MXPA02010417A - Vacuna que comprende una proteina cemento de garrapata. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de proteinas cemento de garrapatas en la produccion de vacunas para proteger animales contra la picadura de ectoparasitos que se alimentan de sangre y contra la transmision de virus, bacterias y otros patogenos por tales ectoparasitos. Cuando se usan como componentes de vacunas, la proteina cemento de garrapata de la invencion confiere amplia reactividad reciproca contra una variedad de especies de ectoparasitos.

Description

VACUNA QUE COMPRENDE UNA PROTEINA CEMENTO DE GARRAPATA La presente invención se refiere al uso de una proteina cemento de garrapata en la producción de vacunas para proteger animales contra la mordedura de ectoparásitos que succionan la sangre y contra la transmisión de virus, bacterias y otros patógenos por tales ectoparásitos. Los ectoparásitos que succionan la sangre, tales como mosquitos y garrapatas, son extremadamente efectivos como transmisores de padecimientos. Por ejemplo, las especies de garrapatas R. appendiculatus representan un obstáculo principal para el desarrollo de ganado en varias regiones del sub-Sahara, transmitiendo el parásito protozoario Theileria parva el cual causa la Fiebre de la Costa Del Este, usualmente fatal. Este padecimiento es a menudo considerado el padecimiento más importante del ganado (Norval et al . , 1992a; Norval et al . , 1992b). Esta garrapata es también el vector principal del virus que causa el padecimiento de la oveja Nairobi, una incapacidad y a menudo padecimiento mortal en ovejas y cabras (Davies, 1988) . Además, las plagas de garrapatas R. appendicula tus y otras plagas de garrapatas causan daño considerable a la piel de los animales, con ello se afecta a ¿a industria del cuero. De manera convencional, las técnicas para controlar las poblaciones de garrapatas han usado el tratamiento de REF.: 142801 animales con químicos tales como acaricidas. Esta estrategia ha resultado en el desarrollo de garrapatas resistentes, significando que deba introducirse una nueva clase de químicos. Además, los químicos tienen poco efecto residual, significando que deben ser aplicados frecuentemente. Un segundo procedimiento es reproducir animales resistentes a las garrapatas, pero el grado de resistencia que resulta está lejos de lo ideal. En un esfuerzo por combatir los padecimientos transmitidos por los parásitos, se han hecho un número de intentos para inmunizar animales contra las garrapatas usando extractos de garrapatas completas o de intestino de garrapata. Ciertos reportes han usado proteínas recombinantes de garrapatas (véase por ejemplo, solicitud de patente Internacional O88/03929) . Sin embargo, debido a tales desarrollos, las únicas vacunas de garrapatas comercialmente disponibles son activas solamente contra el estado adulto de garrapatas B. micropl us y muestran variación en la eficacia dependiendo de la ubicación geográfica de estas especies. No se han desarrollado aún vacunas que proporcionen resistencia contra las poblaciones enteras de animales vacunados o contra parásitos en cada estado de su ciclo de vida. Existe por lo tanto, una gran necesidad de una vacuna efectiva para combatir padecimientos que son transmitidos por ectoparásitos que se alimentan de la sangre. De manera sorprendente, se ha descubierto ahora que las proteínas cemento de garrapata son empleadas como componentes de vacunas . Sumario de la Invención De conformidad con la presente invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende una proteina cemento inmunogénica de garrapata, un fragmento de la misma o un equivalente funcional de la misma, en conjunto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. La inmunización de un animal con tal vacuna se muestra aqui por causar la generación de anticuerpos que son efectivos contra una amplia variedad de especies de ectoparásitos. Existe un gran número de especies de ectoparásitos en varias partes del mundo, aunque su incidencia tiende a ser concentrada en regiones tropicales y subtropicales, en donde las mismas, y padecimientos portados por ellas, son endémicos. Estas especies varian mayormente en el tipo y adoptan estrategias de alimentación que difieren ampliamente, variando de alimentadores pasajeros tales como mosquitos, tábanos, mosca tsetse, pulgas, piojos y ácaros, hasta sanguijuelas y garrapatas, algunas de las cuales se pueden alimentar por periodos prolongados de tiempo. Todos estas especies de ectoparásitos son objetivos adecuados para las vacunas de la invención. Las vacunas de la invención son particularmente eficaces contra las especies de garrapatas. Ejemplos de tales especies de garrapata de objetivo son Rhipicephal us appendi culatus , R. sanguineus, R. bursa , Amblyomma vari ega tum, A. americanum, A. cajennense, A. hebraeum, Boophil us micropl us, B. annulatus, B. decoloratus, Dermacentor reticulatus, D. andersoni , D. marginatus, D. variabilis , Haemaphysalis inermis, Ha . leachii , Ha . punctata , Hyalomma anatolicum anatolicum, Hy. dromedarii , Hy. marginatum margina tum, Ixodes ricinus, I. persulcatus, J. scapularis , I. hexagonus, Argas persicus, A. reflexus, Orni thodoros erra ticus, O. moubata mouba ta , O. m. porcinus y O. savignyi . Lo que es común entre todas las especies de ectoparásitos mencionadas anteriormente, es que ingieren ya sea sangre, linfa o se alimentan en productos hospederos de la piel, significando que cualquier anticuerpo presente en su hospedero es automáticamente internado en el ectoparásito. Esto proporciona una via ventajosa y automática de administración para un anticuerpo y, siempre que el anticuerpo sea reactivo contra una proteina ectoparásita, significa que un régimen de inmunización bien organizado puede resultar en la completa erradicación del parásito dentro del área relacionada. Los ectoparásitos que se alimentan de la sangre son particularmente objetivos preferidos para las vacunas de la invención.

Los inventores han descubierto un número de diferentes proteínas cemento de garrapata y, en muchos casos, han clonado sus genes de codificación. Por ejemplo, la solicitud de Patente Internacional PCT/GB98/03397, el contenido de la cual está incorporado aqui en su totalidad, describe el aislamiento de un número de proteínas cemento de tejido y discute su uso en medicina como componentes de cemento de tejido para uso en la cirugía de piel y sanación de heridas, y para el enlace temporal o permanente de tejidos humano o animal de entre si o a otros materiales biológicos. Las garrapatas Ixodides (duras) son parásitos hematófogos que se fijan ellos mismos a un hospedero vertebrado por medio de un 'cono de cemento' , que se origina a partir del ácino tipo II y tipo III de las glándulas salivales de la garrapata (Kemp et al . , Walker et al . , 1985). El cemento que forma el cono es una secreción blanco lechosa que es inyectada en la piel de los animales en los cuales estos parásitos se alimentan. El cemento comprende un número de componentes de carbohidratos y proteínas que interactúan. El cemento se esparce dentro del sitio de mordedura y sobre la piel y, después del endurecimiento, se asegura que las partes de la boca permanezcan firmemente ancladas al hospedero durante el periodo de alimentación, el cual típicamente dura 4 a 8 dias. El cono de cemento funciona adicionalmente como un empaque para prevenir el derrame de fluidos dentro del sitio de la mordedura durante la alimentación. El cono de cemento de garrapata es una estructura en capas, construida de dos tipos principales de cemento. El primer tipo de cemento se produce justo minutos después de establecer el sitio de la mordedura y se endurece rápidamente para formar un centro' rigido del cono. Un segundo tipo de cemento es secretado después, alrededor de 24 horas después de la fijación, y endurece más lentamente para formar una ^corteza' más flexible. En garrapatas adultas, la producción de cemento típicamente continúa hasta el 3er. o 4to. dia después de la fijación (Kemp et al . , 1982; Sonnenshine et al . , 1991) . La composición del cemento de garrapata parece ser similar entre las diferentes especies de garrapata Ixodide. Por ejemplo, un antisuero promovido contra una proteina salival de 90kD de la garrapata marrón de la oreja, Rhipicephal us appendicula tus, ha mostrado reconocer péptidos a partir de las glándulas salivales y las proteínas cemento de la garrapata del perro Americano, Dermacenter variabilis, la garrapata estrella sola, Amblyomma americanum, y la garrapata marrón del perro, R. sanguineus (Jaworski et al . , 1992) . Los componentes de cemento no purificados han sido sometidos a prueba previamente como inductores de la resistencia a hospederos (Brown et al . , 1986; Shapiro et al . , 1989) , pero no se han desarrollado vacunas confiables basadas en estas proteínas. En un sentido, esto no es sorprendente, debido a que las relaciones de secuencia indican que la proteina cemento se ha diseñado para parecerse a las proteínas de la piel del hospedero, con el objetivo más probable de evitar el rechazo de la piel a la fijación de la garrapata por los mecanismos de defensa inmunes naturales del hospedero. El parecido composicional de ciertas proteínas de garrapata con sus tejidos circundantes puede también facilitar el enlace intimo entre el cono de cemento y los tejidos de la piel circundantes. Las proteínas cemento de garrapata adecuadas para la incorporación en las vacunas de la invención pueden derivarse de cualquiera de las especies de garrapata adecuadas, tal como las especies Rhipicephal us appendiculatus , I. ricinus, Dermacenter reticulatus, Dermacenter variabilis, Amblyo ma americanum, Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma variegatum, Boophilus microplus, y Haemaphysalis leachii . En una modalidad preferida, la proteina cemento de garrapata se deriva de la garrapata R. appendiculatus . Ejemplos de proteínas cemento de garrapata particularmente adecuadas para inclusión en las vacunas de la invención se dan aqui y también en la solicitud de patente PCT/GB98/03397. Estas proteínas cemento incluyen proteínas referidas como clon 21, clon 33, CemA, clon 24, clon 68, clon 64 y clon I . Las secuencias de aminoácido predichas de estas proteínas están identificadas en la Figura 1 aqui. Preferiblemente, la proteina cemento de garrapata, fragmento de la misma o un equivalente funcional de la misma, usadas en la composición de vacuna de la invención, deben contener un epitope inmunogénico que está presente en una o más proteínas ortólogas de especies ectoparásitas que se alimentan de la sangre, preferentemente las especies de garrapata a partir de las cuales las proteínas cemento inmunogénicas, fragmento o equivalente funcional de la misma se derivan. Esto significará que una sola composición de vacuna puede ser efectiva como una vacuna de amplio espectro contra todas las especies de ectoparásitos que producen una proteina que contiene el epitope común. Por ejemplo, en ciertas 'áreas, un número de especies de garrapatas diferentes son endémicas y causa un problema de plaga significante para la industria agrícola. La biodisponibilidad de una vacuna única que es efectiva contra un número de especies diferentes de garrapatas reducirá el costo de administración de la vacuna y de este modo será ventajosa sobre vacunas actualmente disponibles. Las vacunas de este aspecto de la invención son de este modo particularmente ventajosas debido a que es estimulada una respuesta inflamatoria que incrementará el estado inmune de los animales vacunados y, además, dirigirá antigenos disimulados, asi resultando en daño a la garrapata misma. Se han descubierto ciertas proteínas cemento de garrapata, y fragmentos de estas proteínas, de conformidad con un aspecto de la presente invención, por contener epitopes que también existen en proteínas que están presentes en los intestinos y hemolinfa de especies ectoparásitas. Esta reactividad reciproca hace a las vacunas de esta invención particularmente ventajosas, puesto que la ingestión de sangre, y de este modo anticuerpos hospederos en el ectoparásito garantiza el suministro del agente activo al parásito. De esta manera, las vacunas de la invención se dirigen a especies que se alimentan transitoriamente, tales como mosquitos y tábanos, tan eficientemente como aquellas especies que permanecen fijas a sus hospederos por un periodo significante de tiempo, tal como garrapatas. Una proteina particularmente preferida para la inclusión via una vacuna de conformidad con la invención, es la proteina clon 64 (posteriormente 64P) , un fragmento de la misma, o un equivalente funcional de la misma, por ejemplo, aislada a partir de especies preferentemente R. appendicula tus . Esta proteina posee una secuencia tipica de una proteina estructural, y parece ser secretada en la saliva de las garrapatas. La secuencia que comprende los primeros 40 aminoácidos de la proteina cemento es fuertemente similar al colágeno, en tanto el resto de la secuencia se asemeja a la queratina. Las investigaciones de homología conducidas con la secuencia de esta proteina, revelan que el nivel más alto de homología para todas las secuencias buscadas en la base de datos de Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) fue de 51%, para la subunidad I de queratina epidérmica de ratón. La proteina es rica en glicina y contiene varias repeticiones de la porción (C/S) 1-4 (Y/F), que se asemeja a las proteínas estructurales de Drosophila melanogaster (proteina circular) y otras cascaras de huevo de insectos, asi como también citoqueratinas de vertebrados que incluyen la proteínas básica del complejo 2 de queratina de mamífero, queratina de ratón, queratina humana, colágeno tipo IV alfa, y precursor IPIB2. En una modalidad de la invención, las equivalentes funcionales de las proteínas de garrapata pueden ser incluidas en las composiciones de vacuna. El término "equivalente funcional" es usado aqui para describir aquellas proteínas que tienen una función análoga a las proteínas cemento llamadas clon 21, clon 33, CemA, clon 24, clon 68, clon 64 y clon I. Las proteínas funcionalmente equivalentes pueden pertenecer a la misma familia de proteínas como estas proteínas. Por familia de proteina se sugiere un grupo de polipéptidos que comparten una función común y presentan homología de secuencia común entre las porciones que están presentes en las secuencias de polipéptidos. Por "secuencia de homología" se entiende que las secuencias de polipéptidos que están relacionadas por divergencia a partir de un antecesor común. En particular, las proteínas y proteínas parciales identificadas aqui poseen ciertas secuencias en común que son repetidas varias veces a través de la secuencia de la proteina. Preferiblemente, la homología entre las secuencias de polipéptidos en la misma familia de proteínas es al menos de 30% a través del total de la secuencia de amino ácido de la proteina. De manera más preferible, la homología es al menos de 50%, al menos 60%, o al menos del 70% a través del total de la secuencia de amino ácido de la proteina. Aún de manera más preferible, la homología es mayor que 80%, 95%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a través del total de la secuencia de amino ácido de proteina. Por "función análoga" se entiende primeramente que las proteínas han retenido la capacidad para formar un cemento, al menos cuando se presentan con otras proteínas cemento. En combinación con otros constituyentes de cemento necesarios, tales proteínas serán capaces de este modo de endurecerse sobre un periodo de tiempo para formar una masa o pegamento sólido. Segundamente, este término se puede referir a proteínas que son estructuralmente similares a proteínas cemento y asi contienen epitopes similares o idénticos. Equivalentes funcionales de proteínas cemento de tejidos, incluyen mutantes que contienen sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre, siempre que se retenga la inmunogenicidad. Equivalentes funcionales con inmunogenicidad mejorada a partir de la secuencia de proteina de tipo silvestre, pueden también ser designadas a través de la mutación sistémica o dirigida de residuos específicos en la secuencia de la proteina. Equivalentes funcionales incluyen proteínas que contienen sustituciones conservativas de amino ácidos que no afectan la función o la actividad de la proteina en una manera adversa. Este término se entiende también por incluir variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las especies a partir de las cuales se derivan la proteínas cemento de los tejidos) . De conformidad con la invención, fragmentos de proteínas cemento de garrapata están también contempladas como componentes adecuados para la inclusión en las composiciones de vacunas. Por ejemplo, extensiones cortas de péptido derivado de porciones inmunogénicas de proteínas cemento de garrapata se pueden usar de manera particular como inmunógenos. Tales extensiones cortas de secuencia polipéptida son simples para producir en grandes cantidades, ya sea sintéticamente o a través de medios recombinantes. Fragmentos de proteina se pueden preferir en muchos ejemplos para usarse en las vacunas de la invención, puesto que estos fragmentos son probablemente plegados en conformaciones no adoptadas por la secuencia de longitud completa de tipo silvestre. Puesto que algunas proteínas cemento son probablemente cubiertas como para asemejarse a los tejidos de la piel del hospedero y de este modo evitar provocar una respuesta inmune del hospedero contra la garrapata, tales formas anormales de proteínas cemento de garrapata son probablemente para ser de uso particular en las vacunas de la presente invención. Ejemplos de fragmentos de proteínas cemento de garrapata útiles para la inclusión en las composiciones de vacunas de la invención incluyen fragmentos varios de la proteina 64P que ha sido generada recombinantemente por los inventores, y los equivalentes funcionales de estos fragmentos, tal como homólogos cercanos y mutantes del tipo arriba descrito. Como será evidente para el lector experto, fragmentos similares a estos que son divulgados explícitamente aqui, se pueden preparar de especies de ectoparásitos diferentes de las especies de garrapata R. appendiculatus .

Los detalles de los fragmentos de R. appendiculatus descritos aqui son como sigue. El fragmento llamado 64trpl es un pequeño fragmento C-terminal de la proteina 64P que consiste de 29 aminoácidos clonados como una proteina de fusión de etiqueta gltationa-s-transferasa (GST) /histidina, con un peso molecular de alrededor de 30 kDa. El fragmento llamado 64trp2 se refiere a un pequeño fragmento N-terminal de la proteina 64P que consiste de 51 aminoácidos clonados como una proteina de fusión de etiqueta glutationa-s-transferasa (GST) /histidina con un peso molecular de alrededor de 33 kDa. El fragmento llamado 64trp3 se refiere a un fragmento N-terminal más largo de la proteina 64P que consiste de 70 aminoácidos clonados como una proteina de fusión de etiqueta glutationa-s-transferasa (GST) /histidina con un peso molecular de alrededor de 36 kDa. El fragmento llamado 64trp6 se refiere al clon de longitud completa de la proteina 64P que consiste de 133 aminoácidos clonados como una proteina de fusión de etiqueta glutationa-s-transferasa (GST) /histidina. Este fragmento tiene un peso molecular aproximado de alrededor de 42 kDa. El fragmento llamado 64trp4 es un fragmento C-terminal de la proteina 64P que consiste de 63 aminoácidos clonados como una proteina de fusión de etiqueta glutationa- s-transferasa (GST) /histidina con un peso molecular de alrededor de 35 kDa. El fragmento llamado 64trp5 es un clon de longitud completa de la secuencia de la proteina 64P que consiste de 133 aminoácidos clonados como una proteina de fusión GST (es decir, sin la etiqueta histidina) . Esta proteina tiene un peso molecular 41 kDa. Estos fragmentos de proteina, y equivalentes funcionales de la misma, son componentes que se prefieren de manera particular para la incorporación en las vacunas de la invención. Estos fragmentos se pueden expresar como proteina soluble, o de manera alternativa se puede expresar en cuerpos de inclusión y purificarse bajo condiciones desnaturalizantes. Por ejemplo, el constructo 64trp6 como se aisló de R. appendi culatus se ha preparado como una proteina desnaturalizada expresada en cuerpos de inclusión y demuestra ser inmunogénica en esta forma. La inmunización con estos fragmentos de proteina, seguida por la incursión de ectoparásitos, resulta en la inflamación en el sitio de fijación y la muerte subsecuente del ectoparásito. El lector experto apreciará que la presencia de la secuencia de etiqueta GST y HIS heteróloga es meramente para conveniencia de la producción de proteina.

Estas extensiones de secuencia no se consideran esenciales a este aspecto de la invención.

De manera convenientemente, las vacunas contienen de conformidad con la invención, una proteina cemento de garrapata, fragmento de la misma o equivalente funcional de la misma, expresadas en forma recombinante. La proteina expresada de manera recombinante es barata para producir y, usando ahora las técnicas estándares de ingeniería genética, permite la manipulación simple de secuencias de genes para dar un producto de proteina deseada. Se prefiere que las vacunas de la invención sean efectivas contra las formas tanto inmaduras como adultas del ectoparásito. El término "inmaduro" significa incluir las formas tanto larvales como ninfales del ectoparásito. Esto significa que la población entera de ectoparásito se pueda dirigir usando la vacuna, incrementando asi la eficiencia de erradicación de ectoparásitos. Las vacunas pueden específicamente dirigirse a formas adultas o inmaduras de ectoparásitos, pero preferiblemente se dirigirán a todos los estados parasíticos del ciclo de vida. De los fragmentos ejemplificados de manera especifica aqui, animales inmunizados con 64trp2-, 64trp3-, 64trp5- y 64trp6- causaron mortalidad significativa en ninfas de garrapatas o garrapatas adultas o ambas ninfas y adultas, dependiendo de las especies de garrapatas, y estos fragmentos son de este modo, preferidos de manera particular. Un cóctel de 64trp2 + 64trp6 fue efectivo contra las formas tanto inmaduras como adultas de ectoparásitos de garrapata; estos fragmentos particulares usados en combinación son de este modo, preferidos de manera particular para la inclusión en una vacuna de conformidad con la invención. De conformidad con una modalidad adicional de la invención, se proporciona una vacuna cóctel que comprende dos o más proteínas cemento de garrapata, fragmentos o equivalentes funcionales, en conjunción de manera opcional con un adyuvante. Se puede usar cualquiera de dos o más proteínas cemento inmunogénicas de garrapata, fragmentos de proteina o equivalentes funcionales como componentes de tales vacunas cóctel, y pueden ser de la misma o diferentes especies de garrapata. Por ejemplo, se puede desear generar una vacuna que se dirija de manera especifica a más de un ectoparásito, o que dirija proteínas diferentes del mismo ectoparásito. De esta manera, puede ser posible generar una vacuna más eficaz con una mayor cobertura de especies. De manera particular, las combinaciones preferidas de componentes incluyen la combinación de 64trp2, 64trp3, 64trp5 y 64trp6, la combinación de 64trp2 y 64trp6 y la combinación de 64trp3 y 64trp6. Estas combinaciones se demuestran aqui por poseer una eficacia particular en el objetivo de garrapatas adultas e inmaduras y en el otorgamiento de resistencia en la cruza de especies. Las composiciones de vacunas de acuerdo a la invención pueden también comprender agentes adicionales, por ejemplo, moléculas que el ectoparásito usa para promover la transmisión del patógeno, tal como reguladores de interferona, inhibidores de complemento, reguladores de la quimocina y proteínas enlazantes de inmunoglobulina. De esta forma, otras moléculas bioactivas que se liberan de las glándulas salivales de ectoparásitos se pueden reconocer como ajenas por el sistema inmune del hospedero y montan una respuesta inmune. Un aspecto adicional de la presente invención comprende una vacuna que contiene una proteina cemento de garrapata fusionada a otra molécula, tal como una etiqueta, una toxina u otra molécula bioactiva o inmunogénica. Candidatos particularmente adecuados para la fusión pueden ser una molécula tal como una glutationa-s-transferasa o una etiqueta histidina, aunque pueden también ser adecuadas la luciferasa, la proteina verde fluorescente o peroxidasa de rábano picante. Se pueden usar también moléculas enlazadoras tal como estreptavidina o biotina, por ejemplo, para facilitar la purificación de la proteina cemento. Las proteínas de fusión se pueden crear químicamente, usando métodos tal como enlaces químicos de reticulación. Tales métodos serán bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y pueden comprender, por ejemplo, reticulación de los grupos tiol de residuos de cisteina. Los enlaces químicos de reticulación serán usados en la mayoría de los ejemplos, para fusionar la proteina cemento del tejido a moléculas no-proteinicas, tal como etiquetas . Cuando se desea fusionar una proteina cemento del tejido a otra molécula de proteina, el método de selección será de manera general para fusionar las moléculas genéticamente. De manera que para generar una proteina de fusión recombinante, los genes o porciones de gen que codifican las proteínas o fragmentos de proteínas de interés, son diseñados genéticamente para formar un gen continuo arreglado de manera que los codones de las secuencias de los dos genes se transcriban en las estructuras. La inmunización con antigenos específicos que codifican al ADN plásmido, puro, se han reconocido recientemente como un método eficiente de presentación de antigenos al sistema inmune mamario, resultando en respuestas fuertes inmune celular y humoral (Ulmer et al . , Science 1993, 259, 1745-1749) . Esta técnica, también referida como una vacunación de ADN, se ha aplicado satisfactoriamente para generar anticuerpos dirigidos contra proteínas diversas derivadas de los virus. (Ulmer et al . , loe ci t . ; Cox et al . , J. Virol. 1993, 67, 5664-5667; Fynan et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. 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Basada en la evidencia disponible, la inmunización con ADN plásmido que codifica las varias proteínas cemento de garrapata es probablemente una técnica útil para mejorar además los efectos de la vacuna anti-garrapata. El método podria involucrar la inyección directa del hospedero con un vector de expresión eucariótico tal que una o más proteínas cemento se expresen por una transcripción in vivo después de la traducción de la secuencia correspondiente con el hospedero vacunado (humanos, ganado, u otros animales) . Las vacunas de cualquiera de los aspectos arriba descritos de la invención, pueden comprender adicionalmente un adyuvante. Los adyuvantes adecuados para aumentar la efectividad de las proteínas inmunogénicas incluyen de conformidad con la presente invención, pero no se limitan a, formulaciones de emulsión de aceite-en-agua (incluyendo de manera opcional otros agentes inmunoestimulantes específicos tal como péptidos muramilo o componentes de la pared celular bacteriana) , tal como por ejemplo (a) estas formulaciones descritas en la Publ. PCT No. WO 90/14837. Otros adyuvantes adecuados serán conocidos del experto en la técnica e incluyen adyuvantes de Saponina, tal como StimulonMR (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) , Montanido ISA 50, citocinas, tal como interleucinas, interferonas, factor de estimulación de la colonia del macrófago (M-CSF) o factor necrosis del tumor (TNF) . De conformidad con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal que es reactivo con una proteina cemento de garrapata. Por "reactivo significa que el anticuerpo se enlaza a uno o más epitopes de garrapata con una afinidad de al menos 10"8M, de manera preferible de al menos 10-9M, más preferiblemente de al menos 10"10M. De conformidad con una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo o antisuero es reactivo contra cualquiera de una o más de las proteínas cemento, fragmentos o equivalentes funcionales que se mencionan de manera especifica arriba. Este aspecto de la invención incluye un método para la producción de tal anticuerpo o un antisuero, que comprende inmunizar a un animal con una proteina cemento de garrapata, fragmento de la misma, o equivalente funcional de la misma, como se lista en cualquiera de los aspectos de la invención descritos con anterioridad. De conformidad con un aspecto todavía adicional de la invención, se proporciona un proceso para la formulación de una composición de vacuna que comprende la producción de una proteina cemento de garrapata, un fragmento o un equivalente funcional en asociación con un portador aceptable farmacéuticamente, en conjunto de manera opcional con un adyuvante . De conformidad con un aspecto todavía adicional de la invención, se proporciona un método para inmunizar un mamífero contra un padecimiento transmitido por un ectoparásito o contra un ectoparásito que se alimenta de la sangre, que comprende administrar a un animal, una vacuna de conformidad con cualquiera de los aspectos de la invención descritos con anterioridad. La invención proporciona también una proteina cemento de garrapata, fragmento de la misma, o equivalente funcional de la misma, para usarse en una vacuna. La invención proporciona además el uso de una proteina cemento de garrapata como un componente de una vacuna. Aspectos y modalidades varias de la presente invención se describirán ahora con mas detalle a manera de ejemplo, con referencia particular a las proteínas cemento de garrapata aisladas de garrapatas, y de manera especial de Rhipi cephal us appendiculatus . Se apreciará que la modificación de detalles se puede hacer sin apartarse del alcance de la invención. Breve descripción de las Figuras Figura 1: Secuencias de aminoácido inferido y nucleótido de siete clones de proteínas cemento putativas. Clon 21: Secuencia de ADNc parcial y producto de traducción del clon 21. La proteina inferida ADNc se predice por ser una proteina cemento; contiene una región N-terminal hidrófoba la cual posiblemente constituye una secuencia de señal, tipica para productos de secreción, y fuertemente se asemeja a las proteínas estructurales, especialmente a la queratina. Se subraya una secuencia de reconocimiento para la fijación post-traduccional de grupos glicosaminoglicanos. Clon 33: Secuencia de proteina inferida del producto de ADN clonado por PCR (de la biblioteca de ADNc) en el vector de expresión de la proteina de fusión, pGEX-2T (Pharmacia) . Una secuencia de señal putativa se da en negritas. Como muchas proteínas estructurales, esta proteina es rica en glicina y prolina. Algunas se asemejan con las queratinas. *indica el codon de detención. Clon cemA: Secuencia parcial del ADNc cemA y proteina (fragmento lector putativo) . La proteina es muy repetitiva, con la secuencia KGALLQQQQASQVKGALKAI, o variantes ligeras de la misma, repetidas varias veces. Clon 24: Secuencia inferida de ADNc y ADNc incompleto del clon 24. La proteina se asemeja a las proteínas estructurales (entre otros colágenos) , y contiene secuencias repetidas. Muchos clones relacionados se encuentran en la biblioteca. El ADNc también ha conseguido una región en común con la glutenina, una proteina auto-congregante. Clon 68: Secuencia inferida de ADNc y ADNc parcial del clon 68. La biblioteca contiene una familia de clones similares. Las proteínas codificadas se asemejan a proteínas estructurales tal como la queratina. Se subraya una serie de sitios de fijación de glicosaminoglicano posibles. Clon 64 : Secuencia de proteina inferida de ADNc y secuencia de ADNc completa del clon 64. La secuencia de señal putativa se da en negritas. Se subraya un sitio de fijación de glicosaminoglicano posible. La primer pieza de 40 aminoácidos de la proteina madura es similar al colágeno, el resto de la secuencia se asemeja a la queratina. La proteina es rica en glicina y contiene varias repeticiones de la porción (C/S) 1-4 (Y/F) , la cual se encuentra también en las proteínas estructurales de cascaras de huevos de insecto. Las tirosinas pueden estar involucradas en la reticulación por la formación de puentes de ditirosina por las fenoloxidasas . Una proteina similar es codificada por el clon I (véase abajo) . * indica el codón de detención. Clon I: Secuencia de proteina inferida de ADNc y secuencia de ADNc incompleta del clon I. La proteina inferida es rica en glicina y tirosina y se asemeja a una proteina cemento del poliqueto arrecifigeno Pragmatopoma californica (un componente del cemento endurecido con quinona en la construcción de los tubos por estos teredos) . Figura 2: Secuencias de aminoácido de fragmentos de proteina 64P (64TRP) expresada en Escherichia coli . P1/P2, P1/P3, P4/P5, P6/P5, P1/P5 y P7/P5 referido a cebadores usados para productos de PCR del subclon de la secuencia del aminoácido de 64P en el plásmido pGEX-2T, para la expresión en células de Escherichia coli como versiones truncadas de la proteina 64P, es decir, 64trp2 (51 aminoácidos), 64trp3 (70 aminoácidos), 64trpl (29 aminoácidos), 64trp4 (63 aminoácidos), 64trp5 (133 aminoácidos sin ETIQUETA. HIS) y 64TRP6 (133 aminoácidos con ETIQUETA. HIS) , respectivamente. El péptido de señal de desdoblamiento posible predicho (aminoácidos 1 a 8), se subraya en verde. Figuras 3A-3C: SDS-PAGE: (A) Gel Bis-Tris NuPAGE de gradiente 4-12% teñido con Azul de Coomassie, (B) y (C) Manchados Western usando anticuerpo monoclonal GST (dilución 1:500) y conjugado de fosfatasa alcalina de anticuerpo monoclonal ETIQUETA.HIS (dilución 1:2000), respectivamente, de células de E. coli inducidas por IPTG que expresan versiones truncadas recombinantes (trp) de la proteina estructural de garrapata asi como también la proteina del vector GST, 64P (es decir, trpl, trp2, trp3 y trp4). Lineas: 1= marcadores de peso molecular, 2=proteina del vector GST de 26 kD, 3= proteina trpl de 30 kD, 4= proteina trp2 de 33 kD y 5= proteina trp3 de 36 kD, 6= proteina trp4 de 35 kD, 7=proteina trp5 de 41 kD (ninguno ETIQUETADO CON HIS) y 8= proteina trp6 de 42 kD (ETIQUETADO CON HIS) . Las muestras se solubilizaron a 100°C sin SDS previo a la carga de los geles. Flechas: a=proteina trp6 de 42 kD, b= proteina trp4 de 35 kD, c= proteina trp2 de 33 kD, d= proteina trpl de 30 kD y e= proteina del vector GST de 26 kD. Figuras 4A-4C: Estudios de inmunoperoxidasa usando antisuero anti-64trp en secciones delgadas de la piel de Hámster. A y C = secciones delgadas de la piel de Hámster incubadas con antisuerpo anti-64trp: 64trp3 y 64trp2, respectivamente, como anticuerpos primarios; B = secciones delgadas de piel de Hámster incubadas con PBS (solución salina fisiológica) como anticuerpo primario, es decir, muestra de control. 1 = capa cornificada de epidermis (estrato córneo) , 2= epidermis y 3= dermis; K = queratinocitos y CF = fibras de colágeno, dieron reacción positiva (color amarillo/marrón) con antisuero anti-64trp3.

Amplificación= 20X. Figuras 5A-5C: Estudios de inmunoperoxidasa usando antisuero anti-64trp en secciones delgadas de la piel de Hámster post-alimentación con Rhipicephal us appendiculatus . A y C= secciones delgadas de la piel de Hámster incubadas con anti-suero anti-64TRP: 64trp3 y 64trp2, respectivamente, como anticuerpos primarios; y B = sección de piel de hámster incubada con PBS (solución salina fisiológica) en lugar de anticuerpo primario, es decir, muestra de control. Flechas: 1= epidermis, 2= dermis; 3= subcuticula; 4=cono de cemento de garrapata; y *= secciones del cono de cemento y piel de Hámster que dieron reacciones positivas cuando se incubaron con antisuero anti-64trp3. Amplificación =10X. Figuras 6A-6D: Efectos de alimentación de ninfas de Rhipi cephal us appendiculatus en cobayos inmunizados con versiones truncadas de la proteina 64P (64TRP). A= célula con ninfas de Rhipicephal us appendiculatus alimentadas en cobayos de control, inmunizados con GST; B, C y D= células con ninfas de Rhipicephal us appendicula tus alimentadas en cobayos inmunizados con proteínas 64trp. *= la fecha indica los sitios de inflamación (es decir, eritema, edema, linfadenopatia y ardiente al toque) en la piel de cobayos inmunizados B, C y D en los cuales las ninfas de Rhipicephal us appendiculatus se alimentaron. Figuras 7A-7C: Efectos en garrapatas adultas hembras de Rhipicephal us appendi culatus, post-alimentación en cobayos inmunizados con proteínas 64trp. A y B = garrapatas hembra de Rhipicephal us appendiculatus, post-alimentación en cobayos inmunizados con proteínas 64trp2 y 64trp3, respectivamente; y C= garrapatas hembra de Rhipicephalus appendiculatus , post-alimentación en cobayos de control inmunizados con GST. 1= garrapatas hembras vivas, 2= huevos, y 3= garrapatas hembras muertas. Figuras 8A-8E: Estudios de necropsia de biopsias de piel de cobayos inmunizados con proteínas 64trp, postalimentación con garrapatas de Rhipicephal us appendiculatus . A, B y C= biopsias de piel de cobayos inmunizados con proteínas 64trpl, 64trp6 y 64trp2, respectivamente, y, D y E= biopsias de piel de cobayos inmunizados con GST, de control post-alimentación con garrapatas Rhipicephal us appendicula tus; 1= epidermis, 2= dermis/subcuticula, 3= sitios de fijación de garrapata previos, 4= lesiones necróticas . Figuras 9A-9H: Estudios histológicos de secciones de la piel de cobayos inmunizados con proteínas 64trp, postalimentación con garrapatas Rhipi cephal us appendiculatus, teñidas con Hematoxilina y Eosina, y teñidos Wright. 1= sección histológica de la piel de cobayos de control, inmunizados con GST y 2,3,4,5,6,7 y 8= secciones histológicas de la piel de cobayos inmunizados con proteínas 64trp, post- alimentación con garrapatas adultas de Rhipicephal us appendi culatus, teñidas con: teñidos de hematoxilina y eosina= secciones 1, 2, 3, 7 y 8, y teñido Wright= secciones 4, 5 y 6; secciones 1, 2, y 3- amplificación =10X; secciones 7 y 8-amplificación =20X; secciones 4, 5 y 6- amplificación =100X. Flechas-: A= epidermis, B= dermis, cc= áreas en donde los conos de cemento de garrapata de Rhipicephal us appendiculatus fueron previamente fijados, CF= fibras de colágeno, D= dendrocitos, F= fibroblastos, EP= eosinófilos polimorfos, BP= basófilos polimorfos. Figuras 10A-10G: Reactividad reciproca entre fracciones solubles de antigenos de garrapatas de R. appendiculatus, usando suero de cobayos inmunizados con proteínas recombinantes 64trp. A Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendi culatus sometidos a prueba con suero anti-64trp2. Lineas A/1 y A/2 cono de cemento; Lineas A/3 y A/4 glándulas salivales; Lineas A/5 y A/6 hemolinfa; Linea A/7 ninfas; Linea A/8 larvas; Linea A/9marcadores de peso molecular*. B Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendiculatus sometidos a prueba con suero anti-64trp6. Lineas B/l y B/2 cono de cemento; Lineas B/3 y B/4 glándulas salivales; Lineas B/5 y B/6 hemolinfa; Linea B/7 ninfas; Linea B/8 larvas; Linea B/9 marcadores de peso molecular*. C Gel gradiente 4-12% teñido con Azul de Coomassie de antigenos de garrapata de R. appendicula tus (hembra y macho) . Linea C/l marcadores de peso molecular**; Lineas C/2 y C/3 conos de cemento; Lineas C/4 y C/5 extractos de glándulas salivales; Lineas C/6 y C/7 hemolinfa; Lineas C/8 y C/9 intestino medio; Lineas C/10 ninfas; Linea C/11 larvas. D Inmunomanchado de antigenos de garrapatas R. appendicula tus sometidos a prueba con antisuero anti-64trp6.

Linea A/1 marcadores de peso molecular*; Lineas A/2 y A/3 glándulas salivales de garrapatas no alimentadas; Lineas A4, A/5 intestino medio. E Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendiculatus sometidos a prueba con antisuero anti-64trp2.

Lineas B/l y B/2 glándulas salivales de garrapatas no alimentadas; Linea B/3 y B/4 intestino medio; Linea 5 marcadores de peso molecular*. F Inmunomanchado de antigenos de garrapatas de R. appendicula tus usando antisuero anti-64trp5. Linea C/l marcadores de peso molecular*; Lineas C/2 y C/3 glándulas salivales de garrapatas no alimentadas; Lineas C/4 y C/5 intestino medio. G Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendi culatus usando antisuero anti-64trp5. Lineas D/l y D/2 cono de cemento; Lineas D/3 y D/4 glándulas salivales de garrapatas parcialmente alimentadas (dia 2) ; Lineas D/5 y D/6 hemolinfa; Lineas D/7 ninfas; Lineas D/8 larvas; Linea D/9 marcadores de peso molecular* . Figuras 11A-11F: Reactividad reciproca entre fracciones insolubles de antigenos de garrapata de R. appendicula tus usando suero de cobayos inmunizados con proteínas recombinantes 64trp. A Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendi culatus de extractos de tejido de hembras adultas sometidas a prueba con suero anti-64trp3. Linea A/1 marcadores***; Linea A/2 cono de cemento (de hembras parcialmente alimentadas en cobayos) , Linea A/3 glándula salival de garrapatas no alimentadas, Linea A/4 hemolinfa de garrapatas no alimentadas, Linea A/5 intestino medio de garrapatas no alimentadas. B Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendiculatus de extractos de tejido de hembra adulta sometidos a prueba con suero anti-64trp2. Lineas B/l, B/2, B/3 y B/4 como en las Lineas A/2-5. C Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendiculatus sometidos a prueba con suero anti-64trp6. Lineas C/l ninfas completas, Linea C/2 larvas completas. D Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendicula tus sometidos a prueba con suero anti-64trp2.

Linea D/l ninfas completas, Linea D/2 larvas completas, Linea D/3 marcadores***. E Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. appendiculatus sometidos a prueba con suero anti-GST de control. Lineas E/1, marcadores***, Linea E/2 cono de cemento (como Linea A/2), Linea E/3 glándula salival (como linea A/3), Linea E/4 hemolinfa (como Linea A/4), Linea E/5 intestino medio (como Linea A/5) , Linea E/6 ninfa (como Lineas C/2, D/2), Linea E/7 larva (como lineas C/l, C/2). Figura 11 A hasta E marcadores***, marcadores de peso molecular de proteina Plus2 SeeBlueMR: 188 kD=Miosina, 98 kD= Fosforilasa B, 62kD= Albúmina de suero bovino, 49 kD= Deshidrogenasa Glutámica, 38 kD= Deshidrogenasa de Alcohol, 28 kD= Anhidrasa Carbónica, 17 kD= Mioglobina Roja y 14 kD= Lisozima. Figura 11F Gel gradiente 4-12% teñido con Azul de Coomassie de antigenos de garrapata de R. appendiculatus . Lineas F/l marcadores**, Linea F/2 cono de cemento de machos parcialmente alimentados, Linea F/3 cono de cemento de hembras parcialmente alimentadas, Linea F/4 glándulas salivales de machos no alimentados, Linea F/5 glándulas salivales de hembras no alimentada, Linea F/6 hemolinfa de machos, Linea F/7 hemolinfa de hembras, Linea F/8 intestino medio de machos, Linea F/9 intestino medio de hembras, Linea F/10 ninfas completas, Linea F/ll larvas completas. La banda de 26 kD f, una reacción reciproca en las glándulas salivales puede representar GST de R. appendicula tus equivalente a aquel-la reportada para Boophil us micropl us (He et al . , (1999). Insect Biochem. Mol. Biol. 29:737-743). Figura 11 A hasta F. Pesos moleculares de bandas etiquetadas: a= 200 kD, b= 120-188 kD, c= 80-98 kD, d= 55-62 kD, e= 49-55 kD, f = 26 kD, g= 17 kD, h= 15 kD, i= 120 kD, j= 60-62 kD, k= 36 kD, 1= 14 kD, m= 188 kD, n= 98-120 kD, o= 55- 62 kD, p= 200 kD, q= 188 kD, r= 150 kD y s= 50-62 kD. Figuras 12A-12C: Reactividad reciproca de antigenos de garrapata de Amblyomma variegatum y Rhipicephal us sanguineus con antisuero de cobayos inmunizados con proteínas 64trp de R. appendiculatus . A Inmunomanchado de antigenos de garrapata de A. variega tum sometidos a prueba con suero anti-64trp5. Linea A/1 hemolinfa; Linea A/2 intestino medio; Linea A/3 glándula salival; Linea A/4 marcadores de peso molecular*. B Inmunomanchado de antigenos de garrapata de A. variega tum sometidos a prueba con suero anti-64trp6. Linea A/1 marcadores de peso molecular*; Linea A/2 glándulas salivales; Linea A/3 intestino medio; Linea A/4 hemolinfa. C Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. sanguineus sometidos a prueba con suero anti-64trp6. Linea A/1 marcadores de peso molecular*; Linea A/2 glándula salival; Linea A/3 intestino medio; Linea A/4 hemolinfa. Para Figuras 10-12, * representa marcadores de peso molecular de proteina MultiMarkMR (NOVEX) : 98 kDa= Fosforilasa B, 52 kDa= Deshidrogenasa Glutámica, 31 kDa = Anhidrasa Carbónica, 19/17 kDa = Mioglobina Roja/Azul, 11 kDa= Lisozima, 6 kDa = Aprotinina, 3 kDa= Insulina ** representa marcadores de peso molecular de proteina Mark 12TM (NOVEX): 200 kDa= Miosina, 116.3 kDa= ß galactosidasa, 97.4 kDa= Fosforilasa b, 66.3 kDa= Albúmina de suero bovino, 55.4 kDa = Deshidrogenasa Glutámica, 36.5 kDa= Deshidrogenasa de Lactato, 31 kDa = Anhidrasa Carbónica, 21.5 kDa= Inhibidor de Tripsina, 14.4 kDa= Lisozima, 6 kDa= Aprotinina, 3.5 kDa= Cadena de Insulina B y 2.5 kDa = Cadena de Insulina A. Figuras 13A-13C: Reactividad reciproca entre antigenos de garrapata de Rhipicephal us sanguineus usando antisuero de cobayos inmunizados con proteínas 64trp recombinantes de R. appendiculatus . A y B Inmunomanchados de antigenos de garrapata de R. sanguineus usando antisuero anti-64trp3 y anti-64trp2, respectivamente. C gel de gradiente Bis-Tris al 4-12% teñido con Azul de Coomassie (NuPAGE-NOVEX) . Lineas A/1 y B/l: marcadores de peso molecular de proteina Plus2 SeeBlueMR (NOVEX) : 188 kD= Miosina; 98 kDa= Fosforilasa B; 62 kD=BSA; 49 kD= Deshidrogenasa Glutámica; 38 kD= Deshidrogenasa de Alcohol; 28 kD= Anhidrasa Carbónica; 17 kD= Mioglobina Roja; 14 kD= Lisozima; 6 kD= Aprotinina. Linea C/l: marcadores de peso molecular de proteina Markl2MR (NOVEX): 200 kD=Miosina; 116.3 kD= B-galactosidasa; 97.4 kD= fosforilasa b; 66.3 kD= Albúmina de suero bovino; 55.4 kD= Deshidrogenasa Glutámica; 36.5 kD= Deshidrogenasa de Lactato; 31 kD= Anhidrasa Carbónica; 21.5 kD= Inhibidor de Tripsina; 14.4 kD= Lisozima; 6 kD= Aprotinina. Lineas A/2, A/3, A/4, A/5, A/6, A/7 y A/8: extracto de ninfa completa de R. sanguineus, hemolinfa, extracto de intestino medio de macho, extracto de intestino medio de hembra, extracto de glándula salival de macho, extracto de glándula salival de hembra y, extracto de cono de cemento de hembra y macho combinados (de garrapatas parcialmente alimentadas en cobayos) , respectivamente, de las cuales las bandas inmunopositivas fueron observadas como a= 6 kD, b= 17 kD, c= 188 kD, d= 26 kD, e= 28 kD, f= 60 kD y g= 80 kD, usando antisuero anti-64trp3. Lineas B/2, B/3, B/4, B/5, B/6, B/7 y B/8: como en A de las cuales las bandas inmunopositivas fueron observadas como h=120 kD, i= 62 kD y j=60 kD, usando antisuero anti-64trp2. Lineas: C/2, C/3, C/4, C/5, C/6, C/7 y C/8: como en A de las cuales las bandas de proteínas a hasta j corresponden a las bandas inmunopositivas de inmunomanchados A y B. Flecha* = bandas inmunopositivas debido al enlace antecedente con antisuero anti-GST - véase Figura 14. Figura 14: Inmunomanchado de antigenos de garrapata de R. sanguineus usando antisuero anti-GST.

Linea 8: marcadores de peso molecular de proteina Markl2MR (NOVEX): 200 kD= Miosina; 116.3 kD= B-galactosidasa; 97.4 kD= Fosforilasa b; 66.3 kD= Albúmina de suero bovino; 55.4 kD= Deshidrogenasa Glutámica; 36.5 kD= Deshidrogenasa de Lactato; 31 kD= Anhidrasa Carbónica; 21.5 kD= Inhibidor de Tripsina; 14.4 kD= Lisozima; 6 kD= Aprotinina. Lineas 7, 6, 5, 4, 3, 2 y 1: extracto de ninfa completa de R. sanguineus, hemolinfa, extracto de intestino medio de macho, extracto de intestino medio de hembra, extracto de glándula salival de macho, extracto de glándula salival de hembra y, extracto de cono de cemento de hembra y macho combinados (de garrapatas parcialmente alimentadas en cobayos), respectivamente. Las bandas inmunopostiicas I* y Kl y K2* se refieren a enlace no especifico con el antisuero anti-GST con bandas de proteínas (25 kD, 48 kD y 26 kD) presentes en 'extractos de glándula salival de macho y hembra, y extracto de cono de cemento respectivamente . Figuras 15A-15D: Efectos en garrapatas macho y hembra adultos de Rhipicephal us sanguineus durante la alimentación temprana en cobayos inmunizados con cócteles diferentes de proteínas 64trp. (A) garrapatas hembra muertas de cobayos inmunizados con 64trp6/3, (inyectadas en sitios separados) ; (B) garrapatas hembra muertas de cobayos inmunizados con 64trp6/3, (combinadas e inyectadas en un único sitio) ; (C) garrapatas hembra (n=3) y macho (n=2) muertas de cobayos inmunizados con 6 trp6/2 (inyectados en sitios separados) ; (D) garrapatas hembra muertas de cobayos inmunizados con 64trp6/2, (combinados e inyectados en un único sitio) . Figuras 16A-16C: Efecto vacuna de proteínas 64trp en garrapatas adultas de Rhipicephal us sanguineus post-alimentación en cobayos inmunizados con 64trp. (A) : garrapatas de R. sanguineus hembras adultas, supervivientes, post-alimentación en cobayos inmunizados con cóctel de proteina de 64trp2/6 como inmunógeno. Solamente sobrevivieron 2/10 garrapatas; las garrapatas no pusieron huevos y no se engulleron completamente. (B) : garrapatas de R. sanguineus hembras adultas, muertas, post-alimentación en cobayos inmunizados con cócteles 64trp2/6 y 64trp3/6 como inmunógenos. Las garrapatas se tornaron marrón/negro y se desarrolló una consistencia seca 2-5 dias post-separación. (C) : garrapatas hembras de R. sanguineus adultas, normales, que pusieron huevos, post-alimentación en cobayos inmunizados con la proteina de control GST. Figuras 17A-17C: Reactividad reciproca entre antigenos de garrapatas de Boophil us micropl us usando antisuero de cobayos inmunizados con proteínas 64trp2 y 64trp3 recombinantes de R. appendiculatus . A y B inmunomanchados de antigenos de garrapata de Boophil us micropl us usando antisuero 64trp2 y 64trp3 respectivamente; C gradiente en gel de Bis-Tris al 4-12% teñido con Azul de Coomassie (NuPAGE-NOVEX) . Lineas: A/1 y B/l: marcadores moleculares de proteina Plus 2 SeeBlueMR (NOVEX) : 188 kD=Miosina, 98 kD= Fosforilasa B, 62 kD= BSA, 49 kD= Deshidrogenasa Glutámica, 38 kD= Deshidrogenasa de Alcohol, 28 kD= Anhidrasa Carbónica, 17 kD= Mioglobina Roja, 14 kD= Lisozima, 6 kD= Aprotinina, Linea C/l: marcadores de peso molecular de proteina Markl2R (NOVEX): 200 kD= Miosina, 116.3 kD= B-galactosidasa, 97.4 kD= Fosforilasa b, 66.3 kD= Albúmina de suero bovino, 55.4 kD= Deshidrogenasa Glutámica, 36.5 kD= Deshidrogenasa de Lactato, 31 kD= Anhidrasa Carbónica, 21.5 kD= Inhibidor de Tripsina, 14.4 kD= Lisozima y 6 kD= Aprotinina. Lineas A/5, A/4, A/3 y A/2: extracto de cono de cemento de Boophil us micropl us, extracto de glándula salival, extracto de intestino medio y extracto de ninfa completa (garrapatas alimentadas), respectivamente, de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como a= 120-200 kD, b= 80 kD, c= 62 kD, d= 49 kD, e= 40 kD, f= 17 kD, g= 8 kD, y h= 200 kD, 1= 60 kD, j= 55 KD, k=49 kD, y 1=18 kD usando antisuero 64trp2.

Lineas B/5, B/4, B/3 y B/2 : extracto de cono de cemento de Boophil us micropl us, extracto de glándula salival, extracto de intestino medio, y extracto de ninfa completa (garrapatas alimentadas) , respectivamente, de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como m=120 kD, n= 35 kD, o= 62 kD, p= 59 kD, q=49 kD, y r=26 kD usando antisuero 64trp3. Lineas C/5, C/4, C/3 y C/2: extracto de cono de cemento de Boophil us micropl us, extracto de glándula salival, extracto de intestino medio, y extracto de ninfa completa (garrapatas alimentadas) , respectivamente, de las cuales las bandas de proteínas a hasta r corresponden a las bandas inmunopositivas de los inmunomanchados A y B. Figuras 18A-18C: Reactividad reciproca entre' antigenos de garrapatas de Boophil us mi cropl us usando antisuero a partir de cobayos inmunizados con proteínas 64trp5 y 64trp6 de R. appendiculatus . A y B Inmunomanchados de antigenos de garrapatas de Boophil us micropl us usando antisuero anti-64trp5 y anti-64trp6, . respectivamente; C inmunomanchado de antigenos de garrapata de Boophil us micropl us usando antisuero a partir de cobayos inmunizados con la proteina GST recombinante. Lineas: A/5, B/5 y C/5= marcadores de peso molecular de proteina Plus 2 SeeBlueMR (NOVEX) : 188 kD=Miosina, 98 kD= Fosforilasa B, 62 kD= BSA, 49 kD= Deshidrogenasa Glutámica, 38 kD= Deshidrogenasa de Alcohol, 28 kD= Anhidrasa Carbónica, 17 kD= Mioglobina Roja, 14 kD= Lisozima, 6 kD= Aprotinina. Linea: A/1, A/2, A/3 y A/4: extracto de cono de cemento de Boophil us micropl us, extracto de glándula salival, extracto de intestino medio, y extracto de ninfa completa (garrapatas alimentadas), respectivamente, de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como a=50-55 kD, b=32 kD, c=17 kD, d=70 kD, e=48 kD, f=26 kD, g= 40 kD, y h=30 kD, usando antisuero anti-64trp5. Linea: B/l, B/2, B/3 y B/4 : extracto de cono de cemento de Boophil us mi cropl us, extracto de glándula salival, extracto de intestino medio, y extracto de ninfa completa (garrapatas alimentadas), respectivamente, de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como e=48 kD, i=180 kD, j=75 kD, k=12 kD, usando antisuero anti-64trp5. Lineas: C/l, C/2, C/3 y C/4: extracto de cono de cemento de Boophil us micropl us, extracto de glándula salival, extracto de intestino medio, y extracto de ninfa completa (garrapatas alimentadas) , respectivamente, de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como a=50-55 kD, e= 48. Figuras 19A-19B: Reactividad reciproca entre antigenos de garrapatas Ixodes ri cinus usando antisuero de cobayos inmunizados con proteínas 64trp recombinantes de R. appendiculatus . A (ii) , (iii), (iv) y (v) inmunomanchados de extracto de ninfa completa de garrapatas no alimentadas Jxodes ricinus usando antisuero GST, 64trp2, 64trp5 y 64trp6, respectivamente; A (i) gel de gradiente Bis-Tris al 4-12% teñido de Azul de Coomassie (NuPAGE-Novex) del mismo extracto. B (i) y (ii) gel de gradiente Bis-Tris al 4-12% teñido con Azul de Coomassie (NuPAGE-Novex) y un inmunomanchado de extracto larval completo de garrapatas de Ixodes ricinus usando antisuero 64trp6, respectivamente. Lineas: A/ (i) /l y B/(i)/l: marcadores de peso molecular de proteina Markl2MR (NOVEX): 200 kD= Miosina; 116.3 kD= B-galactosidasa; 97.4 kD= Fosforilasa b; 66.3 kD= BSA; 55.4 kD= Deshidrogenasa Glutámica; 36.5 kD= Deshidrogenasa de Lactato; 31 kD= Anhidrasa Carbónica; 21.5 kD= Inhibidor de Tripsina; 14.4 kD= Lisozima; 6 kD= Aprotinina. Lineas A/(ii), (iii), (iv) y (v)/3: marcadores de peso molecular de proteina Plus 2 SeeBlueMR (Novex) : 98 kD= Fosforilasa B, 62 kD= BSA, 49 kD= Deshidrogenasa de Glutamina, 38 kD= Deshidrogenasa de Alcohol, 28 kD= Anhidrasa Carbónica, 17 kD= Mioglobina Roja, 14 kD= Lisozima. Linea: B/(ii)/(3): marcadores de peso molecular de proteina MultiMarkMR (Novex) : 98 kD= fosforilasa B, 52 kD= Deshidrogenasa Glutámica, 31 kD= Anhidrasa Carbónica, 19 kD= Mioglobina Roja, 17 kD= Mioglobina Azul y 11 kD=Aprotinina . Lineas: A/ (iii), (iv) y (v)/4= Extracto de ninfa completa de I. ricinus de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como a= 150 kD y b=62 kD, c=100 kD, d=98 kD, e=62 kD, f= 50 kD y g=42 kD, h=190 kD, i=150 kD, j=80, k=62 kD, 1=55 kD, m=32 kD, n=17 kD y o= 12 kD, respectivamente. Linea: A/(ii)/4. Extracto de ninfa completa de I. ricinus de las cuales se observaron bandas inmunopositivas muy tenues como * debido a la reactividad reciproca no especifica de antigenos de garrapata con antisuero GST. Linea: B/(ii)/4= extracto de larva de J. ricinus de las cuales las bandas inmunopositivas se observaron como a=116 kD, b= 80 kD, c= 62 kD, d=34 kD y e=28 kD. Figuras 20A-20D: Efectos de alimentación de ninfas de garrapatas Ixodes ricinus en hámsters inmunizados con cócteles diferentes de proteínas 64trp. Estudios en pieles de hámster durante la alimentación [ (i) -pre-disección) y post-alimentación ((ii)-post-disección] de ninfas de garrapatas de J. ricinus en hámsteres inmunizados con proteina de control GST (A), proteina 64trp6 (B) , proteina 64trp5 (C) y un cóctel de 64trp6/5 (D) . El pelo que creció posterior a la alimentación de las garrapatas fue normal en hámster de control A y muy lento para los hámsteres inmunizados con 64trp con áreas de alopecia indicada por la flecha a. Esto es debido a las respuestas inmunes inflamatorias locales que ocurrieron durante la alimentación de garrapatas de J. ricinus en los hámsteres inmunizados con 64trp, indicado por flechas: c, d y e; c= sitios de alimentación de garrapatas abandonados que muestran varios grados de inflamación vista como eritema en la subcuticula de la piel disecada; d= nudos linfáticos prescapulares alargados; e= exudación serosa en sitios abandonados de alimentación de garrapatas; f= sitios de alimentación abandonados de garrapatas en el hámster de control del cual la subcuticula y los nudos linfáticos prescapulares parecen normales. b= ninfas de garrapatas I. ri cinus alimentadas; garrapatas alimentadas en el hámster de control se extendieron por 6 horas, comparada con aquellas que se alimentaron en los hámsteres 64trp inmunizados. Ejemplos Ejemplo 1: Expresión de la proteina cemento truncada (64TRP) en bacteria Como los intentos para expresar el clon de longitud completa de 64P en el sistema de baculovirus no fueron exitosos, se investigaron varias estrategias para expresar versiones truncadas de 64P en células bacterianas de Escherichia coli . Se hicieron varios intentos sin éxito para insertar la región codificante completa de la proteina cemento (menos la secuencia de señal, es decir, 144 aminoácidos de longitud) , designada 64P, en vectores de expresión procarióticos pET23a (+) (Novagen) y pGEX-2T (Pharmacia) , para la expresión de la proteina en células AD494 de E. coli (Novagen) . Se concluye que la estructura del constructo puede ser tóxica a la célula bacteriana. Por lo tanto, se adoptó una estrategia de clonación que involucra la clonación serial de regiones truncadas del clon de 64P, iniciando en la región N-terminal (Figura 2) . Los oligonucleótidos se designaron con sitios de enzima de restricción apropiados para permitir la clonación por PCR de los fragmentos diferentes de 64P del ADNc. Estos constructos son como sigue: 64trpl = fragmento C-terminal de 29 aminoácidos 64trp2 = fragmento N-terminal de 51 aminoácidos 64trp3 = fragmento N-terminal de 70 aminoácidos 64trp4 = fragmento C-terminal de 63 aminoácidos 64trp5 = fragmento de 133 aminoácidos sin ETIQUETA.9XHIS del clon 64P de longitud completa menos 3 aminoácidos al final de la secuencia 64trp6 = 133 aminoácidos con la ETIQUETA.9XHIS . Los plásmidos se transformaron en células XL1-BLUE de E. coli (Stratagene) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las proteínas 64TRP expresadas etiquetadas con fusión de GST/histidina, se purificaron por el método de purificación GST (Pharmacia) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. La ETIQUETA.9XHIS se incluyó para facilidad de purificación de las proteínas 64TRP que pueden ser expresadas como cuerpos de inclusión (debido a que el método de purificación GST aplica a las proteínas solubles solamente) . Distinto de las otras proteínas 64P truncadas ETIQUETADAS. GST/9XHIS (es decir, 64trpl, 64trp2, 64trp3 y 64trp64), la proteina 64trp6 (133 aminoácidos con ETIQUETA-9XHIS) resultó en la formación de cuerpos de inclusión en lugar de proteínas solubles. Por lo tanto, la proteina 64trp6 se purificó bajo condiciones de desnaturalización usando perlillas de afinidad metálica TALÓN (Clontech) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Las proteínas 64TRP se analizaron por geles teñidos con Azul de Coomassie gradiente al 4-12% de Tris-Bis de NuPAGE (Novex) , de conformidad con las instrucciones del fabricante (Figura 3A) . Las Figuras 3B y 3C son Manchados Western de geles similares de la Figura 3A, usando anticuerpo monoclonal GST (GST mAb-Pharmacia) a una dilución de 1:500 y anticuerpo monoclonal ETIQUETADO.6XHIS (ETIQUETA.6XHIS mAb/APC-Clontech) a una dilución de 1:2,000, de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se observaron las bandas de proteina de 64TRP esperadas en el gel teñido con azul de Coomassie (Figura 3A) con los siguientes pesos moleculares: 64trpl = 30 kDa; 64trp2 = 33 kDa; 64trp3= 36 kDa; 64trp4 = 35 kDa; 64trp5 = 41 kDa; 64trp6 = 42 kDa. La expresión se confirmó en los Manchados Western (Figuras 3B y 3C) . La banda de proteina GST de 26 kDa se usó como un marcador de control. Como se esperaba, las bandas de proteína 64trp5 y GST cada una que carece de la ETIQUETA.9XHIS no dieron reacciones con la ETIQUETA.6XHIS mAb (Figura 3C, lineas 7 y 2, respectivamente) . Los constructos 64TRP que contienen ya sea un fragmento o la secuencia N-terminal completa del clon 64P (es decir, 64trp2, 64trp3 y 64trp5) , cuando se expresan en células XL1-BLUE de E. coli, resultan en productos de degradación (Figuras 3A, lineas 4, 5 y 7) . Esto se confirmó por el análisis de secuencia amino-terminal (Matsudaira, (1987) Journal of Biological Chemistry 262: 10035-10038) de las bandas de proteínas degradadas. Para ensayar y resolver el problema de la degradación del producto, los constructos se transformarán en la cepa BL21 de E. coli , la cual lleva una supresión en el gen ompT que codifica una proteasa. Como se esperaba, hubo menos degradación de la proteina 64trp6 comparada con la proteina 64trp5 debido a que se expresó como cuerpos de inclusión y con ello, se protegió de la degradación por las proteasas celulares.

Ejemplo 2: Estudios inmunohistoquímicos usando antisuero a 64TRP Se usaron las proteínas 64trp recombinantes purificadas individuales para promover el antisuero policlonal por inyecciones subcutáneas de volúmenes iguales de cada proteina y Montanido ISA 50 en cobayos Dunkin Hartley. Los estudios inmunohistoquímicos se realizaron usando los seis antisueros anti-64trp diferentes. El antisuero se ha hecho reaccionar con secciones de tanto piel de Hámster normal (de animales no expuestos a garrapatas), como de secciones a través de los conos de cemento y la piel circundante de los Hámsteres infectados con garrapatas de R. appendiculatus . Los métodos inmunohistoquimicos fueron como se describen previamente (Coligan et al . , 1991). Los resultados de estos dos estudios, usando el suero anti-64trp2 y anti-64trp3, indican lo siguiente. 2.1 Piel Normal La comparación de las secciones de piel normal tratadas con ya sea suero anti-64trp2 o anti-64trp3, revelan que el suero anti-64trp3 reaccionó fuertemente con los tejidos dérmicos y epidérmicos, particularmente con los queratinocitos y la capa cornificada de la epidermis, y las fibras de colágeno de la dermis (Figura 4A) . Mediante comparación, secciones tratadas con el suero anti-64trp2 fueron distinguibles de las secciones de control tratadas con salina amortiguada de fosfato (PBS) (Figuras 4B y 4C, respectivamente) . Ambas secuencias de proteina 64trp2 y 64trp3 contienen la región similar al colágeno de la proteina 64P. Sin embargo, la proteina 64trp3 también incluye algunas de las secuencias similares a la queratina de la proteína 64P. Las diferencias en inmunoreactividad entre antisuero anti-64trp3 y anti-64trp2 con la sección de piel de Hámster son de este modo, probablemente relacionadas con la biodisponibilidad de los epitopes reactivos dentro de los fragmentos de secuencia de proteina respectiva. Esto además confirma la hipótesis de que la proteina cemento 64P imita la estructura de ciertos tejidos del hospedero, por ejemplo, colágeno y especialmente las proteínas como la queratina de la epidermis y la dermis. 2.2 Piel infestada con garrapatas En la piel de Hámsteres en los cuales se alimentaron garrapatas de JR. appendiculatus, secciones de conos de cemento individuales reaccionaron con suero anti-64trp3. Las reacciones fueron principalmente con la capa más externa y las capas internas de los conos de cemento fijados a la epidermis (Figura 5A) . No se observaron reacciones en las secciones tratadas con suero anti-64trp2 (Figura 5C) , o con PBS usado como un control en lugar de un anticuerpo primario (Figura 5B) . El modelo de reacción del suero anti-64trp3 con conos de cemento puede indicar que el 64P es una proteina cemento que alinea el cono de cemento, posiblemente actuando como un pegamento que enlaza el cono de cemento a los tejidos epidérmicos y dérmicos circundantes. La ausencia de teñido con el cono de cemento, puede indicar que el (los) epitope (s) reconocidos por el suero anti-64trp3 (y posiblemente el suero anti-64trp2) no fueron expuestos en el cono de cemento. Esto podría ocurrir si la proteina 64P se polimeriza para formar el cono de cemento. Asi como también se incrusta en la piel del hospedero, la capa más exterior del cono de cemento también se une hacia abajo y se mezcla sobre la epidermis de la piel del hospedero (dato no mostrado) de manera que es difícil distinguir en donde termina el cono de cemento de la garrapata y comienza el tejido del hospedero. Esta observación además soporta la hipótesis de que la proteina cemento se ha designado para asemejarse a las proteínas de la piel dérmicas y epidérmicas (es decir, colágenos y queratinas) del hospedero, con el fin de evitar el rechazo de la garrapata via la fijación del cono de cemento en la piel del hospedero. Ejemplo 3: Ensayos de vacunación Se usaron cobayos Dunkin-Hartley para los ensayos de inmunización y pruebas inmunogénicas. De los 10 cobayos usados, 2 de cada uno se inmunizaron con 64trpl, 64trp2, 64trp3 y 64trp6, y 2 se inmunizaron con la proteina GST de control. Cada grupo de cobayos inmunizados se dividió además en un cobayo cada uno por estados de alimentación ninfales y adultos de garrapatas de R. appendiculatus . Aproximadamente cincuenta miligramos de cada proteina 64TRP (todavía unidas a las perlillas GST, es decir, no eluidas) , o proteina GST de control, se mezclaron con adyuvante Montanido ISA e inyectaron subcutáneamente; las primeras y segundas inyecciones de refuerzo fueron dadas cada una a intervalos de dos semanas. Las respuestas inmunes del hospedero a la inmunización se determinaron por reactividad del antisuero de cobayo inmunizado con GST y 64TRP en inmunomanchados de proteína GST y proteínas 64TRP individuales. Cuando los títulos de antisuero alcanzaron 1:5,000, los cobayos fueron sometidos a pruebas inmnunogénicas con estados ninfales y adultos de garrapatas de R. appendicula tus . Para la infestación inmunogénica, los números predeterminados de garrapatas (por cobayo, 50-200 ninfas o 20 garrapatas adultas), se 'colocaron dentro de cámaras de retención en la parte posterior de cada cobayo (Figura 7), una semana después de la segunda inyección de refuerzo. Para analizar los efectos de inmunidad inducida por 64TRP, se hicieron examinaciones visuales diariamente de los cobayos iniciando 24 horas post-infestación de la garrapata. Se registraron las velocidades de fijación, duración de alimentación, reacciones inflamatorias al sitio de fijación, y eclosabilidad de los huevos a partir de las garrapatas hembras saciadas separadas. Se determinaron después de la terminación del experimento, los pesos de engullimiento de garrapatas hembras adultas y velocidades de mortalidad de estados tanto ninfales como adultos de las garrapatas. La Tabla 1 resume los resultados de los efectos vacuna de las proteínas 64TRP contra las garrapatas alimentadas en cobayos. No hubo diferencias en las velocidades de fijación del grupo de control inmunizado con GST y los grupos inmunizados con 64TRP; del mismo modo, la duración de la alimentación fue similar para estados tanto ninfales como adultos de la garrapata. Las reacciones inflamatorias, las cuales terminaron 24-48 horas antes de descender, se observaron durante las últimas etapas de alimentación (dias 6to o 7mo.) en la piel de cobayos inmunizados con 64TRP en sitios en donde se fijaron las ninfas. Las reacciones incluyen eritema, edema, linfadenopatia y letargia (Figura 6) .

Tabla 1. Comparación de parámetros de alimentación para garrapatas de Rhipicephalus appendiculatus alimentadas en cobayos inmunizados con proteínas 64TRP y proteína GST.

Parámetros Inmunizado Inmunizado con: con GST 64trp1 54trp2 64tf3 S4trp4 G4tr P 64trp6 A N A N A N A N A N A N A N (%) de Fijación 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Duración de 7-10 5-10 7-11 5-10 7-11 5-10 7-11 5-9 7-10 5-9 7-9 . 5-10 7-10 5-10 alimentación (dias) Inflamación del sitio de fijación + ++ +4 + + +++ rhubdor Anücuc?nb (X10 ) >1:5 >1 :5 1:6 >1:8 1:8 1:8 >1 :8 >1:8 1 :8 1:8 >1:8 >1 :8 1:8 1:8 Irtulador ác Anticuerpo (xlO1 1 :5 1 :5 1:10 1:10 >1:10 >t:10 >1:1ß >1:16 1:8 1:8 1 :10 >1:10 1 :10 1 :20 "peso engullido 447 nd 425 nd 336 nd 441 nd 329 nd 354 nd 498 nd medio (mg) (+ DE) (* 107> <* ß7) (* 175) <* «¡) C*W) (*ßß) (±92) «masa de huevo 147 n/ß 145 p/a 120 p/a 163 p/a 107 n/a 63 n/a 175 n/a medio (mg)(± so) <*Z7| <* 28) (* 102) (± 51) í) eclosabilidad de h •h h h h h huevo (%) de mortalidad 0' 6.7* O1 11.5* 55.5' 18* 70' 1.9ß 0' 5.6* ßo' 5.4? 0* 48.2* No Total de garrapatas 9 159 10 , 145 9 137 10 186 8 194 10 39 9 113 Tabla 1 Notas i = inflamación - y + denota ausencia o presencia de inflamación en sitios de fijación de garrapata, respectivamente; el grado de inflamación está indicado por: += apacible, ++= moderado y +++= severo; 1 y 2 =¡ tituladores de anticuerpo pre y post-infestación; nd= no hecho; n/a= no aplicable; h=nidado; *se refiere a 2/9 5 lotes de huevos que no anidaron, puestos por 2 garrapatas hembras adultas del grupo de garrapatas de R. appendiculatus se han alimentado en cobayos inmunÍ2ados con la proteina 64t?p2; d determinado por la Prueba de Chi Cuadrada usando una tabla de contingencia de una vía que muestra una tasa de portalidad superior a partir del grupo de garrapatas ninfales de R. appendiculatus que se alimentan en cobayos inmunizados con 64trp6 {^, 6 L? =96.5, p<0.00l); § determinado por la Prueba G, tasas de mortalidad observadas en garrapatas hembra adultas de los grupos de garrapatas de R. appendiculatus que se han alimentado en cobayos inmunizados con proteínas 64trp2, 64trp4 y 64trp5, fueron significantemente superiores que para las garrapatas de los otros grupos (G, ß = 33, p<0.00l) ; determinado por la relación F, pesos de engullimiento medios para garrapatas adultas hembras a partir de los grupos de garrapatas de R. appendiculatus que se han alimentado en cobayos inmunizados con 64trp2, 64trp4 y 64trp5 fueron significantemente menos que los pesos de engullimiento pora las garrapatas de los otros grupos (F, 162 = 15.88, p<?.??l) ; * por la relación F, que muestra un peso de masa de huevo medio significantemente menor (F, 1, 44 = 5.646, p<0.022) para garrapatas R. appendiculatus hembra que se alimentaron en cobayos inmunizados con 64trp5 comparados con las garrapatas hembra de los otros grupos. 3.1 Garrapatas Ninfales Las ninfas desprendidas fueron normales en apariencia. La inflamación no fue evidente en los sitios de fijación ninfales en la piel de cobayos inmunizados con GST. Las ninfas desprendidas se criaron de conformidad con Jones et al . , (1988) Animal Technology 39, 99-106. Las tasas de mortalidad comparativamente altas de 18% y 48% se observaron para las ninfas desprendidas que se han alimentado en cobayos inmunizados con 64trp2 y 64trp6, cuando se compara con los cobayos inmunizados de proteina de control (6.7%). Los resultados son estadísticamente significantes, p<0.01 y p<0.001, respectivamente, como se determina por la Prueba de Chi Cuadrada usando una tabla de contingencia 2 x 2. Las muertes de ninfas alimentadas en cobayos inmunizados con 64trp2 y 64trp6, sugieren que una respuesta inmune se estimula cuando el estado ninfal de las garrapatas de R. appendiculatus se alimentan en cobayos inmunizados con 64TRP. Aunque esta respuesta no afecta directamente la alimentación, afecta la supervivencia de las ninfas. Es posible que los epitope (s) inmuno-protectores existan dentro de la proteina 64trp2 (fragmento N-terminal pequeño de la proteina 64P) , asi como también dentro de la proteina 64trp6 (fragmento de 133 aminoácidos de la proteina 64P, como antigeno desnaturalizado) , el cual puede ser conservado en una proteina cemento relacionada en las ninfas. Esto se investigará además por inmunomanchado usando antisuero anti-64trp en extractos de tejido ninfales. 3.2 Garrapatas Adultas La mortalidad también fue significante entre las garrapatas hembra adultas alimentadas en cobayos inmunizados con proteínas 64trp2 (mortalidad 55.5%) y 64trp3 (mortalidad 70%). Figura 7a (no. 1) muestra algunas de las garrapatas adultas que se han alimentado en los cobayos inmunizados con 64trp-2. Han disminuido sus pesos de engullimiento comparados con los otros cobayos inmunizados con 64trp y GST (Tabla 2; peso medio = 336 mg) . Además, dos garrapatas de este grupo pusieron pequeños lotes de huevos que no se anidaron; y durante el último estado de alimentación, algunas de las garrapatas adultas desprendidas repletas murieron 2 dias después de desprenderse. De manera similar, garrapatas adultas post-alimentadas completamente engullidas de cobayos inmunizados con 64trp3 murieron dentro de la primera semana después de desprenderse (Figura 7B) . Estas garrapatas fueron sobre agrandadas con el alimento de sangre comparadas con las garrapatas de control, obscuras en color y desarrollan una consistencia dura al morir. Este efecto vacuna en las garrapatas indica el daño al intestino de la garrapata asi como también una alteración de la osmoregulación que es una función de las glándulas salivales de la garrapata.

Todas las garrapatas normales adultas de los cobayos inmunizados con la proteina de control parecen normales y sobreviven a los huevos puestos (Figura 7C) . Se realizaron estudios de necropsia de biopsias de piel de cobayos inmunizados con proteínas 64TRP después de la alimentación con garrapatas adultas de R. appendiculatus. Se observaron lesiones papulares eritematosas en los sitios de fijación de la garrapata (Figuras 8A, B y C, no. 3), comparadas con las biopsias de piel de cobayos inmunizados con la proteina de control (Figuras 8D y E) . Las lesiones se marcaron en la biopsia de los cobayos inmunizados con 64trp2, indicado por espesor de la piel y lesiones necróticas (Figura 8C) . Estos resultados se correlacionan con la alta mortalidad observada en las garrapatas adultas después de alimentarse en cobayos inmunizados con 64TRP. De este modo, la alimentación de las garrapatas parece haber estimulado una respuesta inmune por los cobayos vacunados 64TRP contra el último estado de alimentación de garrapatas adultas. Para confirmar estos hallazgos, se realizaron estudios histológicos en secciones de las biopsias de piel usando teñidos de Hematoxilina y Eosina (Bancroft J. D., y Stevens, A., Eds. (1990). Theory and Practice of histological Techniques. 3rd Edition). Estos resultados muestran el perfil histológico normal esperado con la sección de biopsia de piel de los cobayos inmunizados con la proteina de control, postalimentación de las garrapatas adultas (Figura 9.1). En contraste, estudios histológicos de secciones de biopsia de piel de cobayos inmunizados con 64TRP confirman respuestas inmunológicas en la alimentación de garrapatas adultas como se observa por la presencia de infiltración leucocitica particularmente en la dermis cerrada previo a los sitios de fijación de garrapata en la epidermis, lo cual se observó en tanto amplificación baja (Figuras 9.2 y 9.3) como amplificación alta (Figuras 9.7 y 9.8). La hiperplasia epitelial está también presente, la cual es evidencia de respuestas inflamatorias crónicas. Se realizaron estudios histológicos adicionales en estas mismas secciones, asi como también la muestra de control usando teñido de Mancha de Sangre Rápida "Gurr" Hema (BDH) (es decir, teñido Wright), de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los resultados confirman a los infiltrados del leucocito ser eosinófilos y basófilos polimorfos en la secciones de biopsia de piel a partir de cobayos inmunizados 64trp (Figuras 9.5 y 9.6), los cuales no están presentes en la muestra de control (Figura 9.4). 3.3 Producción y viabilidad de huevos Análisis estadísticos de producción de huevo determinados por la relación F mostraron un peso de masa de huevo media significantemente inferior (F, ?,44 = 5.646, p<0.022) para garrapatas hembra de R. appendiculatus que se alimentaron en cobayos inmunizados con 64trp5 comparados con garrapatas hembra de los otros grupos. Además, 2/9 lotes de huevos no anidaron. Estos se pusieron por 2 garrapatas hembras adultas del grupo de garrapatas de R. appendiculatus que se han alimentado en cobayos inmunizados con proteina 64trp2. Los resultados indican que ciertos constructos tienen un efecto significante en el rendimiento reproductivo de garrapatas hembras adultas alimentadas en los animales inmunizados. Este es un efecto vacuna deseable. Los resultados de los ensayos de vacunación soportan el uso de proteínas 64trp2, 64trp3, 64trp5 y 64trp6 como vacunas contra las garrapatas adultas y ninfales de R. appendiculatus . Las respuestas inflamatorias inmunes observadas son reminiscentes de las respuestas inmunes detectadas con infestación de garrapatas secundarias (Brown y Askenase, 1981, J. I munol. 127:2163-2167; Brown y Askenase, 1983 Federal Proceedings 42, 1744-1749) que incluyen eritema intenso, edema, necrosis, hiperplasia y palupas eritematosas en sitios abandonados de alimentación de garrapatas. La reacción celular localizada (basófilo y eosinófilo polimorfos) y reacción de tejido en infestación secundaria, se conoce como inmunidad mediada por la célula y es ampliamente considerada como el mecanismo primario de rechazo en animales inmunes a las garrapatas. Por lo tanto, existe un mecanismo inmune complejo que involucra una reacción mediada por la célula, localizada, en el sitio de fijación, asi como también mecanismos efectores dependientes del complemento y humorales. Los tituladores de anticuerpo se determinaron por ELISA usando suero anti-64trp o anti-GST de cobayos inmunizados con antigenos 64trp o GST, respectivamente (Desai, et al . , (1994) J. Neurol. Sci. 122, 109-116). La comparación de tituladores antes y después de la infestación de garrapatas mostró incrementos consistentes en tituladores de anticuerpos para cobayos inmunizados con 64trpl, 64trp2, 64trp3, 64trp5 o 64trp6. Los incrementos observados indican que . la infestación de garrapatas de animales inmunizados tiene un efecto de refuerzo, que induce una respuesta anamnéstica. Esta respuesta indica que la infestación natural de garrapatas obviará la necesidad de inmunizaciones adicionales, debido a que la alimentación de garrapatas proporcionará estimulo necesario para mantener la protección de la vacuna. De este modo, una vacuna de una sola inyección requiere solamente que se pueda preparar una sola inmunización usando un adyuvante apropiado y un solo coctel o cóctel de constructos 64trp.

Sumario de estudios en proteina cemento de 64P El cono de cemento producido por Rhipicephal us sanguineus actúa como un ancla, asegurando las partes de la boca de la garrapata en la epidermis o dermis de la piel del hospedero. La fijación entre el cono de cemento y el tejido hospedero circundante forma un sello a prueba de gotas. Para evitar provocar una respuesta de rechazo de hospedero contra la garrapata, las proteínas cemento han adoptado una estructura similar a aquella del colágeno y queratina. Las formas truncadas de la proteina cemento (64P) se han expresado en E. coli y antisuero promovido en las proteínas. Un sumario de los resultados se muestra en la Tabla 2 abajo.

Tabla 2 : Sumario de las características de las proteínas 64TRP Propiedad proteína truncada 64P: 64trpl 64trp2 64trp3 64trp4 64trp5 (Mtrp6 fragmento de secuencia 29 aa C- 51 aa N- 70 aa N - 63 aa C- 133 aa 133 aa (aa) de aminoácido clon clon clon clon clon de clon de 64P terminal terminal terminal terminal longitud longitud completa completa Peso molecular 3 (30)* 6 (33)* 8 (36)* 7 (34)* 15 (41)f 15 (42)* (kD) • proteína de fusión GST/ GST/ GST/ GST/ GST GST/ETIQUETA.HIS GST/ ETIQUETA.HIS ETIQUETA.HIS ETIQUETA.HIS ETIQUETA.HIS ETIQUETA.HIS ETIQUETA.HIS cn proteína soluble/ desnaturalizada Soluble Soluble Soluble Soluble Soluble Desnaturalizada Efecto vacuna + +++ ++" ++' ++' 10 Efecto vacuna: + = efecto potente mxLerado contra garrapatas ninfales de Rhipicephalus sanguineus, post-alimentadas en cobayos inmunizados con 64trpl; +++ = efecto muy potente contra garrapatas ninfales y adultas de Rhipicephalus sanguíneas, post-alimentación en cobayos inmunizados con 64trp2; ++a = efecto muy potente contra garrapatas adultas de Rhipicf hal us sanguineus, post-alimentación en cobayos inmunizados con 64l;rp3; ++n = efecto muy potente contra garrapatas ninfas de Rhipicephalus sang>ineus, post-alimentación con cobayos inmunizados con 64trp6; sin efecto contra grrapatas adultas y ninfales de Rhipicephalus sanguineus, post-alimentación en cobayos inmunizados con 64trp4. * Peso polecular de proteína de fusión, es decir, que incluye proteína GST de 26 kD + ETIQUETA.9XHIS de 1 kD. f Peso molecular de proteína de fusión que incluye proteína GST de 26 kD.

Ejemplo 4: Reactividad reciproca de antisuero promovida contra la proteina cemento 64 trp de Rhipicephal us sanguineus 4.1 Mecanismo de acción de la vacuna cemento de garrapata Como se expone en el Ejemplo 3, la inmunización de cobayos con ciertos fragmentos de 64 trp de R. appendiculatus resultó en alta mortalidad en garrapatas hembras adultas y ninfales después que han completado su alimentación. Las garrapatas se volvieron negras y llegaron a ser rígidas, sugiriendo daño al intestino de las garrapatas y derrame del alimento de sangre a partir del intestino en la cavidad corporal . Para probar esta hipótesis, se llevaron a cabo inmunomanchados para determinar si los anticuerpos se dirigen contra fragmentos de cemento que reaccionan reciproco con los antigenos en el intestino y hemolinfa de garrapatas adultas, y con antigenos en extractos corporales completos de ninfas y larvas . 4.2 Resultados Se hicieron reaccionar suero anti-64trp2 con bandas de proteínas de 22 kD y 25 kD en extractos de cono cemento (Figura 10A) . El antisuero mostró reactividad reciproca con bandas de proteínas en extractos de glándulas salivales (22, kD) , hemolinfa (22, 52 kD) ; ninfal (52, 98 kD) y larvales (52 kD) (Figura 10A) , y en extractos de intestino medio (52 kD) (Figura 11B) . Se hizo reaccionar suero anti-64trp5 con bandas de proteina de 31 kD y 48 a 70 kD en extractos de cono cemento (Figura 11D) . El antisuero reaccionó reciproco con bandas de proteina en extractos de glándulas salivales de garrapatas no alimentadas (15, 22 y 31; Figura 11C) y de garrapatas que se han alimentado por 2 dias (25, 31 kD; Figura 11D) . La reactividad reciproca también se detectó con bandas de proteínas de intestino medio (52 a 70 kD; Figura 11C) y hemolinfa (31, 48 kD; Figura 11D) , pero sin extractos ninfales y de larvas (Figura 11D) . Se observaron reacciones reciprocas usando suero anti-64trp3 (no mostrado) . Se hizo reaccionar suero anti-64trp6 con bandas de proteínas de 22, 25 kD y 48-70 kD en extractos de centro de cemento (Figura 10B) . El antisuero reaccionó reciproco con bandas de proteina en las glándulas salivales (22, 25kD) , hemolinfa (22, 48 kD) , y extractos larvales (120 kD) (Figura 10B) , y con extractos de intestino medio (65 a 70 kD; Figura 10A) , pero no mostró reacción reciproca aparente con extractos ninfales (Figura 10B) . 4.3 Conclusiones Los anticuerpos promovidos contra fragmentos de cemento de garrapata de R. appendiculatus de la proteina como la queratina, 64trp, claramente reaccionaron reciproco con los epitopes antigénicos en la glándula salival, intestino medio y hemolinfa de R. appendicula tus de hembras adultas. La reacción con estos epitopes por anticuerpos en el alimento sanguíneo de garrapatas alimentadas en animales inmunizados, presumiblemente causa daño al intestino medio resultando en la muerte de la garrapata. La disección de una de las garrapatas hembra afectada revela sangre coagulada dispersa dentro de la cavidad corporal, compatible con la ruptura del intestino medio. De este modo, aunque las vacunas comprendan una proteina secretada de garrapatas (es decir., antigenos "expuestos") , causa alta mortalidad dirigir antigenos "disimulados" en el intestino medio y posiblemente también la hemolinfa y glándulas salivales (es decir, afectando funciones fisiológicas normales) . Los fragmentos de cemento por lo tanto, proporcionan una vacuna de acción dual que: (i) estimula una respuesta inflamatoria la cual reforzará el estado inmune de los animales vacunados, y (ii) dirige los antigenos disimulados que resultan en daño a la garrapata. Ejemplo 5: Reactividad reciproca con otras especies de garrapatas usando inmunomanchados Para determinar si los anticuerpos promovidos contra la proteina cemento de R. appendiculatus reaccionan con epitopes antigénicos de otras especies de garrapatas, se emprendieron inmunomanchados con extractos de tejidos de Rhipicephal us sanguineus (la garrapata de perro), Amblyomma variegatum (una plaga económicamente importante de ganado en África, América del Sur y el Caribe) , y Ixodes ricinus (la garrapata de la oveja o lana, que transmite el padecimiento de Lyme y encefalitis originada de las garrapatas a humanos en Europa) . 5.1 Resultados Suero anti-64trp5 reaccionó reciproco con bandas de proteínas de extractos de glándula salival (180 kD) e intestino medio (25, 52 kD) de A. variegatum y hemolinfas (85 kD) (Figura 12A) . No hubo reacciones reciprocas detectadas con las glándulas salivales de R. sanguineus, hemolinfa o intestino medio (no mostrado) . Suero anti-65trp6 reaccionó reciproco con una banda de 50 kD de hemolinfa de A. variegatum pero no mostró actividad con las preparaciones de glándulas salivales e intestino medio (Figura 12B) . Con R. sanguineus, ocurrieron reacciones reciprocas con varias bandas de proteínas de glándulas salivales (51, 53-55, 65, 120 kD) , y con intestino medio (25, 52 y 55 kD) pero no con hemolinfa (Figura 12C) . Bandas que reaccionan reciproco que parecen rizadas son probablemente proteínas glicosiladas. Usando antisuero 64trp3 (Figura 13A) , dos bandas pronunciadas (a y b) y una banda tenue (c) se detectaron en extractos ninfales y hubo también reactividad reciproca con hemolinfas, intestino medio y glándulas salivales de adultos.

El antisuero a 64trp2 (Figura 13B) detectó varias bandas en extractos de R. sanguineus, que incluyen una banda fuerte (j) presente en todos los extractos. El antisuero de control promovido contra GST detectó bandas que reaccionan reciproco en conos de cemento y glándulas salivales (Figura 14) . Las reacciones reciprocas en las glándulas salivares pueden representar GST de R. sanguineus, como se reporta por Boophil us micropl us y aquellas en conos de cemento son probablemente debido a las reacciones no especificas con proteínas hospederas de extractos de cono de cemento contaminantes de hemoglobulina/IgG que se obtuvieron a partir de garrapatas alimentadas parcialmente. El antisuero a 64trp2 y 64trp5 cada uno reaccionó reciproco con el cono de cemento, intestino y extractos ninfales completos de J. ricinus . Por el contrario, no se detectaron reacciones reciprocas con anti-64trp3. Esta observación difiere de la reactividad reciproca observada con extractos de tejido de R. sanguineus y A. variega tum. Hubo también reactividad reciproca de suero anti-64trp con intestino y ninfas de J. ricinus . Los resultados se resumen en la Tabla 3. 5.2 Conclusiones Los anticuerpos promovidos a los constructos de 64trp de proteina cemento de R. appendiculatus reaccionan reciproco con epitopes antigénicos en las glándulas salivales, intestino medio y hemolinfa de otras tres especies de garrapatas ixodides. Los resultados sugieren que la vacuna candidata derivada del cemento de R. appendiculatus proporciona una vacuna de amplio espectro que es efectiva contra un número de diferentes especies de garrapatas. Una de las bases de las reactividades reciprocas observadas, 64 trp6 de R. appendi culatus se seleccionó como un inmunógeno para un ensayo de vacuna. Como se demostró anteriormente, en ensayos de vacuna con R. appendiculatus (véase Tabla 2), el 64trp6 fue efectivo contra ninfas de R. appendiculatus pero no contra adultos. Por lo tanto, en ensayos de vacuna con R. sanguineus, uno de los dos constructos (ya sea 64trp3 o 64trp2) efectivo contra R. appendiculatus adulto, se incluyó con 64trp6, como se describe en la siguiente sección.

Tabla 3. Sumario de resultados para reactividad recíproca entre antígenos de garrapatas R. appendiculatus, R. sanguineus, Ambly?nima variegaium y Ixodes ricinus losan o suero de cobayos inmunizados con los antígenos recombinantes 64tr s. co 15 Códigos usados para la Tabla 3 CC = extracto de cono de cemento de garrapata, SG = extracto de glándula salival (de garrapatas no alimentadas), intestino = extracto de intestino medio, H= hemolinfa, N= extracto de ninfa de garrapata, L = extracto de larva de garrapata. reacciones + = positiva y - = negativa respectivamente, a antisuero usado en inmunomanchados; ab' = antisuero; nd= no hecho. +* y +g = reacciones positivas a antisuero anti-GST de fracciones insolubles de extractos de CC y SG solubilizados a 100°C en amortiguador de muestra SDS. +* (CC de garrapatas parcialmente alimentadas) = bandas inmunopositivas son probablemente debido al enlace no especifico de anti-GST ab' con fracciones de IgG/hemoglobulina del hospedero enlazadas a los conos de cemento. +g = (SG de garrapatas no alimentadas) = bandas inmunopositivas son probablemente debido al enlace especifico de anti-GST ab' con una proteina GST equivalente (Ref. proteina GST de Boophil us micropl us) . +°° = Extracto insoluble de intestino de A. variegatum, solubilizado en amortiguador de muestra SDS/2-* mercaptoetanol -* bandas inmunopositivas muy tenues, debido al enlace no especifico de antigenos de extracto de ninfa de garrapata con antisuero GST.

Ejemplo 6: Ensayo de vacuna de protección reciproca: cobayos inmunizados con constructos de 64trp de proteina cemento de Rhipicephalus appendiculatus y prueba inmunogénica con adultos de R. sanguineus . 6.1 Tratamientos para ensayos de vacuna: • Grupo 1: 64trp6 recombinante + 64trp2 + Montanido ISA (4 cobayos) • Grupo 2: 64trp6 recombinante + 64trp3 + Montanindo ISA (4 cobayos) • Grupo 3: GST (control) (2 cobayos) • NUMERO TOTAL DE ANIMALES = 10 Ruta y dosi s : Inoculación subcutánea en la región prescapular ya sea combinada con antigenos en un sitio único, o cada antigeno en diferentes sitios. Dosis: 50 µg de antigeno por animal. Esquema de Vacunación : 1. Primera inoculación 2. Primer refuerzo 3. Sangrado sometido a prueba a 10 a 12 dias postinoculación. 4. Segundo refuerzo (si es titulo de anticuerpo <l/5000) . Sangrado sometido a prueba 10 a 12 dias postinoculación 6. Titulo de anticuerpo >l/5000: prueba inmunogénica con pares de R. sanguineus adultos 7. Evaluar resolución de alimentación, supervivencia, rendimiento reproductivo de garrapatas. 6.2 Resultados Los resultados se resumen en la Tabla 4. El total muestra que las vacunas putativas derivadas contra la 64trp proteina cemento de R. appendiculatus fueron protectoras reciprocas contra adultos y ninfas de R. sanguineus . Hubo notables diferencias de las observaciones previas con R. appendiculatus .

Tabla 4. Comparación de parámetros de alimentación para garrapatas de Rhipicephalus appendiculatus alimentadas en cobayos inmunizados con proteínas 64TRP y proteína GST.

Inmunizado con Inmunizado con: Parameters proteína de control GST 64trp2/6: 64trp3/6: C* S* S* C* C M F N M F M F N N M F M F N N (%) Fijación 100 100 100 100 70 70 60 100 100 90 80 100 70 100 100 Duración de alimentación (días) 10-13 10-t3 5-8 nd 1-12 nd 1-10 5-8 5-8 pd 1-13 nd 1-13 5-? 5-8 Inflamación del sitio de fijación - - ++ ++ ++ ++ + + +++ +++ ++ ++ + + peso medio de pd 195 nd 213 rtd nd engullimiento (mg) nd 207 pd nd nd 203 nd 184 nd (%) Mortalidad 0 0 9.2 0 80 30 40 37 33 10 30 0 36 30 18.8 fío. total de garrapatas 8 10 293 10 10 10 10 118 156 10 10 10 11 100 123 peso de masa del huevo I ll/E 0* 121 /E 14/E 106/E (mg)/viabilidad Tabla 4 Notas * denota cobayos individualmente inmunizados con cocteles de proteina 64trp (es decir combinaciones 64trp2/6 o 64trp3/6) ya sea como antigenos combinados en sitios subcutáneos únicos (C) o separados (S) . I se refiere a las reacciones inflamatorias de la piel locales observadas en sitios de alimentación de la garrapata (temporal, 2-3 dias) evidentes como eritema, edema, comezón y linfadenopatia. nd se refiere a no hecho. M y F se refieren a garrapatas adultas macho y hembra, respectivamente. E indica huevos anidados. D indica las dos hembras que sobrevivieron en este grupo que no pusieron huevos. (i) Efecto en la fijación Distinta a R. appendiculatus, se afectó la velocidad de fijación de R. sanguineus adultas en los animales de prueba (pero no de control) . A las 24 horas postinfestación, la mayoría de las garrapatas en todos los 4 animales de prueba no se fijaron y se observó arrastre en la retención del cendal como si se intentara dejar al hospedero.

Subsecuentemente, durante el periodo temprano de alimentación (dia 1 hasta el dia 5) , un total de 16/81 adultos muertos (12 hembras y 4 machos) se removieron de los animales de prueba; todos menos una de estas garrapatas pareció no estar alimentada • (Figura 15) . Todas las 18 garrapatas en el animal de control se fijaron dentro de las 24 h de infestación. (ii) Efecto en machos Nuevamente, distinto de R. appendiculatus, se observó un efecto en la supervivencia de machos. Como se mencionó anteriormente, 4 machos muertos se removieron durante el periodo de alimentación temprano. (iii) Respuesta inflamatoria Todos los 8 cobayos de prueba mostraron una respuesta inflamatoria en el sitio de inoculación del antigeno y también en el área de alimentación de la garrapata. La inflamación se observó primero 6-7 dias postinfestación, y han decaído por el dia 9-10 de alimentación. No se observó inflamación en los animales de control. (iv) Mortalidad post-alimentación Como se observó con R. appendicula tus, la mayoría de las hembras (29/41) completaron su engullimiento. Sin embargo, de estas, 7 murieron dentro de los 2 dias de desprendimiento. Mostraron efectos similares a R. appendiculatus (sobre-distención y obscurecimiento) compatibles con el daño o ruptura al intestino (Figura 16) . Las tasas de mortalidad moderada se observaron con ninfas a partir de animales de prueba, comparadas con el caso de control . (v) Rendimiento reproductivo De las 22 hembras sobrevivientes engullidas de animales de prueba, 19 pusieron huevos. Los análisis estadísticos de estos datos están actualmente siendo determinados . 6.3 Conclusiones 1. Anticuerpos promovidos contra las proteínas 64trp reaccionan reciproco en inmunomanchados con epitopes antigénicos en la glándula salival e intestino medio de garrapatas R. sanguineus . 2. Cocteles de vacunas que comprenden diferentes proteínas 64trp construidos de una proteina cemento secretada (es decir, antigenos "expuestos") de la garrapata de R. appendiculatus, proporcionan protección reciproca contra otras especies de R. sanguineus dirigiendo antigenos "disimulados" en el intestino medio y glándula salival de garrapatas adultas, causando alta mortalidad. 3. Las vacunas coctel estimulan las respuestas inmunes inflamatorias que reforzarán el estado inmune de los animales vacunados. Ejemplo 7: Reactividad reciproca antigénica entre Rhipicephalus appendiculatus y Boophilus microplus detectada por inmunomanchados usando antisuero a los constructos de 64trp de la proteina cemento de JR. appendiculatus . 7.1 Preparación de extracto de garrapata de B. micropl us Se colectaron del ganado ninfas y adultos de Boophil us micropl us . Se nota que las ninfas fueron alimentadas y por lo tanto pueden mostrar niveles incrementados de reactividad reticulada no especifica debido a las proteínas hospederas. 7.2 Resultados 7.2.1 Reactividad reciproca con antisuero 64trp2 y 64trp3 Estudios de reactividad reciproca usando inmunomanchados con antisuero 64trp3 (Figura 17A) detectaron varias proteínas de cono de cemento de B. micropl us (c, i, j, k y 1) ; dos bandas de tamaño similar (c y h) se detectaron en el intestino medio y glándulas salivales. Muchas bandas se detectaron en el extracto ninfal alimentado, algunos de los cuales no fueron probablemente específicos (véase abajo) . Usando antisuero 64trp2 (Figura 17B) , se detectó una banda pronunciada (o) en todos los extractos. Esta banda es de tamaño similar (62 kD) a la banda c detectada en todas las muestras usando antisuero 64trp3, aunque la banda c no fue tan pronunciada. La banda c/o fue apenas detectable en el gel teñido con Azul de Coomassie (Figura 17C) , indicando que la reactividad reciproca con el antisuero 64trp2 o 64trp3 fue probablemente especifica y no debida al enlace no especifico. También compatible con esta interpretación es el hecho de que las proteínas 64trp2 y 64trp3 son constructos relacionados con las secuencias N-terminal traslapantes (véase Figura 2) . Con el antisuero 64trp2, una banda tenue (q) se detectó en todas las muestras. El cono cemento (linea 5) y el extracto ninfal (linea 2) tienen bandas comunes pronunciadas (n y p) mientras la banda r se detectó en todos los extractos de adultos. La banda inmunopositiva designada como e es más probablemente debida a un enlace no especifico de antisuero anti-GST con proteínas hospederas (hemoglobina/IgG) presentes en los extractos de tejidos de garrapata. La banda inmunopositiva f es probablemente debida al enlace especifico del antisuero anti-GST (véase Figura 18C) , con las bandas de proteínas en los extractos de intestino medio, glándula salival y tejido de garrapata completo que representa la proteina GST de 26 kD de larvas de Boophil us micropl us (véase He et al., (1999), Insect-Biochem-Mol-Biol . 29 (0) : 737-43) . 7.2.2 Reactividad reciproca con antisuero 64trp5 y 64trp6 Tanto el antisuero 64trp como 64trp6 detectaron varias bandas en extractos ninfales, pero no hubo reactividad reciproca obvia con extractos de garrapatas adultas (Figuras 18A y 18B) . El antisuero 64trp5 produce una banda dominante (b) con cono cemento pero no se detectó reactividad reciproca entre el extracto de cono de cemento y 64trp6. Las bandas inmunopositivas designadas como a y e son probablemente debidas al enlace no especifico del antisuero anti-GST con proteínas hospederas (hemoglobina/IgG) presentes en extractos de cono de cemento y extracto de ninfa completa de garrapatas alimentadas, respectivamente (figura 18C) . La banda inmunopositiva f es probablemente debida al enlace especifico del antisuero anti-GST con las bandas de proteínas en extractos de intestino medio, glándula salival y tejido completo de garrapata, más probablemente la proteina GST de 26 kDa de la larva Boophil us micropl us . 7.3 Conclusiones Los resultados se resumen en la Tabla 5. Nuestros ensayos de vacuna con R. appendiculatus, R. sanguineus y Ixodes ricinus han mostrado que los datos de inmnunomanchado proporcionan un buen indicador de los inmunógenos de vacuna efectivos. En esta base, los resultados presentados en este Ejemplo sugieren que: (i) 64trp2 y 64trp3 son inmunógenos de vacuna candidatos para controlar las ninfas y adultos de B. microplus; (ii) el constructo 64trp5 puede ser efectivo contra ninfas de B. microplus y al menos parcialmente efectivos contra adultos; (iii) 64trp6 puede ser efectivo contra ninfas y no adultos de B. microplus; (iv) cócteles de inmunógenos pueden ser la estrategia más efectiva para controlar B. microplus: ya sea 64trp2 + 64trp5 o 64trp3 + 64trp5. Tabla 5: Reactividad reciproca entre antigenos de garrapata R. appendiculatus y Boophil us micropl us, usando suero de cobayos inmunizados con antigenos recombinantes 64trp.

CC = extracto de cono cemento de garrapata, SG = extracto de glándula salival, intestino = extracto de intestino medio, H= hemolinfa, N= extracto de ninfa de garrapata, L = extracto de larva de garrapata, reacciones + = positiva y - = negativa respectivamente, a antisuero usado en inmunomanchados; ab' = antisuero; nd= no hecho. +* y +g = reacciones positivas a antisuero anti-GST de fracciones insolubles de extractos de CC y SG solubilizados a 100°C en amortiguador de muestra SDS. +* (CC de garrapatas parcialmente alimentadas) = bandas inmunopositivas son probablemente debido al enlace no especifico de anti-GST ab' con fracciones IgG/hemoglobulina del hospedero enlazadas a los conos de cemento y de las ninfas completas de garrapatas alimentadas. +g = (SG de garrapatas no alimentadas )= bandas inmunopositivas son probablemente debido a enlace especifico de anti-GST ab' con una proteina GST equivalente1. Ejemplo 8: Ensayo de Vacuna de Protección reciproca: cobayos inmunizados con constructos 64trp de proteina cemento de Rhipicephal us appendiculatus y pruebas inmunogénicas con ninfas de J. ricinus 8.1 Selección de Inmunógenos Un sumario de los constructos cemento de 64trp de R. appendiculatus se muestra en la Figura 2. Los inmunógenos candidatos se identificaron en base a si el antisuero al constructo detecta antigenos que reaccionan reciproco especifico en extractos de muestras de J. ricinus . Los estudios de reactividad reciproca usando inmunomanchados con antisuero 64trp mostraron detección de varias proteínas de extracto ninfal y larval completo de J. ricinus (Figura 19) , y preparaciones de adulto de cono cemento y extractos de intestino medio (no mostrados) . Usando antisuero 64trp22 (Figura 19A(iii)), dos bandas principales (a y b) se detectaron en el extracto ninfal y hubo también reactividad reciproca con el cono cemento de adulto y extractos de intestino medio (véase Tabla 3) . El antisuero a 64trp5 y 64trp6 (Figura 19A(iv) y (v) , respectivamente) , detectaron varias bandas en extracto de ninfa completa de J. ricinus . El antisuero a 64trp6 también detectó 5 bandas prominentes en extracto de larva completa (Figura 19B (ii) ) . El antisuero de control promovido contra GST detectó bandas muy tenues en el cono cemento de ninfa completa, y extractos de intestino medio, los cuales son probablemente debido a reacciones no especificas con proteínas hospederas de inmunoglobulina/IgG. Con base en las reactividades reciprocas observadas, 64trp2, 64trp5 y 64trp6 de R. appendiculatus se seleccionó como inmunógenos para un ensayo de vacuna. Estos se usaron individualmente o como cocteles. 8.2 Tratamientos para ensayos de vacunas: • Grupo 1: 64trp6 recombinante + 64trp2 + Montanido ISA (1 hámster) • Grupo 2: 64trp6 recombinante + 64trp5 + Montanido ISA (1 hámster) • Grupo 3: GST (control) (1 hámster) • Grupo 4: 64trp2 recombinante + Montanido ISA (1 hámster) • Grupo 5: 64trp5 recombinante + Montanido ISA (1 hámster) • Grupo 6: 64trp6 recombinante + Montanido ISA (1 hámster) Número Total de Animales = 6 8.3 Ruta y dosis: Inoculación subcutánea en la región prescapular ya sea individualmente o como antigenos combinados en un solo sitio. Dosis 25 µg antigeno por animal. 8.4 Esquema de Vacunación: 1. Primera inoculación 2. Primer refuerzo 3. Sangrado sometido a prueba a 10 a 12 dias postinoculación. 4. Segundo refuerzo (si es titulo de anticuerpo <l/5000) 5. Sangrado sometido a prueba a 10 a 12 dias postinoculación. 6. Titulo de anticuerpo >l/5000: prueba de inmunogenicidad con 50-100 ninfas de J. ricinus . 1 . Evaluar la resolución de alimentación de garrapatas, respuesta inmune inflamatoria local a la alimentación de garrapatas, supervivencia y mudación sucesiva a adultos. 8.5 Resultados Los resultados se resumen en la Tabla 6. Del total, se muestra que las vacunas putativas derivadas contra el cemento de R. appendiculatus fueron reactivas reciprocas contra ninfas de J. ricinus . (i) Efecto en la fijación Como R. appendiculatus, la velocidad de fijación de ninfas de I. ricinus en animales de prueba no fue afectada, (ii) Respuesta inflamatoria Cuatro hámsteres mostraron una respuesta inflamatoria en el sitio de alimentación de la garrapata con 3 hámsteres que tienen varias reacciones (Figura 20) . Este resultado se correlaciona con los ensayos in vi tro (es decir, Manchados Western) . La inflamación se observó 3-5 dias postinfestación, y fue todavía presente en el desprendimiento de garrapatas (dia 5 de alimentación) . No se observó inflamación en el animal de control, (iii) Mortalidad post-alimentación La relación de protección reciproca en los ensayos in vi tro se valorará cuando las ninfas alimentadas hayan mudado a adultos. 8.6 Conclusiones. 1. Anticuerpos promovidos contra las proteínas 64trp reaccionan reciproco en inmunomanchados con epitopes antigénicos en ninfas, larvas y conos cemento de adulto e intestino medio de garrapatas de J. ricinus . 2 . Se observó una respuesta de hospedero en hámsteres inmunizados con inmunógenos 64trp (observaciones previas han sido solamente en 5 cobayos) . 3. Se observaron varios grados de respuesta inflamatoria en el sitio de alimentación de garrapatas ninfales de J. ricinus en animales inmunizados con los constructos 64trp, con las respuestas más severas observadas en hámsteres inmunizados con un coctel de 64trp6/5. 4. Los inmunógenos estimulan las respuestas inflamatorias locales que reforzarán la respuesta inmune. 15 Tabla 6. Comparación de parámetros de alimentación para garrapatas Jxodes ricinus alimentadas en hámsteres inmunizados con proteínas 64TRP y proteína GST.

Inmunizado con: Parámetros Inmunizado con GST 64trn2 64tro2/6 64trn5 64tro5/6 64tro6 (%) de fijación 100 100 100 loo 100 100 Duración de 4-5* 3-5 alimentación 3-5 3-5 3-5 3-5 (días) 00 + - ++ +++ + Inflamación del 10 sitio de fijación (%) de msrtalidac 18 34.9 63.6 34.2 29.3 25.7 No. total de garrapatas 149 63 36 73 143 136 i = inflamación - y + denota ausencia o presencia de inflamación en sitios de fijación de la garrapata durante la ali sntación, respectivamente; el grado de inflamación está indicado por: += leve, ++= moderado y +++= severa; * se refiere a la alitrentación de garrapatas de las garrapatas ninfales de J. ricinus en hámsteres de control, extendido por 6 horas carparado con aquellos alimentados en los hámsteres inmunizados con 64trp.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende una proteina cemento inmunogénica de garrapata, un fragmento de la misma, o un equivalente funcional de la misma, en conjunto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 2. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina cemento de garrapata, fragmento de la misma o equivalente funcional de la misma, contienen un epitope inmunogénico que está presente en una o más proteínas de cemento ortólogas de especies ectoparásitas que se alimentan de la sangre, distintas a las especies de garrapatas de las cuales la proteina cemento inmunogénica, fragmento o equivalente funcional se deriva.
3. 3. Una composición de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 2, caracterizada porque la proteina cemento de garrapata contiene un epitope inmunogénico que está también presente en una proteina de intestino de un ectoparásito que se alimenta de la sangre.
4. 4. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el ectoparásito que se alimenta de la sangre es una garrapata, mosquito, sanguijuela, tábano, mosca tsetse, pulga, piojo o acaro.
5. 5. Una composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque es efectiva contra formas tanto adultas como inmaduras de ectoparásitos que se alimentan de la sangre.
6. 6. Una composición de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la proteina cemento de garrapata se deriva de cualquiera de las especies de garrapatas, Rhipicephal us appendiculatus, R. sanguineus, Amblyomma variegatum, Boophilus microplus, B. annulatus, Ixodes ricinus, I. persulcatus, e I. scapularis.
7. 7. Una composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteina cemento de garrapata se deriva de la garrapata R. appendiculatus .
8. 8. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene cualquiera de las proteínas del clon 21, clon 33, CemA, clon 24, clon 68, clon 64 y clon I, o fragmentos de la misma como un componente activo.
9. 9. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene la proteina cemento 64trp, o un fragmento o equivalente funcional de la misma, como un componente activo.
10. 10. Una composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el fragmento es cualquiera de 64trpl, 64trp2, 64trp3, 64trp4, 64trp5 o 64trp6, o un equivalente funcional del mismo.
11. 11. Una composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el fragmento es 64trp2, 64trp6 o equivalentes funcionales del mismo.
12. 12. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la proteina cemento de garrapata es expresada en forma recombinante.
13. 13. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque adicionalmente comprende un segundo agente activo.
14. 14. Una composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el segundo agente activo es una segunda proteina inmunogénica, o fragmento de proteina derivado de un ectoparásito que se alimenta de la sangre.
15. 15. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque adicionalmente comprende un adyuvante.
16. 16. Un anticuerpo o antisuero, caracterizado porque es reactivo con una proteina cemento de garrapata.
17. 17. Un anticuerpo o antisuero de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la proteina cemento es cualquiera de las proteínas cemento, fragmento o equivalentes funcionales que son listados en cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
18. 18. Un método de producción de un anticuerpo o antisuero de conformidad con ya sea la reivindicación 16 o reivindicación 17, caracterizado porque comprende inmunizar un animal con una composición de vacuna como se lista en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
19. 19. Un método de inmunizar a un animal contra un ectoparásito que se alimenta de la sangre, caracterizado porque comprende administrar a dicho animal, una composición de vacuna como se lista en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
20. 20. Una proteina cemento de garrapata, fragmento de la misma o equivalente funcional de la misma, para uso en una vacuna.
21. 21. Uso de una proteina cemento de garrapata como un componente de una vacuna.