva，该寄生虫导致通常致死的东海岸热。该疾病通常被认为是牛类最主要的疾病(Norval et al.，1992a；Norval et al.，1992b)。这种蜱还是导致内罗毕绵羊病(Nairobi sheep disease)，该疾病在绵羊和山羊中是一种致残并且经常致死的疾病(Davies，1998)。进一步，R.appenddiculatus以及其它蜱害虫还可对动物皮肤造成严重损坏，由此而影响了皮革业。
在传统上，用于控制蜱种群的工艺使用了以诸如acaracide这样的化学物质进行的动物治疗。这一策略已经导致了抗性蜱的形成，这表明必须引入新种类的化学物质。进一步，该化学物几乎不具有残留效能，这说明它们必须经常被应用。第二种方法是培育抗蜱动物，但是其所产生的抵抗力程度远不理想。
在对抗寄生虫传播疾病的努力中已经进行了大量尝试以使用完整蜱抽提物或者蜱消化道来对动物进行抗蜱的免疫。一些特定的报道使用了重组蜱蛋白(例见，国际专利申请WO88/03929)。但是，尽管有了这样的进展，唯一的商业化蜱疫苗仅仅在对抗成体期的B.microlus才具有作用而且还根据该物种的地理分布而在效能上有所变化。
尚未开发出能够提供对蜱动物的整个种群具有抗性或者对其生活史各个阶段的寄生虫具有抗性的疫苗。因此对于抵抗由吸血外寄生虫传播的疾病的疫苗具有巨大的需求。令人惊奇的是，现在已经发现蜱粘合(cement)蛋白可用作疫苗成分。
发明概述
根据本发明，在此提供了一种疫苗组合物，该组合物含有一种免疫原性的蜱粘合蛋白、该蛋白的一个片段或者或其功能等价物，它们与一种药学上可接受的赋形剂结合。在此证明以这样的疫苗对动物的免疫导致了抗体的产生，该抗体有效地对抗多种外寄生虫物种。
在世界的多个部分存在着大量的外寄生虫物种，尽管它们的影响范围倾向于集中在热带和亚热带地区，在那里它们以及它们所携带的疾病是地方性的疾病。这些物种的类型变化巨大并且广泛地适应于各异的进食策略，从短时的进食者如蚊子、马蝇、采采蝇、跳蚤、虱以及螨，一直到可能长期进食的水蛭和蜱。所有这些外寄生虫物种是本发明疾苗的合适的目标。
本发明的疫苗特别有效于对抗蜱物种。靶蜱物种的例子为
               Rhipicephalus appendiculatus，R.sanguineus，R.bursa，Amblyomma variegatum，A.americanum，A. cajennense，A.hebraeum，Boophilusmicroplus，B.annulatus，B.decoloratus，Dermacentor reticulatus，D.andersoni，D.marginatus，D.variabilis，Haemaphysalis inermis，Ha.leachii，Ha.punctata，Hyalommaanatolicum anatolicum，Hy.dromedarii，Hy.marginatum margiatum，Ixodes ricinus，I.persulcatus，I.scapularis，I.hexagonus，Argas persicus，A.reflexus，Ornithodoroserraticus，O.moubata moubata，O.m.porcinus，和O.savignyi.
上述外寄生虫物种中的共同点是它们吸食血液、淋巴液或者它们食用宿主的皮肤产物，这意味着任何存在于宿主中的抗体被自动内化进入外寄生虫。这为抗体的给药提供了一种有利的并且自动化的路线，并且如果该抗体对抗一种外寄生虫的蛋白质，这意味着一种组织良好的免疫方案可导致该寄生虫在相关区域的完全消除。食血外寄生虫是本发明的疫苗的特别优选的目标。
本发明者已经发现多种不同的蜱粘合蛋白，并且已经在多种情况下克隆出了它们的编码基因。例如，国际专利申请PCT/GB98/03397描述了多种组织粘合蛋白的分离并且讨论了它们在医药上作为组织粘合成分对于皮肤手术以及创伤愈合的应用以及应用于人类或者动物组织之间或者同其它生物材料的暂时或者永久连接，其内容在此全部引为参考。
Ixodid(硬)蜱为吸血寄生虫，它们通过一种“粘合锥”将自身附着于一种脊椎动物宿主之上，该粘合锥源于蜱唾液腺的II型和III型腺泡(Kemp et al.，1982；Walker et al.，1985)。
形成该锥的粘质(cement)为一种乳白色的分泌物，该分泌物被注射入这些寄生虫所吸食处的动物的皮肤。该粘质含有大量的相互作用的蛋白质和碳水化合物成分。该粘质被喷入该叮咬位点以及皮肤之上，并且在变硬之后确保该口器在进食期间保持牢固地锚定于该宿主，在典型的情况下这要持续4到8天。该粘合锥还可作为一种在进食期间防止液体从叮咬位点渗漏的密封垫而发挥作用。
蜱粘合锥为一种分层结构，由两个主要类型的粘合物组成。第一类粘质在建立叮咬位点后仅仅几分钟内产生并且迅速硬化以形成该锥的坚硬“核心”。第二类粘质较迟分泌，约在附着后几个小时后进行，并且较为缓慢地硬化以形成一种较有弹性的“外层”。在成体蜱体内，粘质的产生在典型的情况下持续直至附着后的第3到第4天(Kempetal.，1982；Sonnenshine et al.，1991)。
蜱粘质的成分在不同的硬蜱种类中显得互相类似。例如，已经表明一种针对褐耳蜱(brown ear tick)Rhipicephalus appendiculatus的90kD唾液蛋白的抗血清能够识别来自于美洲狗蜱(American dogtick)Dermacenter variabilis、孤星蜱(lone star tick)Amblyommaamericanum、褐狗蜱(Brown dog tick)R.sanguineus的唾液腺的多肽(Jaworski et al.，1992)。
未纯化的粘合成分在此之前已经作为宿主抗性的诱导剂而进行了测试(Brown et al.，1986；Shapiro et al.，1989)，但未能产生基于这些蛋白质的可靠的疫苗。在某种意义上，这并非意外，因为序列关系表明粘合蛋白经设计而模拟了宿主的皮肤蛋白，其最有可能的目的在于避免皮肤通过宿主的自然免疫防御机制进行对蜱附着的排斥。特定的蜱蛋白同其周围的组织在组成上的近似还可以辅助该粘合锥同周围的皮肤组织紧密的结合。
适于引入本发明的疫苗的蜱粘合蛋白可来自于任何适宜的蜱物种，例如Rhipicephalus appendiculatus、I.ricinus、Dermacenterreticulatus、Dermacenter variabilis、Amblyomma americanum、Rhipicephalus sanguineus、Amblyomma variegatum、Boophilusmicroplus以及Haemaphysalis leachii。在一个优选的实施方案中，该蜱粘合蛋白来自于蜱R.appendiculatus。
包括于本发明的疫苗中的特别适宜的蜱粘合蛋白的实施例包括在此给出并且同样在专利申请PCT/GB98/03397中给出。这些粘合蛋白质包括被称为克隆21、克隆33、CemA、克隆24、克隆68、克隆64以及克隆I的蛋白质。这些蛋白质的预测氨基酸序列在本文的图1中标示。
在优选的情况下，本发明的疫苗组合物中所使用的蜱粘合蛋白、其片段或者功能等价物应当含有一种免疫原性表位，该表位存在于除了该免疫原性粘合蛋白、其片段或者功能等价物所出自的蜱之外的吸血外寄生虫物种的一种或者多种定向进化同源蛋白质(orthologousprotein)之中。这将意味着一种单疫苗组合物可能有效地作为对抗产生含有常见表位的蛋白质的外寄生虫物种的广谱疫苗。例如，在特定的地区，多种不同的蜱物种是地方性的并且对于畜牧业导致了严重的害虫问题。一种有效对抗多种不同的蜱的单疫苗的存在将降低接种疫苗的费用并且由此而相对现存的疫苗具有优势。
本发明的这一方面的疫苗由此而特别具有优势，这是由于刺激了一种炎症反应，该反应将增强被接种动物的免疫状态并且还将靶向于隐蔽的抗原，由此导致了对蜱自身的损害。
根据本发明的一个方面，已经发现了特定的蜱粘合蛋白及其片段，该蛋白或片段含有同样存在于外寄生虫的消化道和血淋巴的蛋白中的表位。这一交叉反应性使得本发明的这一实施方案特别有利，这是因为血液的食入以及由此导致的抗体进入该外寄生虫确保了该活性试剂向该寄生虫的递送。通过这样的方式本发明的疫苗靶向于短时吸食的物种，例如蚊子和马蝇，其效率等同靶向于诸如蜱这样的保持长期附着于宿主的物种的效率。
包含于本发明的疫苗的一种特别优选的蛋白质为克隆64蛋白质(后文称64P)、其片段或者其功能等价物，例如分离自除R.appendiculatus之外的物种的蛋白质。这种蛋白质具有结构蛋白质的典型序列并且表现得可被分泌入蜱的唾液中。这种含有粘合蛋白的前40个氨基酸的序列很类似于胶原蛋白，而剩余的序列类似于角蛋白。对该蛋白质序列的同源性研究表明，对于小鼠表皮角蛋白I亚基，所有在Genbank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中检索到的序列的同源性的最高水平为51％。
该蛋白质富含甘氨酸并且含有几个重复的基序(C/S)1-4(Y/F)，这类似于来自果蝇的结构蛋白(表皮蛋白)和其它的昆虫卵的外壳以及脊椎动物细胞角蛋白，包括哺乳类角蛋白复合体2基础蛋白(mammalian keratin 2 basic protein)、小鼠角蛋白、人类角蛋白、IVα型胶原以及IPIB2前体。
在本发明的一个实施方案中，蜱蛋白质的功能等价物可包括于该疫苗组合物中。术语“功能等价物”在此用来描述一些蛋白质，这些蛋白质具有与名为克隆21、克隆33、CemA、克隆24、克隆68、克隆64和克隆I的粘合蛋白类似的功能。功能等价物蛋白可与这些蛋白质属于相同的蛋白家族。蛋白家族指的是一组多肽，这些多肽具有相同的功能并在存在于这些多肽序列的基序之间表现出相同的序列同源性。
“序列同源性”指的是这些多肽序列由于分化自同一种祖先分子而具有相关性。特别地，本文所鉴定的蛋白质或者部分蛋白质具有相同的特定序列，这些序列在该蛋白质的序列中重复数次。在优选的情况下，相同蛋白质家族中的多肽序列之间的同源性占该蛋白质的全部氨基酸序列的至少30％。更优选的情况下，该同源性占蛋白质的全部氨基酸序列的至少50％、至少60％或者至少70％。更为优选的情况下，该同源性高于蛋白质的全部氨基酸序列的80％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％。
“类似功能”首先指的是该蛋白至少在同其它粘合蛋白一起存在的情况下保持了形成一种粘质的能力。这样的蛋白同其它的必需粘质成分在一起将由此而能够在一段时间内硬化以形成一种固体团块或者胶质。其次，该术语可指一些蛋白，这些蛋白在结构上类似于粘合蛋白并且由此而具有类似或者相同的表位。
组织粘合蛋白的功能类似物包括一些突变体，该突变体在保持免疫原性的情况下含有从野生型序列中进行的氨基酸取代、插入或者删除。相比野生型蛋白序列而具有改善的免疫原性的功能等价物可通过在蛋白质序列中的特定残基进行系统突变或者定向突变来进行设计。
功能等价物包括一些蛋白质，这些蛋白质含有对该蛋白质的功能或者活性没有不良影响的保守氨基酸取代。这一术语还应包括天然生物变体(例如，产生组织粘合蛋白的种内的等位基团变体或者地理变异)。
根据本发明，蜱粘合蛋白的片段也可被视为该疫苗组合物所包含的适宜的组分。例如，来自蜱粘合蛋白的免疫原性部分的短链肽在作为免疫原时特别有用。这样的短链多肽序列便于通过人工合成或者重组手段大量生产。蛋白片段在许多情况下被优选地用于本发明的疫苗中，这是由于这些片段有可能折叠成为全长野生型序列所不适合的构象。由于一些粘合蛋白很可能进化以模拟宿主皮肤的组织并且由此而避免了激活针对该蜱的宿主免疫反应，蜱粘合蛋白的这种非天然的形式有可能在本发明的疫苗中特别有用。
可用于包含入本发明的疫苗的蜱粘合蛋白片段的例子包括64P蛋白的多种片段，这些片段由本发明者通过重组手段产生，还包括这些片段的功能等价物，例如上述种类的同源物或者突变体。正如懂技术的读者所理解，同在此明确披露的片段相类似的片段也可从除R.appendiculatus之外的外寄生虫物种中制备。
本文所披露的R.appendiculatus片段的细节如下。
名为64trp1的片段为该64P蛋白的一种小的C-末端片段，该片段由29个氨基酸组成，经过克隆成为分子量约30kD的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/组氨酸标记融合蛋白。
名为64trp2的片段指的是该64P蛋白的一种小的N-末端片段，该片段由51个氨基酸组成，经过克隆成为分子量约33kD的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/组氨酸标记融合蛋白。
名为64trp3的片段指的是该64P蛋白的较大的N-末端片段，该片段由70个氨基酸组成，经过克隆成为分子量约36kD的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/组氨酸标记融合蛋白。
名为64trp6的片段指的是该64P蛋白的全长克隆，它由133个氨基酸组成，经过克隆成为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/组氨酸标记融合蛋白。该片段所具有的分子量约为42kD。
名为64trp4的片段为该64P蛋白的一种C-末端片段，该片段由63个氨基酸组成，经过克隆成为分子量约35kD的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)/组氨酸标记融合蛋白。
名为64trp5的片段为该64P蛋白序列的全长克隆，它由133个氨基酸组成，经过克隆成为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(即，减去了组氨酸标记)。该片段所具有的分子量为41kD。
这些蛋白片段及其功能等价物是用于本发明的疫苗的特别优选的组分。这些片段可以表达成为可溶蛋白或者可以表达进入包含体并且在变性条件下纯化。例如，构建体64trp6在从R.appendicula tus中分离时已经被制备成为表达入包含体的变性蛋白并且经证明在该形式下具有免疫原性。
在外寄生虫附着之前以这些蛋白片段进行的免疫导致了附着位点处的炎症并且随后导致了该外寄生虫的死亡。内行的读者将会认同，外源GST和HIS标记的存在纯粹是为了便于蛋白质的生产。这些短链序列并不被认为对于本发明的这一方面是关键性的。
在方便的情况下，本发明的疫苗含有一种以重组形式表达的蜱粘合蛋白、该蛋白的片段或者其功能等价物。重组表达的蛋白对于生产较为廉价，并且通过使用现今的遗传工程标准工艺实现了对基因序列进行简单的操作以产生需要的蛋白产物。
在优选的情况下本发明的疫苗有效地抵抗了成体和未成熟形式的外寄生虫。术语“未成熟”意思包括了外寄生虫的若虫和幼虫形式。这意味着使用该疫苗整个外寄生虫群体均成为了目标，由此而提高了消灭外寄生虫的效率。
该疫苗可特异地靶向于成体或者未成熟形式的外寄生虫，但在优选的情况下靶向于其生命周期的寄生期。在本文具体例示的片段中，64trp2-、64trp3-、64trp5-以及64trp6-所免疫的动物根据该蜱的物种在其若虫或者成体蜱或者同时在两者中导致显著死亡，因此这些片段特别地优选。64trp2+64trp6的一种混合物有效地对抗了成体和未成熟形式的蜱外寄生虫；这些被组合使用的特定的片段因此特别优选地包含入本发明的疫苗中。
根据本发明的一个进一步的实施方案，提供了一种混合疫苗，该混合疫苗含有一种或者更多种蜱粘合蛋白、其片段或者功能类似物，该混合疫苗根据情况含有某种佐剂。任意两种或多种免疫原性的蜱粘合蛋白、蛋白片段或者功能类似物均可被用作这样一种混合疫苗的组分，并且它们可来自于不同或者相同的蜱。例如，可能需要产生一种疫苗，该疫苗特异地靶向于一种以上的外寄生虫，或者靶向于来自于相同外寄生虫的不同蛋白质。在此情况下，可产生一种具有较大物种覆盖面的有效疫苗。这些成分的特别优选地包括64trp2、64trp3、64trp5和64trp6的组合，64trp2和64trp6的组合以及64trp3和64trp6的组合。这些组合经本文证明在同时靶向于成体和未成熟的蜱中以及在赋予物种交叉抗性中具有特别效能。
本发明的疫苗组合物还可以包括额外的试剂，例如该外寄生虫用来促进病原体传播的一些分子，如干扰素调节剂、补体抑制剂、趋化因子调节剂以及免疫球蛋白结合蛋白。通过这样的途径，由外寄生虫的唾液腺所释放出的其它生物活性分子可被宿主免疫系统识别为外来物并且启动了某种免疫应答。
本发明的一个进一步的方面包括一种疫苗，该疫苗含有一种蜱粘合蛋白，该蛋白同另一种分子进行融合，例如一种标记、一种毒素或者其它生物活性或者免疫原性分子。特别适于融合的候选物可以是诸如谷胱甘肽-S-转移酶或者组氨酸标记这样的分子，尽管荧光素酶、绿色荧光蛋白或者辣根过氧化物酶也可以是适合的。可以使用诸如链亲合素或者生物素这样的连接分子以辅助该粘合蛋白的纯化。
融合蛋白还可以以化学方法产生，使用的方法如化学交联法。这样的方法为该领域的技术人员所熟知，并且可包括，例如，半胱氨酸残基的硫醇基团的交联。化学交联在多数情况下应被用于组织粘合蛋白同非蛋白分子的融合，例如同某些标记的融合。
当需要将一种组织粘合蛋白同另一种蛋白分子进行融合时，选用的方法应是对分子进行遗传学融合。为产生一种重组融合蛋白，编码目的蛋白或者蛋白片段的基因或者部分基因经过工程改造以使其形成一个连续基因，该基因经设计安排以使这两种基因序列的密码子在同一框架中转录。
以编码特异性抗原的裸露质粒DNA进行的免疫近来被视为是一种向哺乳类免疫系统呈递抗原的有效方法，它导致了强烈的体液免疫反应和细胞免疫应答(Ulmer et al.，Science1993，259，1745-1749)。这种又被称为DNA疫苗接种的方法已经被成功地应用于产生针对多种蛋白的抗体，这些蛋白来自于病毒(Ulmer et al.，loc cit；Cox etal.，J.Virol.1993，67，5664-5667；Fynan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，11478-11482；Robinson et al.，Vaccine1993，11，957-960；Wang et al.，1993；DNA Cell Biol.1993，12，799-805；Davis et al.，Hum.Mol.Genet.1993，2，1847-1851；Xiang et al.，Virology 1994，199，132-140；Xiang et al.，Virology 1995，209，569-579以及Justewicz et al.，J.Virol.1995，69，7712-7717)、寄生虫(Sedegah et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，9866-9870；Mor et al.，J.Immunol.1995，155，2039-2046以及Yang etal.，Biochem.Bioph Res.Comm.1995，212，1029-1039)以及细菌(Anderson et al.，Infect.Immun.1996，64，3168-3173)，并且，在多种情况下由宿主产生了显著的保护性反应。这些DNA疫苗连续地刺激免疫系统，增强了免疫性，并且由此而减低了生产和递送成本，这是因为不需要加强注射。
基于现存的证据，以编码多种蜱粘合蛋白的质粒DNA进行的免疫很可能是一种能够进一步提高其抗蜱效果的方法。该方法将涉及到以一种真核表达载体对该宿主进行直接注射以使一种或者多种粘合蛋白通过体内转录以及随后对对应序列的翻译而在该被免疫的宿主(人类、牲畜或者其它动物)体内表达。
上文所述的本发明的任何一个方面的疫苗还可额外地含有一种佐剂。用于增强本发明的免疫原性蛋白的效力的适当的佐剂包括，水包油的乳状液制剂(可根据情况含有其它特异性免疫刺激物，例如胞壁酰肽或者细菌细胞壁组分)，其例子如(a)在PCT Publ.No.WO90/14837中所描述的制剂，但并不限于这些。其它合适的佐剂为该领域的技术人员所已知，包括皂甙佐剂，例如StimulonTM(CambridgeBioscience，Worcester，MA)，还包括ISA Montanide 50、细胞因子，如白细胞介素、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或者肿瘤坏死因子(TNF)。
根据本发明的一个进一步的实施方案，在此提供了一种单克隆抗体，该抗体对一种蜱粘合蛋白具有反应性。“反应性”意指该抗体同一种或者多种蜱表位以至少为10-8M的亲合力结合，在优选的情况下该亲合力至少为10-9M，更优选的情况下该亲合力为至少10-10M。根据本发明的这一方面的一个优选的实施方案，该抗体或者抗血清对于在此具体提及的任何一种或者多种蜱粘合蛋白、片段或其功能类似物具有反应性。本发明的这一方面包括一种用于产生这样一种抗体或抗血清的方法，该方法包括以上文描述的本发明的任何一个方面所列举的一种蜱粘合蛋白、其片段或者功能类似物对动物进行免疫。
根据本发明的更进一步的一个方面，提供了一种加工过程以用于一种疫苗组合物的制剂化，该过程包括将一种蜱粘合蛋白、其片段或者功能类似物同一种药学可接受的载体结相合，根据情况可联合使用一种佐剂。
根据本发明的更进一步的一个方面，提供了一种对哺乳动物进行免疫以对抗外寄生虫传播的疾病或者对抗吸血外寄生虫的方法，该方法包括以上述任何一个本发明的方面的疫苗对动物进行给药。
本发明还提供了一种在疫苗中使用的蜱粘合蛋白、其片段或者功能类似物。本发明进一步提供了蜱粘合蛋白作为一种疫苗成分的用途。
本发明的多个方面和实施方案在此将通过实施例的方式更为详细地描述，该描述特别参考了分离自蜱，特别是分离自Rhipicephalusappendiculatus的蜱粘合蛋白。对细节的修改应被认为可在不脱离本发明的范围的情况下进行。
附图简述图1：推断的粘合蛋白的7个克隆的核苷酸和所推断出的氨基酸序列。克隆21：克隆21的部分cDNA序列和翻译产物。预计该cDNA所推断出的蛋白质为一种粘合蛋白；该蛋白含有一种疏水N-末端区域，该区域可能构成了一种典型的情况下用于分泌产物的信号肽，并且该蛋白十分类似于结构蛋白质，特别是类似于角蛋白。加下划线的为糖胺聚糖的翻译后附着的识别序列。克隆33：PCR克隆至融合蛋白表达载体pGEX-2T(Pharmacia)中的DNA产物(来自于cDNA文库)的推断蛋白质序列。粗体显示的为推测出的信号序列。类似于许多结构蛋白，该蛋白质富含甘氨酸和脯氨酸。它有点像角蛋白。*显示了终止密码子。克隆cemA：cemA cDNA和蛋白(推测的读码框架)的部分序列。该蛋白具有高重复性，含有序列KGALLQQQQASQVKGAKAI或其轻微变体，重复了多次。克隆24：克隆24的不完全的cDNA和cDNA所推断出的序列。该蛋白质类似于结构蛋白(与其它胶原蛋白一起)，并且含有重复序列。在文库中发现了许多相关克隆。该cDNA还具有一个区域同麦谷蛋白，一种自组配蛋白一样。克隆68：克隆24的部分cDNA和cDNA所推断出的序列。该文库含有一个类似克隆的家族。所编码的蛋白类似于结构蛋白，例如角蛋白。一系列可能的糖胺聚糖附着位点被加以下划线。克隆64：克隆64的完整的cDNA和cDNA所推断出的蛋白序列。推测出的信号序列以粗体给出。可能的糖胺聚糖附着位点加以下划线。该成熟蛋白的前40个氨基酸的片段类似于胶原蛋白，该序列的其余部分类似于角蛋白。该蛋白质富含甘氨酸并且含有多个重复基序(C/S)1-4(Y/F)，该基序亦可见于来自昆虫卵壳的结构蛋白中。酪氨酸可能参与了通过以酚氧化酶形成的二酪氨酸桥所进行的交联。克隆I编码了一种类似的蛋白(见下文)。*显示了终止密码子。克隆I：克隆I的不完全的cDNA和cDNA所推断出的蛋白序列。所推断出的蛋白富含甘氨酸和酪氨酸并且类似于造礁类多毛纲(reef-building polychaeta)Pragmatopoma california的粘合蛋白(由这些海生蠕虫产生的管中的醌褐色粘质的一种组分)。图2：在大肠埃希氏杆菌中表达的64P蛋白片段(64TRPs)的氨基酸序列。P1/P2、P1/P3、P4/P5、P6/P5、P1/P5和P7/P5指的是用于将PCR产物从64P氨基酸序列中亚克隆入质粒pGEX-2T的引物，该引物用于在大肠杆菌细胞中以64P蛋白的截短形式，即64trp2(51个氨基酸)、64trp3(70个氨基酸)、64trp1(29个氨基酸)、64trp4(63个氨基酸)、64trp5(133个氨基酸，没有HIS标记)和64trp6(133个氨基酸，带有HIS标记)的形式表达。以绿色下划线表示预测的可能的剪切信号肽(氨基酸1-18)。图3：SDS-PAGE：(A)经考马斯亮蓝染色的4-12％梯度NuPAGE Bis-Tris凝胶，(B)和(C)分别使用GST单克隆抗体(1∶500稀释)和HIS标记单克隆抗体的(1∶2000稀释)碱性磷酸酶偶联物对经IPTG诱导的大肠杆菌细胞进行的Western印迹，这些细胞表达了重组的截短形式(trp)的蜱结构蛋白以及载体GST蛋白64P(即，trp1、trp2、trp3以及trp4)。泳道：1＝分子量标记，2＝26kD载体GST蛋白，3＝30kDtrp1蛋白，4＝33kD trp2蛋白以及5＝36kD trp3蛋白，6＝35kD trp4蛋白，7＝41kD trp5蛋白(未经HIS标记)以及8＝42kD trp6蛋白(经HIS标记)。在上样至凝胶之前，样品在100℃溶于SDS中。箭头：a＝42kD trp6蛋白，b＝35kD trp4蛋白，c＝33kD trp2蛋白，d＝30kD trp1蛋白以及e＝26kD载体GST蛋白。图4：使用抗64trp抗血清对仓鼠皮肤薄切片进行的免疫过氧化物酶研究。A和C＝仓鼠皮肤薄切片，该切片分别同作为一级抗体的抗64trp抗血清：64trp3和64trp2进行了温育；B＝以PBS(生理盐溶液)作为一级抗体进行温育的仓鼠皮肤薄切片，即，对照样品。1＝表皮的角化层(角质层)，2＝表皮，3＝真皮；K＝角质形成细胞，CF＝胶原纤维，使用抗-64trp3的抗血清给出了阳性反应(黄/棕色)。放大倍数＝20×。图5：使用抗64trp抗血清在经Rhipicephalus appendiculatus吸食后对仓鼠皮肤薄切片进行的免疫过氧化物酶研究。A和C＝仓鼠皮肤薄切片，该切片分别同作为一级抗体的抗64trp抗血清：64trp3和64trp2进行了温育；B＝以PBS(生理盐溶液)作为一级抗体进行温育的仓鼠皮肤薄切片，即，对照样品。箭头：1＝表皮；2＝真皮；3＝皮下组织；4＝蜱粘合锥；*＝粘合锥以及仓鼠皮肤切片，它们在同抗-64trp3的抗血清进行温育时给出了阳性反应。放大倍数＝20×。图6：Rhipicephalus appendiculatus若虫在经截短形式的64P蛋白(64TRPs)免疫后的豚鼠身上吸食的效果。A＝在以GST进行免疫的对照豚鼠身上吸食后的Rhipicephalus appendiculatus若虫的细胞；B、C和D＝在以64trp蛋白进行免疫的豚鼠身上吸食后的Rhipicephalus appendiculatus若虫的细胞。*＝显示经免疫的豚鼠B、C和D的皮肤上的炎症位点(即红斑、水肿、淋巴结病、触热)的箭头，这些豚鼠经过Rhipicephalus appendiculatus若虫吸食。图7：Rhipicephalus appendiculatus雌性成体在经64P蛋白免疫后的豚鼠身上吸食后的受到的影响。A和B＝Rhipicephalusappendiculatus雌性蜱，该虫分别在以64trp2和64trp3蛋白进行免疫的豚鼠上进行了吸食；C＝Rhipicephalus appendiculatus雌性蜱，在经GST免疫的对照豚鼠上进行了吸食。1＝活体雌性蜱，2＝卵，3＝死去的雌性蜱。图8：对来自经64P蛋白免疫的豚鼠的皮肤活组织进行的解剖研究，该豚鼠经过Rhipicephalus appendiculatus的吸食。A、B和C＝来自分别经64trpl、64trp6和64trp2蛋白进行免疫的豚鼠的皮肤活检组织，D＝来自经GST免疫的对照豚鼠的皮肤活检组织，这些豚鼠均经过了Rhipicephalus appendiculatus的吸食；1＝表皮，2＝真皮/皮下组织，3＝以前的蜱附着位点，4＝坏死斑。图9：对来自经64P蛋白免疫的豚鼠的皮肤切片进行的组织学研究，该豚鼠经过Rhipicephalus appendiculatus的吸食，以苏木精和曙红以及瑞氏染液进行了染色。1＝来自经GST免疫的对照豚鼠的组织切片，2、3、4、5、6、7和8＝来自来自经64trp蛋白进行免疫的豚鼠的组织切片，这些豚鼠经过Rhipicephalus appendiculatus成体蜱的吸食，染色以：苏木精和曙红＝切片1、2、3、7和8，瑞氏染液＝切片4、5和6；切片1、2和3放大倍数＝10×；切片7和8放大倍数＝20×；切片4、5和6放大倍数＝100×。箭头：A＝表皮，B＝真皮，cc＝Rhipicephalus appendiculatus蜱的粘合锥曾经附着过的区域，CF＝胶原纤维，D＝树突细胞，F＝成纤维细胞，EP＝嗜酸性多形核细胞，BP＝嗜碱性多形核细胞。图10：使用来自于经过64trp重组蛋白免疫的豚鼠的血清所测定的R.appendiculatus蜱抗原的可溶级分之间的交叉反应性。A以抗64trp2血清为探针进行的R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道A/1和A/2为粘合锥；泳道A/3和A/4为唾液腺；泳道A/5和A/6为血淋巴；泳道A/7为若虫；泳道A/8为幼虫；泳道A/9为分子量标记*。B以抗64trp6血清为探针进行的R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道B/1和B/2为粘合锥；泳道B/3和B/4为唾液腺；泳道B/5和B/6为血淋巴；泳道B/7为若虫；泳道B/8为幼虫；泳道B/9为分子量标记*。C R.appendiculatus蜱抗原(雌性和雄性)的4-12％梯度凝胶，经考马斯亮蓝染色。泳道C/1为分子量标记**；泳道C/2和C/3为粘合锥；泳道C/4和C/5为唾液腺抽提物；泳道C/6和C/7为血淋巴；泳道C/8和C/9为中肠；泳道C/10为若虫；泳道C/11为幼虫。D以抗64trp6抗血清为探针进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道A/1为分子量标记*；泳道A/2和A/3为唾液腺抽提物；泳道A/4和A/5为中肠。E以抗64trp2抗血清为探针进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道B/1和B/2为未吸食的蜱的唾液腺抽提物；泳道B/3和B/3为中肠；泳道B/5为分子量标记*。F以抗64trp5抗血清进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道C/1为分子量标记*；泳道C/2和C/3为未吸食的蜱的唾液腺抽提物；泳道C/4和C/5为中肠。G以抗64trp5抗血清进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道D/1和D/2为粘合锥；泳道D/3和D/4为经部分吸食(2天)的蜱；泳道D/5和D/6为血淋巴；泳道D/7为若虫；泳道D/8为幼虫；泳道D/9为分子量标记*。图11：使用来自于经过64trp重组蛋白免疫的豚鼠的血清所测定的R.appendiculatus蜱抗原的不溶级分之间的交叉反应性。A以抗64trp3血清为探针进行的对来自于雌性成体蜱组织抽提物的R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道A/1为分子量标记***；泳道A/2为粘合锥(来自于经过在豚鼠上部分吸食的雌性)；泳道A/3为未进食的蜱的唾液腺；泳道A/4为未吸食的蜱血淋巴；泳道A/5为未吸食的蜱的中肠。B以抗64trp2血清为探针进行的对来自于雌性成体蜱组织抽提物的R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道B/1、B/2、B/3、B/4同泳道A/2-5。C以抗64trp6血清为探针进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道C/1为全若虫，泳道C/2为全幼虫。D以抗64trp2血清为探针进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道D/1为全若虫，泳道D/2为全幼虫，泳道D/3为标记***。E以对照的抗GST血清为探针进行的对R.appendiculatus蜱抗原的免疫印迹。泳道E/1为分子量标记***；泳道E/2为粘合锥(同泳道A/2)；泳道E/3为唾液腺(同泳道A/3)；泳道E/4为血淋巴(同泳道A/4)；泳道E/5为中肠(同泳道A/5)，泳道E/6为若虫(同泳道C/2、D/2)，泳道E/7为幼虫(同泳道C/1、C/2)。图11A到E的标记***为SeeBlueTMPlus2蛋白质分子量标记：188kD＝肌球蛋白，98kD＝磷酸化酶B，62kD＝牛血清白蛋白，49kD＝谷氨酸脱氢酶，38kD＝乙醇脱氢酶，28kD＝碳酸酐酶、17kD＝肌红蛋白以及14kD＝溶菌酶。图11F为R.appendiculatus蜱抗原的4-12％梯度凝胶，经考马斯亮蓝染色。泳道F/1为标记**，泳道F/2为部分吸食的雄性的粘合锥，泳道F/3为部分吸食的雌性的粘合锥，泳道F/4未进食的雄性唾液腺，泳道F/5未吸食的雌性唾液腺，泳道F/6为雄性的血淋巴，泳道F/7为雌性的血淋巴，泳道F/8为雄性的中肠，泳道F/9为雌性的中肠，泳道F/10为全若虫，泳道F/11为全幼虫。唾液腺中的交叉反应的26kD的带f可能表明R.appendiculatus GST等价于针对Boophilusmicroplus所报道的GST(He et al.，(1999)Insect Biochem.Mol.Biol. 29：737-743)。图11A到F.所标记的带的分子量：a＝200kD，b＝120-188kD，c＝80-98kD，d＝55-62kD，e＝49-55kD，f＝26kD，g＝17kD，h＝15kD，i＝120kD，j＝60-62kD，k＝36kD，1＝14kD，m＝188kD，n＝98-120kD，o＝55-62kD，p＝200kD，q＝188kD，r＝150kD&s＝50-62kD。图12：使用来自于经过R.Appendiculantus 64trp重组蛋白免疫的豚鼠的血清所测定的Amblyomma variega tum和Rhipicephalussanguineus蜱抗原的交叉反应性。A以抗64trp5血清为探针进行的对A.variegatum蜱抗原的免疫印迹。泳道A/1为血淋巴；泳道A/2为中肠；泳道A/3为唾液腺；泳道A/4为分子量标记*。B以抗64trp6血清为探针进行的对A.variegatum蜱抗原的免疫印迹。泳道A/1为分子量标记*；泳道A/2为唾液腺；泳道A/3为中肠；泳道A/4为血淋巴。C以抗64trp6血清为探针进行的对R.sanguineus蜱抗原的免疫印迹。泳道A/1为分子量标记*；泳道A/2为唾液腺；泳道A/3为中肠；泳道A/4为血淋巴。对于图10-12，*代表MultiMarkTM蛋白质分子量标记(NOVEX)：98kD＝磷酸化酶B，52kD＝谷氨酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，19/17kD＝肌红蛋白，11kD＝溶菌酶，6kD＝抑酶肽，3kD＝胰岛素**代表Mark 12TM蛋白质分子量标记(NOVEX)：200kD＝肌球蛋白，116.3＝β半乳糖苷酶，97.4kD＝磷酸化酶b，66.3kD＝牛血清白蛋白，55.4kD＝谷氨酸脱氢酶，36.5kD＝乳酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，21.5kD＝胰蛋白酶抑制剂，14.4kD＝溶菌酶，6kD＝抑肽酶，3.5kD＝胰岛素B链以及2.5kD＝胰岛素A链。图13：使用来自于经过R.appendiculatus 64trp重组蛋白免疫的豚鼠的抗血清而测定的Rhipicephalus sanguineus蜱抗原之间的交叉反应性。A和B为分别使用抗64trp3和抗64trp2血清而进行的对R.sanguineus蜱抗原的免疫印迹。C为经考马斯亮蓝染色的4-12％Bis-Tris梯度凝胶(NuPAGE-NOVEX)。泳道A/1和B/1：SeeBlueTMPlus2蛋白质分子量标记(NOVEX)188kD＝肌球蛋白；98kD＝磷酸化酶B；62kD＝BSA；49kD＝谷氨酸脱氢酶；38kD＝乙醇脱氢酶；28kD＝碳酸酐酶；17kD＝肌红蛋白；14kD＝溶菌酶；6kD＝抑酶肽。泳道C/1：Mark12TM蛋白质分子量标记(NOVEX)200kD＝肌球蛋白，116.3kD＝β半乳糖苷酶，97.4kD＝磷酸化酶b，66.3kD＝牛血清白蛋白，55.4kD＝谷氨酸脱氢酶，36.5kD＝乳酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，21.5kD＝胰蛋白酶抑制剂，14.4kD＝溶菌酶，6kD＝抑肽酶。泳道：A/2、A/3、A/4、A/5、A/6、A/7以及A/8：分别为R.sanguineus全若虫抽提物、血淋巴、雄性中肠抽提物、雌性中肠抽提物、雄性唾液腺抽提物、雌性唾液腺抽提物以及组合的雄性和雌性粘合锥抽提物(来自于经过在豚鼠上部分吸食的蜱)，在其中使用抗64trp3抗血清而观察到的免疫阳性带为a＝6kD、b＝17kD、c＝188kD、d＝26kD、e＝28kD、t＝60kD、g＝80kD。泳道：B/2、B/3、B/4、B/5、B/6、B/7以及B/8：同A，使用抗64trp2血清在其中观察到的免疫阳性带为h＝120kD、i＝62kD、j＝60kD。泳道：C/2、C/3、C/4、C/5、C/6、C/7以及C/8：同A，其中蛋白带a到j对应于免疫印迹A和B中的免疫阳性带。箭头*＝由于同抗GST抗血清结合的本底而造成的免疫阳性带-见图14。图14：使用抗GST抗血清进行的R.sanguineus蜱抗原的免疫印迹。泳道8：Mark12TM蛋白质分子量标记(NOVEX)200kD＝肌球蛋白，116.3＝β半乳糖苷酶，97.4kD＝磷酸化酶b，66.3kD＝牛血清白蛋白，55.4kD＝谷氨酸脱氢酶，36.5kD＝乳酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，21.5kD＝胰蛋白酶抑制剂，14.4kD＝溶菌酶，6kD＝抑肽酶。泳道7、6、5、4、3、2和1：分别为R.sanguineus全若虫抽提物、血淋巴、雄性中肠抽提物、雌性中肠抽提物、雄性唾液腺抽提物、雌性唾液腺抽提物以及组合的雄性和雌性粘合追抽提物(来自于经过在豚鼠上部分吸食的蜱)。免疫阳性带I*和K1以及K2*是指抗GST抗血清与存在于雌性和雄性唾液腺抽提物以及粘合锥抽提物中的蛋白带(25kD、48kD以及26kD)的非特异结合。图15：Rhipicephaluss anguineus雌性和雄性成体蜱在64trp蛋白的不同混合物免疫的豚鼠上进行早期吸食时受到的影响。(A)来自经64trp6/3免疫的豚鼠身上的死亡雌性蜱，(注射入分离的位点)(B)来自经64trp6/3免疫的豚鼠身上的死亡雌性蜱，(组合并且注射入同一位点)(C)来自经64trp6/2免疫的豚鼠身上的死亡雌性(n＝3)和雄性蜱(n＝2)，(注射入分离位点)；(D)来自经64trp6/2免疫的豚鼠身上的死亡雌性蜱，(组合并且注射入同一位点)图16：Rhipicephalus sanguineus成体蜱在64trp蛋白免疫的豚鼠上进行吸食后所受到的64trp蛋白的疫苗影响。(A)：在豚鼠上吸食之后存活下来的成体雌性R.sanguineus蜱，该豚鼠经过以64trp2/6蛋白混合物作为免疫原免疫。只有2/10的蜱存活下来，这些蜱并不产卵也不充分地进食。(B)：在豚鼠上吸食之后死亡的成体雌性R.sanguineus蜱，该豚鼠经过以64trp2/6和64trp3/6蛋白混合物作为免疫原免疫。这些蜱转为褐色/黑色并且在脱离吸附2-5天后呈现一种干稠状(dryconsistency)。(C)：在豚鼠上吸食之后的产卵中的正常成体成体雌性R.sanguineus蜱，该豚鼠经过以GST对照蛋白作为抗原免疫。图17：使用来自于经过R.Appendiculantus重组64trp2和64trp3蛋白免疫的豚鼠的抗血清而测定的Boophilus microplus蜱抗原之间的交叉反应性。A和B分别为使用64trp2和64trp3抗血清进行的对Boophilusmicroplus蜱抗原的免疫印迹；C为4-12％的Bis-Tris梯度凝胶(NuPAGE-NOVEX)，经考马斯亮蓝染色。泳道A/1和B/1：SeeBlueTM Plus2蛋白质分子量标记(NOVEX)188kD＝肌球蛋白；98kD＝磷酸化酶B；62kD＝BSA；49kD＝谷氨酸脱氢酶；38kD＝乙醇脱氢酶；28kD＝碳酸酐酶；17kD＝肌红蛋白；14kD＝溶菌酶；6kD＝抑酶肽。泳道C/1：Mark12TM蛋白质分子量标记(NOVEX)200kD＝肌球蛋白，116.3＝β半乳糖苷酶，97.4kD＝磷酸化酶b，66.3kD＝牛血清白蛋白，55.4kD＝谷氨酸脱氢酶，36.5kD＝乳酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，21.5kD＝胰蛋白酶抑制剂，14.4kD＝溶菌酶，6kD＝抑肽酶。泳道A/5、A/4、A/3和A/2：分别为Boophilus microplus粘合锥抽提物，唾液腺抽提物、中肠抽提物以及全若虫(经吸食的蜱)抽提物，其中使用64trp2抗血清所观察到的免疫阳性带为a＝120-200kD、b＝80kD、c＝62kD、d＝49kD、e＝40kD、f＝17kD、g＝8kD、h＝200kD、I＝60kD、J＝55kD、k＝49kD、1＝18kD。泳道B/5、B/4、B/3和B/2：分别为Boophilus microplus粘合锥抽提物，唾液腺抽提物、中肠抽提物以及全若虫(经吸食的蜱)抽提物，其中使用64trp3抗血清所观察到的免疫阳性带为m＝120kD、n＝35kD、o＝62kD、p＝59kD、q＝49kD、r＝26kD。泳道C/5、C/4、C/3和C/2：分别为Boophilus microplus粘合锥抽提物，唾液腺抽提物、中肠抽提物以及全若虫(经吸食的蜱)抽提物，其中蛋白带a到r对应于来自免疫印迹A和B的免疫阳性带。图18：使用来自于经过R.Appendiculantus重组64trp5和64trp6蛋白免疫的豚鼠的抗血清而测定的Boophilus microplus蜱抗原之间的交叉反应性。A和B分别为使用抗64trp5和抗64trp5抗血清进行的对Boophilusmicroplus蜱抗原的免疫印迹；C为使用来自于经过重组GST蛋白免疫的豚鼠的抗血清进行的对Boophilus microplus蜱抗原的免疫印迹。泳道：A/5、B/5和C/5＝SeeBlueTMPlus2蛋白质分子量标记(NOVEX)：188kD＝肌球蛋白；98kD＝磷酸化酶B；62kD＝BSA；49kD＝谷氨酸脱氢酶；38kD＝乙醇脱氢酶；28kD＝碳酸酐酶；17kD＝肌红蛋白；14kD＝溶菌酶；6kD＝抑酶肽。泳道：A/1、A/2、A/3和A/4：分别为Boophilus microplus粘合锥抽提物，唾液腺抽提物、中肠抽提物以及全若虫(经吸食的蜱)抽提物，其中使用抗64trp5抗血清所观察到的免疫阳性带为a＝50-55kD、b＝32kD、c＝17kD、d＝70kD、e＝48kD、f＝26kD、g＝40kD、h＝30kD。泳道：B/1、B/2、B/3和B/4：分别为Boophilus microplus粘合锥抽提物，唾液腺抽提物、中肠抽提物以及全若虫(经吸食的蜱)抽提物，其中使用抗64trp6抗血清所观察到的免疫阳性带为e＝48kD、i＝180kD、j＝75kD、k＝12kD。泳道：C/1、C/2、C/3和C/4：分别为Boophilus microplus粘合锥抽提物，唾液腺抽提物、中肠抽提物以及全若虫(经吸食的蜱)抽提物，其中所观察到的免疫阳性带为a＝50-55kD、e＝48kD。图19：使用来自于经过R.appendiculatus重组64trp蛋白免疫的豚鼠的抗血清而测定的Ixodes ricinus蜱抗原之间的交叉反应性。A(ii)(iii)(iv)和(v)分别为使用GST、64trp2、64trp5和64trp6抗血清进行的Ixodes ricinus全若虫抽提物的免疫印迹；A(i)为同样的抽提物的4-12％的Bis-Tris梯度凝胶(NuPAGE-NOVEX)，经考马斯亮蓝染色。B(i)和(ii)分别为经考马斯亮蓝染色的4-12％的Bis-Tris梯度凝胶(NuPAGE-NOVEX)以及使用64trp6抗血清进行的Ixodes ricinus全幼虫抽提物的免疫印迹。泳道：A/(i)/1以及B/(i)/1：Mark12TM蛋白质分子量标记(NOVEX)：200kD＝肌球蛋白，116.3kD＝β半乳糖苷酶，97.4kD＝磷酸化酶b，66.3kD＝牛血清白蛋白，55.4kD＝谷氨酸脱氢酶，36.5kD＝乳酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，21.5kD＝胰蛋白酶抑制剂，14.4kD＝溶菌酶，6kD＝抑肽酶。泳道：A/(ii)、(iii)、(iv)以及(v)/3：SeeBlueTMPlus2蛋白质分子量标记(NOVEX)：98kD＝磷酸化酶B；62kD＝BSA；49kD＝谷氨酸脱氢酶；38kD＝乙醇脱氢酶；28kD＝碳酸酐酶；17kD＝肌红蛋白；14kD＝溶菌酶。泳道：B/(ii)/3：MultiMarkTM蛋白质分子量标记(NOVEX)：98kD＝磷酸化酶B，52kD＝谷氨酸脱氢酶，31kD＝碳酸酐酶，19kD＝肌红蛋白，17kD＝肌蓝蛋白，11kD＝抑酶肽。泳道：A/(iii)、(iv)和(v)/4＝I.ricinus全若虫抽提物，其中所观察到的免疫阳性带分别为a＝150kD、b＝62kD、c＝100kD、d＝98kD、e＝62kD、f＝50kD、g＝42kD、h＝190kD、i＝150kD、j＝80kD、k＝62kD、1＝55kD、m＝35kD、n＝17kD、o＝12kD。泳道：A/(ii)/4＝I.ricinus全若虫抽提物，其中所观察到为*的弱免疫阳性带是由于蜱抗原同GST抗血清的非特异性交叉反应所造成的。泳道：B/(ii)/4＝I.ricinus全幼虫抽提物，其中所观察到的免疫阳性带分别为a＝116kD、b＝80kD、c＝62kD、d＝34kD、e＝28kD。图20：在经过64trp蛋白的不同混合物免疫的仓鼠上进食的I.ricinus蜱幼虫受到的影响。在I.ricinus蜱的若虫在仓鼠上的进食期间[((i)-解剖前)和进食后((ii)-解剖后)对仓鼠皮肤的研究，该仓鼠经过GST对照蛋白(A)、64trp6蛋白(B)、64trp5蛋白(C)以及64trp6/5混合物(D)的免疫。对照仓鼠A上经蜱吸食后毛发生长正常，对于经过64trp免疫的仓鼠，经蜱吸食后毛发生长非常缓慢，如箭头a所示的斑秃区域。这是由于局部的炎症反应所导致，该反应在I.ricinus蜱在经64trp免疫的仓鼠上吸食期间发生，如箭头所示：c、d和e；c＝废弃的蜱吸食位点，由被解剖的皮下组织上的红斑可见到该位点表现出不同程度的炎症；d＝增大的肩胛前淋巴结；e＝在废弃的蜱吸食位点上的浆液溢出；f＝在对照仓鼠上的蜱吸食位点，该仓鼠的皮下组织和肩胛前淋巴结表现正常。b＝正在吸食的I.ricinus蜱若虫；在对照仓鼠上蜱吸食过程同在经过64trp蛋白免疫的仓鼠上的吸食相比延长了6小时。
实施例实施例1：截短的粘合蛋白(64TRP)在细菌中的表达
由于在杆状病毒系统中表达64P的全长克隆的尝试是不成功的，因此对多种策略进行探索以求在大肠埃希氏杆菌细胞中表达截短形式的64P。
将名为64P的粘合蛋白的完整编码区域(减去了信号序列，即，长度为144个氨基酸)插入pET23a(+)(Novagen)以及pGEX-2T(Pharmacia)原核表达载体，用于在大肠杆菌AD494细胞(Novagen)中表达该蛋白，进行了多次尝试均不成功。结论认为该构建体的结构可能对于细菌细胞具有毒性。
因此而采用了一种克隆策略，该策略涉及到由N-末端开始对该64P克隆的截短区域进行一系列的克隆(图2)。寡核苷酸经设计而具有适当的限制性酶切位点以允许从cDNA中对64P的不同片段进行PCR克隆。这些构建体如下：64trp1＝29个氨基酸的C-末端片段64trp2＝51个氨基酸的N-末端片段64trp3＝70个氨基酸的N-末端片段64trp4＝63个氨基酸的C-末端片段64trp5＝133个氨基酸片段，不具有9×HIS标记全长64P克隆在该序列末端减去3个氨基酸64trp6＝133个氨基酸的片段，具有9×HIS标记
根据制造商的指导将该质粒转化入大肠杆菌XL1-BLUE细胞(Stratagene)。根据制造商的指导通过GST纯化方法(Pharmacia)来纯化GST融合/组氨酸标记的表达64TRP蛋白。为便于对可能会以包含体形式表达的64TRP蛋白的纯化而包含入了9×HIS标记(因为GST纯化方法仅适用于可溶性蛋白)。
与其它的GST/9×HIS标记的截短64P蛋白(即64trp1、64trp2、64trp3和64trp4不同)，64trp6蛋白(具有9×HIS标记的133个氨基酸)导致了包含体的形成而非可溶的蛋白。因此64trp6蛋白在变性条件下使用TALON金属亲和珠(Clontech)根据制造商的建议进行纯化。
这些64TRP蛋白通过经考马斯亮蓝染色的NuPAGE Tris.Bis 4-12％梯度凝胶(Novex)根据制造商的建议进行分析(图3A)。图3B和3C为对类似于图3A的凝胶的Western印迹，根据制造商的说明使用了1∶500稀释的GST单克隆抗体(GST mAb-Pharmacia)以及1∶2000稀释的6×HIS标记单克隆抗体。
在该考马斯亮蓝染色的凝胶上观察到了预期的64TRP蛋白带(图3A)，这些带具有以下的分子量：64trp1＝30kD；64trp2＝33kD；64trp3＝36kD；64trp4＝35kD；64trp5＝41kD；64trp4＝42kD。
表达在Western印迹中得到了证实(图3B和3C)。26kD的GST蛋白被用作为对照标记。
如所预期，没有9×HIS标记的64trp5和GST蛋白带同6×HIS标记mAb不发生反应(图3C，分别为泳道7和2)
当含有64P克隆的某-片段或者完整的N-末端序列的64TRP构建体(即，64trp2、64trp3和64trp5)在大肠杆菌XL1-BLUE细胞中表达时产生了降解产物(图3A，泳道4、5和7)。这通过对降解蛋白带的氨基末端序列分析得到了证实(Matsudaria，(1987)Journal ofBiological Chemistry 262：10035-10038)。为尝试解决产物降解的问题，该构建体被转化入大肠杆菌BL21菌株，该菌株删除了编码一种蛋白酶的ompT基因。
正如预期，同64trp5蛋白相比64trp蛋白的降解较少，这是因为它以包含体的形式表达并且因此而受保护不被细胞蛋白酶所降解。实施例2：使用抗血清对64TRP进行的免疫组织化学研究
各个被纯化的重组64trp蛋白被用于产生多克隆抗血清，该过程通过将等体积的各蛋白质以及Montanide ISA50皮下注射入DunkinHartley豚鼠而完成。
通过使用6种不同的抗64trp抗血清进行免疫组织化学研究。这些抗血清分别同正常仓鼠皮肤(来自于未接触蜱的动物)的切片和受到R.appendiculatus蜱感染的仓鼠穿过粘合锥的切片以及周围皮肤切片。该免疫组织化学方法此前已有描述(Coligan et al.，1991)。
这些研究之中，使用抗64trp2和抗64trp3血清进行的两项研究的结果如下所示。2.1正常皮肤
将经过抗64trp2或者抗64trp3血清处理的正常皮肤进行比较显示抗64trp3血清同表皮和上皮组织发生强烈的反应，特别是和表皮的角质细胞和角化层以及真皮的胶原纤维(图4A)。通过比较，经过抗64trp2血清处理的切片同经磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理的对照切片无法区分(分别为图4B和4C)。
64trp2和64trp3蛋白序列均含有64P蛋白的胶原蛋白样区域。然而，64trp3蛋白还含有64P蛋白的一些角蛋白样序列。抗64trp3和抗64trp2抗血清同仓鼠皮肤切片免疫反应性的差异因此可能相关于各蛋白序列片段中的反应性表位的存在。这进一步证实了64P粘合蛋白摹拟了其宿主组织的特定结构的假说，例如摹拟了表皮和真皮的胶原蛋白，特别是摹拟了角蛋白样蛋白。2.2蜱感染的皮肤
在经过R.appendiculatus蜱吸食的仓鼠皮肤中，各个粘合锥的切片同抗64trp3血清进行了反应。这些反应主要同附着于表皮的粘合锥的最外层以及内层之间进行(图5A)。在以抗64trp2血清处理的切片(图5C)或者以PBS代替一级抗体进行处理以作为对照的切片(图5B)中均中未观察到反应。
抗64trp3血清同粘合锥之间的反应模式表明该64P为一种组成粘合锥的粘合蛋白，可能作为一种胶水将该粘合锥同周边表皮和真皮进行结合。对该粘合锥内部的着色的缺少可能暗示被抗64trp3血清(有可能还有抗64trp2血清)所识别的表位可能并不在粘合锥的内部暴露。这可能在该64P蛋白聚合形成粘合锥的情况下发生。
除了包埋于宿主皮肤内部，该粘合锥的最外层也逐渐变薄并融入该宿主皮肤的表皮(数据未出示)从而难于分辨该蜱粘合锥在何处终止以及宿主组织由何处开始。这一观察结果进一步支持了该粘合蛋白经设计而摹拟宿主真皮和表皮皮肤蛋白(即胶原蛋白和角蛋白)以避免通过粘合锥附着宿主皮肤而对该蜱进行排斥的假说。实施例3：接种试验
Dunkin Hartley豚鼠被用于免疫和侵袭试验。在所使用的10只豚鼠中各有2只以64trpl、64trp2、64trp3、64trp6进行免疫并有2只以对照蛋白GST进行免疫。各组免疫的豚鼠被进一步分开，各自分别对应成体以及若虫吸食期的R.appendiculatus蜱。将约50微克的各种64TRP蛋白(依然连接于GST珠，即，未经洗脱)或者对照GST蛋白同ISA Montanide佐剂进行混合并且进行皮下注射；以两周的间隔进行第一次和第二次加强注射。
通过对经64TRP以及GST免疫的豚鼠抗血清在GST蛋白和各个64TRP蛋白的免疫印迹上的反应性而测定了对免疫的宿主免疫反应。
当抗血清的滴度达到1∶5000时，以成体和若虫期的R.appendiculatus蜱对这些豚鼠进行侵袭。为进行侵袭，在第二次加强注射后一周将预定量的蜱(每只豚鼠50-200只若虫或者20只成体蜱)放置于位于各只豚鼠背部的保持腔(retaining chamber)中(图7)。
为分析64TRP诱导的免疫性的效果，从蜱对豚鼠的侵染后24小时开始每天进行目测。对附着率、吸食时间、附着位点的炎症反应以及来自脱离的饱满雌性蜱的卵的孵化率进行了记录。在该实验结束后测定成体雌性蜱的饱食重量以及成体和若虫期的蜱的死亡率。
表1概述了64TRP蛋白在豚鼠上对抗蜱吸食的疫苗效果。对照的GST免疫组同64TRP免疫组的附着率之间没有差异；成体和若虫期的蜱的吸食持续时间也同样类似。
在吸食的晚期(第6-7天)，在经64TRP免疫的豚鼠皮肤的若虫附着位点上观察到了炎症反应，该反应在消退之前要持续24-48小时。该反应包括红斑、水肿、淋巴结病以及嗜睡(图6)。
表1.对在经64TRP蛋白和GST蛋白免疫的豚鼠上进行吸食的R.appendiculatus蜱的吸食参数的比较
Figure A0181175800281
表1注释
i＝炎症  -和+分别显示了蜱附着位点的炎症的不存在和存在；炎症的程度显示以：+＝轻度，++＝中度，+++＝严重；1和2＝侵染前和侵染后的抗体滴度；nd＝未进行；n/a＝不适用；h＝被孵化；*意指2/9的卵未被孵化，这些卵由2只成体雌性蜱产出，这2只蜱来自在经过64trp2蛋白免疫的豚鼠上吸食的R.appendiculatus蜱组；δ通过卡方检验使用单向列联表来测定，它显示了在经过64trp6免疫的豚鼠上吸食的R.appendiculatus若虫蜱的较高死亡率(χ2，6，＝96.5，p＜0.001)；§通过G检验测定，来自于在经过64trp2、64trp3和64trp5蛋白免疫的豚鼠上吸食的R.appendiculatus蜱组的成体蜱中所观察到的死亡率明显高于来自其它组的蜱(G，6，＝33，p＜0.001)；
Figure A0181175800291
通过F比值(Fratio)进行测定，来自于在经过64trp2、64trp4和64trp5蛋白免疫的豚鼠上吸食的R.appendiculatus蜱组群的成体雌性蜱的平均饱食重量明显低于来自其它组的蜱的吸食重量(F，1，62＝15.88，p＜0.001)；通过F比值测定，显示出在经过64trp5蛋白免疫的豚鼠上吸食的雌性R.appendiculatus蜱的平均卵重量(F，1，44＝5.646，p＜0.002)与来自其它组的雌性蜱相比明显较低。3.1若虫蜱
分离下来的若虫外观正常。在经GST免疫的豚鼠的皮肤上的若虫附着位点的炎症并不明显。
根据Jones et a1.，(1988)Animal Technology 39，99-106而对分离下来的若虫进行饲养。曾经在经64trp2和64trp6免疫的豚鼠上吸食的分离若虫中所观察到的18％和48％的死亡率同在经对照蛋白免疫的豚鼠上吸食的若虫(6.7％)相比较高。这些结果在统计学上较为显著，分别为p＜0.01和p＜0.001，这些值通过卡方检验使用一个2×2的列联表来测定。
在经64trp2和64trp6免疫的豚鼠上吸食的若虫的死亡表明当若虫期的R.appendicu1atus蜱在经64TRP免疫的豚鼠上吸食时一种免疫应答被激发。尽管该应答并不直接影响吸食过程，但它影响这些若虫的存活率。有可能免疫保护性表位存在于64trp2蛋白(64P蛋白的小N-末端片段)以及64trp6(64P蛋白的133氨基酸片段，作为变性抗原)蛋白之中，该表位在若虫中的相关粘合蛋白中可能是保守的。对此将通过使用抗64trp抗血清对若虫组织抽提物进行的免疫印迹来进一步研究。3.2成体蜱
致死作用在经64trp2(死亡率55.5％)和64trp3(死亡率70％)免疫的豚鼠上吸食的成体雌性若虫中也是很明显的。图7A(no.1)显示了一些在64trp2免疫的豚鼠上吸食的成体蜱。这些蜱同其它64trp和GST免疫的豚鼠的蜱相比具有较低的饱食重量(表2；平均重量＝336mg)。进一步，来自于这一组的两只蜱产下了较少量的不能孵化的卵；并且在吸食的晚期一些饱满的脱离成体蜱在脱离后两天死亡。
类似地，在经过64trp3免疫的豚鼠吸食后的蜱在分离后的第一周内死亡(图7B)。同对照蜱相比这些蜱受到血食的过度充胀，体色发黑并且在死亡时呈现一种硬稠状。对蜱的这种疫苗效果显示了对该蜱消化道的损害以及对渗透调节的干扰，该调节为蜱唾液腺的一种功能。
来自于经过对照蛋白免疫的豚鼠的所有正常成体蜱表现正常并且存活下来产卵(图7C)。
对来自于经过64TRP蛋白免疫并随后经过R.appendiculatus成体蜱吸食的豚鼠的皮肤活组织进行研究。同来自于经过对照蛋白免疫的豚鼠的皮肤活组织(图8D和E)相比，在经过64TRP蛋白免疫的豚鼠的蜱附着位点(图8A、B和C，no.3)观察到了红斑状丘疹病变。
这些病变在来自经64trp免疫的豚鼠的活组织之中十分显著，由皮肤的增厚和坏死病变所显示(图8C)。
这些结果相关于在经过64TRP蛋白免疫的豚鼠上吸食后的成体蜱中观察到的死亡率。这样，蜱的吸食表现出刺激了一种由经过64TRP蛋白免疫的豚鼠作出的对抗成体蜱的晚期吸食的免疫应答。
为证实这些发现，对来自皮肤活组织的的切片使用苏木精和曙红染液进行了组织学研究(Bancroft J.D.，and Steven，A.，Eds.(1990)Theory and Practice of Histological Techniques.3rd Edition)。其结果显示了所预期的来自于经过对照蛋白免疫的豚鼠在经成体蜱吸食后的皮肤活组织的正常组织学性状(图9.1)。
与之相对照，对来自于经过64TRP蛋白免疫的豚鼠的皮肤活组织的组织学研究通过观察到白细胞浸润的存在，尤其是存在于表皮上的蜱曾经附着的位点附近的真皮中，从而证实了针对成体蜱的吸食的免疫反应，在低放大(图9.2和9.3)和高放大倍数(图9.7和9.8)下均观察到了该现象的存在。表皮增生也同样存在，该现象是慢性炎症反应的证据。
对这些相同的切片以及对照样品根据制造商的建议使用Hema“Gurr”快速血涂片染色(BDH)(即，瑞氏染色)进行了进一步的组织学研究。其结果证实了来自于经过64trp蛋白免疫的豚鼠的皮肤活组织切片的白细胞浸润为嗜酸性和嗜碱性多形核细胞(图9.5和9.6)，它们并不存在于对照样品中(图9.4)。3.3卵产量和孵化能力
通过F比值对产卵所进行的统计学分析表明在经过64trp5免疫的豚鼠上吸食的雌性R.appendiculatus蜱的平均卵重量显著低于(F，1，44＝5.646，p＜0.022)来自其它组的雌性蜱。另外，2/9的卵不能孵化。这些卵由来自于在经过64trp2免疫的豚鼠上吸食的R.appendiculatus蜱组的2只雌性蜱所产出。这些结果表明该特定的构建体对于在经过免疫的动物上吸食的成体雌性蜱的繁殖具有显著作用。这是一种理想的疫苗效果。
来自于疫苗试验的这些结果支持了64trp2、64trp3、64trp5和64trp6蛋白作为对抗成体和若虫R.appendiculatus蜱的疫苗的用途。
所观察到的免疫炎症反应是通过二次蜱侵染检测到免疫应答的残余(Brown and Askenase，1981 J.Immunol.127：2163-2167；Brownand Askenase，1983 Federal Proceedings 42，1744-1749)，它包括在废弃的蜱吸食位点的大量红斑、水肿、坏死、增生以及红斑状丘疹。二次侵染中的这一局部化的细胞反应(嗜碱性和嗜酸性多形核细胞)和组织反应被称为细胞介导的免疫并且被广泛认为是蜱免疫动物的排斥的主要机制。因此，存在着一种复杂的免疫机制，该机制涉及到位于附着位点的局部化的细胞介导的反应以及依赖于补体和体液的效应机制。
分别使用来自于经过64trp或GST抗原免疫的豚鼠的抗64trp和抗GST血清通过ELISA测定了抗体的滴度(Desai et al.，(1994)J.Neurol.Sci.122，109-116)。对于经过64trp2、64trp3、64trp5和64trp6蛋白免疫的豚鼠，在蜱侵染前和侵染后的滴度的比较显示出一致的抗体滴度的提高。所观察到的提高表明对免疫的动物的蜱侵染具有强化作用，诱导出一种抗体记忆应答。该应答显示，天然蜱侵染将免除对于进一步的免疫的需求，这是因为蜱吸食将提供足以维持疫苗保护的免疫刺激。这样，可使用一种适当的佐剂以及单独或者混合的64trp构建体制备一种仅需要一次免疫的单作用疫苗。64P粘合蛋白的研究总结
由Rhipicephalus appendiculatus所产生的粘合锥作为一种锚定物质发挥作用，该粘合锥将该蜱的口器部分固定于其宿主皮肤的表皮和真皮之中。该粘合锥和其周围宿主组织的接合形成了一种防漏封。为避免激起宿主针对该蜱的排斥反应，该粘合蛋白采用了一种类似于胶原蛋白和角蛋白的结构。在大肠杆菌中对截断形式的粘合蛋白(64P)进行了表达并且产生了该蛋白的抗血清。这些结果的总结见下文的表2。
表2：64TRP蛋白特征的概述
    特征                                     64P截短蛋白
  64trp1   64trp2   64trp3   64trp4   64trp5   64trp6
  64P氨基酸(aa)序列片段   29aa C-末端克隆   51aa N-末端克隆   70aa N-末端克隆   63aa C-末端克隆   133aa全长克隆   133aa全长克隆
  分子量(kD)   3(30)*   6(33)*   8(36)*   7(34)*   15(41)φ   15(42)*
  GST/HIS.标记融合蛋白   GST/HIS标记   GST/HIS标记   GST/HIS标记   GST/HIS标记   GST   GST/HIS标记
  可溶性/变性蛋白   可溶   可溶   可溶   可溶   可溶   变性
  疫苗效果   +   +++   ++a   -   ++a   ++n
免疫效果：+＝对抗在64trp1免疫的豚鼠上吸食后的Rhipicephalus appendiculatus若虫蜱的轻度效果；+++＝对抗在64trp2免疫的豚鼠上吸食后的Rhipicephalus appendiculatus若虫和成体蜱的非常强的效果；++a＝对抗在64trp3免疫的豚鼠上吸食后的Rhipicephalus appendiculatus成体蜱的非常强的效果；++n＝对抗在64trp6免疫的豚鼠上吸食后的Rhipicephalusappendiculatus若虫蜱的非常强的效果；对于在64trp4免疫的豚鼠上吸食后的Rhipicephalus appendiculatus若虫和成体蜱没有效果。*融合蛋白即，包括26kD GST蛋白+1kD 9×HIS标记在内的分子量。φ融合蛋白，即，包括26kD GST蛋白在内的分子量。实施例4：对Rhipicephalus appendiculatus粘合蛋白64trp所产 生的抗血清的交叉反应性 4.1粘合蛋白疫苗的作用机制
如上文的实施例3所阐明，以R.appendiculatus 64trp的特定片段对豚鼠进行的免疫导致了成体雌性和若虫蜱完成吸食后的高死亡率。虫体变黑并且变得坚硬，这暗示了对这些蜱的消化道的损害并且提示了血食由消化道向体腔的泄漏。
为检验这种假说而进行了免疫印迹以测定这些针对蜱粘质片段的抗体是否同成体蜱的消化道和血淋巴中的抗原进行交叉反应以及是否同若虫和幼虫全身体抽提物中的抗原进行交叉反应。4.2结果
抗64trp2血清同粘合锥抽提物的22kD和25kD蛋白带发生反应(图10A)。该抗血清同唾液腺抽提物中的蛋白带(22、25kD)、血淋巴抽提物中的蛋白带(22、52kD)、若虫抽提物中的蛋白带(52、98kD)和幼虫抽提物中的蛋白带(52kD)(图10A)以及中肠抽提物中的蛋白带(52kD)(图11B)具有交叉反应性。
抗64trp5血清同粘合锥抽提物的31kD和48到70kD蛋白带发生反应(图11D)。该抗血清同未吸食蜱的唾液腺抽提物中的蛋白带(15、22和31；图11C)以及同吸食两天的蜱的唾液腺抽提物中的蛋白带(25、31kD；图11D)进行交叉反应。对中肠(52到70kD；图11C)和血淋巴(31、48kD；图11D)的蛋白带也检测出了交叉反应性，但对若虫和幼虫抽提物未检测出交叉反应性(图11D)。使用抗64trp3血清也观察到了类似的交叉反应(未示出)。
抗64trp6血清同粘合锥抽提物的22、25kD以及48-70kD蛋白带发生反应(图10B)。该抗血清同唾液腺抽提物中的蛋白带(22、25kD)、血淋巴抽提物中的蛋白带(22、48kD)和幼虫抽提物抽提物中的蛋白带(120kD)(图10B)以及中肠抽提物中的蛋白带(65到70kD；图10A)发生交联，但同若虫抽提物未表现出明显的交叉反应(图10B)。4.3结论
所产生的抗角蛋白样蛋白64trp R.appendiculatus蜱粘合蛋白片段的抗体很明显同成体雌性R.appendiculatus的唾液腺、中肠和血淋巴中的抗原性表位发生了交叉反应。在免疫动物上吸食的蜱的血食中的抗体同这些表位的反应可能导致了对中肠的损害，这引起了该蜱的死亡。对其中一只受累雌性蜱的解剖显示弥散在体腔中的凝结的血液，这同中肠的破裂相吻合。因此，尽管该疫苗含有蜱分泌的一种蛋白(即，暴露抗原)，但它通过靶定中肠中的一种“隐藏”抗原(即，影响正常生理功能)而导致了高死亡率，该抗原可能还位于血淋巴和唾液腺中。该粘质片段因此而提供了一种双作用疫苗。该疫苗：
(i)刺激一种炎症反应，该反应增强被接种的动物的免疫状态，并且
(ii)靶定可导致该蜱损伤的隐藏抗原。实施例5：使用免疫印迹测定的同其它蜱的交叉反应性
为确定所产生的抗R.appendiculatus蜱粘合蛋白的抗体是否同其它蜱物种的抗原性表位进行反应而用Rhipicephaluss anguineus(狗蜱)、Amblyomma variegatum(非洲、南美和加勒比地区的牛类的一种经济上重要的害虫)以及Ixodes ricinus(绵羊蜱或者木蜱，它向欧洲的人类传播莱姆病以及蜱携带的脑炎)的组织抽捉物进行了免疫印迹。5.1结果
抗64trp5血清同A.variegatum唾液腺抽提物中的蛋白带(180kD)以及中肠(25、52kD)和血淋巴(85kD)抽提物中的蛋白带进行交叉反应(图12A)。同R.sanguineus的唾液腺、血淋巴或者中肠未检测出交叉反应(未出示)。
抗64trp6血清同A.variegatum的血淋巴的50kD带进行交叉反应但同唾液腺和中肠制备物未显示出反应性(图12B)。对于R.sanguineus，交叉反应同多个唾液腺带(51、53-55、65、120kD)以及中肠(5、52和55kD)发生，但同血淋巴无交叉反应(图12C)。表现得模糊的交叉反应带可能是糖基化蛋白。
使用抗64trp3抗血清(图13A)在若虫抽提物中检测到了两条明显的带(a和b)以及一条模糊的带(c)，对成体血淋巴、中肠和唾液腺没有交叉反应性。
抗64trp2(图13B)的抗血清在R.sanguineus抽提物中检测到了数条带，包括一条存在于所有抽提物中的强带(j)。
针对GST而产生的对照抗血清在粘合锥以及唾液腺中中检测到了交叉反应带(图14)。根据关于Booophilus microplus的报道，唾液腺中的交叉反应可能为R.sanguineus的GST并且粘合锥中的交叉反应可能由于与污染了获自部分吸食的蜱的粘合锥抽提物的宿主血红蛋白/IgG的非特异性反应所导致。
抗64trp2和抗64trp5的抗血清均同I.ricinus粘合锥、中肠以及全若虫抽提物发生交叉反应。与之相对比，以抗64trp3的抗血清未检测出交叉反应。该观察结果不同于以R.sanguineus和A.variegatum的组织抽提物所观察到的交叉反应性。抗64trp6血清同I.ricinus的中肠和若虫亦具有交叉反应性。
这些结果概示于表35.2结论
所产生的针对R.appendiculatus粘合蛋白64trp构建体的抗体同另外三种硬蜱的唾液腺、中肠和血淋巴中的抗原性表位进行了交叉反应。这些结果表明来自于R.appendiculatus蜱粘质的候选疫苗提供了一种广谱疫苗，该疫苗有效地对抗多种不同的蜱物种。
根据所观察到的交叉反应性，R.appendiculatus的64trp6被选为一种用于疫苗试验的免疫原。如上文所示，在以R.appendiculatus进行的疫苗试验中(见表2)，64trp6有效地对抗了R.appendiculatus的若虫，但不对抗成体。因此，在以R.sanguineus进行的疫苗试验中，如下文的描述，64trp6中包含入了有效对抗成体R.appendiculatus的两种构建体(64trp3或者64trp2)之一。表3：使用来自于经过64trp重组蛋白免疫的豚鼠血清进行的对R.appendiculatus、R.sanguineus、Amblyomma variegatum以及Ixodes ricinus蜱抗原的交叉反应性的结果的概述。
抗血清                                                          蜱抗原
       R.appendiculatusCC   SG  gut   H    N    L        R.sanguineusCC  SG   gut   H    N      A.variegatumSG   gut   H    CC    I.ricinusCC   gut   N
有效对抗RA成体/若虫蜱(可溶抗原)的抗64trp2 ab′(64P的50aa N端片段)有效对抗RA成体蜱(可溶抗原)的抗64 trp3 ab′(64P的70aa N端片段)有效对抗RA成体蜱(可溶抗原)的抗64 trp5 ab′(64P的133aa全长克隆)有效对抗RA若虫蜱(变性抗原)的抗64trp6 ab′(64P的133aa全长克隆)抗GST ab′对照抗血清 +    +    +    +    +    ++    +    +    +    +    ++    +    +    +    -    -+    +    +    +    +    +-    +g  -    -    -    - +    +    +    +    ++    +    +    +    +-    -    -    -    --    +    +    -    -+*  +g -    -    - +    +    +    ++    +    +    ++    +    +    +-    +∞ +    ++g  -    -   -* +    +    ++    +    +-    +    ++*  +* -*
用于表3的符号CC＝蜱粘合锥抽提物，SG＝唾液腺抽提物(来自未吸食的蜱)，gut＝中肠抽提物，H＝血淋巴，N＝若虫蜱抽提物，L＝幼体蜱抽提物。+＝对用于免疫印迹的抗血清的阳性反应，-＝对用于免疫印迹的抗血清阴性反应；ab’＝抗血清；nd＝未进行。+*和+g＝CC和SG抽提物的不溶级分对抗GST抗血清的阳性反应，该级分于SDS样品缓冲液中在100℃下增溶。+*(来自经部分吸食的蜱的CC)＝免疫阳性带，该带可能由于抗GST ab’同结合于粘合锥的宿主IgG/血红蛋白级分非特异性结合所导致。+g＝(来自于未吸食蜱的SG)＝免疫阳性带，该带可能由于抗GST ab’同一种相当的GST蛋白(参考Booophilus microplus GST蛋白)的特异性结合所导致。+∞为A.variegatum的不溶消化道抽提物，该抽提物在SDS/2-巯基乙醇样品缓冲液中增溶。-*为非常微弱的免疫阳性带，该带由于若虫蜱抽提物抗原同GST抗血清的非特异性结合所导致。实施例6：交叉保护疫苗试验：以Rhipicephalus appendiculatus 粘合蛋白64trp构建体免疫并且以R.sanguineus成体进行侵袭的豚 鼠。 6.1用于疫苗试验的处理·组1：重组64trp6+64trp2+Montanide ISA(4只豚鼠)·组2：重组64trp6+64trp3+Montanide ISA(4只豚鼠)·组3：GST(对照)(2只豚鼠)·动物总数＝10途径和剂量将这些经过组合的抗原皮下接种入肩胛前区的单一位点，或者将各抗原皮下接种入不同位点。剂量：每只动物50μg抗原。接种方案：1.初次接种2.第一次加强3.接种后10到12天进行血液检验4.第二次加强(如果抗体滴度＜1/5000)5.接种后10到12天进行血液检验6.抗体滴度＞1/5000：以10对R.sanguineus成体进行侵袭7.评测蜱吸食表现、存活率、繁殖产出6.2结果
这些结果在表4中进行概述。总体上，这些结果表明所产生的对抗R.appendiculatus的粘合蛋白64trp的推测疫苗可进行防御成体和若虫R.sanguoneus的交叉保护。同先前对R.appendiculatus所观察到的结果有显著的差异。表4.对于在经过64TRP蛋白免疫的豚鼠和经GST免疫豚鼠上进行吸食的Rhipicephalus sanguoneu蜱的吸食参数的比较。
参数   用GST对照蛋白免疫M      F       N                                                      用以下成分免疫
              64trp2/6：C*         S*     S*  C*M     F      M    F     N    N                  64trp3/6：C*        S*     S*   C*M     F     M    F     N     N
附着率(％)吸食持续时间(天)附着位点的炎症I平均饱食重量(mg)死亡率(％)总蜱数卵重量(mg)/存活率E   100    100     10010-13  10-13   5-8-      -       -nd     207     nd0      0       9.28      10      293111/E   100   70    70    60    100  100nd    1-12  nd    1-10  5-8  5-8++    ++    ++    ++    +    +nd    195   nd    213   nd   nd0     80    30    40    37   3310    10    10    10    118  1560       121/E   90    80    100  70    100   100nd    1-13  nd   1-13  5-8   5-8+++   +++   ++   ++    +     +nd    203   nd   184   nd    nd10    30    0    36    30    18.810    10    10   11    100   12314/E       106/E
表4注解*为各自均经过64trp蛋白组合物(即，64trp2/6或者64trp3/6组合)免疫的豚鼠，该组合物以组合抗原注射入单一皮下位点(C)或者分离的皮下位点(S)。I指的是所观察到的吸食位点的局部炎症皮肤反应(短时，2-3天)，该炎症以红斑、水肿、抓痕以及淋巴结病显现。nd意为未进行。M和H分别指雄性和雌性成体蜱。E指孵化的卵。指的是该组中两只存活下来的蜱未产卵。-------------------------------(i)对附着的影响不同于R.appendiculatus，R.sanguineus成体在测试动物上的附着率受到了(但在对照则没有)影响。在侵染后24小时，所有4只动物上的大多数蜱未进行附着并且观察到它们在固定纱布上爬行似乎试图离开该宿主。随后，在吸食早期(1至5天)，从动物体上除去总数为16/81的死亡蜱(12只雌性以及4只雄性)；除一只以外，所有的这些蜱均表现得未进行吸食(图15)。在对照动物上的所有18只蜱均在侵染的24小时内进行了附着。(ii)对雄性的影响同样不同于R.appendiculatus，在雄性的存活率上管观察到了影响。如前所述，在早期吸食期间除去了4只死亡的雄性。(iii)炎症反应所有8只测试动物均在抗原接种位点以及蜱吸食部位表现出了一定的炎症反应。炎症最初在侵染后6-7天发现，并且在吸食9-10消退。在对照动物上未观察到炎症。(iv)吸食后的死亡率与对R.appendiculatus所观察到的相同，多数雌性(29/41)完成了饱食过程。但是，在这些雌性中有7只于附着2天内死亡。它们表现出同R.appendiculatus相类似的影响(过度膨胀和变黑)，这与消化道的损伤和破裂相一致(图16)。对测试动物上的若虫所观察到的中度死亡率与对照的情况形成了对比。(v)繁殖产出在来自于测试动物的22只存活的饱食雌性中有19只产卵。在此测定了这些数据的统计分析。6.3结论1.所产生的对抗64trp蛋白的抗体在免疫印迹中同R.Sanguineus蜱的唾液腺和中肠中的抗原性表位进行交叉反应。2.含有构建自R.appendiculatus的一种分泌粘合蛋白的不同64trp蛋白(即，“暴露”抗原)的疫苗混合物提供了对抗其它蜱R.sanguineus导致高死亡率的交叉保护，该交叉保护通过靶定成体蜱的中肠和唾液腺的“隐藏”抗原而进行。3.该混合疫苗刺激局部炎症免疫反应，该反应将加强度接种动物的免疫状态。实施例7：通过使用抗R.appendiculatus的粘合蛋白64trp构建体 的抗血清进行的免疫印迹检测得到的Rhipicephalus appendiculatus和Boophilus microplus之间的抗原交叉反应性 7.1B.microplus蜱抽提物的制备
从牛身上收集Boophilus microplus成体以及若虫。注意若虫经过了吸食并且因此可能由于宿主蛋白而表现出较高水平的非特异性交叉反应性。7.2结果
7.2.1同64trp2和64trp3抗血清之间的交叉反应
使用64trp3抗血清的免疫印迹而进行的交叉反应性研究(图17A)检测出了多种B.microplus粘合锥蛋白(c、i、j、k和l)；在中肠和唾液腺检测出了两条类似大小的带(c和h)。在经吸食的若虫的抽提物中检测到了多条带，其中一些可能为非特异性的带(见下文)。
通过使用64trp2抗血清(图17B)在所有的抽提物中检测到了一条明显的带(o)。该带的大小(62kD)类似于使用64trp3抗血清在所有样品中检测到的c带，尽管c带并非如此明显。c/o带在考马斯亮蓝染色的凝胶中几乎不能检测到(图17C)，这表明同64trp2或者64trp3抗血清的交叉反应性可能是特异性的并且并非由于非特异性结合所导致。与此解释相吻合的还有，64trp2和65trp3蛋白是具有重叠N-末端序列的相关构建体(见图2)。
使用64trp2抗血清在所有样品中检测到一条模糊的带(q)。粘合锥(泳道5)和若虫抽提物(泳道2)具有相同的明显的带(n和p)，而在所有的成体抽提物中检测到了r带。
名为e的免疫阳性带是最有可能由于抗GST抗血清同存在于蜱组织抽提物中的宿主蛋白(血红蛋白/IgG)的非特异性结合而导致的带。免疫阳性带f可能是由于抗GST血清(见图18C)同中肠、唾液腺和全蜱组织抽提物中的蛋白带的特异性结合所导致，该蛋白带为Boophilius microplus幼虫的26kD GST蛋白(见He et al.，(1999)，Insect-Biochem-Mol-Biol.29(80)：737-43)。7.2.2同64trp5和64trp6抗血清的交叉反应性
64trp5和64trp6抗血清均在若虫抽提物中检测到了数条带，但同成体蜱抽提物没有明显的交叉反应性(图18A和18B)。64trp5抗血清同粘合锥产生了一条显著的带(b)，但在64trp6和粘合锥抽提物之间未检测出交叉反应性。
名为a和e的免疫阳性带可能是由于抗GST血清分别同存在于经吸食的蜱的粘合锥抽提物以及全若虫抽提物中的宿主蛋白(血红蛋白/IgG)的非特异性结合而导致的带(图18C)。免疫阳性带f可能是由于抗GST血清同中肠、唾液腺和全蜱组织抽提物中的蛋白带的特异性结合所导致，该蛋白带很可能为Boophilius microplus幼虫的26kDGST蛋白。7.3结论
这些结果在表5中加以概括。
我们以R.appendiculatus、R.sanguineus以及Ixodes ricinus进行的的疫苗试验显示这些免疫印迹数据提供了有效疫苗免疫原的优良指示。在这一基础上，本实施例中的这些结果表明：(1)64trp2和64trp3为用于控制B.microplus成体和若虫的候选疫苗免疫原；(2)64trp5构建体可能会有效地对抗B.microplus若虫并且至少部分有效地对抗成体；(3)64trp6可能会有效地对抗B.microplus若虫，但不能对抗成体；(4)免疫原的混合可能是用于控制B.microplus的最有效的策略：64trp2+64trp5或者64trp3+64trp5。
表5：使用来自于经过64trp重组蛋白免疫的豚鼠的血清进行的对R.appendiculatus和Boophilus microplus蜱抗原的交叉反应性
抗血清                               蜱抗原
    R.appendiculausCC   SG   gut  H    N    L     B.microplusCC   SG  gut   N
有效对抗RA成体/若虫蜱(可溶抗原)的抗64trp2ab′(64P的50aaN端片段)有效对抗RS成体/若虫蜱(可溶抗原)的抗64 trp3ab′(64P的70aaN端片段)有效对抗RA成体蜱(可溶抗原)的抗64 trp5 ab′(64P的133aa全长克隆)有效对抗RA若虫蜱(变性抗原)的抗64trp6 ab′(64P的133aa全长克隆)抗GST ab′对照抗血清 +    +    +    +    +    +nd   nd   nd   nd   nd   nd+    +    +    +    -    -+    +    +    +    +    +-    -    -    -    -    - +    +    +    ++    +    +    ++    -    -    +-    -    -    ++*  +g +g  +g/+*
CC＝蜱粘合锥抽提物，SG＝唾液腺抽提物，gut＝中肠抽提物，H＝血淋巴，N＝若虫蜱抽提物，L＝幼体蜱抽提物。+＝对用于免疫印迹的抗血清的阳性反应，-＝对用于免疫印迹的抗血清阴性反应；ab’＝抗血清；nd＝未进行。+*和+g＝CC和SG抽提物的不溶级分对抗GST抗血清的阳性反应，该级分于SDS样品缓冲液中在100℃下增溶。+*(来自经部分吸食的蜱的CC)为免疫阳性带，该带可能由于抗GST ab’同结合于粘合锥以及来自于吸食蜱若虫的宿主IgG/血红蛋白级分非特异性结合所导致。+g＝(来自于未吸食蜱的SG)为免疫阳性带，该带可能由于抗GST ab’同一种相当的GST蛋白1的特异性结合所导致。实施例8：交叉保护疫苗试验：经Rhipicephalus appendiculatus 粘合蛋白64trp构建体免疫并且以I.ricinus进行侵袭的豚鼠 8.1免疫原的选择
图2出示了R.appendiculatus 64trp的粘质构建体的一个概述。根据抗该构建体的抗血清是否在I.ricinus的抽提物中检测到特异性交叉反应的抗原而鉴定候选免疫原。
使用以64trp抗血清进行的免疫印迹而进行的交叉反应性研究显示了对数种I.ricinus全若虫以及幼体抽提蛋白(图19)以及粘合锥和中肠抽提物的成体制备物(未示出)的检测。
使用64trp2抗血清(图19A(iii))在若虫抽提物中检测到了两条主要带(a和b)，并且其对成体粘合锥以及中肠抽提物也具有交叉反应性(见表3)。
64trp5和64trp6的抗血清(分别为图19A(iv)和(v))在I.ricinus全若虫抽提物中检测到了数条带。抗64trp6的抗血清还在全幼虫抽提物中检测到了5条显著的带(图19B(ii))。
所产生的抗GST对照抗血清在全若虫、粘合锥以及中肠抽提物中检测出了十分微弱的带，这些带可能是由于同宿主蛋白血红蛋白/IgG的非特异性反应所导致。
在所观察到的交叉反应性的基础上，R.appendiculatus的64trp2、64trp5和64trp6被选择用作疫苗试验的免疫原。这些免疫原被单独使用或者混合使用。8.2用于疫苗试验的处理·组1：重组64trp6+64trp2+Montanide ISA(1只仓鼠)·组2：重组64trp6+64trp5+Montanide ISA(1只仓鼠)·组3：GST(对照)(1只仓鼠)·组4：重组64trp2+Montanide ISA(1只仓鼠)·组5：重组64trp5+Montanide ISA(1只仓鼠)·组6：重组64trp6+Montanide ISA(1只仓鼠)总动物数＝68.3途径和剂量
将各抗原单独皮下接种入肩胛前区，或者将这些经过组合的抗原皮下接种入的单一位点。
剂量：每只动物25μg抗原。8.4接种方案：1.初次接种2.第一次加强3.接种后10到12天进行血液检验4.第二次加强(如果抗体滴度＜1/5000)5.接种后10到12天进行血液检验6.抗体滴度＞1/5000：以50-100只I.ricinus若虫进行侵袭7.评测蜱吸食表现、对吸食的局部炎症反应、存活率以及随后向成体的蜕变。8.5结果
这些结果在表6中进行概括。总体上，这些结果表明所产生的对抗R.appendiculatus的粘质的推测疫苗具有对抗I.ricinus若虫的交叉反应性。(i)对附着的影响
同R.appendiculatus类似，I.ricinus若虫在测试动物上的附着率未受影响。(ii)炎症反应
4只仓鼠在蜱吸食位点表现出了炎症反应，其中3只具有严重的反应(图20)。这些结果同体外分析(即，Western印迹)相一致。炎症在侵染后3-5天被观察到，并且在蜱脱离时(吸食第5天)依然存在。在对照动物上未观察到炎症。(iii)吸食后的死亡率
与体外分析有关的交叉保护将在若虫蜕变成为成体时进行估测。8.6结论1.所产生的抗64trp蛋白的抗体在免疫印迹中与I.ricinus蜱的若虫、幼体和成体粘合锥和中肠中的抗原性表位发生交叉反应。2.在经过64trp免疫原进行免疫的仓鼠体内观察到了宿主反应(此前仅仅在豚鼠中得到这些观察结果)。3.I.ricinus若虫蜱在经过64trp构建体免疫的动物上的吸食位点上观察到了不同程度的炎症反应，以64trp6/5混合物进行免疫的仓鼠体内观察到了最严重的反应。4.这些免疫原刺激了局部炎症免疫反应，该反应将加强免疫应答。表6：对于在经过64TRP蛋白免疫的仓鼠和经GST免疫仓鼠上进行吸食的I.ricinus蜱的吸食参数的比较。
参数   用GST免疫                        用以下成分免疫
64trp2  64trp2/6    64trp5    64trp5    64trp5/6
附着(％)吸食时间(天)附着位点的炎症I死亡率(％)总蜱数     1004-5*+18149     100    100        100        100       1003-5    3-5        3-5        3-5       3-5-      -          ++         +++       +34.9   63.6       34.2       29.3      25.763     36         73         143       136
i＝炎症：-和+分别指在吸食期间在蜱附着位点缺乏或者存在炎症；炎症的程度表示为：+＝轻微，++＝中度，+++＝严重。*指若虫I.ricinus蜱在对照仓鼠上的吸食，该吸食同在经过64trp蛋白免疫的仓鼠上进行的吸食相比延长了6个小时。

Claims (21)

1.一种疫苗组合物，该组合物含有一种免疫原性的蜱粘合蛋白、其片段或者其功能等价物，该蛋白、片段或者功能等价物与一种药学上可接受的赋形剂结合。
2.权利要求1的一种组合物，其中所述的蜱粘合蛋白、其片段或者其功能等价物含有一种免疫原性表位，该表位存在于除所述免疫原性粘合蛋白、其片段或者其功能等价物所来源的蜱物种之外的某种吸血的外寄生虫物种的一种或者多种定向进化同源粘合蛋白之中。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述的蜱粘合蛋白含有一种免疫原性表位，该表位还存在于一种吸血外寄生虫的消化道蛋白中。
4.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述的吸血外寄生虫为蜱、蚊子、水蛭、马蝇、采采蝇、跳蚤、虱或螨。
5.前述权利要求中任意一项的组合物，该组合物有效地对抗成体以及未成熟形式的吸血外寄生虫。
6.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述的蜱粘合蛋白来源于蜱物种Rhipicephalus appendiculatus、R.sanguineus、Amblyomma variegatum、Boophilus microplus、B.annulatus、Ixodes ricinus、I.persulcatus以及I.Scapularis中的任意一种。
7.权利要求6的组合物，其中所述的蜱粘合蛋白来源于蜱R.appendiculatus。
8.前述权利要求中任意一项的组合物，该组合物含有克隆21、克隆33、CemA、克隆24、克隆68、克隆64以及克隆I蛋白或其片段中的任意一种作为活性成分。
9.前述权利要求中任意一项的组合物，该组合物含有64trp粘合蛋白、其片段或者其功能等价物作为活性成分。
10.权利要求9的组合物，其中所述的片段为64trp1、64trp2、64trp3、64trp4、64trp5或64trp6或者其功能等价物中的任意一种。
11.权利要求10的组合物，其中所述的片段为64trp2、64trp6或者其功能等价物。
12.前述权利要求中任意一项的组合物，其中所述的蜱粘合蛋白以重组形式表达。
13.前述权利要求中任意一项的组合物，该组合物额外含有第二种活性试剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述第二种活性试剂为来源于一种吸血外寄生虫的第二种免疫原性蛋白或者蛋白片段。
15.前述权利要求中任意一项的组合物，该组合物额外含有一种佐剂。
16.一种抗体或者抗血清，该抗体或者抗血清同一种蜱粘合蛋白具有反应性。
17.权利要求13的抗体或者抗血清，其中所述的蜱粘合蛋白为权利要求1-12中任意一项所列举的任意一种粘合蛋白、片段或者功能等价物。
18.生产权利要求16或者权利要求17的抗体或者抗血清的方法，该方法包括以权利要求1-15中任意一项所列举的疫苗组合物对动物进行免疫。
19.一种对动物进行抗吸血外寄生虫免疫的方法，包括给予所述动物权利要求1-15中任意一项所列举的疫苗组合物。
20.一种用于疫苗的蜱粘合蛋白、其片段或者其功能等价物。
21.蜱粘合蛋白作为一种疫苗的成分的用途。
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